الأقلمة، تحديد الهوية، واستئصال مستودعات الفئران الدهنية

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نظرا لاتصال جذري والسلبية بين السمنة وأمراض المصاحبة الأخرى، يلعب البحوث حول دور الدهنية في المرض وهناك ما يبرر الصحة العامة. نقدم بروتوكول لعزل واستئصال مستودعات الدهنية مما يسمح لدراسة الدهنية باستخدام في الموقع وطرق المختبر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J. Vis. Exp. (94), e52174, doi:10.3791/52174 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

جعلت الدهنية وظهور ملحوظ في أضواء وسائل الإعلام، وذلك بسبب الزيادة الهائلة السمنة خلال العقود القليلة الأخيرة من القرن ال20. يؤثر السمنة حاليا أكثر من ثلث البالغين و 17٪ من الأطفال والمراهقين في الولايات المتحدة (US) 1. تغطي جميع المجموعات العرقية، وقد أظهرت البحوث الإحصائية المحيطة وباء السمنة أن السود غير اللاتينيين لديها أعلى معدل تعديل سن السمنة (49.5٪) مقارنة مع المكسيكي الاميركيين (40.4٪)، وجميع اللاتينيين (39.1٪)، وغير البيض من أصل اسباني (34.3٪) 2. تأثير الاقتصادي للسمنة هو أيضا مصدر قلق متزايد لنظام الرعاية الصحية. في عام 2012، أشارت التقديرات إلى أن التكلفة السنوية للرعاية الطبية للسمنة في الولايات المتحدة في عام 2005 وكانت 190200000000 $، ما يقرب من 21٪ من ميزانية الإنفاق الطبي بشكل عام. للأسف، قدرت السمنة في مرحلة الطفولة ليكون مسؤولا عن 14 مليار دولار في التكاليف الطبية المباشرة وحدها. إحصائيا، تقرر أن متوسط ​​تكلفة الطبية للكان الأفراد يعانون من السمنة 2741 $ أعلى في السنة من تلك التي من دون هذا الاعتلال 3-5.

السمنة هي عامل خطر رئيسي لمجموعة متنوعة من الظروف مثل: مرض السكري من النوع 2، دسليبيدميا، وأمراض القلب والأوعية الدموية، والسرطان، واضطرابات الهيكل العظمي العضلات والتهاب مزمن. ويرتبط السمنة بعمق إلى التسبب في متلازمة التمثيل الغذائي والأمراض المزمنة الأخرى 6-8. مع مثل هذه الاتصالات جذرية والسلبية بين السمنة وأمراض المصاحبة الأخرى، والبحث العلمي وركزت الانتباه إلى فهم أفضل للالوباء الحالي والأدوار المتنوعة والمحوري الذي يلعبه الدهنية.

تاريخيا، كان يعتبر النسيج الشحمي غير منطقي وكان ينظر كمجرد الأنسجة ملء بسيطة. حاليا، وقد تبين الدهنية للعب العديد من الأدوار الأساسية في وظيفة الجسم في: التمثيل الغذائي، وتنظيم الهرمونات، والتهاب والحماية والعزل 9. وتتكون الأنسجة الدهنية في المقام الأول منالخلايا الشحمية، إلا أنه يحتوي أيضا pericytes، والخلايا البطانية، وحيدات، الضامة والخلايا الجذعية المحفزة 8. يتم توزيع الأنسجة الدهنية في جميع أنحاء الجسم في مستودعات متميزة. مستودعات رئيسية يمكن العثور subdermally، تحت الجلد، العضل، وجدانية 10. وقد ثبت مستودعات الدهنية لمحات المحددة للتمثيل الغذائي مستودع، التي أظهرت قابلية مستودع محددة لالسمنة والاضطرابات ذات الصلة 8.

تقليديا، تم تصنيف الأنسجة الدهنية إلى نوعين رئيسيين: الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT)؛ على الرغم من أن الأدب الحديث يدل على الوجود من مجموعة ثالثة معمد برايت أو البيج الدهنية 11. وقد تبين الأنسجة الدهنية لدينا ألوان مختلفة، الأشكال التضاريسية، وظائف التمثيل الغذائي، وميزات البيوكيميائية وأنماط وراثية التعبير 10. الخلايا الشحمية في WAT لديها واحدة، كبيرة قطرات الدهون وكميات مختلفة من الميتوكوندريا. WATوجدت يغلب في المحليات تحت الجلد والحشوية من الجسم. وظائف WAT في المقام الأول كموقع لتخزين الطاقة وحماية الجهاز. الخلايا الشحمية في BAT لها التشكل متعددة المساكن والميتوكوندريا وفيرة. يقع BAT في المقام الأول في الرقبة والأوعية الدموية الكبيرة في الصدر، وكذلك كتف 12. BAT وظائف في المقام الأول في السلوكيات إنفاق الطاقة التي تنظم توليد الحرارة 7. وقد تبين الدهنية برايت أو البيج لمشاركة التشكل مماثلة والتعبير إلى BAT ولكن تم العثور أن نشأت من الخلايا الشحمية البيضاء 11.

طريقة جراحية وصفها في هذه المخطوطة يوفر الباحثين مع القدرة على تحليل تأثيرات مختلفة أن عوامل مثل: البيئة، والمستحضرات الصيدلانية، وعلم الوراثة، ويكون على الدهنية. وكذلك يلعب مفيد أو ضار دور الدهنية في المرض والصحة العامة. أيضا، وتوفير وسيلة لتحديد وعزل أنواع مختلفة من الأنسجة الدهنية لالسماح لفهم أفضل للعلاقات البيوكيميائية والاختلاف بين مستودعات. هذا يمكن أن تساعد في تحديد العلاقة بين المكان، وظيفة، وأنواع من الدهون داخل الجسم. هذا الأسلوب هو موضح يحقق ذلك عن طريق توفير وسائل التصور الإجمالي، وتحليل التعبير الجيني، وتحليل البروتين التعبير، والفحص النسيجي، والعزلة من خطوط الخلايا الأولية للدراسات في المختبر. حاليا هناك العديد من المقالات التي توفر نظرة ثاقبة سلوك الأيضي للمستودعات الدهنية المختلفة، وكذلك مواقعها التشريحية. ولكنها لا توفر وسيلة متعمقة حول كيفية ترجمة على وجه التحديد، وتحديد، وعزل هذه المستودعات. يوفر هذا الأسلوب الجراحي تقنية دقيقة التي تسمح لعزل مستودعات متعددة مع كمية ضئيلة من تشريح والتلوث مقارنة مع أساليب أخرى مصممة لعزل واحد أو اثنين من مستودعات 13-14.

والهدف من هذا البروتوكول هو توفيرطريقة دقيقة لتحديد وعزل أنواع مختلفة من مستودعات الدهون من مواقع التشريحية متعددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية بموافقة اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة سينسيناتي وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة (NIH النشر لا . 85-23، منقحة 1996).

1. الموت ببطء وتعقيم ماوس

  1. ضع الماوس في المربع المنسدل تحتوي على جرعة supratheraputic من الأيزوفلورين والسماح ليستنشق إلى تأثير. بمجرد الموت الرحيم الماوس، وإزالة من مربع.
  2. خلخل Cervically كوسيلة الثانية من القتل الرحيم.
  3. تعقيم السطح الخارجي للالماوس عن طريق تطهير الحيوان مع الايثانول 70٪.

2. تحديد وعزل ثلاثة مستودعات الدهنية مختلفة

  1. براون الدهنية الأنسجة (BAT) العزلة:
    1. تأكد من الفراء هو الرطب من التطهير الكحول للمساعدة في قطع طريق البشرة والجلد لايروبية.
    2. ضع الماوس في موقف ضعيف مع ظهرها على الطاولة.
    3. الاستيلاء على الجلد مباشرة تحت الحجاب الحاجز مع ملقط، ورفع وشق مع مقص.
    4. قطع مستعرض حول محيط من الماوس لفضح الصفاق.
    5. كشف على شكل فراشة BAT مستودع كتبها لحب النصف العلوي من الفأرة. عقد أقل الزوائد والبطن في يد واحدة وسحب الجلد حتى نحو الرأس.
    6. توجيه الماوس، بحيث يتم وضعه عرضة على الطاولة. يجب الحرص على عدم تلوث مستودع يتعرض مع الشعر.
    7. الأدوات الجراحية النظيفة وتغير إلى زوج جديد من القفازات.
    8. تحديد موقع كتف والمناظر مستودع. إزالة بعناية أي الدهنية بيضاء سطحية فوق فراشة ثم تشريح فراشة من الدهون البني بين الكتفين. كن حذرا لتجنب العضلات المرتبطة بشكل وثيق مع الدهون البني.
      ملاحظة: إن استخدام المجهر تشريح يوصى به لإزالة ثهايت الدهنية، وكذلك في فصل الدهنية البني من كتف.
    9. إزالة الدهون مستودع ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل.
    10. إذا RNA أو البروتين هو ليكون استخراجه، وتجميد الأنسجة عن طريق الغمر في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C. تجميد العينة في وقت واحد لمنع تدهور. إذا زراعة، وتغطي الأنسجة في DMEF-12 وتعيين على الجليد حتى يتم جمع جميع العينات للثقافة (معلومات إضافية).
  2. عزل تحت الجلد الدهنية الأنسجة (SQ)، والأبيض الدهنية الأنسجة مستودع (WAT):
    1. وضع على زوج جديد من القفازات حتى لا عبر تلويث بين مستودعات الدهون.
    2. الكشف عن الأربية، ومستودعات SQ الثلاثي من قبل دي تغطية بقفاز النصف السفلي من الماوس. عقد الزوائد العليا والصدر في يد واحدة وسحب الجلد إلى أسفل نحو القدمين مع جهة أخرى.
    3. توجيه الماوس في موقف ضعيف مع الحرص على عدم تلوث مستودع يتعرض مع الشعر.
    4. surgica نظيفةأدوات لتر والتغيير إلى زوج جديد من القفازات.
    5. تشريح بعناية المثلثات من الدهون SQ. يجب الحرص على عدم تلويث العينة مع العضلات، والدهون والغدد الثديية المجاورة أو عن طريق قطع أي السفن وتلوث العينة مع الدم.
      ويوصى باستخدام المجهر تشريح إذا لم يتم تعريف الحدود بشكل واضح: ملاحظة.
    6. إزالة مخازن الدهون ونقل إلى 2 مل أنابيب microcentrifuge.
    7. إذا RNA أو البروتين هو ليكون استخراجه، وتجميد الأنسجة عن طريق الغمر في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C. تجميد العينة في وقت واحد لمنع تدهور.
    8. لتلطيخ، إصلاح أو تضمين في أكتوبر إذا زراعة، وتغطي الأنسجة في DMEF-12 وتعيين على الجليد حتى يتم جمع جميع العينات للثقافة (معلومات إضافية).
  3. عزل نوعين من الدهون الحشوية الدهنية الأنسجة (VAT) والأبيض الدهنية الأنسجة (WAT) مستودع:
    1. وضع على زوج جديد من القفازات حتى لا عبر تلويث بين مستودعات الدهون.
    2. مع الخيال العلميssors، وقطع الصفاق بشكل مستعرض، مباشرة تحت الحجاب الحاجز. قطع الصفاق من الحجاب الحاجز إلى منتصف المستقيم coronally لفضح أعضاء البطن.
    3. تحديد موقع الخصية أو المبيض وتحديد المرفقة الأنسجة الدهنية البيضاء، والمعروفة باسم الدهنية بربخي في الذكور أو الدهنية الغدد التناسلية عند الإناث.
    4. الأدوات الجراحية النظيفة وتغير إلى زوج جديد من القفازات
    5. تشريح بعناية على حد سواء مستودعات الدهون بربخي من الخصيتين، epididymides، والأوعية الناقلة. أو إذا كان أنثى، تشريح بعناية كل من منصات الدهون الغدد التناسلية من المبيض.
    6. إزالة مخازن الدهون وتحويلها إلى 2 مل أنابيب ميكروسنتريفوج.
    7. إذا RNA أو البروتين هو ليكون استخراجه، وتجميد الأنسجة عن طريق الغمر في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C. تجميد العينة في وقت واحد لمنع تدهور.
    8. لتلطيخ، إصلاح أو تضمين في أكتوبر إذا زراعة، وتغطي الأنسجة في DMEF-12 وتعيين على الجليد حتى يتم جمع جميع العينات للثقافة (معلومات إضافية).

    3. عزل المحيطة بالأوعية الدهنية الأنسجة (PVAT)

    1. العزلة من القلب:
      1. وضع الماوس في موقف ضعيف مع الزوائد العلوية والسفلية الممتدة إلى الخارج.
      2. الزوائد آمنة باستخدام الشريط الجراحية.
      3. بعد تحديد المواقع الماوس كما المذكورة أعلاه، وخلق التوتر من خلال رفع حتى على عملية الخنجري مع ملقط. قطع أفقيا من خلال الحجاب الحاجز، ويعرض الجزء السفلي من التجويف الصدري.
      4. مع الحفاظ على التوتر، من خلال رفع حتى على عملية الخنجري، قطع طريق القفص الصدري متفوق نحو الرأس، فقط لجانب من عظمة القص.
      5. التقاط القفص الصدري فقط أقل شأنا من الترقوة، وقطع على طول أدنى من الترقوة من نحو الإبطين في كلا الاتجاهين. وينبغي أن يكون التجويف الصدري ومحتوياته (القلب، الرئتين، الخ) الآن واضحة للعيان.
      6. تنظيف التجويف الصدري من الدم دخيلة والسوائل باستخدام الجا معقمuze لامتصاص السوائل. إذا جمع الأجهزة أو الأوعية يجب التأكد من وافر (معلومات إضافية).
      7. مرة واحدة يتم مسح المنطقة من السوائل، وقطع الأوعية القصبات الهوائية وربط لإزالة الرئتين، مما يسمح التعرض أفضل للقلب.
    2. تعريب واستئصال الأبهر المحيطة بالأوعية الدهنية الأنسجة (PVAT):
      1. إزالة الأجهزة التالية من أجل تحديد أفضل الأجزاء السفلية من الشريان الأورطي: الكبد والمعدة والطحال والبنكرياس والأمعاء والقولون.
      2. أولا نبدأ مع تحديد المعدة والمريء. قطع المريء عند تقاطع المعدي المريئي لتحرير المعدة من الجسم.
      3. وبعد ذلك، التعرف على الأمعاء ومساريق المحيطة بها. قطع سطحي من خلال مساريق، كما أنها تقع بشكل وثيق جدا إلى الجزء الكلوي من الشريان الأبهر، ثم "تشغيل الامعاء."
      4. قطع القولون تحرير أقرب إلى المستقيم ممكن. وهكذا، وتحرير المعدة والأمعاء والقولون من الماوس.
      5. إعادةتحريك المعدة والأمعاء والقولون والبنكرياس والطحال من خلال قطع مساريق إرفاق والسفن. البنكرياس والطحال يجب أن تأتي مجانا مع المعدة والأمعاء والقولون.
      6. إزالة الكبد من خلال قطع الأوردة الكبدية وربط مساريق، وإزالة كل الفصوص.
      7. قطع بعيدا الطبقة الحشوية والدهون تحيط الكلى. ترك الكلى تعلق على الشريان الأورطي في الجسم الحي لتكون بمثابة علامات الجغرافية لشرائح مختلفة من الشريان الأورطي.
      8. شطف المنطقة مع معقم برنامج تلفزيوني 1X وإزالة جميع السوائل عن طريق امتصاص مع شاش معقم.
      9. باستخدام مقص الصغرى وملقط الدقيقة، فصل الشريان الأورطي من التعلق الظهري للعمود الفقري والتعلق بطني لالمريء.
      10. عزل الشريان الأورطي عن طريق اتباع وفصل الشريان الأورطي طول الشريان الأورطي النازل من الأصل في القلب إلى التشعب في المنطقة الحرقفي.
      11. تحديد وعزل السفن تحت الترقوة. عزل هذه السفنمن الرقبة إلى جذر الأبهر لفضح أفضل تقاطع الأبهر والجذور في القلب.
      12. إزالة الغدة الصعترية ثم قطع الشريان العضدي الرأسي، والشريان السباتي المشترك اليسار، والشريان تحت الترقوة الأيسر، مما يسمح للحركة القلب.
      13. بمساعدة المجهر تشريح، عرض الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية (PVAT) طبقة المحيطة الشريان الأورطي.
      14. مع الحرص الشديد على عدم قرصة أو الضغط على PVAT، بلطف سحب الطريق PVAT من الشريان الأورطي مع ملقط الدقيقة. خفض بلطف المرفق من PVAT إلى الشريان الأورطي مع مقص الصغرى بدءا من منطقة الصدر فقط متفوقة إلى حيث يقع الحجاب الحاجز.
        ملاحظة: ينصح المجهر تشريح.
      15. كرر هذه العملية على طول الشريان الأورطي، والانتهاء في المنطقة الأبهر infrarenal، التي تقع على بعد متفوقة على التشعب الحرقفي السفينة الأبهر.
      16. إذا كان المطلوب قوس الأبهر PVAT، وتستخدم نفس الأسلوب لإزالة PVAT من أقل جurvature من القوس.
      17. وضع عينات PVAT إلى 2 مل أنبوب microcentrifuge (ق).
      18. إذا RNA أو البروتين هو ليكون استخراجه، وتجميد الأنسجة عن طريق الغمر في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C. تجميد العينة في وقت واحد لمنع تدهور. إذا زراعة، وتغطي الأنسجة في DMEF-12 وتعيين على الجليد حتى يتم جمع جميع العينات للثقافة (معلومات إضافية).
        ملاحظة: مستودعات الدهنية إضافية للنظر اذا كانت مهتمة في تحليل شامل مستودع الدهنية وتشمل: خلف الصفاق، المساريقي، ثربي، التامور والمأبضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تحقق تحديد الهوية، وتوطين الدهنية تحت الجلد الإربي، الدهنية البني بين الكتفين، الحشوية الدهنية بربخي (الشكل 1)، وكذلك الدهنية قوس الأبهر ماحول الأوعية، الدهنية الأبهر الصدري، الدهنية الأبهري الكظري والدهنية الأبهر infrarenal (الشكل 2) بنجاح باستخدام طريقة جراحية وصفها. تم تقييم الفحص النسيجي والتمايز بين العينات BAT وWAT إيجابيا باستخدام الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ (الشكل 3). تحليل مستويات RNA من اديبونيكتين (AdipoQ)، بيروكسية تنشيط مستقبلات غاما ناشر (PPAR-γ)، تم قياس خلية الموت الذي يحفز DFFA مثل المستجيب ل(CIDEA)، والدهون الأخرى علامات محددة لجميع مستودعات معزولة ورفعه أعلاه (لا تظهر البيانات).

وكانت خطوط الخلايا الأولية من الخلايا الشحمية تحت الجلد والخلايا الشحمية المحيطة بالأوعية مثقف ومتباينة من preadipocyte الصورة إلى الخلايا الشحمية بنجاح لتحليل ميكروأري. وقد أكدت preadipocytes مثقف تحويلها إلى الخلايا الشحمية مع النفط الأحمر O تلطيخ (الشكل 4). وقد تحقق نجاحا العزلة والثقافة وتمايز الخلايا الشحمية للاستخدام في الدراسات في المختبر، وتم قياس نشاط البروتين بنجاح. وقد تم قياس النشاط الأنزيمي من المصفوفة metaloprotease-2 (MMP2) في مجموعة العلاج مقارنة بالمجموعة الضابطة. وقد تم قياس نشاط MMP2 في الموقع في خط خلية شحمية ماحول الأوعية الأولية عبر zymography (الشكل 5).

الشكل (1)
الشكل 1. المواقع التشريحية من C57BL / 6 الذكور مستودعات الماوس الدهنية. (A) بين الكتفين الدهنية البني مستودع الدهون. (B) الأربي الدهنية تحت الجلد مستودع الدهون. (C) بربخي الحشوية الدهون الدهنية مستودع.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. المواقع التشريحية مستودعات PVAT في C57BL / 6 الذكور الماوس. (A) الأبهر مستودع الدهنية قوس ماحول الأوعية. (B) الأبهر الصدري مستودع الدهنية ماحول الأوعية. (C) الكظرية الأبهر مستودع الدهنية ماحول الأوعية. (D) Infrarenal الأبهر مستودع الدهنية ماحول الأوعية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. H & E تلطيخ BAT وWAT الدهنية. (A) H 8؛ E تلطيخ بارافورمالدهيد الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من C57BL / 6 عينة الماوس الذكور الدهنية WAT في التكبير 40X (B) H & E تلطيخ بارافورمالدهيد الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من C57BL / 6 عينة الماوس الذكور من BAT في التكبير 40X. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. النفط الأحمر O تلطيخ preadipocytes PVAT مثقف والخلايا الشحمية. (A) النفط الأحمر O تلطيخ للمثقف preadipocytes المحيطة بالأوعية الأبهر في الأساس من التمايز في 20X التكبير مع المرحلة التباين. (B) زيت الأحمر O تلطيخ للمثقف الخلايا الشحمية المحيطة بالأوعية الأبهر بعد 5 أيام من التمايز في 20X التكبير مع المرحلة التباين.وفاق / ftp_upload / 52174 / 52174fig3highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. Zymography من الخلايا الشحمية متباينة، معزولة عن الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية، أظهرت النشاط انخفض من MMP2 صدر بعد العلاج مقارنة مع غير المعالجة (السيطرة) الخلايا، * P <0.01 بالمقارنة مع السيطرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

السمنة يمكن أن يؤدي إلى مجموعة واسعة من الحالات المرضية وفهم كامل للدور الذي الدهنية ليست مفهومة تماما يلعب. وبالتالي مواصلة البحث في مجال الدهنية أمر ضروري. النماذج الحيوانية، وتحديدا نماذج الفئران هي مثالية للبحث الأولي في تطور الأمراض واختبار العلاجات الدوائية المحتملة. في استخدام هذه النماذج، والعزلة دقيقة واستئصال مستودعات الدهنية هي أداة هامة للغاية وضرورية في دراسة علم الأمراض من الأمراض الدهنية المتضررة.

في الأدب الحالي فيما يتعلق مستودعات الدهنية، هناك كمية كبيرة من الأدبيات المتعلقة السلوك الأيض والاختلاف بين مستودعات الدهنية، وكذلك مواقعها التشريحية. ومع ذلك، هناك عدد قليل التي توفر طريقة متعمقة حول كيفية ترجمة على وجه التحديد، وتحديد، وعزل هذه المستودعات. واستنادا إلى استعراض أساليب العزلة الحالية الدهنية، وهناك مجموعة فرعية صغيرة من بروتوكولات رقبعة توفر منهجية بشأن كيفية عزل واحد أو اثنين من مستودعات في وقت واحد. ومع ذلك، وهي تقنية دقيقة التي تسمح لعزل مستودعات متعددة مع كمية ضئيلة من تشريح والتلوث، وكذلك عناوين أساليب مختلفة لدراسة العينات التي تم جمعها هي مميزة لهذا البروتوكول 13-14.

ضمن هذه المنهجية، هناك العديد من الخطوات التي هي حيوية مهمة للعزلة ونقاء العينة. تنظيف الأدوات، والقفازات والسطوح كثير من الأحيان لإزالة الشعر والملوثات هي خطوة حتمية لتجنب تلوث مستودع. عندما قطع الجلد بشكل مستعرض حول محيط من الماوس لفضح الصفاق للحب، فمن الأهمية بمكان لتجنب قطع عميق جدا. وقطع الصفاق جعل لحب صعبة للغاية وسوف ترفع احتمال تلوث للعينة. عندما استئصال مستودعات SQ الدهنية فمن الأهمية بمكان لتحديد حدود مثلثة من مستودع قبل استئصال أي من الإعلانipose. أيضا، ينبغي خفض متأنية لتجنب العضلات، والمتاخمة الأوعية والغدد الدهنية و. هذا سوف يمنع تلوث العينة من الدهنية بديل، الأنسجة الغدية والعضلات أو الدم.

فإن القيود الرئيسية إلى العزلة واستئصال مستودعات الدهنية، في هذه الطريقة وطرق أخرى مماثلة يمكن العثور عليها في تعريف لحدود معينة مستودعات. بسبب الحدود غير المحددة بوضوح في مستودعات، مثل مستودعات تحت الجلد، والعزلة التي تفتقر إلى كمية صغيرة من التلوث الناجم عن الدهنية المجاورة يمكن أن يكون تحديا. الحد أخرى يمكن العثور عليها في ضمان ما يكفي من الأنسجة التي يتم جمعها للتجريب التكميلي في الأوعية الدموية المرتبطة مستودعات. هذا القيد يتطلب أحيانا تجميع العينات، على الرغم من أن هذا يعتمد على الموقع من العزلة والنظام الغذائي المرتبطة الحيوان.

بعد عزل مستودعات الدهنية، فإنها يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من المقايسات. والدهنية يمكن أن يكون استخدامد للدراسات الجزيئية مثل التعبير البروتين، ونشاط انزيم وتحليل التعبير الجيني. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن عزل الخلايا الشحمية لخط الخلية الأولي في الدراسات المختبرية. ويمكن أيضا خطوط الخلايا خلده أن تستخدم للدراسات في المختبر، ولكن خلايا خالدة ليست ذات مصداقية مثل خطوط الخلايا المعزولة الأولية. وأخيرا، فإن الدهنية يمكن أن تكون ثابتة أو تجميدها في أكتوبر للفحص النسيجي لتحديد تسلل الكريات البيض، بروتين التعريب، وكذلك توصيف خلية شحمية التشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% Ethanol Fisher 07-678-001
DMEF-12 Sigma Aldrich D-6421 Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes Midsci MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ogden, C. L., Carroll, M. D., Kit, B. K., Flegal, K. M. Prevalence of obesity in the United States, 2009-2010. NCHS Data Brief. 82, 1-8 (2012).
  2. Flegal, K. M., Carroll, M. D., Kit, B. K., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and trends in the distribution of body mass index among US adults, 1999-2010. 307, (5), 491-497 (2012).
  3. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical care costs of obesity: an instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31, (1), 219-230 (2012).
  4. Obesity accounts for 21 percent of U.S. health care costs, study finds. Cornell University. Available from: http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120409103247.htm (2012).
  5. Marder, W., Chang, S. Childhood Obesity: Costs, Treatment Patterns, Disparities in Care, and Prevalent Medical Conditions. Thomson Medstat Research Brief. (2006).
  6. Cortez, M., Carmo, L. S., Rogero, M. M., Borelli, P., Fock, R. A. A high-fat diet increases IL-1, IL-6, and TNF-α production by increasing NF-κB and attenuating PPAR-γ expression in bone marrow mesenchymal stem cells. Inflammation. 36, (2), 379-386 (2013).
  7. Sanchez-Gurmaches, J., Hung, C. M., Sparks, C. A., Tang, Y., Li, H., Guertin, D. A. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metab. 16, (3), 348-362 (2012).
  8. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. J Lipid Res. 48, (6), 1253-1262 (2007).
  9. Aarsland, A., Chinkes, D., Wolfe, R. R. Hepatic and whole-body fat synthesis in humans during carbohydrate overfeeding. Am J Clin Nutr. 65, (6), 1774-1782 (1997).
  10. Park, A., Kim, W. K., Bae, K. H. Distinction of white, beige and brown adipocytes derived from mesenchymal stem cells. World J. Stem Cells. 6, (1), 33-42 (2014).
  11. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and. 150, (2), 366-376 (2012).
  12. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, (9), 2992-3000 (2013).
  13. Casteilla, L., Pénicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods Mol. Biol. 456, 23-38 (2008).
  14. Grant, R., Youm, Y. H., Ravussin, A., Dixit, V. D. Quantification of adipose tissue leukocytosis in obesity. Methods Mol. Biol. 1040, 195-209 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics