स्थानीयकरण, पहचान, और छांटना Murine वसा डिपो की

Medicine

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Summary

कारण मोटापा और अन्य comorbidities के बीच कठोर और नकारात्मक कनेक्शन के लिए, भूमिका वसा पर अनुसंधान रोग में खेलता है और समग्र स्वास्थ्य warranted है। हम अलगाव और बगल में उपयोग करते हुए वसा के अध्ययन के लिए अनुमति वसा डिपो के छांटना के लिए और इन विट्रो विधियों में एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

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Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J. Vis. Exp. (94), e52174, doi:10.3791/52174 (2014).

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Abstract

Introduction

वसा की वजह से 20 वीं सदी के पिछले कुछ दशकों के दौरान मोटापे की नाटकीय वृद्धि करने के लिए, मीडिया की सुर्खियों में एक उल्लेखनीय उपस्थिति बनाया है। मोटापे की वजह से वर्तमान में वयस्कों में से एक-तिहाई और संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका) 1 में बच्चों और किशोरों के 17% से अधिक प्रभावित करता है। सभी जातीय समूहों फैले, मोटापा महामारी आसपास के सांख्यिकीय अनुसंधान मैक्सिकन अमेरिकियों (40.4%), सभी हिस्पैनिक्स (39.1%), और गैर के साथ तुलना में गैर हिस्पैनिक अश्वेतों मोटापा (49.5%) के उच्चतम आयु-समायोजित दर है कि दिखाया गया है हिस्पैनिक सफेद (34.3%) 2। मोटापे के आर्थिक प्रभाव भी स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली के लिए एक बढ़ती चिंता का विषय है। 2012 में, यह 2005 में अमेरिका में मोटापे के लिए देखभाल की वार्षिक चिकित्सा लागत $ 190,200,000,000, समग्र चिकित्सा खर्च के बजट का लगभग 21% था कि अनुमान लगाया गया था। अफसोस की बात है, बचपन का मोटापा अकेले प्रत्यक्ष चिकित्सा लागत 14 अरब डॉलर के लिए जिम्मेदार होने का अनुमान लगाया गया था। सांख्यिकीय, यह की औसत चिकित्सा लागत कि निर्धारित किया गया थामोटापे के साथ व्यक्तियों को इस रुग्णता 3-5 बिना उन लोगों की तुलना में अधिक $ 2741 एक वर्ष था।

टाइप 2 मधुमेह, dyslipidemia, हृदय रोग, कैंसर, मांसपेशियों कंकाल विकारों और जीर्ण सूजन: मोटापा जैसे स्थितियों की एक किस्म के लिए एक बड़ा जोखिम कारक है। मोटापे की वजह से गहरा उपापचयी सिंड्रोम और अन्य पुरानी बीमारियों 6-8 के रोगजनन से जुड़ा हुआ है। मोटापा और अन्य comorbidities के बीच इस तरह के कठोर और नकारात्मक कनेक्शन के साथ, वैज्ञानिक अनुसंधान बेहतर मौजूदा महामारी और वसा द्वारा निभाई विविध और निर्णायक भूमिका को समझने के लिए ध्यान केंद्रित किया है।

ऐतिहासिक, वसा ऊतकों अप्रासंगिक माना जाता था और एक साधारण भरने के ऊतकों के रूप में केवल देखा गया था। चयापचय, हार्मोन विनियमन, सूजन, संरक्षण और इन्सुलेशन 9: वर्तमान में, वसा में शरीर के समारोह में कई आवश्यक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। वसा ऊतकों में मुख्य रूप से बना हैadipocytes लेकिन यह भी pericytes, endothelial कोशिकाओं, monocytes, मैक्रोफेज और स्टेम सेल आठ में शामिल है। वसा ऊतकों अलग डिपो में पूरे शरीर में वितरित किया जाता है। प्रिंसिपल डिपो subcutaneously, intramuscularly, subdermally पाया, और viscerally 10 किया जा सकता है। वसा डिपो विकारों 8 मोटापे के लिए एक डिपो विशिष्ट संवेदनशीलता दिखाया गया है और संबंधित है जो डिपो विशिष्ट चयापचय प्रोफाइल, है करने के लिए दिखाया गया है।

परंपरागत रूप से, वसा ऊतकों के दो प्रमुख प्रकार में वर्गीकृत किया गया है: सफेद वसा ऊतकों (वाट) और भूरे वसा ऊतकों (बैट); हाल ही में साहित्य को इंगित करता है, हालांकि एक तीसरा समूह की मौजूदगी Brite या बेज वसा 11 नाम। वसा ऊतकों अलग अलग रंग, morphologies, चयापचय कार्यों, जैव रासायनिक सुविधाओं और अभिव्यक्ति 10 की आनुवंशिक पैटर्न है दिखाया गया है। वाट में adipocytes एक एकल, बड़े लिपिड छोटी बूंद और माइटोकॉन्ड्रिया के चर मात्रा में है। वाटमुख्यतः शरीर के चमड़े के नीचे और आंत इलाकों में पाया जाता है। मुख्य रूप से ऊर्जा भंडारण और अंग सुरक्षा की एक साइट के रूप में वाट कार्य करता है। बल्लेबाजी में adipocytes एक multilocular आकृति विज्ञान और प्रचुर मात्रा में माइटोकॉन्ड्रिया है। बैट मुख्य रूप से गर्दन और छाती की बड़ी रक्त वाहिकाओं, साथ ही scapulae 12 में स्थित है। Thermogenesis के 7 कि विनियमित ऊर्जा खपा व्यवहार में बैट मुख्य रूप से कार्य करता है। ब्राइट या बेज वसा बल्लेबाजी करने के लिए एक अनुरूप आकृति विज्ञान और अभिव्यक्ति का हिस्सा दिखाया गया है, लेकिन सफेद adipocytes 11 से उत्पन्न होने के लिए पाया गया है।

इस पांडुलिपि में वर्णित शल्य चिकित्सा पद्धति जैसे कारकों है कि अलग अलग प्रभाव का विश्लेषण करने की क्षमता के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है: पर्यावरण, फार्मास्यूटिकल्स, और आनुवंशिकी, वसा पर है; के रूप में अच्छी तरह से फायदेमंद है या हानिकारक भूमिका वसा रोग और समग्र स्वास्थ्य में नाटकों के रूप में। इसके अलावा, एक तरीका प्रदान की पहचान करने के लिए और वसा ऊतकों के विभिन्न प्रकार के अलग करने के लिएबेहतर करने के लिए अनुमति देने के डिपो के बीच जैव रासायनिक रिश्ते और मतभेदों का समझते हैं। यह शरीर के भीतर स्थान, समारोह, और वसा के प्रकार के बीच संबंध का पता लगाने में सहायता कर सकते हैं। यह वर्णित विधि में इन विट्रो अध्ययन के लिए सकल दृश्य, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, histological परीक्षा, और प्राथमिक सेल लाइनों के अलगाव के लिए साधन उपलब्ध कराने के द्वारा इस accomplishes। वर्तमान में विभिन्न वसा डिपो, साथ ही उनके शारीरिक स्थानों के चयापचय व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान कि कई लेख हैं; लेकिन विशेष रूप से, स्थानीयकरण की पहचान है, और इन डिपो को अलग-थलग करने के लिए पर एक में गहराई से विधि प्रदान नहीं करते हैं। इस शल्य चिकित्सा पद्धति एक या दो डिपो 13-14 से अलग के लिए बनाया गया दूसरों के तरीकों की तुलना में विच्छेदन और प्रदूषण की एक न्यूनतम मात्रा के साथ कई डिपो के अलगाव के लिए अनुमति देता है कि एक सटीक तकनीक प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को प्रदान करने के लिए हैकई शारीरिक स्थानों से वसा डिपो के विभिन्न प्रकारों की पहचान और अलगाव के लिए एक सटीक तरीका।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं सिनसिनाटी विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और (एनआईएच प्रकाशन कोई स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया । 85-23), 1996 संशोधित।

1. Euthanize और माउस जीवाणुरहित

  1. Isoflurane की एक supratheraputic खुराक युक्त एक ड्रॉपबॉक्स में माउस प्लेस और प्रभाव के लिए श्वास की अनुमति है। माउस euthanized है एक बार, बॉक्स से हटा दें।
  2. Cervically इच्छामृत्यु का एक दूसरा साधन के रूप में हटाना।
  3. 70% इथेनॉल के साथ जानवरों की सफाई से माउस की बाहरी सतह जीवाणुरहित।

2. पहचान और तीन अलग अलग वसा डिपो का अलगाव

  1. भूरा वसा ऊतकों (बैट) अलगाव:
    1. यकीन फर एपिडर्मल और चमड़े का लेय के माध्यम से काटने में सहायता करने के लिए शराब की सफाई से गीला है बनाओरुपये।
    2. मेज के खिलाफ अपनी पीठ के साथ एक लापरवाह स्थिति में माउस की स्थिति।
    3. सिर्फ संदंश, लिफ्ट के साथ डायाफ्राम के नीचे त्वचा को पकड़ो और कैंची से काटकर अलग कर देना।
    4. पेरिटोनियम बेनकाब करने के लिए माउस की परिधि के आसपास transversely काटें।
    5. माउस के शीर्ष आधा degloving से तितली के आकार का बैट डिपो प्रकट करते हैं। एक हाथ में कम उपांग और पेट पकड़ और सिर की ओर त्वचा खींच रहा है।
    6. यह मेज पर प्रवण स्थिति में है, इसलिए है कि माउस पूरबी। बालों के साथ उजागर डिपो को दूषित करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
    7. स्वच्छ शल्य चिकित्सा उपकरणों और दस्ताने की एक ताजा जोड़ी को बदलें।
    8. Scapulae और इसी डिपो का पता लगाएँ। ध्यान से तितली के ऊपर किसी भी सतही सफेद वसा को हटाने और फिर interscapular भूरा वसा की तितली काटना। बारीकी से भूरा वसा के साथ जुड़े पेशी से बचने के लिए सावधान रहें।
      नोट: एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग डब्ल्यू को हटाने के लिए सिफारिश की हैHite वसा, साथ ही scapulae से भूरे वसा की जुदाई में।
    9. वसा डिपो निकालें और एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण।
    10. शाही सेना या प्रोटीन निकाला जा रहा है, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में विसर्जन से ऊतक फ्रीज। गिरावट को रोकने के लिए एक ही बार में नमूना रुक। संवर्धन, तो DMEF-12 में ऊतक को कवर किया और सभी नमूनों संस्कृति (पूरक जानकारी) के लिए एकत्र कर रहे हैं जब तक बर्फ पर निर्धारित किया है।
  2. चमड़े के नीचे वसा ऊतकों (वर्ग) के अलगाव, एक सफेद वसा ऊतकों डिपो (वाट):
    1. वसा डिपो के बीच नहीं पार दूषित करने के लिए के रूप में दस्ताने की एक ताजा जोड़ी पर डाल दिया।
    2. वंक्षण, माउस के नीचे आधा de-gloving द्वारा त्रिकोणीय वर्ग डिपो प्रकट करते हैं। एक हाथ में ऊपरी उपांग और छाती पकड़ो और दूसरे हाथ से पैर की ओर नीचे त्वचा खींच रहा है।
    3. बालों के साथ उजागर डिपो को दूषित करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, जबकि एक लापरवाह स्थिति में माउस पूरबी।
    4. स्वच्छ surgicaदस्ताने की एक ताजा जोड़ी को एल उपकरणों और बदलते हैं।
    5. सावधानी वर्ग वसा का त्रिकोण काटना। वसा, स्तन ग्रंथियों पड़ोसी, मांसपेशियों के साथ नमूना दूषित या किसी वाहिकाओं में कटौती करके और रक्त के साथ नमूना दूषित करने के लिए नहीं सावधान रहो।
      नोट: सीमाओं को स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं कर रहे हैं अगर एक विच्छेदन खुर्दबीन के उपयोग की सिफारिश की है।
    6. वसा डिपो निकालें और 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण।
    7. शाही सेना या प्रोटीन निकाला जा रहा है, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में विसर्जन से ऊतक फ्रीज। गिरावट को रोकने के लिए एक ही बार में नमूना रुक।
    8. धुंधला के लिए, ठीक है या अक्टूबर में एम्बेड। संवर्धन, तो DMEF-12 में ऊतक को कवर किया और सभी नमूनों संस्कृति (पूरक जानकारी) के लिए एकत्र कर रहे हैं जब तक बर्फ पर निर्धारित किया है।
  3. Gonadal फैट एक आंत वसा ऊतकों (वैट) और सफेद वसा ऊतकों (वाट) डिपो का अलगाव:
    1. वसा डिपो के बीच नहीं पार दूषित करने के लिए के रूप में दस्ताने की एक ताजा जोड़ी पर डाल दिया।
    2. एससीआई के साथssors, सीधे डायाफ्राम नीचे, transversely पेरिटोनियम काटा। Coronally पेट अंगों को बेनकाब करने के लिए मलाशय मध्य डायाफ्राम से पेरिटोनियम काटें।
    3. वृषण या अंडाशय का पता लगाएँ और महिलाओं में अधिवृषणी पुरुषों में वसा या जननांगों वसा के रूप में जाना संलग्न सफेद वसा ऊतकों की पहचान।
    4. दस्ताने की एक ताजा जोड़ी को स्वच्छ शल्य चिकित्सा उपकरणों और परिवर्तन
    5. ध्यान से वृषण, epididymides, और वासा deferentia से अधिवृषणी वसा डिपो दोनों काटना। या महिला हैं, तो ध्यान से अंडाशय से दोनों जननांगों वसा पैड काटना।
    6. वसा डिपो निकालें और 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण।
    7. शाही सेना या प्रोटीन निकाला जा रहा है, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में विसर्जन से ऊतक फ्रीज। गिरावट को रोकने के लिए एक ही बार में नमूना रुक।
    8. धुंधला के लिए, ठीक है या अक्टूबर में एम्बेड। संवर्धन, तो DMEF-12 में ऊतक को कवर किया और सभी नमूनों संस्कृति (पूरक जानकारी) के लिए एकत्र कर रहे हैं जब तक बर्फ पर निर्धारित किया है।

    Perivascular वसा ऊतकों के 3. अलगाव (PVAT)

    1. दिल का अलगाव:
      1. जावक बढ़ाया ऊपरी और निचले appendages के साथ एक लापरवाह स्थिति में माउस बाहर करना।
      2. सर्जिकल टेप का उपयोग कर सुरक्षित उपांग।
      3. उपरोक्त के रूप में माउस स्थिति के बाद, संदंश के साथ असिरूप प्रक्रिया पर ऊपर उठाने के द्वारा तनाव पैदा करते हैं। वक्ष गुहा के निचले हिस्से को उजागर, डायाफ्राम के माध्यम से क्षैतिज काटें।
      4. असिरूप प्रक्रिया पर ऊपर उठाने के द्वारा, तनाव को बनाए रखते हुए, बस उरोस्थि की ओर करने के लिए, सिर की ओर से ऊंचा ribcage के माध्यम से काटा।
      5. हंसली के लिए सिर्फ अवर रिब पिंजरे उठाओ, और दोनों दिशाओं में बगल की ओर बाहर हंसली के अवर लंबाई के साथ काटा। वक्ष गुहा और उसकी सामग्री (हृदय, फेफड़े, आदि) अब स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए।
      6. बाँझ गा उपयोग करके बाहरी रक्त और तरल पदार्थ के वक्ष गुहा साफuze तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए। इकट्ठा करने के अंगों या वाहिकाओं (पूरक जानकारी) विपुल के लिए सुनिश्चित हो सके।
      7. क्षेत्र तरल पदार्थ की मंजूरी दे दी है, एक बार दिल का बेहतर प्रदर्शन की इजाजत दी, फेफड़ों को दूर करने के ब्रांकाई और संलग्न वाहिकाओं में कटौती।
    2. स्थानीयकरण और छांटना महाधमनी के perivascular वसा ऊतकों (PVAT):
      1. जिगर, पेट, प्लीहा, अग्न्याशय, आंतों, और पेट: बेहतर महाधमनी के अवर भागों की पहचान के रूप में निम्नलिखित अंगों निकालें।
      2. सबसे पहले पेट और घेघा की पहचान के साथ शुरू करते हैं। शरीर से पेट मुक्त करने के लिए गैस्ट्रो esophageal जंक्शन पर घेघा काटें।
      3. अगला, आंतों और आसपास अन्त्रपेशी की पहचान। यह महाधमनी के गुर्दे हिस्से को बहुत बारीकी से झूठ के रूप में तो "आंत्र चला रहे हैं।", अन्त्रपेशी के माध्यम से अल्पज्ञता कट
      4. पेट के रूप में संभव मलाशय के करीब मुक्त काटें। इस प्रकार, माउस से पेट, आंत और पेट मुक्त।
      5. फिर सेसंलग्न अन्त्रपेशी और जहाजों के माध्यम से काटने से पेट, आंत, पेट, अग्न्याशय और तिल्ली चाल है। अग्न्याशय और तिल्ली पेट, आंत और पेट के साथ मुक्त करने के लिए आना चाहिए।
      6. सभी खण्डों को हटाने, अन्त्रपेशी यकृत नसों के माध्यम से काटने और संलग्न द्वारा जिगर निकालें।
      7. आंत परत दूर कटौती और वसा गुर्दे के चारों ओर। महाधमनी के विभिन्न वर्गों के लिए भौगोलिक मार्कर के रूप में सेवा करने के लिए vivo में महाधमनी से जुड़ी गुर्दे छोड़ दें।
      8. बाँझ 1x पीबीएस के साथ क्षेत्र कुल्ला और एक बाँझ धुंध के साथ अवशोषण द्वारा सभी तरल पदार्थ को हटा दें।
      9. सूक्ष्म कैंची और सूक्ष्म संदंश का प्रयोग, रीढ़ की हड्डी को अपने पृष्ठीय लगाव और घेघा के लिए अपने उदर लगाव से महाधमनी अलग।
      10. निम्न और श्रोणि क्षेत्र में विभाजन करने के लिए दिल में मूल से महाधमनी उतरते महाधमनी की लंबाई निकाल कर महाधमनी पृथक।
      11. पहचानें और अवजत्रुकी वाहिकाओं को अलग। इन जहाजों को अलग-थलगमहाधमनी जड़ को गर्दन से बेहतर दिल में महाधमनी जंक्शन और जड़ को बेनकाब करने के लिए।
      12. फिर थाइमस निकालें दिल की आवाजाही की इजाजत दी, प्रगंडशीर्षी धमनी, बाईं आम मन्या धमनी, और बाईं अवजत्रुकी धमनी में कटौती।
      13. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की सहायता के साथ, महाधमनी आसपास के परिवाहकीय वसा ऊतकों (PVAT) परत देखें।
      14. चुटकी या PVAT निचोड़, धीरे सूक्ष्म संदंश के साथ महाधमनी से PVAT रास्ता नहीं खींच लिए महान देखभाल। धीरे डायाफ्राम स्थित है, जहां सिर्फ बेहतर वक्ष क्षेत्र में शुरू सूक्ष्म कैंची से महाधमनी को PVAT की कुर्की काटा।
        ध्यान दें: एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की सिफारिश की है।
      15. महाधमनी पोत के श्रोणिफलक विभाजन करने के लिए सिर्फ बेहतर स्थित है जो infrarenal महाधमनी क्षेत्र में परिष्करण, इस प्रक्रिया को महाधमनी की पूरी लंबाई को दोहराएँ।
      16. महाधमनी चाप PVAT वांछित है, कम से सी PVAT दूर करने के लिए एक ही विधि का इस्तेमाल कियामेहराब के urvature।
      17. 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (ओं) में PVAT नमूने रखें।
      18. शाही सेना या प्रोटीन निकाला जा रहा है, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में विसर्जन से ऊतक फ्रीज। गिरावट को रोकने के लिए एक ही बार में नमूना रुक। संवर्धन, तो DMEF-12 में ऊतक को कवर किया और सभी नमूनों संस्कृति (पूरक जानकारी) के लिए एकत्र कर रहे हैं जब तक बर्फ पर निर्धारित किया है।
        नोट: एक व्यापक वसा डिपो विश्लेषण में रुचि रखते अगर अतिरिक्त वसा डिपो पर विचार करने में शामिल हैं: retroperitoneal, मेसेंतेरिक, omental, पेरिकार्डियल और घुटने की चक्की।

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Representative Results

पहचान, और वंक्षण चमड़े के नीचे वसा, interscapular भूरा वसा, आंत अधिवृषणी वसा (चित्रा 1), साथ ही महाधमनी चाप परिवाहकीय वसा, वक्ष महाधमनी वसा, suprarenal महाधमनी वसा और infrarenal महाधमनी वसा का स्थानीयकरण (चित्रा 2) का उपयोग करते हुए सफलतापूर्वक हासिल की थी वर्णित शल्य चिकित्सा पद्धति है। बैट और वाट नमूनों के बीच histological परीक्षा और भेदभाव सकारात्मक धुंधला (चित्रा 3) hematoxylin और eosin (एच एंड ई) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। कोशिका मृत्यु उत्प्रेरण DFFA-जैसे प्रेरक एक (CIDEA), और अन्य वसा विशिष्ट मार्करों सब से ऊपर और अलग excised डिपो के लिए मापा गया एडिपोनेक्टिन (AdipoQ), peroxisome proliferator सक्रिय रिसेप्टर गामा (PPAR-γ), की शाही सेना के स्तर का विश्लेषण (डेटा) नहीं दिखाया।

चमड़े के नीचे adipocytes और परिवाहकीय adipocytes की प्राथमिक सेल लाइनों सुसंस्कृत और preadipocyte से भेदभाव कर रहे थे सफलतापूर्वक माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए adipocytes करने के लिए। adipocytes करने के लिए परिवर्तित सुसंस्कृत preadipocytes तेल रेड हे धुंधला (चित्रा 4) के साथ की पुष्टि की थी। सफल अलगाव, संस्कृति और adipocytes के भेदभाव में इन विट्रो अध्ययन में उपयोग के लिए प्राप्त किया गया था, और प्रोटीन की गतिविधि सफलतापूर्वक मापा गया था। मैट्रिक्स metaloprotease -2 (MMP2) के enzymatic गतिविधि नियंत्रण की तुलना में एक इलाज के समूह में मापा गया था। MMP2 की गतिविधि zymography (चित्रा 5) के जरिए एक प्राथमिक परिवाहकीय adipocyte लाइन में बगल में मापा गया था।

चित्रा 1
चित्रा C57BL 6 / पुरुष माउस वसा डिपो की 1. शारीरिक स्थानों। (ए) Interscapular भूरा वसा वसा डिपो। (बी) वंक्षण चमड़े के नीचे वसा वसा डिपो। (सी) आंत अधिवृषणी वसा वसा डिपो।w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा एक C57BL 6 / पुरुष माउस में PVAT डिपो की 2. शारीरिक स्थानों। (ए) महाधमनी चाप परिवाहकीय वसा डिपो। (बी) छाती रोगों महाधमनी परिवाहकीय वसा डिपो। (सी) Suprarenal महाधमनी परिवाहकीय वसा डिपो। (डी) Infrarenal महाधमनी परिवाहकीय वसा डिपो। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
बैट और वाट वसा की चित्रा 3. एच एंड ई धुंधला हो जाना। (ए) एच 8; एक 40x बढ़ाई वाट वसा की, आयल एम्बेडेड C57BL 6 / पुरुष माउस नमूना तय paraformaldehyde के ई धुंधला तय paraformaldehyde के (बी) एच एंड ई धुंधला हो जाना, एक 40x बढ़ाई पर बल्लेबाजी की आयल एम्बेडेड C57BL 6 / पुरुष माउस नमूना।। कृपया क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
सुसंस्कृत PVAT preadipocytes और adipocytes 4. तेल रेड हे धुंधला चित्रा। चरण विपरीत साथ 20X बढ़ाई भेदभाव के आधार रेखा पर सुसंस्कृत महाधमनी परिवाहकीय preadipocytes (ए) तेल रेड हे धुंधला। (बी) के चरण विपरीत साथ 20X बढ़ाई भेदभाव के 5 दिनों के बाद सुसंस्कृत महाधमनी परिवाहकीय adipocytes का तेल रेड हे धुंधला।तों / ftp_upload / 52,174 / 52174fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
परिवाहकीय वसा ऊतकों से पृथक विभेदित adipocytes, चित्रा 5. Zymography, * पी ​​<0.01 नियंत्रण की तुलना में, अनुपचारित (नियंत्रण) कोशिकाओं की तुलना में उपचार के बाद जारी MMP2 की एक कम गतिविधि का प्रदर्शन किया।

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Discussion

मोटापा रुग्णता की एक बड़ी मेजबान और वसा को पूरी तरह से समझ नहीं है कि नाटकों भूमिका की पूरी समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं; वसा के क्षेत्र में इसलिए जारी रखा अनुसंधान आवश्यक है। पशु मॉडल, विशेष रूप से murine मॉडल रोगों और संभावित दवा उपचार के परीक्षण की प्रगति में प्रारंभिक अनुसंधान के लिए आदर्श होते हैं। इन मॉडलों का उपयोग करने में, सटीक अलगाव और वसा डिपो के छांटना वसा प्रभावित रोगों की विकृति विज्ञान के अध्ययन में एक अत्यंत महत्वपूर्ण और आवश्यक उपकरण है।

वसा डिपो के संबंध में वर्तमान साहित्य में, चयापचय व्यवहार और वसा डिपो के बीच भिन्नता है, साथ ही उनके शारीरिक स्थानों के बारे में साहित्य की एक पर्याप्त मात्रा में है। हालांकि, विशेष रूप से, स्थानीयकरण की पहचान है, और इन डिपो को अलग-थलग करने के लिए पर एक में गहराई से विधि प्रदान करते हैं कि कुछ कर रहे हैं। वसा की वर्तमान अलगाव के तरीकों की समीक्षा के आधार पर, प्रोटोकॉल टी के एक छोटे सबसेट नहीं हैटोपी एक बार में एक या दो डिपो को अलग करने के तरीके के बारे में कार्यप्रणाली प्रदान करते हैं। हालांकि, विच्छेदन और प्रदूषण की एक न्यूनतम मात्रा के साथ कई डिपो, साथ ही पतों एकत्र नमूनों का अध्ययन करने के विभिन्न तरीकों के अलगाव के लिए अनुमति देता है कि एक सटीक तकनीक इस प्रोटोकॉल 13-14 के लिए विशिष्ट है।

इस पद्धति के भीतर, vitally के नमूने के अलगाव और शुद्धता के लिए महत्वपूर्ण हैं कि कई कदम उठाए हैं। बाल और contaminants को दूर करने के लिए अक्सर उपकरण, दस्ताने और सतहों सफाई डिपो संदूषण से बचने के लिए एक अनिवार्य कदम है। Degloving के लिए पेरिटोनियम बेनकाब करने के लिए माउस की परिधि के आसपास transversely त्वचा को काटने है, यह भी गहराई से काटने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। पेरिटोनियम काटना बहुत मुश्किल degloving कर देगा और नमूना के प्रदूषण के लिए क्षमता को बढ़ा देंगे। वर्ग वसा डिपो excising जब यह विज्ञापन के किसी भी excising से पहले डिपो की त्रिकोणीय सीमाओं की पहचान के लिए महत्वपूर्ण हैipose। इसके अलावा, सावधान कटौती पेशी से बचने के लिए बनाया है, और जहाजों, ग्रंथियों और वसा आसन्न किया जाना चाहिए। इस वैकल्पिक वसा, ग्रंथियों के ऊतकों, मांसपेशियों या रक्त से नमूना के प्रदूषण को रोकने जाएगा।

अलगाव और इस विधि और अन्य तुलनीय तरीकों में वसा डिपो के छांटना के लिए प्रमुख सीमा निश्चित डिपो की सीमाओं की परिभाषित करने में पाया जा सकता है। कारण इस तरह के चमड़े के नीचे डिपो के रूप में डिपो में खराब परिभाषित सीमाओं करने के लिए, पड़ोसी वसा से संदूषण की एक छोटी राशि की कमी अलगाव चुनौतीपूर्ण हो सकता है। एक और सीमा संवहनी जुड़े डिपो में पूरक प्रयोग के लिए एकत्र किया जाता है पर्याप्त ऊतक को सुनिश्चित करने में पाया जा सकता है। इस अलगाव की साइट और जानवर के साथ जुड़े आहार पर निर्भर है, हालांकि यह सीमा कभी कभी, नमूनों की पूलिंग की आवश्यकता है।

वसा डिपो अलग कर रहे हैं के बाद, वे assays के एक किस्म के लिए उपयोग किया जा सकता है। वसा उपयोग किया जा सकता हैइस तरह के प्रोटीन अभिव्यक्ति, एंजाइम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के रूप में आणविक अध्ययन के लिए डी। इसके अतिरिक्त, एक इन विट्रो अध्ययन में प्राथमिक सेल लाइन के लिए adipocytes अलग कर सकते हैं। अमर कोशिकाओं लाइनें भी हालांकि अमर कोशिकाओं प्राथमिक पृथक सेल लाइनों के रूप में के रूप में विश्वसनीय नहीं कर रहे हैं, इन विट्रो अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, वसा या तय ल्युकोसैट घुसपैठ, प्रोटीन स्थानीयकरण, साथ ही adipocyte आकृति विज्ञान के लक्षण वर्णन की पहचान के लिए ऊतकीय परीक्षा के लिए अक्टूबर में जमे हुए किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% Ethanol Fisher 07-678-001
DMEF-12 Sigma Aldrich D-6421 Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes Midsci MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK

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