Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

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Summary

Durch die drastische und negative Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, Forschung über die Rolle Fettgewebe spielt in Krankheit und die allgemeine Gesundheit gerechtfertigt ist. Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Entfernung von Fettgewebe Depots ermöglicht die Untersuchung von Fettgewebe unter Verwendung von in situ und in vitro-Verfahren.

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Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J. Vis. Exp. (94), e52174, doi:10.3791/52174 (2014).

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Abstract

Introduction

Adipöse einen bemerkenswerten Auftritt im Scheinwerferlicht der Medien, durch dramatische Zunahme Adipositas ist in den letzten Jahrzehnten des 20. Jahrhunderts. Übergewicht wirkt sich auf derzeit mehr als ein Drittel der Erwachsenen und 17% der Kinder und Jugendlichen in den Vereinigten Staaten (US) 1. Quer durch alle ethnischen Gruppen hat statistische Untersuchungen rund um die Adipositas-Epidemie gezeigt, dass nicht-hispanischen Schwarzen haben die höchste altersbereinigte Rate von Übergewicht (49,5%) im Vergleich zu Mexico-Amerikaner (40,4%) aller Hispanics (39,1%), und nicht- hispanischen Weißen (34,3%) 2. Die wirtschaftlichen Auswirkungen von Übergewicht ist auch ein wachsendes Interesse für das Gesundheitssystem. Im Jahr 2012 wurde geschätzt, dass die jährlichen medizinischen Kosten für die Betreuung von Fettleibigkeit in den USA im Jahr 2005 190.200.000.000 $, fast 21% der gesamten medizinischen Ausgaben Budget. Leider wurde die Fettleibigkeit bei Kindern geschätzt 14 Milliarden Dollar im direkten medizinischen Kosten allein verantwortlich zu sein. Statistisch gesehen, war es, dass die durchschnittliche medizinische Kosten ermitteltPersonen mit Übergewicht war 2741 $ pro Jahr höher als die ohne diese Morbidität 3-5.

Übergewicht ist ein wichtiger Risikofaktor für eine Vielzahl von Erkrankungen wie: Typ 2-Diabetes, Fettstoffwechselstörungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Muskel-Skelett-Erkrankungen und chronischen Entzündungen. Adipositas ist tief mit der Pathogenese von metabolischen Syndrom und anderen chronischen Erkrankungen 6-8 gebunden. Mit solch drastische und negative Zusammenhänge zwischen Adipositas und anderen Begleiterkrankungen, hat die wissenschaftliche Forschung konzentrierte sich die Aufmerksamkeit auf die aktuelle Epidemie und die vielfältigen und eine entscheidende Rolle gespielt von Fettgewebe besser zu verstehen.

Historisch wurde Fettgewebe als belanglos und wurde nur als eine einfache Befüllung Gewebe angesehen. Derzeit Fettgewebe wurde gezeigt, dass viele wichtige Rollen in der Körper die Funktion spielen: Stoffwechsel, Hormonhaushalt, Entzündungen, Schutz und Isolierung 9. Fettgewebe ist in erster Linie ausAdipocyten enthält aber auch Perizyten, Endothelzellen, Monozyten, Makrophagen und pluripotenten Stammzellen 8. Fettgewebe wird durch den Körper in unterschiedlichen Depots verteilt. Die Hauptdepots können subdermal gefunden werden, subkutan, intramuskulär und viscerally 10. Adipose Depots gezeigt worden, Depot spezifische Stoffprofile, die eine Depot spezifische Anfälligkeit für Fettleibigkeit gezeigt und verwandten Störungen 8 haben.

Traditionell wurde Fettgewebe in zwei Haupttypen klassifiziert: weißes Fettgewebe (WAT) und braunem Fettgewebe (BAT); obwohl neuere Literatur zeigt die Präsenz einer dritten Gruppe getauft brite oder beige Fettgewebe 11. Fettgewebe ist gezeigt worden, um verschiedene Farben zu Morphologien, die Stoffwechselfunktionen, biochemischen Eigenschaften und die genetische Expressionsmuster 10 aufweisen. Adipozyten in WAT ein einziges, großes Fetttröpfchen und variable Mengen von Mitochondrien. WATdominant im subkutanen und viszeralen Ortschaften des Körpers gefunden. WAT wirkt in erster Linie als Ort der Energiespeicherung und Organprotektion. Adipozyten in BAT eine multilokuläre Morphologie und reichlich Mitochondrien. BAT ist in erster Linie in den Hals und großen Blutgefäße des Thorax, sowie die Schulterblätter 12 angeordnet. BAT vor allem Funktionen in energie aufwendet Verhaltensweisen, die Thermogenese 7 regulieren. Brite oder beige Fettgewebe wurde gezeigt, dass eine analoge Morphologie und Expression BAT teilen, aber hat sich herausgestellt, von weißen Fettzellen 11 entstanden ist.

Die beschriebene Operationsmethode in diesem Manuskript bietet Forschern mit der Fähigkeit, verschiedene Effekte, dass Faktoren wie zu analysieren: Umwelt, Pharmazie und Genetik, haben am Fettgewebe; sowie die vorteilhafte oder nachteilige Rolle spielt in adipose Erkrankungen und allgemeine Gesundheit. Auch bietet eine Möglichkeit zur Identifizierung und Isolierung verschiedener Arten von Fettgewebeermöglichen ein besseres Verständnis der biochemischen Zusammenhänge und Unterschiede zwischen Depots. Dies kann bei der Bestimmung der Beziehung zwischen der Lage, die Funktion und Arten von Fett im Körper zu unterstützen. Das beschriebene Verfahren erreicht dies, indem sie die Einrichtung zum Brutto Visualisierung, Genexpressionsanalyse, Analyse der Proteinexpression, die histologische Untersuchung und Isolierung von primären Zelllinien für die in vitro-Studien. Momentan gibt es viele Artikel, die einen Einblick in die metabolischen Verhalten verschiedener adipose Depots sowie ihre anatomischen Orten bereitzustellen; aber nicht bieten eine gründliche Methode, wie man gezielt zu lokalisieren, identifizieren und isolieren diese Depots. Dieses chirurgische Verfahren liefert eine genaue Technik, die für die Isolierung von mehreren Depots mit einer minimalen Menge an Präparation und Verunreinigungen im Vergleich zu anderen Methoden zur Isolat von einem oder zwei Depots 13-14 gestaltet ermöglicht.

Das Ziel des Protokolls ist es,ein präzises Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von verschiedenen Arten von Fettdepots von mehreren anatomischen Stellen.

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Protocol

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der University of Cincinnati und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichung durchgeführt . 85-23, Revised 1996).

1. Euthanize und Sterilisieren der Maus

  1. Platzieren Sie die Maus in eine Dropbox gemacht, die einen supratheraputic Dosis von Isofluran und lassen Sie den Effekt zu inhalieren. Sobald die Maus getötet, aus dem Feld zu entfernen.
  2. Zervikal als ein zweites Mittel der Euthanasie verrücken.
  3. Sterilisieren der Außenfläche der Maus durch Reinigen des Tieres mit 70% Ethanol.

2. Identifizierung und Isolierung von drei verschiedenen Fettgewebedepots

  1. Braunes Fettgewebe (BAT) Isolation:
    1. Stellen Sie sicher, das Fell nass vom Alkohol Reinigung in Durchschneiden der epidermale und dermale laye Hilfers.
    2. Bewegen Sie die Maus in Rückenlage mit dem Rücken gegen den Tisch.
    3. Besorgen Sie sich die Haut direkt unterhalb der Membran mit einer Pinzette, Aufzug und mit einer Schere einschneiden.
    4. Schneiden in Querrichtung um den Umfang der Maus, um das Peritoneum aussetzen.
    5. Zeigen die schmetterlingsförmige BAT Depot von degloving die obere Hälfte der Maus. Die unteren Fortsätzen und Bauch in einer Hand und ziehen Sie die Haut bis zum Kopf.
    6. Richten Sie die Maus, so dass es anfällig auf dem Tisch positioniert ist. Achten Sie darauf, um die freiliegende Depot mit Haar verunreinigen.
    7. Saubere chirurgischen Instrumenten und Wechsel zu einem neuen Paar Handschuhe.
    8. Suchen Sie die Schulterblätter und entsprechende Depot. Entfernen Sie vorsichtig jede oberflächliche weiße Fettgewebe oben auf dem Schmetterling und sezieren den Schmetterling von interskapulären braune Fett. Seien Sie vorsichtig, um den Muskel eng mit der braune Fett assoziiert zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Verwendung eines Dissektionsmikroskop wird zur Entfernung des w empfohlenhite Fettgewebe sowie bei der Trennung von dem braunen Fettgewebe von den Schulterblättern.
    9. Entfernen Sie Fettdepots und Transfer zu einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    10. Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt.
  2. Isolierung von Unterhautfettgewebe (SQ), einem weißen Fettgewebe Depot (WAT):
    1. Setzen Sie auf ein frisches Paar Handschuhe, um nicht kreuzkontaminieren zwischen Fettdepots.
    2. Zeigen die Leisten, dreieckig SQ Depots de Behandschuhung die untere Hälfte der Maus. Halten Sie die oberen Fortsätzen und Thorax in einer Hand und ziehen Sie die Haut nach unten in Richtung der Füße mit der anderen Hand.
    3. Richten Sie die Maus in Rückenlage, während man aufpassen, nicht, um den belichteten Depot mit Haar verunreinigen.
    4. Saubere surgical Instrumente und Wechsel zu einem neuen Paar Handschuhe.
    5. Sorgfältig sezieren die Dreiecke der SQ Fett. Achten Sie darauf, die Probe mit Muskel verschmutzen, benachbarte Fett, Milchdrüsen oder indem alle Gefäße und verunreinigen die Probe mit Blut.
      HINWEIS: Die Verwendung eines Dissektionsmikroskop empfiehlt sich, wenn die Grenzen sind nicht klar definiert.
    6. Entfernen Sie Fettdepots und Transfer zum 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    7. Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern.
    8. Zur Färbung, fix oder in OCT eingebettet werden. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt.
  3. Isolierung von Keimdrüsenfett eine viszerale Fettgewebe (VAT) und weißen Fettgewebe (WAT) Depot:
    1. Setzen Sie auf ein frisches Paar Handschuhe, um nicht kreuzkontaminieren zwischen Fettdepots.
    2. Mit Scissors, schneiden Sie das Bauchfell in Querrichtung, direkt unterhalb des Zwerchfells. Schneiden Sie das Bauchfell von der Membran auf den Mastdarm Mitte koronal Bauchorgane aussetzen.
    3. Suchen Sie die Hoden oder Eierstöcke und identifizieren die angebracht weißen Fettgewebe, wie die Nebenhoden Fettgewebe bei Männern oder Gonaden Fettgewebe bei Frauen bekannt.
    4. Saubere chirurgischen Instrumenten und Wechsel zu einem neuen Paar Handschuhe
    5. Sorgfältig sezieren sowohl Nebenhodenfettdepots aus dem Hoden, Nebenhoden und Samenleiter. Oder wenn weiblich, sorgfältig sezieren beide Gonaden Fettpolster aus den Eierstöcken.
    6. Entfernen Sie Fettdepots und sie auf 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    7. Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern.
    8. Zur Färbung, fix oder in OCT eingebettet werden. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt.

    3. Isolierung Perivaskuläre Fettgewebe (PVAt)

    1. Die Isolierung des Herzens:
      1. Legen Sie die Maus in Rückenlage mit oberen und unteren Fortsätze nach außen erweitert.
      2. Sichere Anhängsel mit chirurgischen Band.
      3. Nach dem Positionieren der Maus wie oben aufgeführt, zu schaffen Spannung durch Anheben des Schwertfortsatz mit einer Pinzette. Horizontal geschnitten durch die Membran, Aussetzen der untere Teil der Brusthöhle.
      4. Gute Spannungsstabilität, durch Anheben des Schwertfortsatz, schneiden durch den Brustkorb superior in Richtung des Kopfes, nur an der Seite des Brustbeins.
      5. Nehmen Sie den Brustkorb nur schlechter als die Schlüsselbein und schnitt entlang der unteren Länge des Schlüsselbeins heraus in Richtung der Achselhöhle in beide Richtungen. Die Brusthöhle und sein Inhalt (Herz, Lunge, etc.) sollte nun deutlich sichtbar sein.
      6. Reinigen Sie die Brusthöhle von fremden Blut und Flüssigkeit durch den Gebrauch steriler gauze um die Flüssigkeit zu absorbieren. Wenn das Sammeln Organen oder Gefäßen achten Sie darauf, profuse (zusätzliche Informationen).
      7. Sobald der Bereich des Fluid gelöscht, schneiden die Bronchien und Anbringen Gefäßen, um die Lungen zu entfernen, so dass eine bessere Belichtung des Herzens.
    2. Lokalisierung und Exzision Aortic Perivaskuläre Fettgewebe (PVAt):
      1. Entfernen Sie die folgenden Organe besser zu identifizieren, die dem unteren Bereich der Hauptschlagader: Leber, Magen, Milz, Pankreas, Darm und Dickdarm.
      2. Starten Sie zunächst mit der Identifizierung des Magens und der Speiseröhre. Schneiden Sie die Speiseröhre in den Magen-und Speiseröhrenkrebs Kreuzung, um den Magen aus dem Körper zu befreien.
      3. Als nächstes identifiziert den Darm und die umliegende Gekröse. Schneiden Sie oberflächlich durch Gekröse, da es sehr eng mit dem Nieren Teil der Aorta liegt, dann "führen Sie den Darm."
      4. Schneiden Sie den Doppelpunkt zu befreien so nah an den Mastdarm wie möglich. Somit befreit den Magen, Darm und Dickdarm von der Maus.
      5. Rebewegen Sie den Magen, Darm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse und Milz durch Schneiden durch die Befestigungs Gekröse und Gefäße. Die Bauchspeicheldrüse und Milz sollte mit dem Magen, Darm und Dickdarm Tarif.
      6. Entfernen Sie die Leber durch Schneiden durch die Lebervenen und Anbringen Gekröse, entfernen Sie alle Lappen.
      7. Schneiden Sie die viszerale Fettschicht und umgeben die Nieren. Lassen Sie die Nieren in die Aorta in vivo angebracht ist, als geografische Marker für verschiedene Segmente der Aorta zu dienen.
      8. Spülen Sie den Bereich mit sterilen 1x PBS und entfernen Sie alle Flüssigkeit durch Absorption mit steriler Gaze.
      9. Mit Mikro-Schere und Mikro-Pinzette, trennen Sie die Hauptschlagader von seinem Rücken-an der Wirbelsäule und ihrer ventralen Befestigung an der Speiseröhre.
      10. Isolieren Sie die Aorta, indem Sie und Lösen der Aorta die Länge der absteigenden Aorta vom Ursprung im Herzen zur Bifurkation in der Leistengegend.
      11. Identifizieren und zu isolieren, die Schlüsselbeingefäßen. Trennen Sie diese Gerätevom Hals bis der Aortenwurzel, besser setzen die Aorten-Kreuzung und Wurzel im Herzen.
      12. Entfernen Sie den Thymus dann schneiden die Truncus brachiocephalicus, die linke Halsschlagader und der linken Schlüsselbeinarterie, die eine Bewegung des Herzens.
      13. Mit der Unterstützung von einem Dissektionsmikroskop, zeigen Sie die perivaskulären Fettgewebe (PVAt) Schicht rund um die Aorta.
      14. Unter besonderer Berücksichtigung der nicht kneifen oder drücken Sie die PVAt, ziehen Sie den PVAt Weg aus der Aorta mit Mikro-Pinzette. Geschnitten sanft die Befestigung des PVAt zur Aorta mit Mikroscheren ab thorakalen Bereich genau oberhalb denen die Membran angeordnet ist.
        HINWEIS: Ein Dissektionsmikroskop empfohlen.
      15. Wiederholen Sie diesen Vorgang über die gesamte Länge der Aorta, und endet bei der infrarenalen Region, die sich nur überlegen die iliakalen Bifurkation der Aorta Gefäß.
      16. Wenn Aortenbogen PVAt gewünscht wird, verwendet die gleiche Methode, um die PVAt vom wenigen c entfernenurvature des Bogens.
      17. Platzieren PVAt Proben in 2 ml Mikrozentrifugenrohr (en).
      18. Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt.
        HINWEIS: Weitere Fettgewebe Depots bei Interesse an einer umfassenden Fettgewebe Depotanalyse berücksichtigen: retroperitoneal, mesenterialen, omentalis, Herzbeutel und Kniekehle.

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Representative Results

Identifizierung und Lokalisierung von Leisten subkutane Fettgewebe, interskapulären braunen Fettgewebe, viszerale Fettgewebe Nebenhoden (Abbildung 1) sowie den Aortenbogen perivaskulären Fettgewebe, thorakalen Aorta Fettgewebe, Neben Aorta Fettgewebe und der infrarenalen Fettgewebe (Abbildung 2) wurde erfolgreich mit Hilfe erreicht die beschriebene Operationsmethode. Die histologische Untersuchung und Differenzierung zwischen BAT und WAT Proben wurden positiv mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung (Abbildung 3) bewertet. Analyse von RNA adiponectin (ADIPOQ), Peroxisomproliferator-aktivierter Rezeptor gamma (PPAR-γ), Zelltod induzierende DFFA artigen Effektor a (CIDEA) und andere fettspezifischen Marker wurden für alle oben isoliert und ausgeschnitten Depots gemessenen (Daten nicht gezeigt).

Primäre Zelllinien von subkutanen Fettzellen und perivaskuläre Adipozyten wurden kultiviert und differenziert von Präadipozyten s zu Adipozyten erfolgreich für Microarray-Analyse. Die kultivierten Präadipozyten zu Adipozyten umgewandelt wurden mit Ölrot O Anfärbung (Figur 4) bestätigt. Erfolgreiche Abgeschiedenheit, Kultur und Differenzierung von Fettzellen wurde für den Einsatz in in-vitro-Studien erreicht und Proteinaktivität wurde erfolgreich gemessen. Enzymatische Aktivität von Matrix metaloprotease-2 (MMP-2) wurde in einer Behandlungsgruppe im Vergleich zur Kontrolle gemessen. Die Aktivität von MMP-2 wurde in situ in einem primären perivaskuläre Adipozyten Leitung über Zymographie (Abbildung 5) gemessen.

Figur 1
Abbildung 1. Anatomische Lage der C57BL / 6 männlichen Maus Fettgewebe Depots. (A) interskapulären braunen Fettgewebe Fett Depot. (B) Leisten subkutane Fettgewebe Fett Depot. (C) Viszerale Fettgewebe Nebenhodenfettdepot.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Anatomische Standorte PVAt Depots in einer C57BL / 6 männlichen Mäusen. (A) Aortenbogen perivaskulären Fettgewebe Depot. (B) thorakalen Aorta perivaskulären Fettgewebe Depot. (C) Nebenniere Aorta perivaskulären Fettgewebe Depot. (D) infrarenalen perivaskulären Fettgewebe Depot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. H & E Färbung des BAT und WAT Fettgewebe. (A) H 8; E-Färbung von Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebetteten C57BL / 6 männlichen Maus Stichprobe von WAT Fettgewebe bei einem 40-facher Vergrößerung (B) H & E-Färbung von Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebetteten C57BL / 6 männlichen Maus Stichprobe von BAT in einem 40-facher Vergrößerung.. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4
Abbildung 4. Oil Red O Färbung von kultivierten Präadipozyten und Adipozyten PVAt. (A) Oil Red-O-Färbung von kultivierten aortischen perivaskuläre Präadipozyten an der Grundlinie der Differenzierung bei 20facher Vergrßerung mit Phasenkontrast. (B) Oil Red-O-Färbung von kultivierten aortischen perivaskuläre Adipozyten nach 5 Tagen der Differenzierung bei 20facher Vergrßerung mit Phasenkontrast.es / ftp_upload / 52.174 / 52174fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Zymographie von differenzierten Fettzellen, isoliert aus perivaskulären Fettgewebe, zeigten eine verminderte Aktivität der MMP-2 nach der Behandlung entlassen, verglichen mit unbehandelten (Kontroll-) Zellen, * p <0,01 im Vergleich zur Kontrolle.

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Discussion

Übergewicht kann zu einer großen Vielzahl von Begleiterkrankungen und dem vollen Verständnis der Rolle, die adipöse spielt ist nicht vollständig geklärt führen; daher die weitere Forschung auf dem Gebiet der adipösen notwendig. Tiermodelle, insbesondere murine Modelle sind ideal für Vorlaufforschung in der Progression von Krankheiten und das Testen von potentiellen pharmazeutischen Behandlungen. Bei der Verwendung dieser Modelle ist eine genaue Trennung und Entfernung von Fettgewebedepots ein äußerst wichtiges und notwendiges Instrument bei der Untersuchung der Pathologie der Fettgewebe beeinflusst Krankheiten.

In der aktuellen Literatur betreffend adipose Depots gibt es eine beträchtliche Menge an Literatur über Stoffwechselverhalten und die Unterschiede zwischen adipose Depots sowie ihre anatomischen Stellen. Allerdings gibt es nur wenige, die eine gründliche Methode, wie man gezielt zu lokalisieren, identifizieren und isolieren diese Depots bieten. Auf der Grundlage der Überprüfung der derzeitigen Isolierungsverfahren aus Fettgewebe, gibt es eine kleine Teilmenge der Protokolle tKappe bereitzustellen Methodik, wie ein oder zwei Depots zu einem Zeitpunkt zu isolieren. Jedoch ist eine präzise Technik, die für die Isolierung von mehreren Depots mit einer minimalen Menge an Präparation und Verunreinigungen, sowie Adressen verschiedene Verfahren zur Untersuchung der gesammelten Proben ermöglicht Scheidungs ​​diesem Protokoll 13-14.

Innerhalb dieser Methode gibt es mehrere Schritte, die von entscheidender Bedeutung, um die Isolierung und Reinheit der Probe sind. Reinigung der Werkzeuge, Handschuhe und Oberflächen oft zu Haar und Verunreinigungen zu entfernen, ist ein Gebot Schritt zur Vermeidung von Kontaminationen Depot. Beim Schneiden der Haut quer über den Umfang der Maus, um das Bauchfell für degloving aussetzen, ist es wichtig, damit nichts zu tief. Schneiden das Bauchfell machen degloving sehr schwierig und das Potenzial für eine Kontamination der Probe zu erhöhen. Beim Ausschneiden der SQ Fettgewebe Depots ist es wichtig, die dreieckigen Grenzen des Depots vor Herausschneiden eines der Anzeige zu identifizierenipose. Außerdem sollten Sie vorsichtig Schnitte gemacht werden, um Muskeln zu vermeiden, und der angrenzenden Gefäße, Drüsen und Fettgewebe. Dadurch wird eine Kontamination der Probe aus alternativen Fettgewebe, Drüsengewebe, Muskeln oder Blut zu verhindern.

Die Hauptbeschränkung, um eine Isolation und Exzision von Fettgewebedepots, in diesem Verfahren und anderen vergleichbaren Verfahren können an der Definition der Grenzen bestimmter Depots finden. Durch die schlecht definierte Grenzen in Depots, beispielsweise die subkutane Depots können Isolations fehlt eine kleine Menge von Verunreinigungen von benachbarten adipose schwierig sein. Eine weitere Einschränkung kann bei der Sicherstellung genügend Gewebe für ergänzende Versuche an Gefäß verbunden Depots gesammelt zu finden. Diese Begrenzung erfordert manchmal Pooling von Proben, obwohl dies abhängig von der Stelle der Isolierung und der Ernährung mit dem Tier verbunden sind.

Nachdem die Fettgewebe Depots isoliert sind, können sie für eine Vielzahl von Assays verwendet werden. Das Fettgewebe kann Gebrauch sein,d für molekulare Studien, wie die Proteinexpression, die Enzymaktivität und Genexpressionsanalyse. Zusätzlich können ein Adipozyten Primärzelllinie in vitro Untersuchungen zu isolieren. Immortalisierte Zellinien können auch zur in vitro-Studien verwendet werden, jedoch unsterblichen Zellen nicht so glaubwürdig wie primär getrennte Zellinien. Schließlich kann das Fettgewebe festen oder in OCT zur histologischen Untersuchung eingefroren, um die Leukozyten-Infiltration, Proteinlokalisierung sowie Charakterisierung der Adipozyten-Morphologie zu identifizieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% Ethanol Fisher 07-678-001
DMEF-12 Sigma Aldrich D-6421 Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes Midsci MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK

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References

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