生产和使用慢病毒的有选择性地转导原少突胶质前体细胞

Developmental Biology

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Peckham, H. M., Ferner, A. H., Giuffrida, L., Murray, S. S., Xiao, J. Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays. J. Vis. Exp. (95), e52179, doi:10.3791/52179 (2015).

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Abstract

髓鞘是一个复杂的过程,涉及神经元和髓鞘形成神经胶质细胞,在中枢神经系统(CNS)的少突胶质细胞和雪旺氏细胞在周围神经系统(PNS)。我们使用一个体外髓鞘形成测定中,已建立的模型用于研究的CNS髓鞘体外 。要做到这一点,少突胶质细胞前体细胞(OPCs的)被加入到该纯化的初级啮齿类背根神经节(DRG)神经元,以形成髓鞘形成共培养物。为了专门询问角色由少突胶质细胞表达的特定蛋白质发挥对髓鞘形成,我们已经开发协议被接种到DRG神经元在此之前,有选择地使用转导的慢病毒过表达的OPC野生型,组成积极或显性负蛋白质。这让我们专门询问在调节髓鞘少突胶质细胞,这些蛋白质的作用。该协议也可以在加时赛的应用研究她的细胞类型,从而提供了一种方法,允许以期望的细胞类型表达的蛋白质,如少突胶质细胞用于信令和补偿机制的目标研究的选择性操纵。总之,结合慢病毒感染的OPC 体外髓鞘检测提供了参与髓鞘形成的分子机制进行分析的战略工具。

Introduction

轴突的髓鞘是用于在中央和周围神经系统的快速和有效的传输动作电位是至关重要的。特化的细胞,雪旺氏细胞中的外周神经系统和少突胶质细胞在中枢神经系统中,环绕并ensheathe轴突在髓鞘,有效隔热的神经和推动跳跃式传导1。髓鞘形成的方法,可使用的视网膜神经节神经元2中 ,工程化的纳米纤维3,或背根神经节神经元共培养要么雪旺氏细胞4或少突5-7来研究在体外在体外测定髓鞘形成是一个建立的模型用于研究神经系统的髓鞘和它复制许多髓鞘体内 5-8期间发生的基本过程。该法涉及背根神经节(DRG)神经元的纯人口的共培养,用的OPC(对于CNS髓鞘)或雪旺氏细胞(PNS髓鞘)。在特定条件下,这些髓鞘细胞ensheathe DRG轴突在有序,超结构验证,多层状绝缘表达髓鞘本体内特异性蛋白质的相同补质膜片

学习的CNS髓鞘体外的最常用的细胞模型是在共培养物的DRG神经元和OPCs的,并已成功地用于研究的影响,外源因素,如神经营养蛋白产生关于CNS髓鞘体外 5,6。外源因子如生长因子或小分子的药理学抑制剂已被广泛用于研究用DRG-OPC共培养模型7,9的信号通路中髓鞘形成的作用。然而,在包含两个神经元和少突胶质细胞的混合共培养的设置,但仍可能正式,无论是生长因子或所述的医药macological抑制剂可以发挥经DRG神经元和少突胶质细胞(OL)两种效果。这确实提供了具体剖析该蛋白的病种付费仅明示或少突胶质细胞在发挥髓鞘使用这种双电池系统中的作用的能力。明确地确认该信号通路在少突胶质细胞直接调节髓鞘,OPCs的慢病毒转导,对接种到DRG神经元的体外髓鞘测定之前,已被证明是一种优雅的方式来过表达野生型和突变体蛋白质,以及作为组成型表达的蛋白质由少突胶质细胞敲低表达。因此,这种方法提供了一条专门询问和操作信号少突胶质细胞内途径研究髓鞘9,10。

在本文中,我们报告,我们已经发展到过度表达的目的蛋白选择性地少突胶质细胞通过慢病毒的方法方法在体外研究髓鞘形成。该技术始于含有感兴趣的基因的表达载体的产生,无论是在野生型,组成型活性或显性负形式被随后克隆到载体pENTR载体(载体pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP)。该载体(含有目的基因)中,巨细胞病毒启动子给体(载体pENTR L4-R 1载体pENTR-pDNOR-CMV)和2K7慢病毒结合在酶反应以产生含有CMV启动一个2K7矢量,感兴趣的基因,一个内部核糖体进入位点和GFP( 图1)。该Gateway克隆2K7构建体结合PMD2.G病毒包膜和pBR8.91病毒包可以被共转染到HEK293T细胞,以产生慢病毒随后可以用于转导的OPCs。一旦感染了慢病毒的OPCs的表达感兴趣的蛋白质的高水平。这些OPCs的就可以接种于DRG神经元的文化和效果的表达的高水平的所需蛋白质的施加在髓鞘可以询问。共同评价培养物用免疫印迹分析髓鞘蛋白表达和可视化的免疫细胞化学的形成髓鞘的轴突段。

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Protocol

注:用于此研究中的所有动物的混合性别和繁殖的解剖及病理科的动物设施和神经科学与心理健康研究的弗洛里学院在墨尔本大学。所有动物的程序进行,在墨尔本大学经动物实验伦理委员会。

1.克隆2K7慢病毒的

  1. 前克隆感兴趣的基因插入2K7慢病毒载体,亚克隆的基因导入用标准分子技术11的载体pENTR载体(3637 bp的,卡那霉素抗性)。使用EcoRI和SacⅡ位限制位点亚克隆。
  2. 在2K7慢病毒扩增
    1. 变换2K7慢病毒的DNA,轻轻混合100ng的质粒DNA的感受态细胞,并在冰上孵育30分钟。
    2. 热休克的DNA /感受态细胞混合,在42℃下90秒和板它们含有ampici的LB琼脂平板LLIN(100微克/毫升)和氯霉素(15微克/毫升),在37℃进行16-18小时。
      注:氯霉素用于防止所述长末端重复之间的重组。
    3. 第二天,生长在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)和氯霉素(15微克/毫升),在37℃下进行16-18小时的LB培养基中选择的细菌克隆。提取使用市售的质粒DNA的大量制备试剂盒按照制造商的说明将DNA。
  3. 子克隆从载体pENTR载体2K7慢病毒( 图1)
    图1
    图1:该Gateway重组过程的示意图感兴趣的基因,这里表示为标示-ERK1,被克隆入载体pENTR L1-L2矢量。这被加入到含有CMV启动子和骨干2K7矢量的载体pENTR L4-R 1向量。这三个矢量由在LR克隆酶II正酶重组插入的感兴趣的基因和启动子插入病毒就绪2K7矢量。
    1. 以下内容添加到1.5毫升管,轻轻混匀:
      L4-R1载体pENTR-pDNOR-CMV(子)(60 BNG)1-2.5微升
      L1-L2 pENTR4IRES2GFP(与感兴趣的基因)(80 BNG)1-2.5微升
      K7慢病毒(80纳克/微升)1微升
      的TE缓冲液,pH值82-5微升
      共有8微升
    2. 从-80℃取出克隆酶酶混合物和解冻冰上2分钟。确保这种酶是从-80℃的新鲜等分试样作为酶大大减少了克隆效率与反复冻融
    3. 加入2微升每反应的酶,并通过涡旋拌匀,孵育23-25​​℃下克隆酶反应混合物6-24小时。
    4. 加入1微升蛋白酶K溶液(用酶试剂盒提供)到克隆酶反应混合物中,并孵育10分钟,在37℃。
    5. 变换克隆酶反应混合物注入感受态细胞和成长的选择菌落在含有氨苄青霉素(100微克/毫升),在37℃下进行16-18小时的LB培养基。
    6. 提取和使用商业质粒DNA的小量制备试剂盒按照制造商的说明纯化DNA。
    7. 确认通过使用限制性消化酶SpeⅠ和SacI II和合适的缓冲液根据制造商的指示,以除去含有感兴趣的启动子和基因的片段的DNA。
      注意:此步骤是关键的,以检查是否该亚克隆的DNA具有与右载体骨架的兴趣正确插入片段的基因。该载体本身没有插入片段的大小为6.7 kb的。所释放的插入片段的大小既包括启动子和感兴趣的插入物的基因。质粒编辑器-通过DNA序列编辑程序, 例如 ,APE计算预期的片段大小从消化的特异基因。
    8. 检查两个DNA载体主链,并通过运行在1%琼脂糖凝胶中释放的片段的大小在1×TAE缓冲液(见表储备液)在100伏
    9. 通过在37℃下生长的细菌在500ml含有氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB培养基中16-18小时,扩增的DNA证实。
    10. 提取和使用商业质粒DNA的大量制备试剂盒按照制造商的说明纯化DNA。
      注:大量制备通常产生的DNA所需的病毒产生足够量。
  4. 重复步骤1.3.9-1.3.10以扩增为慢病毒制剂以下的DNA:包络线矢量(PMD2.G,6.1 kb的),封装向量(pBR8.91,12.5 kb的),以及一个空的慢病毒载体作为对照(GFP -CMV-2K7,8.7 KB)。

2. 2K7病毒生产

注:第1天:

  1. 在转染的当天,板32000000 HEK293 T细胞中有25ml的HEK293 T细胞培养基T175烧瓶(见储备溶液的表)。另外,板16万个细胞的一天在染前如果时间紧运行转染的一天。
    注:转染可通过转染的当天或前一天电镀细胞同样成功。使用这两种替代的,这里的关键点是确保细胞被卡住向下培养皿表面之前转染。
    注意: 第2天:
  2. 转染
    1. 在转染之前,稀释的DNA至1微克/微升TE缓冲液中包含10毫摩尔Tris pH值8,在去离子水中1毫摩尔EDTA pH为8。
    2. 在50ml管中,制备主混合物( 表1),用于转染在T175烧瓶中。加入DNA,以预热贝科的改良Eagle培养基(DMEM)和涡拌匀,再加入无菌聚乙烯亚胺(PEI)(请参见库存解决方案的表),以避免过早沉淀。 “>
      向量 仲> 浓度 音量
      pMDG.2 1微克/微升 5微升
      pBR8.91 1微克/微升 15微升
      与GFP +感兴趣的基因2K7矢量 1微克/微升 22微升
      无菌聚乙烯亚胺(PEI) 1g / L的 500微升
      DMEM 2100微升
      表1:准备转染混合物为2K7病毒。
    3. 通过倒转试管3-4倍拌匀孵育在室温下15分钟(RT)。
    4. 执行对HEK293T细胞全媒体转变。抽吸掉从细胞完全培养基和饲料用预温的HEK293T细胞培养基(每T175烧瓶25ml)中。
    5. 添加转染混合物(DNA / PEI混合物)逐滴于单层细胞。移动轻轻拌匀,并培育转染的细胞在37℃,5%CO 2过夜。
      注:第3天:
    6. 以确保转染是成功的,通过荧光显微镜检查GFP表达24小时后转染。
      注:超过50%的细胞表达GFP的通常表示一个很好的转染。
      注:第4天:
    7. 在48小时后转染,收集的病毒上清,并替换为新鲜的HEK293Ť培养基(每T175烧瓶25ml)中。
      1. 离心病毒上清在1140×g离心10分钟,在4℃下清理从上清液细胞碎片。转印清零上清液至50ml管中并储存于4℃。
        注:第5天:
    8. 在72小时后转染,收集第二批病毒上清液。重复步骤2.3.1和游泳池48和72小时清除上清液。
    9. 使用30毫升超速离心管在4℃下浓缩病毒,离心机病毒上清在170000×g离心90分钟。
    10. 弃去上清液,并重复步骤2.6,直到所有被清除上清液已经离开离心病毒的(不可见的)粒料加在管的底部沉淀的PEI。
    11. 重悬病毒,加入500μlSATO媒体(见表股票方案)的超速离心管。涡旋30秒第二刮管的底部用一个移液管尖,以机械地松开该病毒。以松病毒颗粒重复此步骤6倍。
    12. 池中的悬浮病毒进入离心管和旋转很简单,除去不溶PEI。通过0.45微米的过滤器过滤上清液,以除去蛋白质。
    13. 分装成病毒20微升,50微升,100微升等分试样并储存在-80℃。

    3.病毒滴度测定HEK293T细胞

    1. 检查感兴趣的蛋白质的表达,并确定最佳的病毒浓度为实验中,添加了一系列病毒原料的系列稀释( 例如 ,0,5,10,20,40,80微升)以转导的HEK293 T细胞接种于6孔板中,并培养24小时,在37℃,5%的CO 2。这个协议典型地产生病毒,可以在浓度范围为1:50至1被使用:200实现的基因的表达鲁棒兴趣。
    2. 48小时后的病毒转导,裂解HEK293T细胞在TNE缓冲液(见表原液)与蛋白酶抑制剂。
      1. 漂洗孔两次用冷的DPBS,然后添加150微升TNE缓冲液到每个孔中。
      2. 裂解细胞通过上下吹打5到10倍。传送全细胞裂解物,以1.5 ml离心管,并在冰上孵育15-30分钟。
      3. 离心溶胞产物在4℃下进行30分钟,在最大速度(20,000 xg离心),并转移清零上清液至新管用于通过Bradford蛋白测定和随后的免疫印迹分析。
    3. 确定通过标准蛋白质印迹分析目的蛋白质的表达水平,而探测的抗体对蛋白质本身和熔合标记( ,标记)。使用的病毒稀释能产生> 95%的GFP +细胞和用于实验目的蛋白的稳健表达。

    4.分离培养的DRG和(Figure 2步骤1&2)

    图2
    图2: 在体外试验髓鞘 DRG神经元的示意图 ,从P2-3幼鼠,然后纯化和培养两周(1-2)解剖。 OPCs的是从P7-9大鼠脑使用immunopanning纯化(3)。 OPCs的随后感染慢病毒和48小时(4)中培养。的OPCs然后接种到的DRG,和感兴趣的任何生长因子,如BDNF加入(5)。共培养物,然后培养2周,以允许OPCs的分化和髓鞘的轴突(6)。最后,共培养物或者裂解为蛋白印迹或固定为免疫细胞化学(7)。

    注:1天前2天清扫:

    <OL>
  3. 外套蒸压22毫米X22毫米盖玻片用聚-L-鸟氨酸(0.5毫克/毫升)在6孔板中,并孵育在37℃下过夜。
  4. 第二天,再次涂覆盖玻片与层粘连蛋白(在MEM 20微克/毫升)在37℃下过夜,吸去多余和干燥20分钟,在组织培养罩。
    注:第2天:按病种付费的解剖和隔离:
  5. 牺牲P2-P3幼鼠12倍颈椎横断。
  6. 去除皮肤覆盖从该动物的背部的肌肉。使用vannas剪刀剪开椎孔,然后使用镊子轻轻舀出脊髓。
  7. 摘下指出在于椎骨列之间的DRG和切断附脊神经纤维,然后发生的DRG中装有3毫升的L-15介质33毫米的培养皿。它通常是可以从脊髓的每一侧8和12之间的DRG收集
  8. 传递收集的DRG随着L-15介质装入一个15毫升的管中,离心,在180×g离心5分钟。
  9. 吸气上清,加2ml的0.25%胰蛋白酶至DRG粒料和孵育在37℃下30分钟。
  10. 加入5 ml M1介质(见表原液)到DRG粒料以停止胰蛋白酶,和离心机在180×g离心3分钟,在RT。
  11. 吸去上清液,重悬浮沉淀在2ml预热M1介质(未用生长因子)。吹打50倍,或直至神经节被分散磨碎的节粒料。离心细胞悬浮液在180×g离心3分钟。
  12. 重悬解离的神经元在M1的介质,并在6孔板板下来每孔100μl5节。
  13. 以除去增殖非神经元细胞,最少4小时培养后,以方便附着,除去M1介质和进料的神经元与M2的介质(见表原液)。文化DRG神经元NGF(100毫微克/毫升)的存在,净化NGF依赖TrkA的表达病种付费的文化。另外,使用的BDNF(100毫微克/毫升)以纯化的BDNF依赖的TrkB-EXPRES星病种付费。
  14. 维持神经元M1的媒体(+ NGF或BDNF的在100纳克/毫升)与抗有丝分裂的M2介质交替为如下2周。
  15. 维持介质M1(+ NGF或BDNF的在100纳克/毫升)天:4-6,8-10,12-14和M2培养基(+ NGF或BDNF的在100纳克/毫升)与FDU和尿苷天1至4,6-8,以及10-12。最少的M2培养基纯化3个循环是必需的。
  16. 保持货币供应量M1病种付费,仅一个星期再完成2周抗有丝分裂周期之后。改变M1媒体每2-3天。

5.分离的OPCs文化(图2步骤3)

注:1天前2天清扫:

  1. 外套10厘米组织培养板用聚-D-赖氨酸(PDL,在无菌去离子水10微克/毫升)在4℃下过夜。
    注:第2天:4天前清扫:
  2. 用无菌去离子水进行3次洗PDL板。让干燥〜6小时在组织培养罩。如果不使用直线距离,包装和储存最多至4周,在4℃。
  3. 准备二次抗体板为immunopanning。为1脑解剖,准备2个IgG的板(用于RAN2抗体以除去星形细胞和01抗体以除去premyelinating少突),以每10cm的培养皿中的DPBS 45微升山羊α小鼠IgG(15毫升); 1倍的IgM板(O4抗体用于选择少突胶质细胞前体细胞),45微升山羊α小鼠IgM在DPBS中每10cm培养皿(15毫升)中。
    注:第3天:清扫日:
  4. 添加200单位木瓜蛋白酶在10毫升的木瓜蛋白酶缓冲液( 表2),并升温于37℃,直到缓冲区变清。
    浓度 对于250毫升 终浓度
    EBSS股票 10倍 25毫升 1X
    硫酸镁 100毫米 2.5毫升 1毫米
    葡萄糖 30% 3毫升 0.46%
    EGTA 0.5M的 1毫升 2毫米
    碳酸氢钠 1M的 6.5毫升 26毫米
    带体积达250毫升去离子水和过滤杀菌
    表2:木瓜蛋白酶缓冲准备。
  5. 清洗所有二抗板的DPBS的3倍。
  6. 倒入RAN2和O1抗体上的IgG板和O4杂交到IgM的板。培育这些初级抗体板超过2小时,在RT。
  7. 从P7老鼠解剖大脑的一个。斩首用削尖剪刀小狗,并消除皮肤上覆用剪刀头骨。
    1. 从枕叶,颞叶和额叶切断围绕颅骨。除去使用镊子从颅骨脑并轻轻它用1ml DPBS转移到35毫米培养皿中。
    2. 骰子大脑切成小块大致用剪刀或刀片消毒。
  8. 滤波器预温热木瓜蛋白酶缓冲液(10毫升)到一个新的15ml试管含有L-半胱氨酸的几粒,然后加入200μl的DNA酶(12500 U / ml的)与过滤木瓜蛋白酶缓冲液中。
  9. 倒入木瓜蛋白酶缓冲到切块脑组织;孵育在37℃下90分钟。
  10. Gentlly转移解离脑组织到50ml管中,用25毫升吸管和允许定居。
  11. 除去木瓜蛋白酶缓冲液,加2ml螺大毛(卵类粘蛋白),以脑组织和titurate 5到10倍,通过移液打碎脑组织块,允许沉降,除去顶部2毫升上清液到新的管中。
  12. 添加另一个2毫升罗大毛到脑组织,然后重复步骤5.11,直到没有大块的组织仍然存在。 Tituration能得到越来越咄咄逼人。
  13. 离心分离细胞悬浮液15分钟,在200×g下。抽吸掉上清,在10毫升您好大毛重悬细胞沉淀,并离心15分钟,在200×g下。
  14. 与DPBS的3倍洗第一immunopanning板(RAN 2板)。吸去上清液,重悬细胞在10ml淘洗缓冲液( 表2)和倾到第一immunopanning板(冉2片)。孵育细胞15分钟,在室温。
  15. 洗第二immunopanning板(01片)与DPBS的3倍。
  16. 在第一immunopanning板培养后,小费的细胞悬浮到第二immunopanning板(01片),冲洗任何松散细胞离该板的表面用1-3毫升平移缓冲器和转移用移液管向01板。孵育细胞15分钟,在室温。
  17. 洗净第三immunopanning板(O4板)。该板是正选择板,其中所述的OPCs结合其表面上。与DPBS的3倍洗O4板。
  18. 在第二immunopanning板培养后,在RT下将细胞转移到最终immunopanning板(O4板),孵育细胞45分钟。这一步将选择O4 + OPCs的。
  19. 吸从上immunopanning板(O4版)上清液,冲洗板EBSS的6倍。
  20. 以除去OPCs的断板,孵育细胞用5毫升温暖的0.05%胰蛋白酶-EDTA的1:10稀释用EBSS在37℃下8分钟。
  21. 加入5 ml的30%的FBS(在EBSS制造),以中和胰蛋白酶。去除细胞脱盘吹打表面约50倍。
  22. 转移所有的细胞悬浮液到一个新的管中,离心15分钟,在200×g下。
  23. 弃上清,重悬细胞沉淀在1ml预热佐藤介质,随后通过细胞计数。 1大脑的解剖可以产生1.5-2万元的OPC。
  24. 板单元上干燥的PDL包被的板在1×10 55×10 5个每10cm平板的密度与佐藤介质(10毫升)中含有睫状神经营养因子(CNTF,10纳克/毫升),血小板衍生的生长因子(PDGF,10纳克/毫升,),神经营养因子3(NT3,1毫微克/毫升),和毛喉素(4.2微克/毫升)2,12。培养的OPCs在37℃,8%的CO 2。

6.转导的OPC

  1. 在佐藤介质(10毫升/ 10厘米板)配有CNTF培养初级OPCs的(10毫微克/毫升),PDGF(10毫微克/毫升),NT3(1纳克/毫升),和毛喉素(4.2微克/毫升),在37℃, 8%CO 2的解剖后24小时。
  2. 完全吸出的OPC文化传媒,饲料细胞和新鲜的SATO媒体(10毫升)用生长因子(见上面在步骤6.1)。
  3. 添加病毒到OPCs的由步骤3( 图2,步骤4),培养的OPCs要进一步48小时确定的最佳浓度。

7. OPC播种的髓鞘形成共同的文化(图2,步骤5和6)

  1. 以除去离表面的OPCs,第一冲洗的OPC板用8ml EBSS两次,然后孵育细胞用5毫升温暖的0.05%胰蛋白酶-EDTA的1:10稀释用EBSS在37℃下2分钟。
  2. 中和,用30%的FBS的胰蛋白酶中EBSS(5毫升)中,并通过移液除去从板的细胞。转移细胞悬液至15ml管中,离心机在180×g离心15分钟,在RT。
  3. 抽吸掉在1ml预热佐藤媒体随后细胞计数上清液和重悬细胞沉淀。
  4. 前OPC播种,从DRG培养板完全吸媒体。轻轻种子20万的OPC逐滴到DRG神经元如前所述4-6。
    注意:总的OPC播种体积必须每22毫米盖玻片小于200微升。
  5. 离开细胞不移动板在组织培养罩10分钟沉降,然后轻轻地补足用1ml预热佐藤媒体每孔。
  6. Replate其余姐妹的OPC与SATO媒体与生长因子(见步骤6.1)。使用这些姐姐OPCs的验证感兴趣的蛋白质的表达。
  7. 24小时后,用共培养培养基(2毫升/孔)含有佐藤培养基(无因子)和的Neurobasal(V / V),用1%B27的更换佐藤介质。保持共培养物14天与媒体变化每2-3天。
  8. 通过Western印迹分析评估的共培养物为髓鞘蛋白表达和可视化用于通过双免疫染色用抗髓鞘碱性蛋白标记物和神经元标记物4-6的形成有髓轴突的段。

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Representative Results

旗标记细胞外信号相关 ​​激酶1(标志-ERK1)构建体用于慢病毒的生产用限制性验证酶消化所用的构建体,包括2K7构建体和所需的病毒生产的包装和辅助构建体两者的( 图3)

图3
图3:DNA构建验证 。所需的慢病毒生产所有的DNA构建体从Stbl3细菌中纯化,并通过限制性酶消化验证。附件和包装载体用NcoI和EcoRI消化,所指示的,并与未切割的质粒(A)中。 2K7-GFP用SpeI消化和SacⅡ位(A)。 2K7 -旗-ERK1 DNA用消化验证与任一SpeI位或SacⅡ位单独,或者通过双消化(B)中 。带型分别为相比于使用猿软件构建体序列的虚拟消化产生预期的图案。

确定最佳稀释到OPCs的使用,所述的Erk 1慢病毒滴定在HEK293T细胞( 图4)。这是通过增加一个范围的病毒稀释到HEK293T细胞的完成( 图4A,4C4D)或OPCs的( 图4B)。对基因利益的增加与时间( 图4D)的表达水平。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:标记-ERK1病毒在HEK293T细胞和OPCs的滴定 。标志-ERK1病毒滴定HEK293T细胞(A,C,D),或OPCs的(B)。 HEK293T细胞(A)或OPCs的(B)的感染用Flag-ERK1病毒后进行成像的GFP表达48小时。 HEK293T细胞裂解物探查化Erk1或总ERK1 / 2 48小时后的感染的(C)的存在下进行。 HEK293T细胞裂解物探查标志的存在下,ERK1 / 2和肌动蛋白作为上样对照或者48小时或感染用Flag-ERK1病毒(D)之后96小时。这些印迹所有印迹和成像一起以方便的表达水平在两个时间点(D)的直接比较。为(A)比例尺= 100微米。为(B)比例尺= 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

一旦最佳病毒稀释已经确定的,纯化的OPCs感染并培养至少48小时,以允许转基因表达达到SUFFicient的水平,然后接种到DRG神经元,以评估其髓鞘潜力( 图5)。一旦接种到DRG神经元时,OPCs将分化为少突胶质细胞,并开始表达髓鞘蛋白,这可以通过免疫印迹( 图5C)进行评估。一些成熟少突胶质细胞髓鞘会,并且这可以通过MBP染色( 图5D)被可视化。轴突也需要用一个标记,如神经丝或βIII微管蛋白( 图5D)进行染色,以确保分析髓鞘水平时轴突密度被考虑在内。

图5
图5:播种到DRG神经元前的OPCs被感染标志-ERK1病毒48小时 。妹妹的OPC不是被固定,染色标志和GFP(A)或裂解和探测的标志和Erk1验证该病毒过表达蛋白(C)的表达。共培养物固定2周培养后和染色βIII微管蛋白和MBP形象化DRG轴突和髓鞘形成以及非髓鞘少突胶质细胞(B)中 。甲髓鞘形成少突胶质细胞中由箭头和非髓鞘形成少突胶质细胞表示由箭头头部(B)中表示。平行共培养裂解并探测用于髓鞘蛋白MBP和MAG,以及标示和Erk1 / 2,以确认转基因表达在共培养物(D)。在化Erk1水平的增加并不在共培养可见由于大量的DRG衍生的ERK1存在于溶胞产物比例尺= 20微米。

名字 主料 笔记
TE缓冲液pH值8 的10mM Tris pH值8
1mM EDTA的pH为8
弥补在去离子水中。
聚乙烯亚胺(PEI) 1g / L的弥补在去离子水中,过滤灭菌并贮存股在-20℃。
LB培养基 20克胨
10g酵母提取
10克氯化钠
使高达2升,用去离子水
50%甘油的库存甘油弥补用的去离子水和高压釜等体积
HEK 293 T细胞中 DMEM
10%胎牛血清
1%青霉素/链霉素
1%L-谷氨酰胺
TNE裂解液的10mM Tris pH值8
150毫米氯化钠
1mM EDTA的pH为8
1%NP40
在去离子水中的较小的体积溶解NP40的第一,因为它会结晶在与水接触。弥补在去离子水最终体积
M1 MEM
10%胎牛血清
0.4%D-葡萄糖
为2nM L-谷氨酸
1%青霉素/链霉素
对于大鼠背根神经节的使用
MM1 Neurobasal培养基
2%B27(SM1)的补充
0.4%D-葡萄糖
为2nM L-谷氨酸
1%青霉素/链霉素
对于鼠标的背根神经节的使用
M2 DMEM
10毫克/升运铁
5毫克/升的胰岛素
20纳米孕酮
100μM腐胺
10μM的FdU
10μM尿苷
弥补M2在体积较大DMEM没有FdU的尿苷使用了1-2个月。添加的FdU和尿苷,以更小的体积,可以在2周内完成
MM2 MM1
10μM的FdU
10μM尿苷
添加FdU的和尿苷至较小体积的培养基,可以2个星期内完成。
10X MT-PBS pH值7.4 28.48克/ L(160毫米)的Na 2 HPO 4·2H 2 O
5.52克/ L(40毫米)和NaH 2 PO 4·H 2 O
87.66克/ L(1.5米)的NaCl
加入去离子水并调节pH值至7.4用10N NaOH
1个MT-PBS 10X MT-PBS
去离子水
稀释10倍的MT-PBS中1:10的去离子水,使1×MT-PBS中
10×硼酸盐缓冲液(1.5M) 18.55克硼酸
1个MT-PBS
溶解硼酸在150毫升1×MT-PBS中。调节至pH 8.56用10N NaOH并使最终体积为200毫升,1×MT-PBS中。高压灭菌器
1X硼酸盐缓冲液(0.15 M) 10X硼酸盐缓冲剂
1个MT-PBS
编写本缓冲区溶于PLN为100毫升。加入10 mL 10X硼酸盐缓冲液(pH 8.56)的90 1X MT-PBS毫升
0.5mg / ml的聚-L-鸟氨酸(PLN)的 50毫克聚-L-鸟氨酸氢溴酸
的0.15M硼酸盐缓冲液(pH 8.56)
溶解50毫克聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐在100毫升1×硼酸盐缓冲液。过滤消毒(0.22微米过滤器),并储存在4℃下长达一个月
100X聚-D-赖氨酸(PDL) 5毫克聚-D-赖氨酸
无菌去离子水
100倍的PDL股可以在-20℃在单次使用的等分试样进行冷冻保存。使用时,稀释在无菌去离子水至1倍
木瓜蛋白酶缓冲 见表2
DNA酶 12500ü的DNase I
1毫升EBSS
在冰溶解酶I 1毫升冷水EBSS的。等分试样( 例如 ,300微升/管)并冷冻过夜,在-20℃下。存储在-20℃。
4%BSA 8克BSA
200毫升DPBS
溶解的BSA在150毫升DPBS在37℃。将pH调节至7.4以〜将1ml的1N NaOH。使体积为200毫升通过0.22微米的过滤器过滤消毒。使1ml等份并储存在-20℃。
10X螺卵类粘蛋白 3克BSA
200毫升DPBS
3克胰蛋白酶抑制剂
加入BSA至150ml DPBS拌匀。加入胰蛋白酶抑制剂,混合溶解。添加约1毫升的1N NaOH以调节pH至7.4。使体积为200毫升的DPBS。过滤消毒用0.22微米的过滤器。使1ml等份并储存在-20℃。
6X喜卵类粘蛋白 6克BSA
200毫升DPBS
6克胰蛋白酶抑制剂
加入BSA至150ml DPBS拌匀。加入胰蛋白酶抑制剂,混合溶解。添加约1毫升1N的NaOH将pH调节至7.4。使体积为200毫升的DPBS。过滤消毒用0.22微米的过滤器。使1米等份并储存在-20℃。
SATO基地 见表3
佐藤媒体(大鼠) 1%SATO基地
1%青霉素/链霉素
1%0.5毫克/毫升的胰岛素
1%L-谷氨酰胺
0.1%NAC
0.1%生物素
做了DMEM和过滤消毒。
佐藤媒体(小鼠) 1%SATO基地
1%0.5毫克/毫升的胰岛素
1%青霉素/链霉素
1%L-谷氨酰胺
0.1%NAC
0.1%生物素
0.1%微量元素B
2%B27
做了DMEM和过滤消毒。
胰岛素 10毫克胰岛素
20毫升无菌deionzed水
添加胰岛素到去离子水中,并添加100微升1N HCl中,以允许胰岛素溶解。拌匀。通过0.22微米的过滤器,并储存在4℃下4-6周过滤
NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸) 5毫克/毫升的NAC
DMEM
溶解的NAC在DMEM作出5毫克/ ml的溶液,分装并储存于-20℃。
d-生物素 50μg/ ml的生物素
无菌去离子水
溶解生物素在水,使50微克/毫升的溶液,分装并储存于-20℃。
CNTF(睫状神经营养因子) 10μg/ ml的CNTF
在DPBS 0.2%BSA的
稀CNTF做出10微克/毫升的溶液用DPBS无菌0.2%BSA中。等分试样,在液氮中,并储存在-80℃的闪冻。
PDGF(血小板衍生的生长因子) 10μg/ ml的PDGF
在DPBS 0.2%BSA的
稀PDGF主存量(根据制造商的说明制备)至10微克/毫升与在DPBS无菌0.2%BSA中。等分试样,在液氮中,并储存在-80℃的闪冻。
NT3(神经营养因子-3) 1微克/毫升的NT-3
在DPBS 0.2%BSA的
淡化NT3主STOCK(根据制造商的说明制备)至1微克/毫升与在DPBS无菌0.2%BSA中。等分试样,在液氮中,并储存在-80℃的闪冻。
毛喉素 50毫克毛喉素
无菌DMSO
加入1毫升无菌DMSO至50毫克,一瓶毛喉拌匀悬浮充分。转移至15ml管中,并添加11毫升无菌DMSO中以达到4.2毫克/毫升的浓度。分装和储存在-20℃。

表3.股票的解决方案。

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Discussion

轴突的髓鞘为脊椎动物的中央和外周神经系统的最佳功能的关键过程。髓轴突的生成和维护是一项涉及神经元之间的分子相互作用,胶质(来自雪旺氏细胞或少突胶质细胞)和细胞外基质蛋白的复杂和协调的过程。这个协议的意义和适用性是它允许操纵蛋白的内混合共培养设置一个特定的细胞类型。作为多种细胞类型中涉及髓鞘在体内和在体外髓鞘测定中,使用钝的药理学工具,以阻止特定蛋白质的活性或信号传导途径不能提供有关影响特定信息蛋白施加在髓鞘形成从任一神经元或胶质的角度来看,除非该蛋白质是由一种细胞类型特异表达。因此, 在体外髓鞘作为说,在与使用慢病毒的特异性转导的OPCs一起允许我们询问效果少突胶质细胞蛋白施加在髓鞘形成。我们已经成功地使用2K7慢病毒以过表达特定蛋白特异性在少突胶质细胞的体外测定髓鞘形成以剖析该少突胶质细胞的信号时的CNS髓鞘9发挥的效果。

以实现在体外测定髓鞘形成的转导的OPC再现的结果,最优化是必需的协议从通过解剖和OPC播种克隆的每个步骤。当务之急是,在DNA水平,含有感兴趣构建体的标记基因的载体pENTR载体进行测序,而2K7的DNA与感兴趣的标记基因通过Western印迹的标记和感兴趣的基因表达的遏制,之前使用DNA来产生病毒。重要的是要选择使用HEK293Tcells或HEK293FT细胞产生病毒和支原体自由的环境下生长。制备的慢病毒后滴定每批病毒确定最佳稀释到OPCs的使用是很重要的。这可以通过加入各种病毒稀释到HEK293T细胞或OPCs的工作要做。作为2K7构建体包含和GFP所述的感兴趣基因,转导的功效可以通过GFP的荧光显微镜的表达和通过测定该标记的和通过Western印迹分析感兴趣的基因的表达进行评估。更明亮的GFP +细胞成为具有较高的病毒浓度可见的,因为它有可能为多个病毒颗粒感染的单个的细胞。的GFP通过荧光显微镜中的表达的验证是病毒的GFP和表达滴度的一个有用的指标,但不能用来作为替代,用于检查感兴趣的蛋白质的表达。它来验证感兴趣的蛋白质的表达水平在两种HEK293T细胞是关键的,因此并通过的OPC免疫印迹分析。如果感兴趣的蛋白是内生通过在共培养的神经元表达,过度表达通过的OPCs /的OL可以在分析共培养裂解物通过免疫印迹所掩盖;从而要么标记的兴趣或培养的姐妹的OPCs以下播种的蛋白质,以便感兴趣的蛋白质的表达可以在姐姐OPCs的验证,如果不是在共培养是很重要的。

无论DRG和OPC文化素质直接决定如果实验成功。在共培养的设置,鼠背根神经节,可与共培养无论从大鼠或小鼠来源的OPC。 OPCs的需要轻柔而迅速的处理。如太少不能有效地转导,导致利息和过多病毒蛋白质的表达水平低是有毒的OPCs所以有太少的细胞播种到神经元的OPCs优化病毒滴度为OPCs的是重要的。这两个次优转导可能resul吨髓鞘或髓鞘蛋白表达无法分析或微不足道的变化。 OPCs的区分,如果它们变得过度汇合,并且不能接种他们是否已分化后,OPCs的培养和转导的需求因而数进行优化,以当地的条件。理想的是种子的OPCs每个髓鞘测定允许有髓轴突的段数的直接比较相同数量在多个实验条件之间进行比较。

这种技术的潜在的局限性是在髓鞘测​​定之间基底髓鞘水平的可变性。以下病毒转导,髓鞘的基础水平被降低,这表明病毒感染的OPCs不髓鞘以及幼稚(非病毒感染的)的OPCs。这可以通过量化至基底髓鞘在每次测定的相对髓鞘的程度来克服。因此,表达仅GFP空载体,必须使用作为内部对照醇。除了髓鞘,目的蛋白质的表达也可能影响的OPCs如存活,增殖和分化的其它方面,导致对髓鞘形成的间接影响。因此,OPC行为分析,如细胞活力应该同时进行,从而髓鞘检测。

此处所描述的病毒转导的方法不限于少突胶质细胞髓鞘形成的研究;事实上,它可以推广和应用,研究其它细胞类型,例如许旺细胞,星形胶质细胞,以及神经元而可能需要的单独的细胞类型优化。这个协议提供了巨大的灵活性来研究细胞的行为,如增殖和分化由感兴趣(野生型或突变体)在所需的细胞类型,使用的是混合细胞培养系统时,其具有特别的优势的蛋白的选择性过表达。了用于转导的细胞可以从大鼠或分离小鼠(野生型或转基因),因此允许的信令和补偿机制在转基因动物的有针对性的研究,这是通常难以实现和更耗时比使用体内转基因小鼠模型。最近的证据表明,所述慢病毒为基础的策略,已经成功地用于细胞转导的动物模型13,这表明转导使用慢病毒的方法在体内少突胶质细胞的强烈潜力。

总之, 在体外测定髓鞘形成用慢病毒感染的OPCs组合提供了所涉及的髓鞘形成的分子机制的分析的战略工具。特定蛋白质的髓鞘的作用,可被询问并作为OPCs能从大鼠和小鼠中分离对大鼠DRG共培养物的使用,慢病毒的方法也可以组合使用各种鼠标线询问机甲敲除技术在髓鞘形成的处理补偿anisms。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2K7 lentivector  Kind gift from Dr Suter9
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100mg
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 115545205
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) Life Technologies A11005
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11012
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement Stem Cell Technologies  5711
BDNF (Human) Peprotech PT450021000
Biotin (d-Biotin) Sigma Aldrich B4639
Bradford Reagent Sigma Aldrich B6916-500ML  
BSA Sigma Aldrich A4161
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-100G
CNTF Peprotech 450-13020
DAKO fluoresence mounting media DAKO S302380-2
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Life Technologies 10313039
DNase Sigma-Aldrich D5025-375KU
DPBS Life Technologies 14190250
DPBS, calcium, magnesium Life Technologies 14040182
EBSS Life Technologies 14155063
EcoRI-HF NEB R3101
Entry vectors for promoter and gene of interest Generate as per protocols 1-2
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C
Forskolin  Sigma Aldrich F6886-50MG
Glucose (D-glucose) Sigma-Aldrich G7528
Glycerol Chem Supply GL010-500M See stock solutions
Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115005003
Goat Anti-Mouse IgM  Jackson ImmunoResearch 115005020
Goat Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch 112005167
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
Igepal Sigma Aldrich I3021-100ML 
Insulin  Sigma Aldrich I6634 
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615
Laminin  Life Technologies 23017015
LB Medium See stock solutions
LB-Agar See stock solutions
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-7477
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415064
L-Glutamate Sigma-Aldrich G1626
L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid Life Technologies 25030081
LR Clonase II Plus enzyme Life Technologies 12538-120
MEM, NEAA, no Glutamine Life Technologies 10370088
Mouse α βIII Tubulin  Promega G7121
Mouse αMBP (monoclonal) Millipore MAB381
Na pyruvate  Life Technologies 11360-070
NAC Sigma Aldrich A8199
NcoI-HF NEB R3193S
NEBuffer 4 NEB B7004S
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
NGF (mouse) Alomone Labs N-100
NT-3 Peprotech  450-03
O1 antibody - Mouse anti-O1 Millipore MAB344 Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable
O1 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning
O4 antibody - Mouse anti-O4 Millipore MAB345 Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable
O4 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning
Competent cells Life Technologies A10460
One Shot Stbl competent cells Life Technologies C7373-03
Papain Suspension Worthington/Cooper LS003126
pBR8.91 Kind gift from Dr Denham10
PDGF-AA (Human) Peprotech PT10013A500  
Penicillin-streptomycin 100x solution Life Technologies 15140122
pENTRY4IRES2GFP Invitrogen 11818-010 
pMD2.G Addgene 12259
Poly-D-lysine Sigma P6407-5MG
Polyethylenimine (PEI)  Sigma-Aldrich 408727-100ML
Poly-L-ornithine  Sigma Aldrich  P3655
Progesterone  Sigma Aldrich P8783
Protease inhibitor tablet (Complete mini) Roche 11836153001
Proteinase K Supplied with Clonase enzyme
Putrescine Sigma Aldrich P-5780
Rabbit α neurofilament Millipore AB1987  
Rabbit αMBP (polyclonal) Millipore AB980
Ran2 hybridoma cells ATCC TIB-119 Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning
Rat anti CD140A/PDGFRa antibody BD Pharmingen 558774
SacII NEB R0157
SOC medium Supplied with competent bacteria
Sodium selenite  Sigma Aldrich S5261
Spe I NEB R0133S
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Buffer NEB B0202S
TE buffer pH8 See stock solutions
TNE lysis buffer
Trace Elements B Cellgro  99-175-CI
Transferrin (apo-Transferrin human) Sigma-Aldrich T1147
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White Roche 10109878001
Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) Life Technologies 25300-054
Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 Vector laboratories  L-1100
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G

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References

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