Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para

Developmental Biology

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Peckham, H. M., Ferner, A. H., Giuffrida, L., Murray, S. S., Xiao, J. Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays. J. Vis. Exp. (95), e52179, doi:10.3791/52179 (2015).

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Abstract

La mielinización es un proceso complejo que implica tanto a las neuronas y las células gliales que forman la mielina, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS) y células de Schwann en el sistema nervioso periférico (SNP). Utilizamos un ensayo in vitro en la mielinización, un modelo establecido para el estudio de la mielinización del SNC in vitro. Para ello, se añaden las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) a las neuronas purificados dorsal roedor ganglio de la raíz primaria (GRD) para formar co-cultivos myelinating. Con el fin de interrogar específicamente el papel que determinadas proteínas expresadas por los oligodendrocitos ejercen sobre la mielinización hemos desarrollado protocolos que transducen selectivamente OPC utilizando el lentivirus sobreexpresan tipo salvaje, proteínas negativas constitutivamente activos o dominantes antes de ser sembradas en las neuronas DRG. Esto nos permite interrogar específicamente las funciones de estas proteínas oligodendrogliales en la regulación de la mielinización. Los protocolos también pueden aplicarse en el estudio de otsus tipos de células, proporcionando de este modo un enfoque que permite la manipulación selectiva de las proteínas expresadas por un tipo de célula deseada, tales como los oligodendrocitos para el estudio selectivo de señalización y mecanismos de compensación. En conclusión, la combinación de la mielinización ensayo in vitro con los OPC lentiviral infección proporciona una herramienta estratégica para el análisis de los mecanismos moleculares implicados en la mielinización.

Introduction

La mielinización de los axones es crucial para la transmisión rápida y eficaz de los potenciales de acción en los sistemas nerviosos central y periférico. Las células especializadas, las células de Schwann en el sistema nervioso periférico y los oligodendrocitos en el sistema nervioso central, y se envuelven alrededor de los axones en ensheathe mielina, aislantes efectivamente el nervio y que facilitan la conducción saltatoria 1. El proceso de mielinización puede ser estudiada in vitro usando las neuronas ganglionares de la retina 2, nanofibras de ingeniería 3, o neuronas ganglionares de la raíz dorsal co-cultivadas con células de Schwann o 4 oligodendrocitos 5-7. El ensayo de mielinización in vitro es un modelo establecido para el estudio de la mielinización del sistema nervioso y se replica muchos de los procesos fundamentales que ocurren durante la mielinización in vivo 5-8. El ensayo consiste en la co-cultivo de las poblaciones purificadas de Ganglio de raíz dorsal (GRD) neuronas, con los OPC (para CNS mielinización) o células de Schwann (por PNS mielinización). En condiciones específicas de estas células mielinizantes ensheathe axones DRG en la ordenada y ultra verificado estructuralmente, hoja multi-lamelar de aislante membrana plasmática que expresan el mismo complemento de proteínas específicas de mielina presentes in vivo.

El modelo de célula más comúnmente utilizado de estudiar la mielinización del SNC in vitro es el co-cultivos de neuronas DRG y OPC, que han sido utilizados con éxito para estudiar el efecto que los factores exógenos tales como las neurotrofinas ejercen sobre la mielinización del SNC in vitro 5,6. Los factores exógenos tales como factores de crecimiento o inhibidores farmacológicos de moléculas pequeñas se han utilizado ampliamente para estudiar el papel de vías de señalización en la mielinización utilizando el DRG-OPC modelo de cocultivo 7,9. Sin embargo, en la configuración de co-cultivo mixto que contienen tanto las neuronas y oligodendrocitos, se mantuvo formalmente posible que cualquiera de los factores de crecimiento o la pharinhibidores macológico podrían haber ejercido efectos en tanto las neuronas y oligodendrocitos (OL) DRG. Este sí ofrece la capacidad de diseccionar específicamente las funciones que las proteínas expresadas únicamente por GRD o oligodendroglia ejerce sobre la mielinización utilizando este sistema celular dual. Para confirmar inequívocamente que la vía de señalización en oligodendroglial regula directamente la mielinización, la transducción lentiviral de OPC, antes de sembrar en las neuronas DRG para el ensayo de mielinización in vitro, ha demostrado ser una manera elegante de sobreexpresan tanto de tipo salvaje y las proteínas mutantes, así como expresión desmontables de proteínas constitutivamente expresadas por los oligodendrocitos. Así, este enfoque ofrece una vía para interrogar y manipular las vías de señalización dentro de los oligodendrocitos para el estudio de la mielinización 9,10 específicamente.

En este artículo analizamos los métodos que hemos desarrollado para sobreexpresan una proteína de interés de forma selectiva en los oligodendrocitos a través de un lentiviralenfoque para el estudio de la mielinización in vitro. La técnica comienza con la generación de vectores de expresión que contienen el gen de interés, ya sea en un tipo salvaje, forma negativa constitutivamente activa o dominante que luego se clonó posteriormente en el vector pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Este vector (que contiene el gen de interés), el donante promotor CMV (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) y el lentivector 2K7 se combinan en una reacción enzimática para producir un vector que contiene el promotor CMV 2K7, el gen de interés, una sitio interno de entrada ribosomal y las buenas prácticas agrarias (Figura 1). Este constructo clonado 2K7 puerta de enlace combinada con la envoltura del virus PMD2.G y el paquete de virus pBR8.91 se puede co-transfectadas en células HEK293T para generar lentivirus que posteriormente se puede usar para transducir OPC. Una vez infectado con el lentivirus los OPCs expresan un alto nivel de la proteína de interés. Estos OPC pueden ser sembradas en cultivos de neuronas DRG y el efecto que la expresiónde altos niveles de la proteína deseada ejerce sobre la mielinización puede ser interrogado. Los co-cultivos se evaluaron para la expresión de proteínas de mielina por análisis de transferencia Western y se visualizaron para la formación de segmentos axonales mielinizadas por inmunocitoquímica.

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Protocol

NOTA: Todos los animales utilizados para este estudio eran de sexo mixto y se crió en el Animalario del Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica y El Instituto de Neurociencias Florey y la Investigación en Salud Mental de la Universidad de Melbourne. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por los Comités de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Melbourne.

1. Clonación de 2K7 LentiVector

  1. Antes de clonar el gen de interés en el vector lentiviral 2K7, subclonar el gen en el vector pENTR (3637 pb, resistente a la kanamicina) utilizando técnicas moleculares estándar 11. Utilice los sitios de restricción EcoRI y SacII para la subclonación.
  2. La amplificación de la 2K7 lentivector
    1. Transformar ADN lentivector 2K7 mezclando suavemente 100 ng de ADN plasmídico con las células competentes y se incuba en hielo durante 30 min.
    2. ADN de choque térmico / células competentes mezcla a 42 ° C durante 90 segundos y la placa en platos de agar LB que contienen tanto ampiciLLIN (100 g / ml) y cloranfenicol (15 mg / ml) a 37 ° C durante 16-18 h.
      NOTA: El cloranfenicol se usa para prevenir la recombinación entre las repeticiones terminales largas.
    3. Al día siguiente, crecer selecciona clones bacterianos en medio LB que contenía ampicilina (100 mg / ml) y cloranfenicol (15 mg / ml) a 37 ° C durante 16-18 h. Extraer el ADN usando un kit DNA maxiprep plásmido comercial según las instrucciones del fabricante.
  3. Sub-clonación de pENTR vector para 2K7 lentivector (Figura 1)
    Figura 1
    Figura 1:. Representación esquemática del proceso de recombinación de puerta de enlace El gen de interés, aquí representado como Flag-Erk1, se clonó en el vector pENTR L1-L2. Esto se añade al vector pENTR L4-R1 que contiene el promotor CMV y el vector 2K7 columna vertebral. Estos tres vectores se recombinan por la enzima LR Clonase II Plus ainsertar el gen de intereses y el promotor en el 2K7 vector de virus listo.
    1. Agregue lo siguiente a un tubo de 1,5 ml y mezclar suavemente:
      L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotor) (60 BNG) 1-2,5 l
      L1-L2 pENTR4IRES2GFP (con el gen de interés) (80 BNG) 1-2,5 l
      K7 lentivector (80 ng / l) 1 l
      TE-buffer, pH 82-5 l
      Total de 8 l
    2. Eliminar mezcla de enzimas clonase de -80 ° C y descongelar en hielo durante 2 min. Asegúrese de que esta enzima es una parte alícuota de -80 ° C como la enzima ha reducido sustancialmente la eficacia de clonado con los ciclos de congelación-descongelación
    3. Añadir 2 l de enzima por reacción y mezclar bien a través de vórtice, y se incuba la mezcla de reacción clonasa a 23-25 ​​° C durante 6-24 h.
    4. Añadir 1 l de solución de proteinasa K (suministrado con el kit de enzima) a la mezcla de reacción clonase y se incuba durante 10 min a 37 ° C.
    5. Transformar mezcla de reacción clonasa en células competentes y crecer el selectocolonias en medio LB que contenía ampicilina (100 mg / ml) a 37 ° C durante 16-18 horas.
    6. Extraer y purificar el ADN utilizando un kit de DNA Miniprep plásmido comercial según las instrucciones del fabricante.
    7. Confirmar el ADN a través de la digestión usando las enzimas de restricción Spe I y Sac II y un tampón apropiado como por las instrucciones del fabricante para eliminar el fragmento que contiene el promotor y el gen de interés.
      NOTA: Este paso es fundamental para comprobar si el ADN subclonado tiene el gen inserto correcto de intereses con el esqueleto del vector derecha. El tamaño del vector por sí mismo sin fragmento insertado es 6,7 kb. El tamaño del fragmento insertado liberada incluye tanto el promotor y el gen inserto de interés. Calcular los tamaños de los fragmentos esperados de la digestión para el gen específico a través de un programa de edición de secuencia de ADN, por ejemplo, APE - Un editor de plásmido.
    8. Compruebe los tamaños de ambos esqueleto del vector de ADN y el fragmento liberado mediante la ejecución de un gel de agarosa al 1%en tampón TAE 1x (ver Tabla de soluciones de reserva) a 100 V.
    9. Amplificar el ADN confirmado por el crecimiento de bacterias en 500 ml de medio LB que contenía ampicilina (100 mg / ml) a 37 ° C durante 16-18 h.
    10. Extraer y purificar el ADN usando un kit DNA maxiprep plásmido comercial según las instrucciones del fabricante.
      NOTA: maxiprep normalmente genera suficiente cantidad de ADN necesaria para la producción viral.
  4. Repita los pasos 1.3.9-1.3.10 para amplificar los siguientes ADNs para preparaciones lentiviral: Sobre vector (PMD2.G, 6,1 kb), vector de paquetes (pBR8.91, 12,5 kb) y un vector lentiviral vacío como control (GFP -CMV-2K7, 8,7 kb).

2. 2K7 Producción Virus

NOTA: Día 1:

  1. En el día de la transfección, placa 32 millones de células HEK293 T en frasco T175 que contiene 25 ml de medio de células HEK293 T (véase la Tabla de soluciones de reserva). Alternativamente, la placa 16 millones de células del díaantes de la transfección se ejecuta si el tiempo ajustado en el día de la transfección.
    NOTA: La transfección puede ser el mismo éxito en placas las células en el día de la transfección o antes del día. El uso de cualquiera de las dos alternativas, el punto crítico aquí es hacer que las células seguro de ser pegado hacia abajo en la superficie de placa de cultivo antes de la transfección.
    NOTA: Día 2:
  2. La transfección
    1. Antes de la transfección, diluir ADN a 1 mg / l en tampón TE que contiene Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8 en agua desionizada.
    2. En un tubo de 50 ml, preparar una mezcla maestra (Tabla 1) para la transfección en el matraz T175. Añadir ADN para pre-calentado medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y mezclar bien por vortex, a continuación, añadir polietilenimina estéril (PEI) (véase la Tabla de soluciones de reserva) para evitar la precipitación prematura. ">
      Vector trong> Concentración Volumen
      pMDG.2 1 mg / l 5 l
      pBR8.91 1 mg / l 15 l
      Vector 2K7 con GFP + gen de interés 1 mg / l 22 l
      Polietilenimina Estéril (PEI) 1 g / L 500 l
      DMEM 2100 l
      Tabla 1: Preparación de mezcla de transfección para 2K7 Virus.
    3. Mezclar bien invirtiendo el 3-4x tubo e incubar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
    4. Realizar un cambio de medio completo en las células HEK293T. Aspirar los medios de cultivo de las células completamente y alimentar con medios de cultivo celular HEK293T pre-calentado (25 ml por matraz T175).
    5. Añadir la mezcla de transfección (ADN mezcla / PEI) gota a gota a la monocapa de células. Mueva suavemente para mezclar bien e incubar células transfectadas a 37 ° C, 5% de CO2, durante la noche.
      NOTA: Día 3:
    6. Para garantizar la transfección se realiza correctamente, compruebe la expresión de GFP 24 horas después de la transfección a través de un microscopio de fluorescencia.
      NOTA: Más del 50% de las células que expresan GFP suele indicar una buena transfección.
      NOTA: Día 4:
    7. Al 48 horas después de la transfección, recoger el sobrenadante viral y reemplazar con medios HEK293 T frescas (25 ml por matraz T175).
      1. Centrifugar el sobrenadante viral a 1140 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar los desechos de células del sobrenadante. Transferencia aclaró sobrenadante para tubo de 50 ml y se almacena a 4 ° C.
        NOTA: Día 5:
    8. En 72 horas después de la transfección, recoger el segundo lote de sobrenadante viral. Repita el paso 2.3.1 y piscina 48 y 72 hr borran sobrenadantes.
    9. Para concentrar el virus, el sobrenadante viral se centrifuga a 170.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando 30 ml tubos de ultracentrífuga.
    10. Descartar el sobrenadante y repetir el paso 2.6 hasta que todo el sobrenadante clarificado se ha centrifugado dejando un (invisible) de pellets de virus más precipitado PEI en la base del tubo.
    11. Para volver a suspender virus, añadir 500 l SATO medios de comunicación (véase la Tabla de soluciones de reserva) a los tubos de ultracentrífuga. Vortex durante 30 segundos unand raspar la base del tubo con una punta de pipeta para aflojar mecánicamente el virus. Repita este paso 6x con el fin de perder pellet viral.
    12. En común el virus se resuspendió en tubos de microcentrífuga y girar muy brevemente para eliminar PEI insoluble. Se filtra el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micras para eliminar las proteínas.
    13. Alícuota del virus en 20 l, 50 l, y alícuotas de 100 ly se almacena a -80 ° C.

    3. Determinación del título viral en células HEK293T

    1. Para comprobar la expresión de la proteína de interés y para determinar la concentración viral óptima para los experimentos, añadir una serie de diluciones en serie de acciones viral (por ejemplo, 0, 5, 10, 20, 40, 80 l) para transducir células HEK293 T sembraron en placas de 6 pocillos, y la cultura durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Este protocolo genera típicamente virus que se puede utilizar en concentraciones que van de 1:50 a 1: 200 que lograr la expresión robusta del gen deinterés.
    2. 48 hr transducción viral posterior, las células HEK293T lisan en tampón TNE (ver Tabla de solución madre) con inhibidores de la proteasa.
      1. Enjuague pocillos dos veces con DPBS enfriado y luego añadir tampón TNE 150 l a cada pocillo.
      2. Lyse células pipeteando arriba y abajo 5-10x. Transferencia de lisados ​​de células enteras para tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se incuba en hielo durante 15-30 min.
      3. Centrifugar los lisados ​​a 4 ° C durante 30 min a velocidad máxima (20.000 xg) y la transferencia se aclaró el sobrenadante a un tubo nuevo para la determinación de proteínas por Bradford y análisis de transferencia western posterior.
    3. Determinar el nivel de expresión de la proteína de interés por Western blot estándar, mientras que el sondeo de anticuerpos frente a la proteína en sí y la etiqueta fundido (es decir, de la bandera). Utilice la dilución viral que produce células> 95% GFP + y sólida expresión de la proteína de interés para los experimentos.

    4. Aislamiento y cultivo de los GRD (Figura 2 los pasos 1 y 2)

    Figura 2
    Figura 2: Diagrama esquemático. De la mielinización de ensayo in vitro neuronas DRG se disecan a partir de crías de rata P2-3, a continuación, purificados y cultivados durante dos semanas (1-2). OPCs se purificaron a partir de cerebros de ratas usando P7-9 immunopanning (3). OPCs resultan luego infectados por lentivirus y se cultivaron durante 48 horas (4). OPCs son entonces sembradas en GRD, y se añaden los factores de crecimiento de interés tales como BDNF (5). Co-cultivos se cultivaron durante 2 semanas para permitir que los OPC para diferenciar y mielinizan los axones (6). Por último, co-cultivos se lisan ya sea para el Western Blot o fijos para inmunocitoquímica (7).

    NOTA: Día 1- 2 días antes de la disección:

    <ol>
  3. Escudo autoclave 22 mm x 22 mm cubreobjetos con poli-L-ornitina (0,5 mg / ml) en una placa de 6 pocillos, y se incuba a 37 ° C durante la noche.
  4. Al día siguiente, cubreobjetos de la capa de nuevo con laminina (20 g / ml en MEM) a 37 ° C durante la noche, aspirar el exceso y seco durante 20 minutos en campana de cultivo de tejido.
    NOTA: Día 2: La disección y aislamiento de los GRD:
  5. Cachorros Sacrificio P2-P3 de rata 12x por transección cervical.
  6. Retire la piel que recubre el músculo de la parte posterior del animal. Utilice Vannas tijeras para abrir agujero vertebral y el uso de fórceps para sacar con cuidado la médula espinal.
  7. Arranca GRD que se encuentran en medio de las columnas vertebrales y cortar las fibras nerviosas de la médula adjuntos, luego coloque GRD en un plato de Petri de 33 mm que contiene 3 ml L-15 medios de comunicación. Por lo general, es posible reunir entre 8 y 12 DRG de cada lado de la médula espinal
  8. Transferencia de recogida GRD junto con los medios de comunicación L-15 en un tubo de 15 ml, se centrifuga a 180 xg durante 5 min.
  9. Aspiradoel sobrenadante, añadir 2 ml 0,25% de tripsina a DRG gránulos y se incuba a 37 ° C durante 30 min.
  10. Añadir 5 ml de medio M1 (véase la Tabla de solución madre) a los pellets de DRG para detener la tripsina, y se centrifuga a 180 xg durante 3 min a TA.
  11. Aspirar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento en 2 ml de medio M1 precalentado (no con factores de crecimiento). Se tritura el pellet ganglios pipeteando 50x o hasta los ganglios se dispersan. Suspensión de células se centrifuga a 180 xg durante 3 min.
  12. Resuspender disociado neuronas en medios M1 y la placa en una placa de 6 pocillos a 5 ganglios por 100 l por pocillo.
  13. Para eliminar la proliferación de células no neuronales, después de un mínimo de 4 h de incubación para facilitar la fijación, retirar el medio M1 y alimentar las neuronas con los medios de comunicación M2 (véase la Tabla de solución madre). Cultura neuronas DRG en presencia de NGF (100 ng / ml) para purificar una cultura de GRD TrkA-expresión de NGF-dependientes. Alternativamente, utilizar BDNF (100 ng / ml) para purificar TrkB-expres BDNF dependientecantar GRD.
  14. Mantener las neuronas en los medios de comunicación M1 (+ NGF o BDNF a 100 ng / ml) que alternan con antimitótico M2 medios de comunicación durante 2 semanas siguientes.
  15. Mantener medio M1 (+ NGF o BDNF a 100 ng / ml) en días: 4-6, 8-10, 12-14 y M2 medios de comunicación (+ NGF o BDNF a 100 ng / ml) con FDU y uridina en los días 1 a 4, 6-8, y 10-12. Se requiere un mínimo de 3 ciclos de purificación de los medios de comunicación M2.
  16. Mantener GRD en M1 solo durante una semana más después de completar el ciclo de antimitótico 2 semanas. Cambie medios M1 cada 2-3 días.

5. Aislamiento y cultivo de los OPC (Figura 2 paso 3)

NOTA: Día 1- 2 días antes de la disección:

  1. Coat 10 cm placas de cultivo de tejido con poli-D-lisina (PDL, 10 g / ml en agua desionizada esterilizada) a 4 ° C durante la noche.
    NOTA: Día 2: 1 día antes de la disección:
  2. Lave las placas de PDL con agua destilada esterilizada para 3x. Deje secar durante ~ 6 h en campana de cultivo de tejidos. Si no se utiliza inmediatamente, envuelva y tiendapara un máximo de 4 semanas a 4 ° C.
  3. Preparar placas de anticuerpos secundarios para immunopanning. Para 1 disección de cerebro, preparar planchas de IgG 2x (por Ran2 anticuerpo para eliminar astrocitos y anticuerpo O1 para eliminar premielinizantes oligodendrocitos), con 45 l de IgG de cabra α ratón en DPBS (15 ml) por 10 cm placa de Petri; 1x placa de IgM para (anticuerpo O4 para la selección de células precursoras de oligodendrocitos), 45 l de cabra α IgM de ratón en DPBS (15 ml) por 10 cm placa de Petri.
    NOTA: Día 3: Día de la disección:
  4. Añadir 200 unidades de papaína en 10 ml de tampón de papaína (Tabla 2), y calentar a 37 ° C hasta que el buffer se vuelve claro.
    Concentración para 250 ml La concentración final
    EBSS social 10x 25 ml 1x
    MgSO 4 100 mM 2,5 ml 1 mM
    Glucosa 30% 3 ml 0,46%
    EGTA 0,5 M 1 ml 2 mM
    NaHCO 3 1 M 6,5 ml 26 mM
    Aumentar el volumen hasta 250 ml con agua desionizada y se esteriliza con filtro
    Tabla 2: Preparación de tampón de papaína.
  5. Lave todas las placas de anticuerpos secundarias con DPBS de 3x.
  6. Verter el anticuerpo Ran2 y O1 sobre las placas de IgG y el hibridoma O4 a la placa de IgM. Incubar todas estas placas de anticuerpo primario durante más de 2 horas a RT.
  7. Diseccionar un cerebro de una rata P7. Decapitar a un cachorro con tijeras afiladas y quitar la piel que cubre el cráneo con tijeras.
    1. Corte alrededor del cráneo del lóbulo occipital, el lóbulo temporal y el lóbulo frontal. Eliminar cerebro de cráneo usando un fórceps y suavemente transferirlo a un 35-mm placa de Petri con 1 ml de DPBS.
    2. Cortar el cerebro en pedazos pequeños o menos con unas tijeras o una cuchilla estéril.
  8. Filtro pre-calentado tampón la papaína (10 ml) en un nuevo tubo de 15 ml que contiene unos granos de L-cisteína, a continuación, añadir 200 l de ADNasa (12.500 U / ml) al tampón de la papaína se filtró.
  9. Vierta el buffer papaína en los tejidos del cerebro en cubitos; incubar a 37 ° C durante 90 min.
  10. Transferencia Gentlly disociarse los tejidos del cerebro en el tubo de 50 ml con una pipeta 25 ml yse deja reposar.
  11. Retire búfer papaína, añadir 2 ml Mín Ovo (ovomucoide) a los tejidos cerebrales y titurate 5-10x con la pipeta para romper trozos de tejidos cerebrales, dejar reposar y quitar la parte superior 2 ml de sobrenadante a un nuevo tubo.
  12. Añadir otra 2 ml Mín Ovo a los tejidos cerebrales y repita el paso 5.11 hasta que no haya trozos de tejido permanecen. La trituración puede obtener cada vez más agresivo.
  13. Centrifugar la suspensión celular disociada durante 15 min a 200 x g. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml Hola Ovo y centrifugar durante 15 min a 200 x g.
  14. Lave primera placa immunopanning (Ran 2 placa) con DPBS de 3x. Aspirar el sobrenadante, Resuspender las células en 10 ml de tampón panning (Tabla 2) y se vierte a la primera placa de immunopanning (Ran 2 plato). Se incuban las células durante 15 min a RT.
  15. Lave la segunda placa immunopanning (placa O1) con DPBS de 3x.
  16. Después de la incubación en la primera placa de immunopanning, la punta de la suspensión celular en segundoplaca immunopanning (placa O1), Enjuagar las células sueltas de la superficie de la placa con 1-3 ml de paneo tampón y extraer con la pipeta a la placa O1. Se incuban las células durante 15 min a RT.
  17. Lavar la placa immunopanning tercero (placa O4). Esta placa es la placa de selección positiva en los OPCs unen su superficie. Lavar la placa O4 con DPBS de 3x.
  18. Después de la incubación en la segunda placa immunopanning, transferir las células a la placa immunopanning final (placa O4), incubar las células durante 45 min a RT. Este paso será seleccionar O4 + OPC.
  19. Aspirar el sobrenadante de la última placa immunopanning (placa O4) y enjuagar la placa con EBSS de 6x.
  20. Para eliminar los OPC de la placa, se incuban las células con 5 ml de tibia 0,05% de tripsina-EDTA diluido 1:10 con EBSS a 37 ° C durante 8 min.
  21. Añadir 5 ml de 30% de FBS (hecho en EBSS) para neutralizar la tripsina. Eliminar las células fuera de la superficie de la placa por pipeteado durante aproximadamente 50x.
  22. Transfiera toda celularla suspensión a un tubo nuevo y se centrifuga durante 15 min a 200 x g.
  23. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml pre-calentado medios SATO, seguido por el recuento de células. Disección de un cerebro puede producir 1,5-2.000.000 OPC.
  24. Células placa sobre placas recubiertas de PDL seco a una densidad de entre 1 x 10 5 y 5 x 10 5 por 10 cm de placa con los medios de comunicación en SATO (10 ml) que contienen el factor neurotrófico ciliar (CNTF, 10 ng / ml), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, 10 ng / ml,), la neurotrofina 3 (NT-3, 1 ng / ml), y la forskolina (4,2 mg / ml) 2,12. OPCs cultivo a 37 ° C, 8% de CO 2.

6. OPCs de transducción

  1. OPCs primarios Cultura en SATO medios de comunicación (10 ml / placa de 10 cm) con CNTF (10 ng / ml), PDGF (10 ng / ml), NT3 (1 ng / ml), y la forskolina (4,2 mg / ml) a 37 ° C, 8% de CO 2 durante 24 horas después de la disección.
  2. Completamente aspirar fuera el medio de cultivo OPC, las células de alimentación con recién hecha medios SATO (10 ml) Con factores de crecimiento (véase más arriba en el paso 6.1).
  3. Añadir virus a las OPC a la concentración óptima determinada por el paso 3 (Figura 2, etapa 4), ​​los OPC de cultivo para un 48 horas más.

7. Siembra OPC para mielinizantes Co-culturas (Figura 2, los pasos 5 y 6)

  1. Para eliminar los OPC fuera de la superficie, primero placas OPC enjuague con 8 ml EBSS dos veces, luego incubar las células con 5 ml de agua tibia 0,05% de tripsina-EDTA diluido 1:10 con EBSS a 37 ° C durante 2 min.
  2. Neutralizar la tripsina con 30% FBS en EBSS (5 ml) y eliminar las células de la placa por pipeteado. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml, se centrifuga a 180 xg durante 15 min a TA.
  3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml pre-calentado medios SATO seguido por el recuento de células.
  4. Antes de la siembra OPC, medios completamente aspirado desde la placa de cultivo DRG. Semilla suavemente 200.000 OPCs gota a gota a las neuronas DRG como anteriormente descritos 4-6.
    NOTA:El volumen total de la siembra OPC debe ser inferior a 200 l por 22 mm cubreobjetos.
  5. Deja células para resolver sin mover la placa durante 10 min en la campana de cultivo de tejidos, luego de arriba suavemente con 1 ml pre-calentado medios SATO por pocillo.
  6. Replate los OPCs hermanas restantes con medios SATO con factores de crecimiento (véase el paso 6.1). Utilice estas OPCs hermanas para verificar la expresión de la proteína de interés.
  7. Después de 24 h, reemplazar los medios de comunicación SATO con los medios de co-cultivo (2 ml / pocillo) que contiene medios SATO (sin factores) y neurobasal (v / v) con 1% B27. Mantener los co-cultivos durante 14 días con cambio de medio cada 2-3 días.
  8. Evaluar los co-cultivos para la expresión de proteínas de mielina por análisis de transferencia Western y visualizar para la formación de segmentos axonales mielinizadas por doble inmunotinción con anticuerpos contra marcadores de proteína básica de mielina y los marcadores neuronales 4-6.

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Representative Results

La bandera de etiquetado de señales relacionadas quinasa 1 (Bandera-Erk1) construcción utilizada para la producción de lentivirus es verificado por enzimas de restricción digerir de las construcciones utilizadas, incluyendo tanto las construcciones 2K7 y las construcciones de embalaje y accesorios requeridos para la producción de virus extracelular (Figura 3) .

Figura 3
Figura 3: verificación construcción de ADN. Todos los constructos de ADN necesarias para la producción de lentivirus se purificaron a partir de bacterias Stbl3 y verificados por la enzima de digestión de restricción. Fueron digeridos vectores de accesorios y embalaje con NcoI y EcoRI, como se indica, y se compara con el plásmido sin cortes (A). 2K7-GFP se digirió con SpeI y SacII (A). ADN 2K7-Flag-Erk1 se verificó por digestión con SpeI ya sea o SacII solo, o por digestión doble (B). Patrones de bandas eranen comparación con los patrones esperados generados a partir de la digestión virtual de las secuencias de los fragmentos con software APE.

Para determinar la dilución óptima para usar en los OPC, la Erk 1 lentivirus se tituló en células HEK293T (Figura 4). Esto se hizo mediante la adición de una serie de diluciones virales a las células HEK293T (Figuras 4A, 4C, y 4D) o para los OPC (Figura 4B). Los niveles de expresión del gen aumento de intereses con el tiempo (Figura 4D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: La titulación del virus de la bandera de ERK1 en las células HEK293T y OPC. Virus Flag-Erk1 se tituló en células HEK293T (A, C, D) o los OPC (B). Células HEK293T (A) o OPCs (B) se obtuvieron imágenes de la expresión de GFP 48 horas después de la infección con el virus de la bandera-Erk1. Lisados ​​de células HEK293T se probaron para la presencia de Erk1 o total de Erk1 / 2 después de 48 horas de la infección (C). Lisados ​​de células HEK293T se probaron para la presencia de la bandera, Erk1 / 2 y actina como control de carga, ya sea 48 horas o 96 horas después de la infección con el virus-Flag Erk1 (D). Estas transferencias fueron todos borrados y la imagen juntos para facilitar la comparación directa de los niveles de expresión en los dos puntos de tiempo (D). La barra de escala para (A) = 100 micras. La barra de escala para (B) = 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez que la dilución de virus óptima ha sido determinada, OPCs purificados fueron infectados y se cultivaron durante un mínimo de 48 h para permitir la expresión del transgen para alcanzar suffniveles cientes, luego sembradas en las neuronas DRG para evaluar su potencial de mielinización (Figura 5). Una vez sembradas en las neuronas DRG, los OPC se diferenciarán en oligodendrocitos, y comenzar a expresar proteínas de la mielina, que pueden ser evaluados por el Western Blot (Figura 5C). Algunos oligodendrocitos maduros myelinate, y esto puede ser visualizado a través de la tinción de MBP (Figura 5D). Los axones también necesitan ser manchado con un marcador tal como Neurofilamentos o βIII-tubulina (Figura 5D) para asegurar la densidad axón se toma en cuenta al analizar los niveles de mielinización.

Figura 5
Figura 5: OPCs se infectaron con el virus de Flag-Erk1 durante 48 horas antes de la siembra en las neuronas DRG. OPCs su hermana estaban fijadas y teñidas de la bandera y GFP (A) o lisadas y probaron para la bandera y Erk1 para verificarexpresión de la proteína sobreexpresada-viralmente (C). Co-cultivos se fijaron después de 2 semanas en cultivo y se tiñeron para βIII-tubulina y MBP para visualizar los axones DRG y myelinating así como oligodendrocitos no mielinizantes (B). A oligodendrocitos myelinating se indica por la flecha y un oligodendrocitos no mielinizante se indica por la flecha de cabeza (B). Co-cultivos paralelos se lisaron y se probaron para las proteínas de la mielina y MAG MBP, así como la bandera y ERK1 / 2 para confirmar la expresión del transgén en el co-cultivo (D). Un aumento en los niveles de Erk1 no era visible en el co-cultivo debido a las grandes cantidades de derivados de DRG Erk1 presentes en la barra de lisados ​​Escala = 20 micras.

Nombre Ingredientes Notas
TE tampón de pH 8 MM Tris pH 8 10
EDTA 1 mM pH 8
Maquillaje en agua desionizada.
Polietilenimina (PEI) 1 g / L Maquillaje de las reservas de agua desionizada, filtra-esterilizar y almacenar a -20 ° C.
Medio LB 20 g de triptona
10 g de extracto de levadura
10 g de NaCl
Completar hasta 2 L con agua desionizada
50% de glicerol Glicerol Make up con un volumen igual de agua desionizada y autoclave
HEK 293 medio de células T DMEM
10% de Suero Bovino Fetal
1% de penicilina / estreptomicina
1% de L-glutamina
Tampón de lisis TNE MM Tris pH 8 10
NaCl 150 mM
EDTA 1 mM pH 8
1% de NP40
Disolver NP40 en un volumen menor de agua desionizada primero ya que cristalizará en contacto con el agua. Enrasar final en agua desionizada
M1 MEM
10% de Suero Bovino Fetal
0,4% de D-glucosa
2 nM L-glutamato
1% de penicilina / estreptomicina
Para el uso con las neuronas DRG de rata
MM1 Medio Neurobasal
2% B27 (SM1) suplemento
0,4% de D-glucosa
2 nM L-glutamato
1% de penicilina / estreptomicina
Para el uso con las neuronas DRG ratón
M2 DMEM
10 mg / L de transferrina
5 mg / L de insulina
20 nM progesterona
100 mM putrescina
10 mM FdU
10 mM uridina
Invente M2 en un DMEM mayor volumen sin FdU y uridina para su uso durante 1-2 meses. Añadir FdU y uridina a volúmenes más pequeños que pueden acabar dentro de 2 semanas
mm2 MM1
10 mM FdU
10 mM uridina
Añadir FdU y uridina a volúmenes más pequeños de medio que puede acabar en el plazo de 2 semanas.
10x MT-PBS pH 7,4 28.48 g / l (160 mM) Na 2 HPO 4 · 2H 2 O
5,52 g / L (40 mM) NaH 2 PO 4 · H 2 O
87.66 g / l (1,5 M) de NaCl
Añadir a agua desionizada y ajustar el pH a 7,4 con NaOH 10 N
1x PBS MT- 10x MT-PBS
Agua desionizada
Diluir 10 veces MT-PBS 1:10 en agua desionizada para hacer 1x PBS MT-
10x tampón de borato (1,5 M) Ácido bórico 18,55 g
1x PBS MT-
Disolver ácido bórico en 150 ml de 1x MT-PBS. Ajustar el pH a 8,56 con NaOH 10 N y llevar el volumen final a 200 ml con 1x MT-PBS. Autoclave
1 x tampón de borato (0,15 M) 10x tampón de borato
1x PBS MT-
Preparar 100 ml de este tampón para disolver en PLN. Añadir 10 ml de 10x tampón de borato (pH 8,56) a 90 ml de PBS 1x MT-
0,5 mg / ml de poli-L-ornitina (PLN) 50mg de poli-L-ornitina bromhidrato
0,15 M tampón de borato (pH 8,56)
Disolver 50 mg de bromhidrato de poli-L-ornitina en 100 ml de tampón de borato de 1x. Se esteriliza con filtro (0.22 micras filtro) y se almacena a 4 ° C durante hasta un mes
100x poli-D-lisina (PDL) 5 mg de poli-D-lisina
, Agua desionizada estéril
Stocks 100x PDL se pueden congelar a -20 ° C en alícuotas de un solo uso. Tras su uso, diluir a 1x en agua desionizada estéril
Tampón papaína Ver Tabla 2
DNasa 12.500 U de DNasa I
1 ml de EBSS
En el hielo, disolver la ADNasa I en 1 ml de EBSS enfriada. Alícuota (por ejemplo, 300 l / tubo) y congelar durante la noche a -20 ° C. Almacenar a -20 ° C.
4% de BSA 8 g BSA
200 ml de DPBS
Disolver el BSA en 150 ml de DPBS a 37 ° C. Ajustar el pH a 7,4 con ~1 ml de 1 N NaOH. Llevar el volumen a 200 ml. Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras para esterilizar. Hacer alícuotas de 1 ml y se almacena a -20 ° C.
10x Mín ovomucoide 3 g BSA
200 ml de DPBS
3 g inhibidor de tripsina
Añadir BSA a 150 ml de DPBS y mezclar bien. Añadir inhibidor de tripsina y mezclar hasta que se disuelva. Añadir ~ 1 ml de NaOH 1 N para ajustar el pH a 7,4. Llevar el volumen a 200 ml con DPBS. Esterilizar por filtración con un filtro de 0,22 micras. Hacer alícuotas de 1 ml y se almacena a -20 ° C.
6x Hola ovomucoide 6 g BSA
200 ml de DPBS
6 g de inhibidor de tripsina
Añadir BSA a 150 ml de DPBS y mezclar bien. Añadir inhibidor de tripsina y mezclar hasta que se disuelva. Añadir ~ 1 ml de 1N NaOH para ajustar el pH a 7,4. Llevar el volumen a 200 ml con DPBS. Esterilizar por filtración con un filtro de 0,22 micras. Hacer 1 m alícuotas y almacenar a -20 ° C.
Base de SATO Ver Tabla 3
Medios SATO (rata) 1% de base de SATO
1% de penicilina / estreptomicina
1% 0,5 mg / ml de insulina
1% de L-glutamina
0.1% de NAC
0,1% Biotina
Maquillaje con DMEM y esterilice filtro.
Medios SATO (ratón) 1% de base de SATO
1% 0,5 mg / ml de insulina
1% de penicilina / estreptomicina
1% de L-glutamina
0.1% de NAC
0,1% Biotina
0,1% Elementos Traza B
2% B27
Maquillaje con DMEM y esterilice filtro.
Insulina 10 mg de insulina
Agua deionzed 20 ml estéril
Añadir a la insulina a agua desionizada y añadir 100 l de HCl 1 N para permitir que la insulina se disuelva. Mezclar bien. Filtrar a través de un filtro y almacenar 0,22 micras a 4 ° C durante 4-6 semanas
NAC (N-acetil-L-cisteína) 5 mg / ml NAC
DMEM
Disolver NAC en DMEM hacer una 5 mg/ Ml solución, alícuota y almacenar a -20 ° C.
d-biotina 50 mg / ml de biotina
, Agua desionizada estéril
Disolver la biotina en el agua para hacer una 50 mg / ml solución, alícuota y almacenar a -20 ° C.
CNTF (factor neurotrófico ciliar) 10 mg / ml de CNTF
0,2% de BSA en DPBS
Diluir CNTF para hacer una solución / ml 10 g con estéril BSA 0,2% en DPBS. Alícuota, congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) 10 mg / ml de PDGF
0,2% de BSA en DPBS
Diluir maestro PDGF Stock (preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante) a 10 mg / ml estéril con BSA 0,2% en DPBS. Alícuota, congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
NT3 (neurotrofina-3) 1 mg / ml NT-3
0,2% de BSA en DPBS
Diluir NT3 stoc maestrok (preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante) a 1 mg / ml estéril con BSA 0,2% en DPBS. Alícuota, congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
Forskolin 50 mg Forskolin
DMSO estéril
Añadir 1 ml de DMSO estéril a la botella 50 mg de forskolina y mezclar bien para resuspender completamente. Traslado al tubo de 15 ml y añadir 11 ml de DMSO estéril para alcanzar una concentración de 4,2 mg / ml. Alícuota y almacenar a -20 ° C.

Tabla 3. Las soluciones madre.

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Discussion

La mielinización de los axones es un proceso crucial para la función óptima de los sistemas nerviosos central y periférico de vertebrados. La generación y el mantenimiento de los axones mielinizados es un proceso complejo y coordinado de las interacciones moleculares entre neuronal, glial (a partir de células de Schwann o oligodendrocitos) y proteínas de la matriz extracelular. La importancia y la aplicabilidad de este protocolo es que permite la manipulación de las proteínas en un tipo celular específico dentro de la configuración de co-cultivo mixtos. Como múltiples tipos de células están implicados en la mielinización tanto in vivo como en el ensayo in vitro de la mielinización en, utilizando herramientas farmacológicas romos para bloquear la actividad de proteínas particulares o vías de señalización no pueden proporcionar información específica acerca de la influencia que las proteínas ejercen sobre la mielinización ya sea de un neuronal o perspectiva glial, a menos que la proteína se expresa de forma única por un tipo de célula. Por lo tanto, la mielinización in vitro comodecir, en relación con el uso de Lentivirus para transducir específicamente OPCs nos permite interrogar a los efectos de que las proteínas oligodendrogliales ejercen sobre la mielinización. Hemos utilizado con éxito 2K7 Lentivirus para sobreexpresar proteínas particulares específicamente en oligodendrocitos para el ensayo de mielinización in vitro con el fin de diseccionar el efecto de que las señales oligodendrogliales ejercen sobre la mielinización del SNC 9.

Para obtener resultados reproducibles en el OPC transducidas en el ensayo de mielinización vitro, se requiere de optimización para cada paso del protocolo de la clonación a través de disecciones y OPC siembra. Es imperativo que, a nivel de ADN, el vector pENTR que contiene el gen de interés etiquetado constructo se secuenció y que el ADN 2K7 con el gen etiquetado de interés se comprobó mediante transferencia Western para la expresión de la etiqueta y el gen de interés, antes de usar el ADN para generar virus. Es esencial elegir bien HEK293Tcells o HEK293FT células para generar el virus y crecen bajo micoplasma ambiente libre. Después de producir lentivirus es importante para valorar cada lote de virus para determinar la dilución óptima para usar en OPC. Esto puede hacerse mediante la adición de una serie de diluciones virales a las células HEK293T o para los OPC. Como el constructo 2K7 contiene tanto el gen de interés y GFP, la eficacia de la transducción se puede evaluar mediante la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia y mediante el ensayo de expresión de la etiqueta y el gen de interés mediante análisis de transferencia Western. Células GFP + brillantes se hacen visibles con concentraciones más altas de virus, ya que es posible que múltiples partículas virales para infectar una única célula. Verificación de la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia es un indicador útil de título de virus y la expresión de GFP, pero no se puede utilizar como un sustituto para el control de la expresión de la proteína de interés. Por tanto, es crítico para verificar el nivel de expresión de la proteína de interés tanto en las células HEK293Ty OPCs por Western blot. Si la proteína de interés se expresa de forma endógena por las neuronas en la co-culturas, la sobreexpresión de OPC / OLs puede enmascararse al analizar el lisado de co-cultivo de Western Blot; por lo tanto es importante ya sea etiquetar la proteína de interés o cultura los OPCs hermanas después de la siembra así la expresión de la proteína de interés se puede verificar en las OPCs hermana si no en el co-cultivo.

La calidad tanto de DRG y cultura OPC determina directamente si los experimentos tiene éxito. En la configuración de cocultivo, DRG neuronas de rata pueden cocultivaron con OPCs derivados de cualquiera de rata o ratón. OPCs requieren un manejo suave y rápida. Es importante optimizar el título de virus para los OPC como demasiado poco falla para transducir eficazmente los OPCs que conducen a bajos niveles de expresión de la proteína de interés y el exceso de virus es tóxico para los OPC por lo que hay muy pocas células, a las semillas en las neuronas. Ambas transducciones subóptimos pueden Result en cambios no analizables o insignificantes en la mielinización o mielina expresión de la proteína. OPCs diferenciar si se convierten en más confluentes y no se pueden sembrar después de que se han diferenciado, así el número de OPCs cultivadas y necesidades transducidas que ser optimizado a las condiciones locales. Es deseable sembrar el mismo número de OPC para cada ensayo de mielinización permitiendo comparaciones directas de la cantidad de segmentos axonales mielinizadas para ser comparados entre las condiciones en múltiples experimentos.

Una limitación potencial de esta técnica es la variabilidad en los niveles de mielinización basales entre los ensayos de mielinización. Después de la transducción viral, el nivel basal de la mielinización se reduce, lo que sugiere que los OPC infectadas por virus no mielinizan así como los OPC (infectados no virales) ingenuas. Esto se puede superar mediante la cuantificación de la extensión de la mielinización con relación a la mielinización basal en cada ensayo. Por lo tanto, el vector vacío que expresa GFP sólo debe ser utilizado como un contr internaol. Además de la mielinización, la expresión de una proteína de interés también puede influir en otros aspectos de los OPC como la supervivencia, proliferación y diferenciación, dando lugar a un efecto indirecto sobre la mielinización. Por lo tanto, el análisis del comportamiento del OPC como la viabilidad celular debe llevarse a cabo de forma paralela a los ensayos de mielinización.

Los métodos de transducción viral descritos aquí no se limitan al estudio de la mielinización de oligodendrocitos; de hecho, puede aplicarse de forma generalizada para estudiar otros tipos de células tales como las células de Schwann, astrocitos y neuronas, mientras que la optimización puede ser necesaria para el tipo de célula individual. Este protocolo ofrece una gran flexibilidad para estudiar el comportamiento celular, tales como la proliferación y la diferenciación por la sobreexpresión selectiva de una proteína de interés (de tipo salvaje o mutante) en el tipo celular deseado, que tiene ventajas particulares cuando se utiliza un sistema de cultivo celular mixto. Las células que se utilizan para la transducción se pueden aislar de cualquiera de rata oratón (tipo salvaje o transgénico), permitiendo de este modo para el estudio específico de los mecanismos de señalización y de compensación en animales transgénicos, que suele ser difícil de lograr y mucho más tiempo que el uso de un modelo de ratón transgénico in vivo. La evidencia reciente sugiere que la estrategia basada en lentiviral ha sido utilizado con éxito para la transducción de células en modelos animales 13, lo que sugiere un fuerte potencial de transducir células oligodendrogliales utilizando los enfoques lentiviral in vivo.

En conclusión, la combinación del ensayo in vitro de la mielinización en la infección de Lentiviral del OPC ofrece una herramienta estratégica para el análisis de los mecanismos moleculares implicados en la mielinización. El papel de las proteínas específicas en la mielinización puede ser interrogado y como OPC pueden ser aisladas de ratas y ratones para su uso en DRG de rata co-cultivos, el enfoque lentiviral también se puede utilizar en combinación con la tecnología knockout de varias líneas de ratón para interrogar mechmecanis- de compensación en los procesos de mielinización.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2K7 lentivector  Kind gift from Dr Suter9
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100mg
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 115545205
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) Life Technologies A11005
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11012
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement Stem Cell Technologies  5711
BDNF (Human) Peprotech PT450021000
Biotin (d-Biotin) Sigma Aldrich B4639
Bradford Reagent Sigma Aldrich B6916-500ML  
BSA Sigma Aldrich A4161
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-100G
CNTF Peprotech 450-13020
DAKO fluoresence mounting media DAKO S302380-2
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Life Technologies 10313039
DNase Sigma-Aldrich D5025-375KU
DPBS Life Technologies 14190250
DPBS, calcium, magnesium Life Technologies 14040182
EBSS Life Technologies 14155063
EcoRI-HF NEB R3101
Entry vectors for promoter and gene of interest Generate as per protocols 1-2
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C
Forskolin  Sigma Aldrich F6886-50MG
Glucose (D-glucose) Sigma-Aldrich G7528
Glycerol Chem Supply GL010-500M See stock solutions
Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115005003
Goat Anti-Mouse IgM  Jackson ImmunoResearch 115005020
Goat Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch 112005167
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
Igepal Sigma Aldrich I3021-100ML 
Insulin  Sigma Aldrich I6634 
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615
Laminin  Life Technologies 23017015
LB Medium See stock solutions
LB-Agar See stock solutions
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-7477
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415064
L-Glutamate Sigma-Aldrich G1626
L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid Life Technologies 25030081
LR Clonase II Plus enzyme Life Technologies 12538-120
MEM, NEAA, no Glutamine Life Technologies 10370088
Mouse α βIII Tubulin  Promega G7121
Mouse αMBP (monoclonal) Millipore MAB381
Na pyruvate  Life Technologies 11360-070
NAC Sigma Aldrich A8199
NcoI-HF NEB R3193S
NEBuffer 4 NEB B7004S
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
NGF (mouse) Alomone Labs N-100
NT-3 Peprotech  450-03
O1 antibody - Mouse anti-O1 Millipore MAB344 Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable
O1 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning
O4 antibody - Mouse anti-O4 Millipore MAB345 Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable
O4 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning
Competent cells Life Technologies A10460
One Shot Stbl competent cells Life Technologies C7373-03
Papain Suspension Worthington/Cooper LS003126
pBR8.91 Kind gift from Dr Denham10
PDGF-AA (Human) Peprotech PT10013A500  
Penicillin-streptomycin 100x solution Life Technologies 15140122
pENTRY4IRES2GFP Invitrogen 11818-010 
pMD2.G Addgene 12259
Poly-D-lysine Sigma P6407-5MG
Polyethylenimine (PEI)  Sigma-Aldrich 408727-100ML
Poly-L-ornithine  Sigma Aldrich  P3655
Progesterone  Sigma Aldrich P8783
Protease inhibitor tablet (Complete mini) Roche 11836153001
Proteinase K Supplied with Clonase enzyme
Putrescine Sigma Aldrich P-5780
Rabbit α neurofilament Millipore AB1987  
Rabbit αMBP (polyclonal) Millipore AB980
Ran2 hybridoma cells ATCC TIB-119 Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning
Rat anti CD140A/PDGFRa antibody BD Pharmingen 558774
SacII NEB R0157
SOC medium Supplied with competent bacteria
Sodium selenite  Sigma Aldrich S5261
Spe I NEB R0133S
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Buffer NEB B0202S
TE buffer pH8 See stock solutions
TNE lysis buffer
Trace Elements B Cellgro  99-175-CI
Transferrin (apo-Transferrin human) Sigma-Aldrich T1147
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White Roche 10109878001
Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) Life Technologies 25300-054
Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 Vector laboratories  L-1100
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G

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References

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