Produktion og anvendelse af Lentivirus til selektivt at transducere Primary oligodendrocyt precursorceller for

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Peckham, H. M., Ferner, A. H., Giuffrida, L., Murray, S. S., Xiao, J. Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays. J. Vis. Exp. (95), e52179, doi:10.3791/52179 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Myelinering er en kompleks proces, der involverer både neuroner og myelin danner gliaceller, oligodendrocytter i det centrale nervesystem (CNS) og Schwann-celler i det perifere nervesystem (PNS). Vi anvender en in vitro myelinering assay, en etableret model til undersøgelse CNS myelinering in vitro. For at gøre dette, er oligodendrocyt præcursorceller (OPCs) lægges til den rensede primære gnaver dorsale ganglion (DRG) neuroner til at danne myelinerende co-kulturer. For specifikt at forespørge de roller, som bestemte proteiner udtrykt af oligodendrocytter udøve på myelinering har vi udviklet protokoller, der selektivt transducerer OPCs hjælp af lentivirus overudtrykker vildtype konstitutivt aktive eller dominerende negative proteiner før den podes på DRG-neuroner. Dette giver os mulighed for specifikt at afhøre rollerne for disse oligodendrogliale proteiner i reguleringen myelinering. Protokollerne kan også anvendes i studiet af othendes celletyper, hvilket giver en tilgang, der giver mulighed for selektiv manipulation af proteiner udtrykt af en ønsket celletype, såsom oligodendrocytter for målrettet undersøgelse af signalering og kompensationsordninger. Afslutningsvis kombinere in vitro myelinering assay med lentivirale smittet OPCs giver et strategisk redskab til analyse af molekylære mekanismer involveret i myelinering.

Introduction

Myelinering af axoner er afgørende for en hurtig og effektiv overførsel af aktionspotentialer i både det centrale og perifere nervesystem. Specialiserede celler, Schwann-celler i det perifere nervesystem og oligodendrocytter i centralnervesystemet, wrap rundt og ensheathe axoner i myelin, effektivt isolerende nerven og letter saltatory ledning 1. Processen med myelinering kan studeres in vitro ved anvendelse retinale ganglion neuroner 2, manipulerede nanofibre 3 eller dorsale rodganglieneuroner co-dyrket med enten Schwann-celler 4 eller oligodendrocytter 5-7. Den myelinering in vitro-assay er en etableret model til at studere nervesystem myelinering og replikerer mange af de grundlæggende processer, der forekommer under myelinering in vivo 5-8. Assayet involverer cokultur af oprensede populationer af Dorsal rodganglie (DRG) neuroner med OPCs (for CNS myelinering) eller Schwann-celler (for PNS myelinering). Under særlige betingelser disse myelinerende celler ensheathe DRG axoner i bestilt, ultra strukturelt verificeret, multi-lamellar ark af isolerende plasmamembranen, der udtrykker den samme supplement af myelin proteiner til stede in vivo.

Den mest almindeligt anvendte celle model studere CNS myelinering in vitro er co-kulturer af DRG-neuroner og OPCs, som med succes er blevet anvendt til at undersøge, at udefrakommende faktorer såsom neurotrophiner udøver på CNS myelinering in vitro 5,6. Eksogene faktorer såsom vækstfaktorer eller småmolekylære farmakologiske inhibitorer er i vid udstrækning blevet anvendt til at undersøge den rolle, signaleringsveje i myelinering anvendelse af DRG-OPC cokultur model 7,9. Men i de blandede co-kultur indstillinger, der indeholder både neuroner og oligodendrocytter, forblev formelt muligt, at enten vækstfaktorer eller Pharmacological hæmmere kunne have udøvet virkninger på både DRG-neuroner og oligodendrocytter (OL). Dette gør tilbyde evnen til specifikt dissekere de roller, de proteiner, der kun udtrykkes af DRG eller oligodendroglia udøver på myelinering ved hjælp af denne dobbelte celle system. Utvetydigt at bekræfte, at signalvejen i oligodendrogliale direkte regulerer myelinering, lentiviral transduktion af OPCs før podning på DRG-neuroner til in vitro myelinering assay, har vist sig at være en elegant måde at overudtrykke både vildtype og mutante proteiner, samt som knockdown ekspression af konstitutivt udtrykte proteiner af oligodendrocytter. Således denne fremgangsmåde giver en avenue til specifikt afhøre og manipulere signalveje inden oligodendrocytter til at studere myelinering 9,10.

I dette papir rapporterer vi metoder, som vi har udviklet til at overudtrykke et protein af interesse selektivt i oligodendrocytter via en lentiviralfremgangsmåde til at studere myelinering in vitro. Teknikken begynder med generering af ekspressionsvektorer indeholdende genet af interesse, det være sig i en vildtype, konstitutivt aktiv eller dominant negativ form, der er så efterfølgende klonet ind i pENTR vektoren (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Denne vektor (indeholdende genet af interesse), er CMV-promoteren donor (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) og 2K7 lentivector kombineret i en enzymreaktion til at producere en 2K7 vektor indeholdende CMV promotoren, genet af interesse, en internt ribosomalt indgangssted og GFP (figur 1). Denne gateway klonet 2K7 konstruktion kombineret med PMD2.G viruskappen og pBR8.91 virus pakke kan co-transficeres ind HEK293T celler til at generere lentivirus, der efterfølgende kan anvendes til at transducere OPCs. Når smittet med lentivirus de OPCs udtrykke et højt niveau af proteinet af interesse. Disse OPCs kan derefter podes på DRG neuron kulturer og den virkning, at udtrykketaf høje niveauer af det ønskede protein udøver på myelinering kan aflæses. De co-kulturer vurderes for myelin protein ekspression ved Western blot analyse og visualiseret for dannelsen af ​​myelinerede axonale segmenter ved immunocytokemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyr, der anvendes til denne undersøgelse var af blandet køn og opdrættet på dyrefaciliteter i Anatomisk Institut & patologi og The Florey Institut for Neurovidenskab og Mental Health Research ved University of Melbourne. Alle dyreforsøg blev godkendt af dyreforsøg etiske komitéer på University of Melbourne.

1. Kloning af 2K7 Lentivector

  1. Før kloning af genet af interesse i 2K7 lentivirusvektor, subklone genet i pENTR vektoren (3637 bp, kanamycinresistent) ved anvendelse af standard molekylære teknikker 11. Brug EcoRI- og SacII restriktionssteder til subkloning.
  2. Forstærkning af 2K7 Lentivector
    1. Transform 2K7 lentivector DNA ved forsigtigt at blande 100 ng af plasmid-DNA med kompetente celler og inkuberes på is i 30 minutter.
    2. Heat shock DNA / kompetente celler blandes ved 42 ° C i 90 sek og plade dem på LB-agarplader indeholdende både ampicillin (100 ug / ml) og chloramphenicol (15 ug / ml) ved 37 ° C i 16-18 timer.
      BEMÆRK: Chloramphenicol anvendes til at forhindre rekombination mellem de lange terminale gentagelser.
    3. Den næste dag, vokser udvalgte bakterielle kloner i LB-medier indeholdende både ampicillin (100 ug / ml) og chloramphenicol (15 ug / ml) ved 37 ° C i 16-18 timer. Uddrag DNA under anvendelse af et kommercielt plasmid DNA Maxiprep kit ifølge producentens anvisninger.
  3. Sub-kloning fra pENTR vektor til 2K7 Lentivector (figur 1)
    Figur 1
    Figur 1:. Skematisk repræsentation af Gateway rekombinationsproces Genet af interesse, her repræsenteret Flag-Erk1, klones ind i pENTR L1-L2 vektor. Dette sættes til pENTR L4-R1 vektor indeholdende CMV-promotoren og rygraden 2K7 vektor. Disse tre vektorer rekombineres af LR Clonase II Plus enzym tilindsætte genet af interesse og promotoren i virus-klar 2K7 vektor.
    1. Tilføj følgende til et 1,5 ml rør og bland forsigtigt:
      L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotor) (60 BNG) 1-2,5 pi
      L1-L2 pENTR4IRES2GFP (med gen af ​​interesse) (80 BNG) 1-2,5 pi
      K7 lentivector (80 ng / pl) 1 pi
      TE-buffer, pH 82-5 pi
      I alt 8 pi
    2. Fjern CLONASE enzymblanding fra -80 ° C og optøning på is i 2 min. Kontroller, at dette enzym er en frisk aliquot fra -80 ° C som enzymet er blevet væsentligt reduceret kloningseffektivitet gentagne fryse-tø cykler
    3. Tilsæt 2 pi enzym pr reaktion og bland godt via vortex, og inkuberes CLONASE reaktionsblandingen ved 23-25 ​​° C i 6-24 timer.
    4. Tilsæt 1 pi proteinase K-opløsning (leveret med enzym kit) til CLONASE reaktionsblandingen og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
    5. Omdan CLONASE reaktionsblandingen i kompetente celler og vokse selectkolonier i LB-medier indeholdende ampicillin (100 pg / ml) ved 37 ° C i 16-18 timer.
    6. Uddrag og oprense DNA under anvendelse af et kommercielt plasmid DNA Miniprep Kit ifølge producentens anvisninger.
    7. Bekræft DNA via fordøjelse ved hjælp af restriktionsenzymerne Spel og Sac II og en passende puffer som pr fabrikantens anvisninger for at fjerne fragmentet indeholdende promotoren og genet af interesse.
      BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at kontrollere, om den subklonede DNA har det korrekte insert genet af interesse med den rigtige vektor rygraden. Størrelsen af ​​vektoren selv uden indsatte fragment er 6,7 kb. Størrelsen af ​​det frigivne indsatte fragment indeholder både promotoren og indsatsen genet af interesse. Beregn de forventede fragmentstørrelser fra digest for det specifikke gen via en DNA-sekvens redigering program, f.eks APE - et plasmid Editor.
    8. Kontroller størrelser af både DNA-vektor rygrad og det frigivne fragment ved at køre en 1% agarosegeli 1x TAE buffer (se tabel af stamopløsninger) ved 100 V.
    9. Amplificere bekræftet DNA ved voksende bakterier i 500 ml LB medium indeholdende ampicillin (100 ug / ml) ved 37 ° C i 16-18 timer.
    10. Uddrag og oprense DNA under anvendelse af et kommercielt plasmid DNA Maxiprep kit ifølge producentens anvisninger.
      BEMÆRK: Maxiprep genererer typisk tilstrækkelig mængde af DNA, der kræves til viral produktion.
  4. Gentag trin 1.3.9-1.3.10 at forstærke de følgende DNA'er for lentivirale præparater: Envelope vektor (PMD2.G, 6,1 kb), Pakke vektor (pBR8.91, 12,5 kb), og en tom lentivirusvektor som en kontrol (GFP -CMV-2K7, 8,7 kb).

2. 2K7 virusproduktion

BEMÆRK: Dag 1:

  1. På dagen for transfektion, plade 32 millioner HEK293 T-celler i T175 kolbe indeholdende 25 ml HEK293 T-celle medier (se tabellen af ​​stamopløsninger). Alternativt pladen 16 millioner celler dagenfør transfektion hvis tiden kører stramt på dagen for transfektion.
    BEMÆRK: Transfektion kan være lige så vellykket ved udpladning celler på dagen for transfektion eller før dag. Enten ved hjælp af de to alternativer, det kritiske punkt her er at sikre celler blive hængende ned på dyrkningsskål overflade før transfektion.
    BEMÆRK: Dag 2:
  2. Transfektion
    1. Før transfektion fortyndet DNA til 1 pg / pl i TE-buffer, der indeholder 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 i deioniseret vand.
    2. I en 50 ml rør, forberede en master mix (tabel 1) til transfektion i T175 kolben. Føj DNA til forvarmet Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) og bland godt ved vortex, tilsæt derefter steril polyethylenimin (PEI) (se tabellen af ​​stamopløsninger) for at undgå for tidlig udfældning. ">
      Vektor Trong> Koncentration Volumen
      pMDG.2 1 pg / pl 5 pi
      pBR8.91 1 pg / pl 15 pi
      2K7 vektor med GFP + genet af interesse 1 pg / pl 22 pi
      Steril polyethylenimin (PEI) 1 g / L 500 pi
      DMEM 2.100 pi
      Tabel 1: Forberedelse transfektion mix for 2K7 Virus.
    3. Bland godt ved at vende røret 3-4x og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
    4. Udfør en fuld medier ændring på HEK293T celler. Aspirer fra dyrkningsmediet fra cellerne fuldstændigt og foder med foropvarmet HEK293T celledyrkningsmedier (25 ml pr T175 kolbe).
    5. Tilsæt transfektion blanding (DNA / PEI blanding) dråbevis til monolagcellerne. Flyt forsigtigt for at blande godt og inkuber transficerede celler ved 37 ° C, 5% CO 2, natten over.
      BEMÆRK: Dag 3:
    6. For at sikre transfektionen er vellykket, kontrollere GFP-ekspression 24 timer efter transfektion via fluorescensmikroskopi.
      BEMÆRK: Over 50% af celler, der udtrykker GFP angiver typisk en god transfektion.
      BEMÆRK: Dag 4:
    7. Ved 48 timer efter transfektion, indsamle den virale supernatant og erstatte med friske HEK293 T medier (25 ml pr T175 kolbe).
      1. Centrifugeres den virale supernatant ved 1.140 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at rydde op cellerester fra supernatanten. Transfer klarede supernatant til 50 ml rør og opbevares ved 4 ° C.
        BEMÆRK: Dag 5:
    8. Ved 72 timer efter transfektion, indsamle det andet parti af viral supernatant. Gentag trin 2.3.1 og pool 48 og 72 timer ryddet supernatanter.
    9. For at koncentrere viruset, centrifuge viral supernatant ved 170.000 xg i 90 min ved 4 ° C ved anvendelse af 30 ml ultracentrifugerør.
    10. Supernatanten fjernes, og gentage trin 2.6 indtil alle klarede supernatant er blevet centrifugeret forlader en (usynlig) pellet af virus plus udfældet PEI i bunden af ​​røret.
    11. At opblande virus, tilsættes 500 pi SATO medier (se tabel af stamopløsninger) til ultracentrifugerør. Vortex for 30 sec ennd skrabe bunden af ​​røret med en pipettespids til mekanisk at løsne virus. Gentag dette trin 6x for at miste viral pellet.
    12. Pool den resuspenderet virus i mikrocentrifugerør og spin meget kortvarigt at fjerne uopløseligt PEI. Filtreres supernatanten gennem et 0,45 um filter til fjernelse af proteiner.
    13. Alikvot virus i 20 pi, 50 pl, og 100 portioner pi og opbevares ved -80 ° C.

    3. Viral titerbestemmelse i HEK293T Celler

    1. For at kontrollere ekspressionen af proteinet af interesse og at bestemme den optimale viral koncentration for eksperimenter, tilføje en række serielle fortyndinger af viral lager (f.eks 0, 5, 10, 20, 40, 80 pi) til at transducere HEK293 T-celler udplades i 6-brønds plader og kultur i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO 2. Denne protokol typisk genererer virus, der kan anvendes i koncentrationer i området fra 1:50 til 1: 200, som opnår robust ekspression af genet afinteresse.
    2. 48 timer efter viral transduktion, lyserer HEK293T celler i TNE buffer (se tabel stamopløsning) med proteasehæmmere.
      1. Skyl brønde to gange med kølede DPBS og derefter tilføje 150 pi TNE buffer til hver brønd.
      2. Lyse celler ved pipettering op og ned 5-10x. Overførsel helcellelysater til 1,5 ml mikrocentrifugerør og inkuberes på is i 15-30 min.
      3. Centrifuger lysaterne ved 4 ° C i 30 minutter ved maksimal hastighed (20.000 x g) og overførsel klarede supernatant til et nyt rør for proteinbestemmelse ved Bradford og efterfølgende Western blot-analyse.
    3. Bestemme niveauet af ekspression af proteinet af interesse ved standard Western blot analyse under måling for antistoffer mod proteinet selv, og den fusionerede tag (dvs. Flag). Brug den virale fortynding, der giver> 95% GFP + celler og robust ekspression af proteinet af interesse for eksperimenter.

    4. isolering og dyrkning af DRG (Figur 2 trin 1 & 2)

    Figur 2
    Figur 2:. Skematisk diagram af in vitro myelinering assay DRG-neuroner dissekeres fra P2-3 rotteunger, derefter oprenset og dyrket over to uger (1-2). OPCs oprenses fra P7-9 rottehjerner ved hjælp immunopanning (3). OPCs derefter inficeret med lentivirus og dyrket i 48 timer (4). OPCs derefter podet på DRG, og eventuelle vækstfaktorer af interesse såsom BDNF tilsættes (5). Co-kulturer dyrkes derefter i 2 uger for at tillade OPCs at differentiere og myelinate axoner (6). Endelig co-kulturer enten lyseret for western blotting eller fastsat for immunocytokemi (7).

    BEMÆRK: Dag 1- 2 dage inden dissektion:

    <ol>
  3. Coat autoklaveret 22 mm x 22 mm dækglas med poly-L-ornithin (0,5 mg / ml) i en 6-brønds plade og inkuberes ved 37 ° C natten over.
  4. Den næste dag, coat dækglas igen med laminin (20 ug / ml i MEM) ved 37 ° C natten over, aspireres overskydende og tørre i 20 minutter i vævskultur hætte.
    BEMÆRK: Dag 2: Dissektion og isolering af DRG:
  5. Sacrifice P2-P3 rotteunger 12x ved cervical overskæring.
  6. Fjern huden overliggende musklen fra bagsiden af ​​dyret. Brug Vännäs saks til at åbne vertebrale foramen og bruge pincet til forsigtigt øse ud rygmarven.
  7. Pluk ud DRG, der ligger i mellem rygsøjle og afskåret knyttet spinal nerve fibre, og derefter placere DRG i en 33 mm petriskål indeholdende 3 ml L-15 medier. Det er normalt muligt at samle mellem 8 og 12 DRG fra hver side af rygmarven
  8. Overfør indsamlet DRG sammen med L-15 medie i et 15 ml rør, centrifugeres ved 180 xg i 5 minutter.
  9. Aspirersupernatanten, tilsættes 2 ml 0,25% trypsin til DRG pellets og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
  10. Der tilsættes 5 ml M1-medium (se tabel stamopløsning) til DRG pellets at stoppe trypsin, og der centrifugeres ved 180 xg i 3 min ved stuetemperatur.
  11. Aspirer supernatanten, re-suspendere pellet i 2 ml forvarmet M1 medium (ikke med vækstfaktorer). Tritureres ganglier pellet ved pipettering 50x eller indtil ganglier er dispergeret. Centrifuger cellesuspensionen ved 180 xg i 3 min.
  12. Resuspender dissocierede neuroner i M1 medier og pladen ned i en 6-brønds plade ved 5 ganglier per 100 pi per brønd.
  13. For at fjerne prolifererende ikke-neuronale celler, efter mindst 4 timers inkubation for at lette fastgørelsen, fjern M1 medier og foder neuroner med M2 medier (se tabel stamopløsning). Kultur DRG-neuroner i nærvær af NGF (100 ng / ml) at oprense en kultur af NGF-afhængige TrkA-udtrykkende DRG. Alternativt kan du bruge BDNF (100 ng / ml) for at rense BDNF-afhængige TrkB-Expressynge DRG.
  14. Oprethold neuroner i M1 medier (+ NGF eller BDNF ved 100 ng / ml) skiftevis med antimitotiske M2 medier i 2 uger som vist nedenfor.
  15. Oprethold medium M1 (+ NGF eller BDNF på 100 ng / ml) på dag: 4-6, 8-10, 12-14 og M2 medier (+ NGF eller BDNF på 100 ng / ml) med FDU og uridin på dag 1 til 4, 6-8 og 10-12. Et minimum af 3 cyklusser af M2 medier oprensning er påkrævet.
  16. Vedligehold DRG i M1 alene i endnu en uge efter at have gennemført 2 uge antimitotisk cyklus. Skift M1 medier hver 2-3 dage.

5. isolering og dyrkning af OPCs (figur 2 trin 3)

BEMÆRK: Dag 1- 2 dage inden dissektion:

  1. Coat 10 cm vævsdyrkningsplader med poly-D-lysin (PDL, 10 ug / ml i steriliseret deioniseret vand) ved 4 ° C natten over.
    BEMÆRK: Dag 2: 1 dag før dissektion:
  2. Vask PDL-plader med steriliseret deioniseret vand til 3x. Lad det tørre i ~ 6 timer i vævskultur hætte. Hvis ikke bliver brugt med det samme, wrap og opbevarei op til 4 uger ved 4 ° C.
  3. Forbered sekundært antistof plader til immunopanning. For 1 hjerne dissektion forberede 2x IgG plader (for Ran2 antistof for at fjerne astrocytter og O1 antistof for at fjerne premyelinating oligodendrocytter), med 45 pi Goat α muse IgG i DPBS (15 ml) pr 10 cm petriskål; 1x IgM plade til (O4 antistof til udvælgelse oligodendrocyt precursorceller), 45 pi Goat α muse-IgM i DPBS (15 ml) pr 10 cm petriskål.
    BEMÆRK: Dag 3: Dag dissektion:
  4. Tilføj 200 enheder papain i 10 ml papain buffer (tabel 2), og varme op ved 37 ° C, indtil bufferen viser klart.
    Koncentration for 250 ml Slutkoncentration
    EBSS lager 10x 25 ml 1x
    MgSO4 100 mM 2,5 ml 1 mM
    Glucose 30% 3 ml 0,46%
    EGTA 0,5 M 1 ml 2 mM
    NaHCO3 1 M 6,5 ml 26 mm
    Bring volumen op til 250 ml med deioniseret vand og Filtersteriliser
    Tabel 2: Fremstilling af papain buffer.
  5. Vask alle sekundære antistof plader med DPBS til 3x.
  6. Hæld Ran2 og O1 antistof på IgG pladerne og O4 hybridomet IgM pladen. Inkuber alle disse primære antistof plader til over 2 timer ved stuetemperatur.
  7. Skær en hjerne fra en P7 rotte. Halshugge en hvalp med skærpede saks og fjerne huden overliggende kraniet med en saks.
    1. Skær rundt om kraniet fra occipital lap, tindingelappen og frontallappen. Fjern hjerne fra kraniet ved en pincet og forsigtigt overføre det til et 35-mm petriskål med 1 ml DPBS.
    2. Skær hjernen i små stykker groft med en saks eller steril kniv.
  8. Filter forvarmet papain buffer (10 ml) i en ny 15 ml rør indeholdende nogle få korn af L-cystein, hvorefter der tilsættes 200 pi DNAase (12.500 U / ml) til den filtrerede papain buffer.
  9. Hæld papain buffer på hakkede hjernevæv; inkuberes ved 37 ° C i 90 minutter.
  10. Gentlly overførsel dissocieret hjernevæv i 50 ml rør ved hjælp af en 25 ml pipette oghenstår til bundfældning.
  11. Fjern papain buffer, tilsættes 2 ml Lo Ovo (Ovimucoid) til hjernevæv og titurate 5-10x ved pipettering at bryde op klumper af hjernevæv, henstår og fjerne de øverste 2 ml supernatant til et nyt rør.
  12. Tilføj en 2 ml Lo Ovo til hjernevæv og gentag trin 5.11, indtil der ikke klumper af væv tilbage. Tituration kan få mere og mere aggressive.
  13. Centrifuge dissocierede cellesuspension i 15 minutter ved 200 x g. Aspirer off supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml Hi Ovo og centrifugeres i 15 minutter ved 200 x g.
  14. Vask først immunopanning plade (Ran 2 plade) med DPBS til 3x. Aspirer supernatanten, resuspender cellerne i 10 ml panorering buffer (tabel 2) og hæld på den første immunopanning plade (Ran 2 plade). Cellerne inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
  15. Vask den anden immunopanning plade (O1 plade) med DPBS til 3x.
  16. Efter inkubationen på den første immunopanning plade, tip cellesuspensionen på andenimmunopanning plade (O1 plade), skylles eventuelle løse celler fra overfladen af ​​pladen med 1-3 ml panorering buffer og med pipette til O1 pladen. Cellerne inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
  17. Vask den tredje immunopanning plade (O4 plade). Denne plade er positiv selektion plade hvor OPCs binde dets overflade. Vask O4 plade med DPBS til 3x.
  18. Efter inkubationen på den anden immunopanning plade overføre cellerne til den endelige immunopanning plade (O4 plade), inkuberes cellerne i 45 minutter ved stuetemperatur. Dette skridt vil vælge O4 + OPCs.
  19. Aspirer supernatanten fra den sidste immunopanning plade (O4 plade) og skyl pladen med EBSS for 6x.
  20. For at fjerne OPCs fra pladen inkuberes celler med 5 ml varm 0,05% trypsin-EDTA fortyndet 1:10 med EBSS ved 37 ° C i 8 min.
  21. Der tilsættes 5 ml 30% FBS (fremstillet i EBSS) for at neutralisere trypsin. Fjern celler off overflade af pladen ved pipettering i ca. 50x.
  22. Overfør alle cellesuspension til et nyt rør og centrifugeres i 15 minutter ved 200 x g.
  23. Supernatanten kasseres, og cellepelleten resuspenderes i 1 ml foropvarmet SATO medier, efterfulgt af celletælling. Dissektion af en hjerne kan give 1,5-2.000.000 OPCs.
  24. Plate celler på tørt PDL overtrukne plader ved en densitet på mellem 1 x 10 5 og 5 x 10 5 per 10 cm plade med i SATO medier (10 ml), der indeholder ciliær neurotrofisk faktor (CNTF, 10 ng / ml), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF, 10 ng / ml,), neurotrophin 3 (NT3, 1 ng / ml), og forskolin (4,2 ug / ml) 2,12. Kultur OPCs ved 37 ° C, 8% CO 2.

6. transduktion OPCs

  1. Kultur primære OPCs i SATO medier (10 ml / 10 cm plade) med CNTF (10 ng / ml), PDGF (10 ng / ml), NT3 (1 ng / ml), og forskolin (4,2 ug / ml) ved 37 ° C, 8% CO 2 for 24 timer efter dissektion.
  2. Helt aspireres fra OPC dyrkningsmedier, foder celler med frisk gjort SATO medier (10 ml) Med vækstfaktorer (se ovenfor i trin 6.1).
  3. Tilføj virus til OPCs til den optimale koncentration bestemt ved trin 3 (figur 2, trin 4), kultur OPCs i yderligere 48 timer.

7. OPC Såning for myelinerende co-kulturer (figur 2, trin 5 og 6)

  1. For at fjerne OPCs fra overfladen, først skylles OPC plader med 8 ml EBSS to gange, derefter inkuberes celler med 5 ml varm 0,05% trypsin-EDTA fortyndet 1:10 med EBSS ved 37 ° C i 2 min.
  2. Neutraliseres trypsin med 30% FBS i EBSS (5 ml) og fjerne celler fra pladen ved pipettering. Overførsel cellesuspension til et 15 ml rør, centrifugeres ved 180 xg i 15 minutter ved stuetemperatur.
  3. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml foropvarmet SATO medier efterfulgt af celletal.
  4. Forud for OPC såning, helt Aspirer medier fra DRG kultur plade. Frø forsigtigt 200.000 OPCs dråbevis til de DRG-neuroner, som tidligere beskrevet 4-6.
    BEMÆRK:Den samlede OPC seeding volumen skal være mindre end 200 pi per 22 mm dækglas.
  5. Efterlad celler til afvikling uden at flytte pladen i 10 minutter i vævskultur hætte, derefter forsigtigt top op med 1 ml foropvarmet SATO medier per brønd.
  6. Udpladning de resterende søster OPCs med SATO medier med vækstfaktorer (se trin 6.1). Brug disse søster OPCs at kontrollere ekspression af proteinet af interesse.
  7. Efter 24 timer, skal du udskifte SATO medier med co-dyrkningsmedier (2 ml / brønd) indeholdende SATO medier (ingen faktorer) og Neurobasal (v / v) med 1% B27. Vedligehold co-kulturer til 14 dage med medier skifter hver 2-3 dage.
  8. Vurdere de co-kulturer for myelin-proteinekspression ved western blot-analyse og visualisere for dannelsen af myelinerede axonal segmenter ved dobbelt immunfarvning med antistoffer mod myelin basisk protein markører og neuronale markører 4-6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flag-tagget ekstracellulære signal-relateret kinase 1 (Flag-Erk1) konstruktionen, der anvendes til lentivirus produktion verificeres ved restriktionsenzymspaltning af konstruktionerne anvendes, herunder både 2K7 konstruktioner emballagen og tilbehør konstruktioner kræves til virusproduktion (figur 3) .

Figur 3
Figur 3: DNA-konstruktion kontrol. Alle DNA-konstruktioner, der kræves for lentivirus produktion blev oprenset fra Stbl3 bakterier og bekræftet ved hjælp af restriktionsfordøjelse. Tilbehør og emballage vektorer blev fordøjet med Ncol og EcoRI, som angivet og sammenlignet med uncut plasmid (A). 2K7-GFP blev spaltet med Spel og SacII (A). 2K7-Flag-Erk1 DNA blev verificeret ved spaltning med enten Spel eller SacII alene eller ved dobbelt fordøjelse (B). Båndmønstre vari forhold til forventede mønstre genereret fra virtuelle fordøjelse af konstruktionen sekvenser under anvendelse abe software.

For at bestemme den optimale fortynding til brug på OPCs blev Erk 1 lentivirus titreret i HEK293T celler (figur 4). Dette blev gjort ved tilsætning af en række virale fortyndinger til HEK293T celler (figur 4A, 4C og 4D) eller OPCs (figur 4B). Ekspressionsniveauer af genet af interesse stigning med tiden (figur 4D). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Titrering af Flag-Erk1 virus i HEK293T celler og OPCs. Flag-Erk1 virus blev titreret i HEK293T celler (A, C, D) eller OPCs (B). HEK293T celler (A) eller OPCs (B) blev afbildet for GFP-ekspression 48 timer efter infektion med Flag-Erk1 virus. HEK293T cellelysater blev probet for tilstedeværelse af Erk1 eller total ERK1 / 2-efter 48 timers infektion (C). HEK293T cellelysater blev undersøgt for tilstedeværelsen af Flag, Erk1 / 2 og Actin som lastning kontrol enten 48 timer eller 96 timer efter infektion med Flag-Erk1 virus (D). Disse blots blev alle blottet og afbildes sammen for at lette direkte sammenligning af ekspressionsniveauer på de to tidspunkter (D). Scale bar for (A) = 100 um. Scale bar for (B) = 50 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Når den optimale virusfortynding er blevet bestemt, blev oprenset OPCs inficeret og dyrket i mindst 48 timer for at tillade transgenekspression at nå sufficient niveauer, derefter podet på DRG-neuroner for at vurdere deres myelinering potentiale (figur 5). Når podet på DRG-neuroner, vil OPCs differentiere til oligodendrocytter, og begynder at udtrykke myelinproteiner, som kan vurderes ved Western blotting (figur 5C). Nogle modne oligodendrocytter vil myelinate, og dette kan visualiseres ved hjælp af MBP farvning (figur 5D). Axoner skal også farves med en markør, såsom neurofilament eller βIII-tubulin (Figur 5D) for at sikre axon tæthed tages i betragtning, når analysen myelinering niveauer.

Figur 5
Figur 5: OPCs blev inficeret med Flag-Erk1 virus i 48 timer før såning på DRG-neuroner. Sister OPCs blev enten fikseret og farvet for Flag og GFP (A) eller lyseret og undersøgt for Flag og Erk1 at verificereekspression af viralt overudtrykt protein (C). Co-kulturer blev fikseret efter 2 uger i kultur og farvet for βIII-tubulin og MBP at visualisere DRG axoner og myelinerende samt ikke-myelinerende oligodendrocytter (B). En myelinerende oligodendrocyt er angivet med pilen, og en ikke-myelinerende oligodendrocyt er angivet ved pilen-head (B). Parallelle co-kulturer blev lyseret og undersøgt for myelinproteiner MBP og MAG samt Flag og ERK1 / 2 for at bekræfte transgen ekspression i co-kultur (D). En stigning i ERK1 niveauer var ikke synlig i co-kultur på grund af de store mængder af DRG-afledt Erk1 stede i lysater Scale bar = 20 um.

Navn Ingredienser Bemærkninger
TE Buffer pH 8 10 mM Tris pH 8
1 mM EDTA pH 8
Fyldes op i deioniseret vand.
Polyethylenimin (PEI) 1 g / L Fyldes op i deioniseret vand, filtrer-steriliseres og gemme lagre ved -20 ° C.
LB-medium 20 g trypton
10 g gærekstrakt
10 g NaCl
Der fyldes op til 2 L med deioniseret vand
50% glycerol stock Glycerol Der fyldes op med et tilsvarende volumen deioniseret vand og autoklave
HEK 293 T-celle medium DMEM
10% kalvefosterserum
1% penicillin / streptomycin
1% L-glutamin
TNE lysepuffer 10 mM Tris pH 8
150 mM NaCl
1 mM EDTA pH 8
1% NP40
Opløs NP40 i et mindre volumen af ​​deioniseret vand først, da det vil krystallisere ved kontakt med vand. Der fyldes op til slutvolumenet i deioniseret vand
M1 MEM
10% kalvefosterserum
0,4% D-glucose
2 nM L-glutamat
1% penicillin / streptomycin
Til brug med rotte DRG-neuroner
MM1 Neurobasal medium
2% B27 (SM1) tillæg
0,4% D-glucose
2 nM L-glutamat
1% penicillin / streptomycin
Til brug med muse DRG-neuroner
M2 DMEM
10 mg / L Transferrin
5 mg / L Insulin
20 nM Progesteron
100 uM Putrescin
10 uM FdU
10 uM Uridin
Fyldes op M2 i et større volumen DMEM uden FdU og uridin til brug i løbet af 1-2 måneder. Tilføj FdU og uridin til mindre mængder, der kan afsluttes inden for 2 uger
MM2 MM1
10 uM FdU
10 uM Uridin
Tilføj FdU og uridin til mindre mængder af medium, der kan afsluttes inden for 2 uger.
10x MT-PBS pH 7,4 28.48 g / L (160 mM) Na 2 HPO 4 · 2H 2 O
5,52 g / L (40 mM) NaH 2 PO 4 · H2O
87,66 g / L (1,5 M) NaCl
Tilføj til deioniseret vand og justere pH til 7,4 med 10 N NaOH
1x MT-PBS 10x MT-PBS
Deioniseret vand
Fortynd 10X MT-PBS 1:10 i deioniseret vand for at gøre 1x MT-PBS
10x boratbuffer (1,5 M) 18.55 g Borsyre
1x MT-PBS
Borsyre i 150 ml 1x MT-PBS opløses. Juster til pH 8,56 med 10 N NaOH og bringe slutvolumenet til 200 ml med 1x MT-PBS. Autoklave
1x boratbuffer (0,15 M) 10x boratbuffer
1x MT-PBS
Forbered 100 ml af denne buffer til at opløse PLN i. Tilsæt 10 ml 10x boratpuffer (pH 8,56) til 90 ml 1x MT-PBS
0,5 mg / ml poly-L-ornithin (PLN) 50mg poly-L-ornithin hydrobromid
0,15 M borat-buffer (pH 8,56)
Opløs 50 mg af poly-L-ornithin-hydrobromid i 100 ml 1x boratpuffer. Filtersteriliser (0,22 um filter) og opbevares ved 4 ° C i op til en måned
100x poly-D-lysin (PDL) 5 mg poly-D-lysin
Sterilt deioniseret vand
100x PDL lagre kan fryses ved -20 ° C i engangsmaterialer portioner. Ved brugen fortyndes til 1x i sterilt, deioniseret vand
Papain buffer Se tabel 2
DNase 12.500 U DNase I
1 ml EBSS
På is, opløse DNase I i 1 ml afkølet EBSS. Prøve (fx 300 pi / rør) og fryse natten over ved -20 ° C. Opbevares ved -20 ° C.
4% BSA 8 g BSA
200 ml DPBS
Opløs BSA i 150 ml DPBS ved 37 ° C. PH justeres til 7,4 med ~1 ml 1 N NaOH. Rumfanget bringes op på 200 ml. Der filtreres gennem et 0,22 um filter for at sterilisere. Lav 1 ml prøver og opbevares ved -20 ° C.
10x Lo Ovimucoid 3 g BSA
200 ml DPBS
3 g Trypsininhibitor
Tilføj BSA til 150 ml DPBS og bland godt. Tilføj trypsininhibitor og blandes for at opløse. Tilføj ~ 1 ml 1 N NaOH for at justere pH til 7,4. Rumfanget bringes op på 200 ml med DPBS. Filtersteriliser gennem et 0,22 um filter. Lav 1 ml prøver og opbevares ved -20 ° C.
6x Hi Ovimucoid 6 g BSA
200 ml DPBS
6 g trypsininhibitor
Tilføj BSA til 150 ml DPBS og bland godt. Tilføj trypsininhibitor og blandes for at opløse. Tilføj ~ 1 ml 1 N NaOH for at justere pH til 7,4. Rumfanget bringes op på 200 ml med DPBS. Filtersteriliser gennem et 0,22 um filter. Lav 1 m portioner og opbevares ved -20 ° C.
SATO basen Se tabel 3
SATO medier (rotte) 1% SATO basen
1% penicillin / streptomycin
1% 0,5 mg / ml Insulin
1% L-glutamin
0,1% NAC
0,1% Biotin
Der fyldes op med DMEM og Filtersteriliser.
SATO medier (mus) 1% SATO basen
1% 0,5 mg / ml insulin
1% penicillin / streptomycin
1% L-glutamin
0,1% NAC
0,1% Biotin
0,1% Trace Elements B
2% B27
Der fyldes op med DMEM og Filtersteriliser.
Insulin 10 mg Insulin
20 ml sterilt deionzed vand
Tilføj insulin til deioniseret vand, og der tilsættes 100 pi af 1 N HCI for at tillade insulin opløses. Bland godt. Der filtreres gennem et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C i 4-6 uger
NAC (N-acetyl-L-cystein) 5 mg / ml NAC
DMEM
Opløs NAC i DMEM for at gøre en 5 mg/ Ml opløsning, portion og opbevares ved -20 ° C.
d-Biotin 50 ug / ml biotin
Sterilt deioniseret vand
Opløses biotin i vand for at lave en 50 ug / ml opløsning alikvot og opbevares ved -20 ° C.
CNTF (ciliær neurotrofisk faktor) 10 ug / ml CNTF
0,2% BSA i DPBS
Fortynd CNTF til at gøre en opløsning / ml 10 ug med steril 0,2% BSA i DPBS. Alikvot, flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
PDGF (blodpladeafledt vækstfaktor) 10 ug / ml PDGF
0,2% BSA i DPBS
Fortynd PDGF Master lager (fremstillet ifølge producentens anvisninger) til 10 ug / ml med steril 0,2% BSA i DPBS. Alikvot, flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
NT3 (neurotrophin-3) 1 ug / ml NT-3
0,2% BSA i DPBS
Fortynd NT3 mester STOCk (fremstillet ifølge producentens anvisninger) til 1 pg / ml med steril 0,2% BSA i DPBS. Alikvot, flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
Forskolin 50 mg Forskolin
Steril DMSO
Tilsæt 1 ml sterilt DMSO til 50 mg flaske forskolin og bland godt for at resuspendere helt. Overførsel til 15 ml rør, og der tilsættes 11 ml sterilt DMSO for at opnå en koncentration på 4,2 mg / ml. Alikvot og opbevares ved -20 ° C.

Tabel 3. Stamopløsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Myelinering af axoner er en afgørende proces for den optimale funktion af både det centrale og perifere nervesystem hos hvirveldyr. Frembringelsen og vedligeholdelse af myelinerede axoner er en kompleks og koordineret proces, der involverer molekylære interaktioner mellem neuronal, glial (fra Schwann-celler eller oligodendrocytter) og ekstra cellulære matrixproteiner. Betydningen og anvendelsen af ​​denne protokol er, at det giver mulighed for manipulation af proteiner i en specifik celletype i det blandede co-kultur indstillinger. Som flere celletyper er involveret i myelinering både in vivo og i in vitro myelinering assay ved stump farmakologiske værktøjer til at blokere aktiviteten af bestemte proteiner eller signalveje kan ikke give specifikke oplysninger om den indflydelse, som proteiner udøver på myelinering fra enten en neuronal eller glial perspektiv, medmindre proteinet unikt udtrykkes af én celletype. Således in vitro myelination somsige i forbindelse med brugen af ​​lentivirus specifikt transducere OPCs tillader os at udspørge de virkninger, oligodendrogliale proteiner udøver på myelinering. Vi har med succes brugt 2K7 lentivirus at overudtrykke bestemte proteiner specifikt i oligodendrocytter for in vitro myelinering assay med henblik på at dissekere, at oligodendrogliale signaler udøver på CNS myelinering 9.

For at opnå reproducerbare resultater i transducerede OPC in vitro myelinering assay optimering kræves for hvert trin af protokollen fra kloning gennem dissektioner og OPC såning. Det er bydende nødvendigt, at der på niveauet af DNA, er pENTR vektor indeholdende den mærkede genet af interesse konstruktion sekventeret og at 2K7 DNA med den mærkede gen af ​​interesse kontrolleres ved Western blot for ekspression af taggen og genet af interesse, før anvendelse af DNA til at generere virus. Det er vigtigt at vælge enten HEK293Tcells eller HEK293FT-celler til at generere virus og vokse under mycoplasma miljø. Efter fremstilling af lentivirus er det vigtigt at titrere hver batch af virus til at bestemme den optimale fortynding til brug på OPCs. Dette kan gøres ved at tilsætte en række virale fortyndinger til HEK293T celler eller OPCs. Som 2K7 konstruktionen indeholder både genet af interesse og GFP, kan effektiviteten af ​​transduktion vurderes ved ekspression af GFP ved fluorescensmikroskopi og ved at analysere ekspression af taggen og genet af interesse ved western blot-analyse. Lysere GFP + -celler bliver synlige med højere koncentrationer virus, da det er muligt for flere viruspartikler til at inficere en enkelt celle. Verifikation af ekspressionen af ​​GFP via fluorescensmikroskopi er en nyttig indikator for titer af virus og ekspression af GFP, men kan ikke anvendes som et surrogat for at kontrollere ekspressionen af ​​proteinet af interesse. Det er derfor afgørende for at kontrollere ekspressionen af ​​proteinet af interesse i både HEK293T cellerog OPCs ved Western blot analyse. Hvis proteinet af interesse udtrykkes endogent af neuroner i co-kulturer, kan overekspression af OPCs / OLS være maskeret i analysen af ​​co-kultur lysat ved western blot; derfor er det vigtigt at enten tagge proteinet af interesse eller kultur søster OPCs efter såning, så ekspression af proteinet af interesse kan verificeres i søster OPCs hvis ikke i co-kultur.

Kvaliteten af ​​både DRG og OPC kultur direkte bestemmer Hvis forsøgene lykkes. I cokultur indstillingerne kan rotte DRG-neuroner blive dyrket sammen med OPCs afledt fra enten rotte eller mus. OPCs kræver skånsom og hurtig håndtering. Det er vigtigt at optimere virustiteren for OPCs som for lidt ikke effektivt transducere OPCs fører til lave niveauer af ekspression af proteinet af interesse og for meget virus er giftigt for OPCs så der er for få celler til frø, på neuronerne. Begge disse sub optimale transduktioner kan Result i unanalyzable og ubetydelige ændringer i myelinering eller myelin protein udtryk. OPCs differentiere, hvis de bliver i løbet af sammenflydende og kan ikke seedet efter at de har differentieret, således at antallet af OPCs kulturperler og transducerede skal optimeres til lokale forhold. Det er ønskeligt at pode det samme antal OPCs for hver myelinering assay tillader direkte sammenligninger af antallet af myelinerede axonal segmenter skal sammenlignes mellem betingelser over flere eksperimenter.

En potentiel begrænsning ved denne teknik er variabiliteten i basale myelinering niveauer mellem myelinering assays. Efter viral transduktion, er det basale niveau af myelinering reduceret, hvilket tyder på, at virusinficerede OPCs ikke myelinate samt de naive (ikke-virale inficerede) OPCs. Dette kan overvindes ved at kvantificere omfanget af myelinering i forhold til den basale myelinering i hvert assay. Således skal den tomme vektor, som kun udtrykker GFP anvendes som en intern control. Udover myelinering kan ekspressionen af ​​et protein af interesse også påvirke andre aspekter af OPCs såsom overlevelse, proliferation og differentiering, hvilket fører til en indirekte effekt på myelinering. Derfor bør der foretages analyser af OPC adfærd såsom cellelevedygtighed parallelt med myelinering assays.

De virale transduktion her beskrevne metoder er ikke begrænset til studiet af oligodendrocyt myelinering; i virkeligheden kan generaliseres og anvendes til at studere andre celletyper, såsom Schwann-celler, astrocytter og neuroner, mens kan være påkrævet optimering for individuel celletype. Denne protokol giver stor fleksibilitet til at studere celle adfærd såsom proliferation og differentiering ved selektiv overekspression af et protein af interesse (vildtype eller mutant) i den ønskede celletype, der har særlige fordele, når anvendelse af en blandet cellekultur system. De celler, der anvendes til transduktion kan isoleres fra enten rotte- ellermus (vildtype eller transgene), hvilket giver mulighed for en målrettet undersøgelse af signalering og kompensationsordninger i transgene dyr, som normalt er vanskeligt at opnå og meget mere tidskrævende end at bruge en in vivo transgen musemodel. De seneste oplysninger tyder på, at den lentivirale funderede held har været anvendt for celle transduktion i dyremodeller 13, hvilket tyder på et stort potentiale for at transducere oligodendrogliale celler med lentivirale tilgange in vivo.

Afslutningsvis kombinere in vitro myelinering assay med Lentiviral infektion af OPCs giver et strategisk værktøj til analyse af molekylære mekanismer, der er involveret i myelinering. Rollen af ​​specifikke proteiner i myelinering kan interrogeres og som OPCs kan isoleres fra rotter og mus til brug på rotte DRG co-kulturer, kan den lentivirale tilgang også anvendes i kombination med knockout-teknologi af forskellige muselinjer at forhøre mechnismer for kompensation i de processer af myelinering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2K7 lentivector  Kind gift from Dr Suter9
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100mg
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 115545205
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) Life Technologies A11005
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11012
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement Stem Cell Technologies  5711
BDNF (Human) Peprotech PT450021000
Biotin (d-Biotin) Sigma Aldrich B4639
Bradford Reagent Sigma Aldrich B6916-500ML  
BSA Sigma Aldrich A4161
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-100G
CNTF Peprotech 450-13020
DAKO fluoresence mounting media DAKO S302380-2
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Life Technologies 10313039
DNase Sigma-Aldrich D5025-375KU
DPBS Life Technologies 14190250
DPBS, calcium, magnesium Life Technologies 14040182
EBSS Life Technologies 14155063
EcoRI-HF NEB R3101
Entry vectors for promoter and gene of interest Generate as per protocols 1-2
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C
Forskolin  Sigma Aldrich F6886-50MG
Glucose (D-glucose) Sigma-Aldrich G7528
Glycerol Chem Supply GL010-500M See stock solutions
Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115005003
Goat Anti-Mouse IgM  Jackson ImmunoResearch 115005020
Goat Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch 112005167
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
Igepal Sigma Aldrich I3021-100ML 
Insulin  Sigma Aldrich I6634 
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615
Laminin  Life Technologies 23017015
LB Medium See stock solutions
LB-Agar See stock solutions
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-7477
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415064
L-Glutamate Sigma-Aldrich G1626
L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid Life Technologies 25030081
LR Clonase II Plus enzyme Life Technologies 12538-120
MEM, NEAA, no Glutamine Life Technologies 10370088
Mouse α βIII Tubulin  Promega G7121
Mouse αMBP (monoclonal) Millipore MAB381
Na pyruvate  Life Technologies 11360-070
NAC Sigma Aldrich A8199
NcoI-HF NEB R3193S
NEBuffer 4 NEB B7004S
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
NGF (mouse) Alomone Labs N-100
NT-3 Peprotech  450-03
O1 antibody - Mouse anti-O1 Millipore MAB344 Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable
O1 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning
O4 antibody - Mouse anti-O4 Millipore MAB345 Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable
O4 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning
Competent cells Life Technologies A10460
One Shot Stbl competent cells Life Technologies C7373-03
Papain Suspension Worthington/Cooper LS003126
pBR8.91 Kind gift from Dr Denham10
PDGF-AA (Human) Peprotech PT10013A500  
Penicillin-streptomycin 100x solution Life Technologies 15140122
pENTRY4IRES2GFP Invitrogen 11818-010 
pMD2.G Addgene 12259
Poly-D-lysine Sigma P6407-5MG
Polyethylenimine (PEI)  Sigma-Aldrich 408727-100ML
Poly-L-ornithine  Sigma Aldrich  P3655
Progesterone  Sigma Aldrich P8783
Protease inhibitor tablet (Complete mini) Roche 11836153001
Proteinase K Supplied with Clonase enzyme
Putrescine Sigma Aldrich P-5780
Rabbit α neurofilament Millipore AB1987  
Rabbit αMBP (polyclonal) Millipore AB980
Ran2 hybridoma cells ATCC TIB-119 Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning
Rat anti CD140A/PDGFRa antibody BD Pharmingen 558774
SacII NEB R0157
SOC medium Supplied with competent bacteria
Sodium selenite  Sigma Aldrich S5261
Spe I NEB R0133S
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Buffer NEB B0202S
TE buffer pH8 See stock solutions
TNE lysis buffer
Trace Elements B Cellgro  99-175-CI
Transferrin (apo-Transferrin human) Sigma-Aldrich T1147
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White Roche 10109878001
Trypsin-EDTA (1x), phenol red (0.05%) Life Technologies 25300-054
Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 Vector laboratories  L-1100
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81, (2), 871-927 (2001).
  2. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60, (4), 555-569 (2008).
  3. Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (1), 336-341 (2013).
  4. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29, (13), 4016-4022 (2009).
  5. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43, (2), 183-191 (2004).
  6. Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18, (3), 186-202 (2010).
  7. Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11, (12), e1001743 (2013).
  8. Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
  9. Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122, (6), 1167-1180 (2012).
  10. Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33, (11), 4947-4957 (2013).
  11. Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. (2014).
  12. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138, (1), 172-185 (2009).
  13. Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (25), 9115-9120 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics