분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

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Developmental Biology

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Zielins, E. R., Tevlin, R., Hu, M. S., Chung, M. T., McArdle, A., Paik, K. J., Atashroo, D., Duldulao, C. R., Luan, A., Senarath-Yapa, K., Walmsley, G. G., Wearda, T., Longaker, M. T., Wan, D. C. Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis. J. Vis. Exp. (95), e52181, doi:10.3791/52181 (2015).

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Abstract

Protocol

참고 : 모든 환자 샘플 동의 얻었다, 실험 프로토콜을 검토하고 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회 (프로토콜 # 2188과 # 9999)에 의해 승인되었다.

1. 세포 분리 및 문화 :

  1. 일반 / 국소 마취하에 복부, 옆구리, 및 / 또는 허벅지 영역의 선택 과목 lipoaspiration를 받고 건강한 여성 환자에서 인간의 피하 지방 조직을 얻습니다. 임상 시험 심사위원회 (IRB) 승인 인체 조직에서의 ASC를 분리의 프로토콜 얻어되었는지 확인하고, 그러한 물질들로 작업하는 동안 제도적 안전주의 사항을 따르십시오.
  2. lipoaspirated 지방 조직에서 SVF를 얻으려면, 먼저 1X 멸균 인산 완충 생리 식염수를 같은 부피 (PBS)와 리포 애스 퍼 레이트 세 번 씻는다. 조심스럽게 기음과 바닥 수성 층을 버린다.
  3. 내가 행크의에서 콜라 0.075 % 유형 : 콜라겐 소화 버퍼를 준비균형 소금 솔루션 (HBSS). FACS 버퍼를 준비 : 2 % FBS, 1 % P188 및 PBS에 1 % 펜 연쇄상 구균을. 시판 0.22 ㎛의 공극 크기 빠른 유동 폴리 필터를 사용하여 두 용액을 필터.
  4. 세척 된 지방 조직을 소화, 37 ° C (약 180 흔들기 / 분)에서 60 분 동안 진탕 수욕 안전하게 분해 용기를 콜라게나 제 소화 버퍼의 동일 부피를 추가 배치.
    참고 :이 떨고 동안 최대한의 소화 수 있습니다대로, 요구되는 것보다 더 큰 볼륨 분해 용기를 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다 (즉, 콜라겐 소화 버퍼 250 ml의, 1L 멸균 플라스크에 씻어 지방 조직의 250 ㎖).
  5. FACS 완충액의 동량을 첨가하고 5 분 동안 RT에 앉아 있도록함으로써 효소 활성을 중화. 다음, 4 ℃에서 20 분 동안 233 XG에 원심 분리기.
  6. 조심스럽게 기음과 고밀도 SVF 펠렛을 방해하지 돌보는, 상층 액을 제거한다.
  7. RT 레드 5-10 ml의 펠렛을 재현 탁세포 펠렛의 크기에 기초하여, 용해 완충액. 실온에서 5 분 동안 233 XG에서 5 분 원심 분리기에 대한 RT에 앉아 솔루션을 남겨주세요.
  8. 기음 상등액과 펠릿 크기에 따라 기존의 성장 배지 5-10 ml를 첨가하여 펠릿을 재현 탁 (둘 베코 변형 이글 중간 [DMEM] / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 [펜 연쇄상]).
  9. 세포 파편을 제거하기 위해 100 ㎛ 나일론 세포 여과기를 통해 현탁액을 여과.
  10. 4 ° C에서 5 분 233 XG에 원심 분리기 및 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다.
  11. 펠릿의 크기에 기초하여 기존의 성장 배지 5~10 ㎖,에 펠렛을 재현 탁.
  12. 15cm 표준 배양 접시에 2 × 10 6 세포를 놓고 37 ° C / 21 % O 2, 5 % CO 2에서 차 문화 O / N을 설정합니다. 37 ° C / 21 % O 2, 성장 배지에서 5 % CO 2에서 자발적인 분화를 방지하기 위해 서브 합류 수준에서 유지한다.
    참고 : 완전히의 셀 밀도합류 15cm 플레이트는 약 4-6 × 106 세포이다.

2. 염색

  1. 염색하기 전에 36 시간 동안 37 ° C / 21 % O 2, 5 % CO 2, 전통적인 성장 배지에서 배양의 ASC는 / 정렬.
  2. (제조사의 프로토콜에 따라) Accutase를 사용하여 배양 접시에서 리프트의 ASC.
  3. 한 번 (2 % FBS와 1 % 펜 연쇄상 구균과 PBS) FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오.
  4. 4 ℃에서 5 분 동안 233 XG에 원심 분리기.
  5. 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다. FACS 완충액 0.5 ml의 세포를 재현 탁 (세포 수 및 항체의 원하는 양에 따라).
    주 : 세포 현탁액의 부피는, FACS 항체 제조자의 권고에 따라, 항체 농도를 결정한다. 그러나, 항체의 농도가 적정, 하나의 출발 농도를 사용 : 그것은 항체를 사용하는 최초 시간 인 경우 (100), 일반적으로 권장된다.
  6. 총 수를 계산혈구를 사용하여 세포.
  7. 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에서 예약 100 UL 분취 흠 샘플 (사용하는 형광 항체의 수에 따라) 단일 색상 조절을 위해 사용된다.
  8. (제조업체의 지침에 따라 소정의 농도에서) 적절한 형광 표지 된 단일 클론 항체를 추가하고 빛으로부터 보호 얼음에 20 ~ 30 분 동안 품어.
    1. 골 형성 모집단 레이블을 지정하려면 : 1시 50분의 농도로 FACS 버퍼에 안티 CD90 (APC 안티 - 인간 CD90 (Thy1)) 또는 안티 CD105 (FITC 안티 - 인간의 CD105 (endoglin))를 희석.
    2. 다른 세포 집단 (예를 들어, 조혈 및 내피 세포)에 레이블을 지정하려면 : 안티 CD45 (안티 - 인간 CD45 태평양 블루), 항 CD34 (안티 - 인간 CD34 APC), 및 / 또는 항 CD31 (안티 - 인간 CD31 PE를 희석 ) FACS 1:50의 농도로 버퍼.
    3. 직접 접합 된 항체를 사용하지 않는 경우, 적절한 스트렙 타비 딘 - 접합 제와 비오틴 차 항체를 사용하여하나의 희석 등 스트렙 타비 딘 PE-Cy7로 진 항체, 100.
  9. 상층 액을 흡입, 4 ° C에서 5 분 동안 233 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기와 튜브를 채우기 : 부화 후, 두 번 세포를 씻으십시오.
  10. 세포 덩어리를 제거하기 위해 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 400 ~ 500 μL FACS 버퍼 및 필터 샘플에서 세포를 재현 탁.
  11. 필터 상단으로 FACS 튜브에 표시된 세포를 전송하고 분석 기간 동안 얼음에 샘플을 유지.

3. 형광 활성화 셀 정렬

주 : 다음 단계는 이전 형광 활성화 된 세포에서 지식 정렬 (FACS) 또는 숙련 된 기술자의 도움을 의무화.

  1. 포워드 산란 (FSC), 측면 산란 (SSC)를 조사하기 위해 설계 분석 플롯을 적절한 FACS 소프트웨어를 이용하여, 피코 에리 트린 (PE) - 텍사스 레드, 퍼시픽 블루, 형광 염료 (FITC), 알로 피코시 아닌 (APC)와 다른 형광 물질을 사용D는 세포 레이블을.
  2. 셀 소터, 잠시 소용돌이 세포를 재현 탁 각 샘플에로드하기 전에.
  3. 세포 파편을 제외하고,베이스 라인 형광도를 결정하기 위해, 전체 세포 집단을위한 게이트를 설정하기 위해 흠 견본의 분석을 시작.
  4. 흠 견본에 요오드화 프로피 듐 (PI)를 첨가하고, 전체 세포 집단 내에서 살아있는 세포 집단을 시각화하기 위해 그것을 분석. 이 인구 주위에 게이트를 구축합니다.
  5. 형광 보정을 설정하기 위해 각각의 형광 색소에 대한 단색 대조군 샘플을 분석한다.
  6. 정렬 게이트의 위치를​​ 설정하는 스테인드 샘플을 분석 할 수 있습니다.
  7. 죽은 세포를 염색하기 위해 염색 된 샘플에 PI를 추가합니다.
  8. 표지 된 세포 집단을 정렬합니다. 정렬 1.5 ml를 원심 분리기 튜브 또는 배양 배지를 함유하는 원뿔형 튜브 (15 mL) 중 하나에.
  9. 수동 셀들의 수량이 필요한 구하면 정렬 중단.
  10. 우리FACS를 보내고, 극히 일부를 분석 (예., 500 세포) 취득 된 세포 집단의 순도에 의해 검사를 수행한다.
    참고 :이 단계는 정렬 된 세포 집단의 순도를 확인합니다. 이상적으로, 순도 90-95 % 이상이어야한다.
  11. 39 °에서 5 분 동안 원심 분리기 (233) XG 세포를 즉시 10 % FBS를 함유하는 새로운 배지 1 ㎖에 정렬 완료하고 다음을 재현 탁시켰다.
    주 : 사용 된 용지의 양이 세포 펠렛의 크기에 따라 증가 될 수있다.
  12. 젤라틴 코팅 플레이트에 플레이트는 세포 생존 능력을 향상시킬 수 있습니다. 최종 세포 수율, 판 6 웰 플레이트에 웰 당 30 만 셀, 12 웰 플레이트에 웰 당 10 만 셀에 따라.

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Representative Results

인간의 ASC (그림 1A, 1B)의 고농축 인구의 분리 향상된 골 형성의 결과 세포 마커로서 CD90 사용. 태평양의 ASC는 블루 - 공액 항 - 인간 CD45, FITC 접합 된 항 - 인간 CD105 및 APC 공액 항 - 인간 CD90으로 염색 하였다. 정렬 후 분석으로 정량으로 정렬 한 후 순도의 수준은 98 % 이상이었다.

두 개의 새로운 개체군의 미래의 격리를 위해 허용 전사 프로필을 기반으로 세포의 그룹을 정의. 앞서 설명한대로 6,8,9 각 유망 모집단 (낮은 CD90 및 CD105 +)의 전위 골 형성뿐만 아니라, 그 정렬되지 않은 체외에서 인구의 특성을, 세포를 14 일 골 세포 분화 배지에서 배양 하였다. 7 일째에 (골 형성 (10)의 조기 검출을 위해 사용) 알칼리 포스 파타 아제 염색 CD90 + 크게 증대하고 (그림 2A)에 인구의 상대적인 위치를 설정합니다. 이것은 모두 육안 및 정량화 (도 2A) 후에 관찰 하였다. 마찬가지로, 알리자린 레드 염색의 날 (14)에서 (세포 외 기질 광물 및 최종 단말기 골 형성 분화 (9)에 대한 메트릭을 감지하는 데 사용되는 분석은) CD90 +의 ASC는 세포 외 기질 (그림 2B)의 훨씬 더 많은 양을 무기화 할 수 있었던 것으로 나타났다. 절연의 ASC 정렬 후 골 형성 분화를 받아야하는 능력을 유지하지만 복구 며칠이 필요할 수 있습니다. 의 ASC 문화에 전파하는 동안 노화됨에 따라이 낮은 통로 세포와 모든 추가 실험을 수행하는 것이 필수적입니다.

그림 1
그림 1 : 세포의 크기와 복잡성 (A) 게이츠 세포 파편을 제외하고 인구 O를 분리 그려진추가 분석을 위해 F 단일 세포. (B) 단일 분류 CD90 (왼쪽)와 하나의 정렬 된 CD105 (오른쪽) 36 시간 ASC의 수확 후의 ASC의 FACS 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : (A) 알칼리 포스 파타 아제 염색 (위)와 골 형성 분화 배지에서 배양 후 7 일의 ASC의 정량 (아래) (B) 후 14 일에의 ASC의 알리자린 레드 염색 (위) 및 염색 (아래)의 정량화. 골 형성 분화 배지에서 배양. 두 꼬리 학생의, CD90 +의 ASC 및 CD105 낮은 세포 분류되지 않은 세포 (* P <0.05에 비해 알칼리 포스 파타 아제 염색 및 세포 외 기질 광물 증가 보여t-test를). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

현재, 인간 지방 조직의 SVF에서의 ASC의 동종 개체군의 분리는 바람직한 목표 그래도 도전 남아있다. 이러한 세포는 골격 조직의 형성 및 항상성을 연구하는데 이용 될 수있는 친 조골 ASC의 개체군의 분리는, 특히 바람직하다. 그러나, 지방 조직의 SVF는. 셀 용량과 분화 가능성을 막기위한 관련이 이질성에 대한 분자 기초는 세포의 풀링 된 인구에서 이해 될 수없는 11 이질성을 품고, 대신 단일 세포 분석을 필요로한다. (12)이 방법을, 표면 마커는 밀접의 ASC의 조골 세포 분화 능력이 확인 될 수와 연관된.

상기 방법에 설명 된대로의 ASC 성공적 농축을위한 가장 중요한 요소는, FACS에 이용 된 항체에 관한 것이다. 하나는 CEL에 대한 높은 친 화성 항체를 선택 신중해야문제의 1- 표면 마커. 이상적으로는, 따라서 여러 단계와, 세포 사멸, 세포 손실 및 오류 적립되는 기회를 증가 요구 간접 염색법, 반대로 일차 공액 된 항체이어야한다. 또한, FACS 동안 약간의 수정은 세포 생존 능력을 증가시킬 수있다. 이 10 % 젤라틴으로 미리 코팅 된 배양 접시에 획득 한 세포 집단 도금, 멋진 콘센트에 정렬 항상 얼음에 세포를 유지, 또한 문화 미디어를 포함하고 소켓에 세포를 정렬이 포함됩니다. 이는 정렬 세포의 순도를 보장하기 위해, 포스트 - 정렬 순도 분석을 수행하는 것이 중요하다.

이 기술은 시설 내에서 FACS 장비 및 전문 지식의 가용성에 의해 제한된다. 기본 샘플이 이질적으로 또한, 표면 마커의 발현은 개별적으로 변경됩니다. 전술 한 바와 같이, 이는 ASC로 낮은 통로 셀에서 모든 실험을 수행하는 것이 필수적이다의 문화에 전파하는 동안 노화된다. 또한,는의 ASC는 줄기 세포 생물학을 변경시킬 수있는 조건하에 시험 관내 형질 발현에 차이를 나타내는 것으로 알려져있다. 따라서, 임상 적 변환을 행하기 위해서는, 시험 관내 배양 용 지지체 없이도 직접 이식 또는 셀 시드 고도로 정제 된 세포 집단을 얻기 위해 최적 일 것이다. 논의 최근 간행물 13 Zuk 및 동료에 의해 ​​다루어으로 또한 필요한 리포 애스 퍼 레이트의 큰 볼륨, SVF는 기술에 익숙하지 않은 사용자에게 부담이 될 수 분리하도록 처리한다. Zuk 등에 의해 기술 된 방법에 따라.이 프로토콜은 쉽게 확장 할 수있는 또는 아래 리포 애스 퍼 레이트의 양을 수용 할 수 있도록하고 복부 성형술 및 기타 유사한 절차를 통해 얻어진 지방 조직으로부터의 ASC를 격리하도록 구성 될 수있다.

CD90와 CD105는 이전에 초기 중간 엽 줄기 C로 확인되었다BM-MSC와 ASC 인구의 두 엘 마커,. 이전 연구에 아울러, CD90 + 인구가 갓 격리 SVF의 약 50 %를 차지. 반면에 (14), 초기 SVF의 약 5 ~ 10 %는 CD105를 표명했다. 6은 특히, 연속적인 통로로, CD105 발현이 신속하게 거의 증가 문화에 거의 유비쿼터스 표현 제로 4-7 일 후. 그것은의 ASC는 줄기 세포의 생물학을 변경할 수있다 체외 확장, 동안 상당한 표현형 편차를 보이는 것으로 알려져있다. 15 ~ 17 이상적으로, 줄기 세포 임상 응용 프로그램이 발판에 직접 이식 또는 파종에 대한 정제 된 세포 집단의 즉각적인 사용을 포함 것 체외 배양 없이도. CD90 + 세포의 비율은 지방 창고에 의존 기원 다른 리포 애스 퍼 레이트 샘플 또는 연령 의존적 사이에 차이가있을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 세포 표면 마커로서 CD90을 사용하여 농축 O 허용강화 된 골 형성 가능성을 가진 인간의 ASC의 FA 아군. 골 세포의 농축 방법은 신규 중요한 크기 골격 결함 환자에서 신속하고 강력한 골 형성을 촉진하기위한 수단으로서 역할을 할 수있는 잠재력을 갖는다. 우리는 일상적으로이 전술 한 바와 있지만 지방 저장소 기원 또는 환자 인구 통계에 따라 차이가있을 수 있습니다. 표준 리포 애스 퍼 레이트에서 그 대략적인 세포 수율이 상기 수확 방법을 사용하여 리포 애스 퍼 레이트의 5 × 10 7 유핵 세포 / 500 ml 인 것을 관찰 18 요시무라와 동료들은보고 ASC를 따라서 SVF. 19 유핵 세포 집단 10~35 %를 차지하고, FACS를 이용하여 조골 세포의 ASC의 농축 다음 골조직 공학 전략의 구현을위한 골격의 직파에 대한 상당한 잠재력이있다.

자주 고순도 세포 집단을 필요로 실험 및 임상 응용 프로그램에 대한 세포 기반 조직 공학 줄기. 안녕하세요 기타정화의 GH 처리량 방법은 FACS에 대한 간단한 대안으로 존재, 패닝 보완 고갈, 자기 활성화 셀 (MACS) 정렬이 포함됩니다. 그러나, 특정 상황에서, FACS 모두가 필요하고 바람직하다 : 고순도 개체군의 분리가 요구되는 경우, 타겟 표면 마커는 세포 집단에서 자주 발생하거나, 세포를 분리해야 할 때 동일한 표면의 다양한 발현 량에 근거 할 때 마커.

미세 유체 기반 단일 세포 전사 분석 및 형광 - 활성화 세포 분류, endoglin (CD105) 네-1 (CD90)을 모두 사용하는 조골 ASC 유전자 발현에서의 차이와 관련된 것으로 밝혀졌다. 단일 세포 전사 프로필의 통계 분석은 CD105과 CD90의 높은 표현의 낮은 발현이 증가 골 형성 용량의 ASC의 하위 그룹을 설명하는 것을 보여 주었다. 이 단백질은 이후 D 세포의 골 형성 개체군에 대한 풍부하게 사용되었다인간의 피하 지방 조직에서 erived. 6,20

함께, 이러한 데이터는 조골 전사 활성과 연관 특정 세포 표면 마커의 ASC에 기초하여 선별의 효과를 예시한다. 이 접근법의 타당성이 예로서 CD90 및 CD105를 사용하여 여기에 설명된다하더라도, 상기 분석은 매우 조골 전사 활성과 상관 표면 항원의 발현 유망한 모든 조합을 포함 할 필요가있다.

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Disclosures

저자 중에이 원고에서 언급 된 제품, 장치 또는 약물의에 재무 적 이해 관계가 없습니다. 저자 중에보고 어떤 경쟁 금융 관심이 없다.

Acknowledgments

본 연구는 건강 연구 보조금 R01-DE021683-01 및 건강 연구 보조금 R01 - DE019434의 국립 연구소 MTL에 국립 연구소에 의해 지원되었다; MTCDCW 하워드 휴즈 의학 연구소의 연구 활동은 ACS 프랭클린 마틴 교수 연구 활동, 소아 재생 의학 Hagey 연구소와 스탠포드 대학 아동 건강 연구소 학부 학술 수상에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes Corning (Thomas Scientific) 2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement Gibco 10566-016
PBS, pH 7.4 Gibco 10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution Purdue  PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X Cellgro 21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin Gibco 16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution Stem Cell Technologies 7920
APC Mouse Anti-Human CD90 BD Pharmingen 559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) BD Pharmingen 561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)  eBioscience 48-9459-41
Anti-Human CD34 APC eBioscience 17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE eBioscience 12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7 eBioscience 25-4317-82
BD FACS Aria II instrument BD Biosciences
BD FACSDiva Software BD Biosciences

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References

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