Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

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Developmental Biology

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Zielins, E. R., Tevlin, R., Hu, M. S., Chung, M. T., McArdle, A., Paik, K. J., Atashroo, D., Duldulao, C. R., Luan, A., Senarath-Yapa, K., Walmsley, G. G., Wearda, T., Longaker, M. T., Wan, D. C. Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis. J. Vis. Exp. (95), e52181, doi:10.3791/52181 (2015).

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Abstract

Protocol

HINWEIS: Alle Patientenproben wurden mit Einwilligung erhalten, und experimentelle Protokolle wurden überprüft und von der Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 und # 9999) zugelassen.

1. Zell Isolierung und Kultur:

  1. Erhalten menschlichen Hautfettgewebe von gesunden weiblichen Patienten nach elektiven lipoaspiration des Bauches, Flanke, und / oder Oberschenkelbereich unter örtlicher / Vollnarkose. Stellen Sie sicher, dass Institutional Review Board (IRB) Approbation ist für die Protokoll zur Isolierung von ASC aus menschlichen Geweben gewonnen wurden, und folgen institutionelle Schutzmaßnahmen beim Umgang mit derartigen Materialien.
  2. Um die SVF vom lipoaspirated Fettgewebe zu erhalten, zuerst waschen die lipoaspirate dreimal mit gleichen Volumina 1x sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Vorsichtig absaugen und entsorgen Sie die untere wässrige Schicht.
  3. Bereiten Sie die Kollagenase-Verdauungspuffer: 0,075% Typ I Kollagenase in HanksBalanced Salt Solution (HBSS). Bereiten FACS-Puffer: 2% FBS, 1% P188 und 1% Pen-Strep in PBS. Filtern beide Lösungen mit Hilfe eines im Handel erhältlichen 0,22 um Porengrße fast flow Polyethersulfon Filter.
  4. Zu den gewaschenen Fettgewebe verdauen, ein gleiches Volumen von Kollagenase-Verdauungspuffer und legen Digerierbehälter sicher in einem Schüttelwasserbad für 60 min bei 37 ° C (etwa 180 Shakes / min).
    HINWEIS: Es empfiehlt sich, ein größeres Volumen Aufschlussgefäß als erforderlich verwenden, da dies ermöglicht eine maximale Verdauung beim Schütteln (dh 250 ml Kollagenaseverdau Puffer, 250 ml gewaschen Fettgewebe in einem 1L sterile Flasche).
  5. Neutralisieren enzymatische Aktivität durch Zugabe eines gleichen Volumens von FACS-Puffer und Stehenlassen bei RT für 5 min stehen. Als nächstes Zentrifuge bei 233 × g für 20 min bei 4 ° C.
  6. Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen, kümmert sich nicht um die hochdichte SVF Pellet stören.
  7. Das Pellet in 5-10 ml RT rotZelllysepuffer, bezogen auf die Pelletgröße. Verlassen Lösung bei RT für 5 Minuten und Zentrifugation bei 233 × g für 5 min bei RT sitzen.
  8. Überstand wird abgesaugt und das Pellet durch Zugabe von 5-10 ml traditionellen Wachstumsmedien, bezogen auf die Pelletgröße (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung [Pen-Strep]).
  9. Filtern der Suspension durch ein 100 um Nylon Zellsieb um Zelltrümmer zu entfernen.
  10. Zentrifuge bei 233 xg für 5 Minuten bei 4 ° C, und den Überstand verwerfen, ohne dass der Pellets.
  11. Das Pellet in 5-10 ml traditionellen Wachstumsmedien, bezogen auf die Pelletgröße.
  12. Je 2 x 10 6 Zellen in einem 15 cm-Standard Kulturschale und stellen Primärkulturen O / N bei 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2. Zu halten, bei sub-konfluenten Ebenen spontane Differenzierung bei 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2 in Wachstumsmedium zu verhindern.
    HINWEIS: Die Zelldichte in einem vollkonfluenten 15 cm Platte beträgt ca. 4-6 x 10 6 Zellen.

2. Die Färbung

  1. Kultur ASC in herkömmlichen Wachstumsmedium bei 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2, für 36 Stunden vor der Färbung / Sortieranlagen.
  2. Fahrstuhl ASC von Kulturplatten mit Accutase (nach Herstellerprotokoll).
  3. Waschen Sie die Zellen einmal mit FACS-Puffer (PBS mit 2% FBS und 1% Pen-Strep).
  4. Zentrifuge bei 233 × g für 5 min bei 4 ° C.
  5. Überstand verwerfen, ohne dass der Pellets. Die Zellen in 0,5-1 ml FACS-Puffer (je nach Zellzahl und der Menge des Antikörpers gewünscht).
    ANMERKUNG: Das Volumen der Zellsuspension, in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des FACS Antikörper Herstellers bestimmt Antikörperkonzentration. Jedoch Titration von Antikörper-Konzentration, unter Verwendung einer Ausgangskonzentration von 1: 100 wird in der Regel empfohlen, wenn es das erste Mal ist, einen Antikörper zu verwenden.
  6. Zählen der Gesamtzahl derZellen unter Verwendung eines Hämocytometers.
  7. Reserve 100 ul Aliquots in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für eine ungefärbte Probe und einfarbige Kontrollen (entsprechend der Anzahl von fluoreszierenden Antikörpern verwendet wird) verwendet werden.
  8. Fügen Sie die entsprechenden fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern (in vorgegebenen Konzentrationen, den Anweisungen des Herstellers) und Inkubation für 20 bis 30 Minuten auf Eis, vor Licht geschützt.
    1. Osteogene Subpopulation beschriften: Verdünnen anti-CD90 (APC-anti-Mensch CD90 (Thy1)) bzw. anti-CD105 (FITC-Anti-Human CD105 (Endoglin)) in FACS-Puffer auf eine Konzentration von 1:50.
    2. Um andere Zellpopulationen (zB hämatopoetische und Endothelzellen) zu kennzeichnen: Verdünnen anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), Anti-CD34 (Anti-Human CD34 APC), und / oder anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS-Puffer auf eine Konzentration von 1:50.
    3. Wenn nicht mit direkt konjugierten Antikörper, mit einem biotinylierten primären Antikörpers mit einem geeigneten Streptavidin-konjugierten zweitenary-Antikörper, wie beispielsweise Streptavidin PE-Cy7, bei einer Verdünnung von 1: 100.
  9. Nach der Inkubation wurden die Zellen werden zweimal: Füllrohre mit FACS-Puffer und Zentrifugieren bei 233 × g für 5 min bei 4 ° C, Absaugen Stand.
  10. Die Zellen in 400 bis 500 & mgr; l FACS-Puffer und Filterproben durch einen 70 & mgr; m Nylon Zellsieb um Zellklumpen zu entfernen.
  11. Übertragen markierten Zellen in FACS-Röhrchen mit Filter oben und halten Proben auf Eis für die Dauer der Analyse.

3. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

Hinweis: Die folgenden Schritte Mandat Vorkenntnisse in fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder die Hilfe von einem Fachmann.

  1. Mit der entsprechenden Software FACS, Konstruktionsanalyse Grundstücke zum Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) zu untersuchen, Phycoerythrin (PE) -Texas Red, Pacific Blue, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Allophycocyanin (APC) und andere Fluorophor Verwendungd, um Zellen zu markieren.
  2. Vor dem Laden in den Zellsortierer, Vortexen jede Probe, um die Zellen zu resuspendieren.
  3. Beginnen Sie mit der Analyse der ungefärbten Probe, um Tore zu der gesamten Zellpopulation gesetzt, um Zelltrümmer ausschließen und die Baseline Autofluoreszenz zu bestimmen.
  4. Hinzufügen Propidiumiodid (PI) auf die ungefärbten Probe und zu analysieren, um die Population von lebenden Zellen in der Gesamtzellpopulation zu visualisieren. Konstruieren Sie ein Tor um diese Bevölkerung.
  5. Analysieren Sie einen einfarbigen Kontrollprobe für jedes Fluorochrom um Fluoreszenzkompensation eingestellt.
  6. Analysieren Sie die gefärbten Probe, um die Position der Tore für die Sortierung festlegen.
  7. Fügen PI auf die gefärbte Probe, um abgestorbene Zellen zu färben.
  8. Die markierten Zellpopulationen zu sortieren. Sortieren entweder in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen oder konische Röhren (15 ml) enthaltenden Kulturmedium.
  9. Manuell einzustellen Sortier, wenn die erforderliche Menge von Zellen erhalten worden ist.
  10. Unsing FACS, führen eine Überprüfung der Reinheit durch Analyse eines kleinen Bruchteil (z. B. 500 Zellen) der erfassten Zellpopulation.
    HINWEIS: Dieser Schritt bestätigt die Reinheit der sortierten Zellpopulationen. Idealerweise sollte die Reinheit größer als 90-95% betragen.
  11. Zentrifuge Zellen bei 233 g für 5 min bei 4 ° C unmittelbar nach der Beendigung des Sortierens und Resuspension in 1 ml frischem Medium, enthaltend 10% FBS.
    HINWEIS: Die Menge des verwendeten Mediums kann auf der Grundlage der Größe der Zellpellet erhöht werden.
  12. Platte auf mit Gelatine beschichtete Platten Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Abhängig von dem jeweiligen Zellausbeute, Platte 300.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen, 100.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 12 Vertiefungen.

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Representative Results

Verwendung CD90 als ein Marker für Zellen mit erhöhter Osteogenese ergibt Isolierung eines hochangereicherten Populationen menschlicher ASCs (1A, 1B). ASC wurden mit Pacific Blue-konjugierten Anti-Human-CD45 FITC-konjugiertem Anti-Human CD105 und APC-konjugiertem Anti-Human-CD90 gefärbt. Nach dem Sortieren der Reinheitsgrad betrug mehr als 98%, wie durch die Post-Sortieranalyse quantifiziert.

Definieren von Gruppen von Zellen auf Basis von Transkriptionsprofilen für angehende Isolierung von zwei neuartigen Subpopulationen erlaubt. Um das osteogene Potenzial jedes vielversprechende Subpopulation (CD90 + und CD105 niedrig), ebenso wie die von den unsortierten Bevölkerung in vitro zu charakterisieren, wurden die Zellen für 14 Tage in die osteogene Differenzierung Medium kultiviert, wie zuvor beschrieben, 6,8,9. Alkalische Phosphatase-Färbung an Tag 7 (für die Früherkennung von Knochenbildung 10 verwendet wird) wurde in der CD90 + signifikant erhöhte (2A). Dies wurde sowohl grob und nach Quantifizierung (2A) beobachtet. Ähnlich Alizarin-Rot-Färbung (ein Assay verwendet, um die Mineralisierung der extrazellulären Matrix und einer Metrik für Enddatenendgerät osteogene Differenzierung 9 zu erkennen) an Tag 14 zeigten, dass CD90 + ASCs konnten eine deutlich größere Menge an extrazellulärer Matrix (2B) zu mineralisieren. Isolierte ASC behalten die Fähigkeit, osteogene Differenzierung nach der Sortierung unterzogen werden, sondern kann ein paar Tage dauern zu erholen. Es ist wichtig, alle weiteren Versuche mit niedrigen Durchgang Zellen durchzuführen, wie ASC werden bei der Ausbreitung in der Kultur seneszenten.

Figur 1
Abbildung 1: (A) Tore für die Zellgröße und Komplexität waren zugezogen, um Zelltrümmer auszuschließen und zu isolieren, eine Bevölkerung of einzelnen Zellen für die weitere Analyse. (B) FACS-Analyse von Einzel sortiert CD90 (links) und Einzel sortiert CD105 (rechts) ASC 36 Stunden nach der ASC Ernte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2: (A) der alkalischen Phosphatase-Färbung (oben) und die Quantifizierung (unten) der ASC nach 7 Tagen Kultur in osteogenen Differenzierungsmedium (B) Alizarin-Rot-Färbung (oben) und Quantifizierung der Färbung (unten) der ASC nach 14 Tagen. der Kultur in osteogenen Differenzierungsmedium. CD90 + und CD105 ASC niedrigen Zellen zeigen eine erhöhte alkalische Phosphatase-Färbung und der extrazellulären Matrix-Mineralisierung im Vergleich zum unsortierten Zellen (* p <0,05; zweiseitigen Studentent-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

Derzeit bleibt die Isolierung homogene Subpopulationen von ASC vom SVF menschlichen Fettgewebe eine anspruchsvolle aber wünschenswertes Ziel. Isolation von Pro-osteogenen ASC Subpopulationen ist besonders wünschenswert, da solche Zellen verwendet werden, um die Bildung und die Homöostase von Skelettgewebe zu untersuchen. Die SVF von Fettgewebe birgt jedoch erhebliche Heterogenität bezüglich Stammzellenkapazität und Differenzierungspotential. 11 wird die molekulare Grundlage dieser Heterogenität nicht aus gepoolten Populationen von Zellen zu verstehen, und statt erfordert Einzelzellanalyse. 12 Mit diesem Ansatz Oberflächenmarker eng mit der osteogene Differenzierung Kapazität von ASC identifiziert werden verbunden.

Der wichtigste Faktor für die erfolgreiche Anreicherung von ASCs, wie in dem obigen Verfahren beschrieben wurde, ist im Zusammenhang mit den für die FACS verwendet Antikörpern. Man muss vorsichtig sein, um einen Antikörper mit einer hohen Affinität für das cel auszuwählenl-Oberflächenmarker in Frage. Idealerweise sollte es ein primäres konjugierte Antikörper, im Gegensatz zu einer indirekten Färbemethode, die mehrere Schritte und somit erhöhte Wahrscheinlichkeit von Zelltod, Zellverlust und Fehlerrückstellung erfordert. Darüber hinaus können geringfügige Änderungen im FACS die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Dazu gehören das Sortieren in eine kühle Aufnahme, wobei Zellen auf Eis zu allen Zeiten, Sortieren von Zellen in Behälter, die Kulturmedien enthalten und auch, Ausplattieren der erworbenen Zellpopulationen auf Kulturplatten, die bereits mit 10% Gelatine vorbeschichtet sein. Es ist wichtig, um eine post-sort Reinheitsanalyse durchzuführen, um die Reinheit der sortierten Zellen gewährleisten.

Diese Technik wird durch die Verfügbarkeit von FACS Ausrüstung und Know-how in einer Anlage begrenzt. Darüber hinaus, wie die Einzelproben heterogen sind, die Expression von Oberflächenmarkern wird auf individueller Basis zu ändern. Wie bereits erwähnt, ist es wichtig, alle Experimente mit niedrigen Durchgang Zellen durchzuführen, wie ASCs werden bei der Ausbreitung in der Kultur seneszenten. Darüber hinaus ist es bekannt, dass ASCs zeigen eine Verschiebung in phänotypischen Expression unter in vitro-Bedingungen, die die Stammzell biology verändern können. So kann klinische Umsetzung, wäre es optimal, eine hoch gereinigte Zellpopulation zur direkten Transplantation oder Zellaussaat an ein Gerüst, ohne die Notwendigkeit für die in vitro Kultivierung erhalten. Darüber hinaus, um die großen Mengen von lipoaspirate, die verarbeitet werden müssen, um zu isolieren, die SVF kann lästig diejenigen, die nicht mit der Technik, wie diskutiert und von Zuk und Kollegen in einer aktuellen Veröffentlichung 13 gerichtet. Gemäß der von Zuk et al., Dieses Protokoll kann leicht nach oben oder unten skaliert werden, um die Lautstärke des lipoaspirate zubringen und kann auf ASC aus durch abdominoplasties oder ähnlichen Verfahren erhalten Fettgewebe zu isolieren.

CD90 und CD105 wurden zuvor bereits mesenchymalen Stamm c identifiziertell Marker sowohl im BM-MSC und ASC Bevölkerung. Im Einklang mit früheren Forschung, die CD90 + Population repräsentiert etwa 50% der frisch isolierten SVF 14 dagegen. Nur etwa 5-10% der Ausgangs SVF ausgedrückt CD105. 6 Namentlich mit aufeinanderfolgenden Durchgängen, CD105 Expression rasch fast erhöhte Null auf fast ubiquitäre Expression nach 4-7 Tagen in Kultur. Es ist bekannt, dass ASCs weisen beträchtliche phänotypischen Drift während der in vitro Expansion, die die Biologie von Stammzellen verändern können. 15-17 Idealer, klinische Anwendungen für Stammzellen würde die sofortige Verwendung von gereinigten Zellpopulationen zur direkten Transplantation oder Aussaat auf einem Gerüst beinhalten ohne die Notwendigkeit für die in vitro Kultivierung. Der Anteil der CD90 + Zellen können zwischen verschiedenen lipoaspirate Proben in einem Fettdepot abhängige Herkunft oder Alter abhängig variieren. Dennoch, mit CD90 als Zelloberflächenmarker können zur Anreicherung ofa Subpopulation menschlicher ASC mit verbesserten osteogenen Potenzial. Dieses Verfahren des osteogenen Anreicherung hat das Potential, dienen als ein neues Mittel zur Förderung einer raschen und robusten Knochenbildung bei Patienten mit kritischer große Skelettdefekten. Wir beobachten, dass routinemäßig ungefähre Zellausbeute aus Standard lipoaspirate ist 5 x 10 7 Zellen mit Kern / 500 ml lipoaspirate Verwendung des oben erwähnten Ernteverfahren, auch wenn, wie oben beschrieben, kann dies auf den Fettdepots Herkunft oder Patientendaten variieren. 18 Yoshimura und Kollegen berichteten, dass ASCs stellen 10-35% der Bevölkerung von kernhaltigen Zellen im SVF. 19. Daher besteht ein beträchtliches Potenzial für die Direktsaat eines Gerüsts für die Durchführung von Knochengewebetechnik Strategien folgenden osteogenen Anreicherung ASCs mittels FACS.

Stammzellbasierte Gewebetechnik für experimentelle und klinische Anwendungen oft hoch gereinigten Zellpopulationen erfordert. Andere hallogh Durchreinigungsverfahren existieren als einfachere Alternativen zu FACS umfassen Schwenken Komplement Verarmungs und Magnetvermittelte Zellsortierung (MACS). In bestimmten Situationen ist FACS notwendig und vorteilhaft: Wenn die Isolierung von hochreinem Subpopulationen gewünscht wird, wenn die Ziel-Oberflächenmarker selten auftritt in der Zellpopulation, oder wenn die Zellen abgetrennt werden muss, basierend auf unterschiedlichen Expressionsniveaus der gleichen Oberfläche Marker.

Verwendung sowohl mikrofluidischen basierte Einzelzelltranskriptionsanalyse und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, Endoglin (CD105) und Thy-1 (CD90) wurden festgestellt, dass Unterschiede in der ASC Expression osteogene Gene verknüpft sein. Die statistische Analyse der Einzelzelle Transkriptionsprofile gezeigt, dass niedrige Expression von CD105 und hohe Expression von CD90 beschreiben Gruppen von ASC mit erhöhter osteogene Kapazität. Anschließend wurden diese Proteine ​​verwendet werden, um für osteogene Subpopulationen von Zellen bereichern daus menschlichen Hautfettgewebe erived. 6,20

Zusammen zeigen diese Daten veranschaulichen die Effektivität der Sortierungs ASCs Grundlage spezifischer Zelloberflächenmarker, die mit osteogenen Transkriptionsaktivität korrelieren. Obwohl die Durchführbarkeit dieses Ansatzes wird hier durch die Verwendung von CD90 und CD105 als Beispiele gezeigt, bedarf einer weiteren Analyse zu tun, um alle vielversprechenden Kombinationen von Oberflächen-Antigen-Expression, die hoch korrelieren mit osteogenen Transkriptionsaktivität erweitert werden.

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Disclosures

Keiner der Autoren ein finanzielles Interesse in irgendwelchen der Produkte, Geräte oder in diesem Manuskript erwähnt Drogen. Keiner der Autoren haben eine konkurrierende finanzielles Interesse zu berichten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von der National Institutes of Health Research Stipendium R01-DE021683-01 und National Institutes of Health Forschungsstipendium R01-DE019434 zu MTL unterstützt; Howard Hughes Medical Institute Forschungsstipendium zu MTCDCW wurde von der ACS Franklin Martin Fakultät Research Fellowship, The Hagey Labor für Pädiatrische Regenerative Medizin und der Stanford University Child Health Research Institute Fakultät Scholar Award unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes Corning (Thomas Scientific) 2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement Gibco 10566-016
PBS, pH 7.4 Gibco 10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution Purdue  PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X Cellgro 21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin Gibco 16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution Stem Cell Technologies 7920
APC Mouse Anti-Human CD90 BD Pharmingen 559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) BD Pharmingen 561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)  eBioscience 48-9459-41
Anti-Human CD34 APC eBioscience 17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE eBioscience 12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7 eBioscience 25-4317-82
BD FACS Aria II instrument BD Biosciences
BD FACSDiva Software BD Biosciences

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References

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