टी सेल रिसेप्टर छांटना सर्किलों के एक साथ मात्रा (TRECs) और कश्मीर हटाने पुनर्संयोजन छांटना हलकों (KRECs) वास्तविक समय पीसीआर द्वारा

Immunology and Infection

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Sottini, A., Serana, F., Bertoli, D., Chiarini, M., Valotti, M., Vaglio Tessitore, M., Imberti, L. Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR. J. Vis. Exp. (94), e52184, doi:10.3791/52184 (2014).

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Abstract

Introduction

टी सेल रिसेप्टर छांटना हलकों (TRECs) और कश्मीर को हटाने पुनर्संयोजन छांटना हलकों (KRECs), एक जीनोमिक डीएनए पुनर्संयोजन प्रक्रिया के दौरान टी और क्रमश: बी-कोशिकाओं, के अनुपात में excised हैं कि छोटे circularized डीएनए तत्व हैं करने के लिए अग्रणी एक उच्च विविध टी के प्रदर्शनों की सूची और बी सेल रिसेप्टर्स के गठन। वे कोई कार्य किया है, लेकिन वे स्थिर हैं और नहीं दोहराया जा सकता है, क्योंकि वे इस प्रकार केवल दो बेटी कोशिकाओं में से एक में बने, प्रत्येक कोशिका विभाजन के बाद पतला कर रहे हैं। इसलिए, परिधीय रक्त में इनकी मात्रा Thymic और अस्थि मज्जा उत्पादन के एक अनुमान के रूप में माना जा सकता है।

TREC परख काफी हद तक Thymic उत्पादन की हद तक मूल्यांकन करने के लिए पिछले 15 वर्षों से इस्तेमाल किया गया है, जबकि शुरू में विकसित किया गया था, जो एक KREC परख, बी सेल प्रसार और स्वास्थ्य और रोग में बी-सेल समस्थिति के लिए अपने योगदान, 2 को मापने के लिए हाल ही में हड्डी मीटर की एक मार्कर के रूप में प्रस्तावित किया गया हैउत्पादन तीर। 3,4 यहाँ, हम हम TRECs और KRECs दोनों के एक साथ मात्रा का ठहराव के लिए विकसित की विधि का वर्णन। 4

इस संयुक्त विधि के साथ, वास्तविक समय पीसीआर द्वारा डीएनए मात्रा का ठहराव के लिए जुड़े परिवर्तनशीलता TRECs, KRECs और टी सेल रिसेप्टर अल्फा निरंतर के टुकड़े से युक्त एक ट्रिपल डालने प्लाज्मिड गिराए द्वारा प्राप्त एक अद्वितीय मानक वक्र के उपयोग (TCRAC) से सफाया कर दिया है 1: 1 के अनुपात में एक 1 में जीन। इस TREC और KREC प्रतिलिपि संख्या का एक और अधिक सटीक मूल्यांकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक ही प्रतिक्रिया में दो लक्ष्यों के एक साथ मात्रा का ठहराव अभिकर्मक लागत में कमी की अनुमति देता है।

प्रस्तावित TREC / KREC परख गंभीर संयुक्त इम्यूनो (SCID), 4 आम चर इम्यूनो, 5 autoimmune रोग, 6-8 और एचआईवी संक्रमण के साथ बच्चों या वयस्कों में टी की हद और बी सेल नव उत्पादन को मापने के लिए उपयोगी हो सकता है 9। इसके अलावा, यह करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैरोगियों KREC मात्रा का ठहराव का उपयोग कर पहचाना जा सकता है agammaglobulinemia SCID रोगियों अंतर्निहित आनुवंशिक दोषों के बावजूद TREC परख का उपयोग कर मान्यता प्राप्त कर रहे हैं, क्योंकि अंत में। 6-8 hematopoietic स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण, 10 एंजाइम प्रतिस्थापन, 11 और एंटीवायरल 9 या immunomodulating उपचारों के बाद प्रतिरक्षा वसूली की निगरानी, ​​और , TREC / KREC परख भी नवजात स्क्रीनिंग कार्यक्रमों में immunodeficiencies का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 12 इस मामले में, परीक्षण रक्त मिट के छोटे धब्बे से निकाले डीएनए पर प्रदर्शन किया और फिल्टर पेपर पर सूख जाना चाहिए, अत्यधिक संवेदनशील और के लिए विशिष्ट होना चाहिए लक्ष्य रोगों, साथ ही अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और लागत प्रभावी है।

विस्कॉन्सिन introduc करने के लिए पहली बन गया जब परीक्षा में KREC मात्रा का ठहराव की शुरूआत नियमित तौर पर 2008 के बाद से संयुक्त राज्य अमेरिका (WI, एमए, सीए) के कुछ भागों में प्रदर्शन किया गया है जो immunodeficiencies के लिए नवजात स्क्रीनिंग, के प्रदर्शन में सुधार करना चाहिएअपने प्रसव के बाद स्क्रीनिंग कार्यक्रम में TRECs के ई विश्लेषण। 13

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Protocol

नोट: आचार बयान: इस प्रोटोकॉल हमारी संस्था, Spedali Civili डि ब्रेशिया के दिशा निर्देशों के बाद

एक "ट्रिपल डालें" प्लाज्मिड 1. तैयारी

  1. चयन और उचित मूल्य उस सामग्री की तैयारी:
    1. ऐसे EDTA के ट्यूबों में एकत्र एक स्वस्थ युवा विषय के परिधीय रक्त के रूप में पीसीआर, द्वारा detectable TRECs और KRECs है की बहुत संभावना कोशिकाओं से युक्त एक नमूना प्राप्त करते हैं।
      नोट: मूल रूप से, हम KRECs के लिए tonsil टुकड़े से TRECs और मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के लिए thymocytes का उपयोग कर विधि विकसित की थी, लेकिन स्वस्थ विषयों आमतौर पर TRECs और पीसीआर द्वारा उनके पता लगाने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त KRECs की राशि है। इसलिए, परिधीय रक्त प्राप्त करने के लिए और साथ काम करना आसान एक मान्य विकल्प होना चाहिए। यदि नहीं, तो TRECs, विशेष रूप से, एक बच्चों से एक युवा वयस्क से स्वस्थ वयस्कों में उम्र, परिधीय रक्त के साथ कम होती है कि ध्यान में रखते हुए सलाह दी है।
    2. अलग परिधीय रक्त mononucएक मानक घनत्व ढाल जुदाई विधि द्वारा लेअर कोशिकाओं (PBMC)।
  2. डीएनए निष्कर्षण:
    1. एक वाणिज्यिक डीएनए रक्त मिनी किट का उपयोग PBMC से डीएनए निकालने। नीचे वर्णित कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
      1. 1400 rpm पर एक प्रकार के बरतन-इनक्यूबेटर का उपयोग कर 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस (के बजाय 56 डिग्री सेल्सियस) पर नमूने सेते हैं।
      2. 70 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और निर्माता के निर्देशों के अनुसार centrifugation द्वारा डीएनए elute, स्तंभ के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गरम क्षालन बफर जोड़ें। 260/280 एनएम पर spectrophotometric अनुमान से निकाले डीएनए एकाग्रता का निर्धारण।
  3. TREC और KREC संकेत जोड़ों (एसजे) और TCRAC संदर्भ जीन की आवेषण युक्त प्लाज्मिड की तैयारी:
    1. TRECs, KRECs और TCRAC के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ (TREC-एसजे, KREC-एसजे, और TCRAC टुकड़े प्राप्त करने के लिए) PBMC से निकाले डीएनए बढ़ाना (1 टेबल देखें)।
      नोट: 5'-अंत में, KREC- और TCRAC विशिष्ट प्राइमरों (इटैलिक में इंगित) अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड flanking का एक उचित संख्या के साथ (1 टेबल दिखाया दृश्यों में कम-मामले में) HindIII और SpeI प्रतिबंध साइटों होते हैं; दोनों सुविधाओं विहित KREC और TCRAC दृश्यों में मौजूद नहीं हैं।
TRECs आगे 5'-एएए भूमिकाः GGC एजीसी सी सी टी सीटीसी CAA से GGC-3 '
उलटा 5'-GGC टीजीए TCT टीजीटी CTG एसीए TTT जीसी 3 '
KRECs आगे 5'- सीसीसी आग सीटीटी टीसीए GCG सीसीसी एटीटी ACG TTT सीटी -3 '
उलटा 5'- सीसीसी आग सीटीटी GTG AGG GAC ACG कैग सीसी-3 '
TCRAC आगे 5'- जी एसी टैग गूंथना भूमिकाः एसीसी GTG अधिनियमटी जी सी कैग -3 '
उलटा 5'- जी एसी टैग टी जी सी टीजीटी टीजीटी टीजीए AGG CGT टीटीजी सी 3 '

तालिका 1 प्राइमरों क्लोनिंग प्रक्रियाओं के लिए प्रयोग किया जाता है। 5'-अंत में, कम मामले में प्रतिबंध एंजाइम साइटों के लिए इसी न्यूक्लियोटाइड दिखाए जाते हैं, इटैलिक में न्यूक्लियोटाइड flanking जोड़ा दिखाए जाते हैं जबकि।

    1. 1x बफर द्वितीय, से मिलकर, 25 μl के अंतिम मात्रा में पीसीआर प्रतिक्रियाओं सम्पन्न 1.5 मिमी 2 MgCl, (200 माइक्रोन प्रत्येक), प्राइमरों 900 एनएम, AmpliTaq डीएनए पोलीमरेज़ (2.5 यू / 25 μl) के अंतिम एकाग्रता में dNTP मिश्रण, और डीएनए के 100 एनजी।
    2. निम्नलिखित पीसीआर मापदंडों का उपयोग करें: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पहला कदम है, 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों के बाद; 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के अंत में एक चक्र। पीसीआर उत्पाद लंबाई होना चाहिए: TRECs के लिए 380 बीपी, कश्मीर के लिए 166 बी.पी.आरईसी, TCRAC के लिए 381 बीपी।
    3. PCR2.1-Topo वेक्टर के टीए स्वीकर्ता साइट में TREC-एसजे की पीसीआर उत्पाद डालें। कोशिकाओं के साथ प्रदान की प्रोटोकॉल के बाद गर्मी के झटके से XL1-नीले रासायनिक सक्षम कोशिकाओं में प्लास्मिड डीएनए रूपांतरण। क्योंकि एम्पीसिलीन प्रतिरोध के बढ़ने कि कालोनियों के अलावा, क्योंकि खो β-galactosidase complementation की सफेद दिखाई देते हैं, और एक मास्टर डिश में उन्हें टीका लगाना होगा जो डालें, ले जाने के उन लोगों की पहचान। अंत में, पीसीआर द्वारा TREC टुकड़ा युक्त कालोनियों की पहचान।
    4. पहचान की कालोनियों में से एक का विस्तार और एक प्लाज्मिड Miniprep किट का उपयोग प्लास्मिड डीएनए को शुद्ध और निर्माता के निर्देशों का पालन करें। प्लास्मिड डीएनए और SpeI प्रतिबंध एंजाइम के साथ TCRAC प्रवर्धित उत्पाद डाइजेस्ट और SpeI प्रतिबंध साइट में TCRAC टुकड़ा ligate।
    5. XL1-नीले रंग की कोशिकाओं में डीएनए प्लाज्मिड रूपांतरण और पीसीआर द्वारा TCRAC टुकड़ा युक्त कालोनियों की पहचान। पहचान की कालोनियों में से एक का विस्तार और शुद्धप्लाज्मिड Miniprep किट का उपयोग प्लास्मिड डीएनए।
    6. प्लास्मिड डीएनए और HindIII साथ KREC प्रवर्धित उत्पाद डाइजेस्ट और HindIII प्रतिबंध साइट में KREC-एसजे टुकड़ा क्लोन। XL1-नीले रंग की कोशिकाओं में डीएनए प्लाज्मिड रूपांतरण और पीसीआर द्वारा तीसरा टुकड़ा युक्त कालोनियों की पहचान।
    7. प्रत्यक्ष अनुक्रमण द्वारा, सत्यापित करें, तीन आवेषण की उपस्थिति और म्यूटेशन के अभाव। अंतिम ट्रिपल डालने प्लाज्मिड के नक्शे चित्रा 1 में प्रतिनिधित्व किया है।

चित्रा 1
चित्रा 1. ट्रिपल डालने प्लाज्मिड नक्शा। TREC, KREC, TCRAC दृश्यों और प्रतिबंध एंजाइम साइटों की स्थिति दिखा ट्रिपल डालने प्लाज्मिड नक्शा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    1. पहचान की कालोनियों में से एक का विस्तार एक प्लाज्मिड midiprep किट का उपयोग प्लास्मिड डीएनए शुद्ध। 260/280 एनएम पर spectrophotometric अनुमान से प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता और जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा डीएनए गुणवत्ता का निर्धारण। -80 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मिड की उचित aliquots के स्टोर (उदा।, 50 μl प्रत्येक)।

2. मानक वक्र तैयारी

नोट: विशेष रूप से डीएनए ले ओवर की रोकथाम के लिए बनाया गया एक जगह में 0.1x ते बफर में सभी dilutions तैयार।

  1. (एम पी =: ब्याज की प्लाज्मिड प्रतिलिपि संख्या के द्रव्यमान की गणना प्लाज्मिड आकार 4846 बी.पी. है कि खाते में ले रही है, (2 टेबल देखें) और बीपी प्रति औसत द्रव्यमान 1.096 एक्स 10 -21 जी / बीपी, और इसलिए है कि 4846 बीपी) एक्स (1.096 एक्स 10 -21 जी / बीपी) = 5,311.216 एक्स 10 -21 जी = 5.311 एक्स 10 -18 जी।
कॉपी # एक्स 5.311 एक्स 10 -18 जी प्लास्मिड डीएनए का मास (G)
1 एक्स 10 6 5.311 एक्स 10 -12
1 एक्स 10 5 5.311 एक्स 10 -13
एक 10 x 4 5.311 एक्स 10 -14
1 एक्स 10 3 5.311 एक्स 10 -15
1 एक्स 10 2 5.311 एक्स 10 -16

प्रत्येक मानक वक्र कमजोर पड़ने बिंदु के लिए आवश्यक प्लाज्मिड तालिका 2 मास।

  1. प्रत्येक प्रतिक्रिया में pipetted किए जाने की मात्रा (5 μl) द्वारा की जरूरत प्लाज्मिड जनता को विभाजित करके प्लास्मिड डीएनए की सांद्रता की गणना (3 टेबल देखें)।
प्लास्मिड डीएनए का मास (G) ÷ 5 μl प्लास्मिड डीएनए के अंतिम एकाग्रता (छ / μl)
5.311 एक्स 10 -12 1.062 एक्स 10 -12
5.311 एक्स 10 -13 1.062 एक्स 10 -13
5.311 एक्स 10 -14 1.062 एक्स 10 -14
5.311 एक्स 10 -15 1.062 एक्स 10 -15
5.311 एक्स 10 -16 1.062 एक्स 10 -16

प्रत्येक कमजोर पड़ने बिंदु के लिए आवश्यक प्लाज्मिड सांद्रता के पटल 3. गणना।

  1. प्लाज्मिड के एक विभाज्य पिघलना। XhoI साथ प्लास्मिड डीएनए के दो माइक्रोग्राम प्रति linearize और अपनी एकाग्रता बी का निर्धारण260/280 एनएम पर Y spectrophotometric आकलन।
  2. (उदाहरण के लिए, 100 एनजी / μl = 0.1 माइक्रोग्राम प्रति / μl = 1 एक्स 10 -7 / छ μl) से शुरू करने के लिए एक सुविधाजनक काम कर शेयर समाधान प्राप्त करने के क्रम में linearized प्लास्मिड डीएनए का एक उचित कमजोर पड़ने को तैयार है। डिग्री सेल्सियस -80 में linearized प्लास्मिड डीएनए के शेष स्टोर।
  3. 1 एक्स 10 -10 जी / μl के और अधिक व्यावहारिक एकाग्रता में प्लाज्मिड लाने के लिए 100 dilutions: 01:10 या एक का एक सुविधाजनक संख्या में प्रदर्शन।
  4. श्रृंखला के पहले मानक वक्र बिंदु तैयार करने की जरूरत है (1 एक्स 10 6 प्रतियां, इसी 1.062 करने के लिए एक्स 10 -12 जी - सूत्र सी 1 वी 1 = कमजोर पड़ने की मात्रा की गणना के लिए सी 2 वी 2 (1 वी वी 2) का प्रयोग करें / 5 μl; तालिका 4 देखें)।
प्रारंभिक सान्द्र। (छ / μl) प्लास्मिड डीएनए वॉल्यूम (μl) DilueNT वॉल्यूम (μl) अंतिम वॉल्यूम। (Μl) अंतिम सान्द्र। (छ / μl) प्लास्मिड डीएनए के अंतिम प्रतिलिपि संख्या / 5μl
सी 1 वी 1 वी 2 वी 1 वी 2 सी 2
1 एक्स 10 -7 5 μl 45 μl 50 μl 1 एक्स 10 -8 लागू नहीं
1 एक्स 10 -8 5 μl 495 μl 500 μl 1 एक्स 10 -10 लागू नहीं
1 एक्स 10 -10 5 μl 465 μl 470 μl 1.062 एक्स 10 -12 1 एक्स 10 6
1.062 एक्स 10 -12 50 μl 450 μl 500 μl 1.062 एक्स 10 -13 1 एक्स 10 5
1.062 एक्स 10 -13 50 μl 450 μl 500 μl 1.062 एक्स 10 -14 एक 10 x 4
1.062 एक्स 10 -14 50 μl 450 μl 500 μl 1.062 एक्स 10 -15 1 एक्स 10 3
1.062 एक्स 10 -15 50 μl 450 μl 500 μl 1.062 एक्स 10- 16 1 एक्स 10 2

तालिका 4 कमजोर पड़ने गणना।

  1. शेष मानक वक्र अंक प्राप्त करने के लिए 1:10 dilutions की एक नियमित श्रृंखला के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: अगले प्रदर्शन से पहले संक्षेप में प्रत्येक प्लाज्मिड कमजोर पड़ने भंवर मत भूलना।
    नोट: सेंट के उच्चतम कमजोर पड़नेप्लास्मिड डीएनए के ऐसे एक छोटी मात्रा काफी स्थिर भविष्य के उपयोग के लिए भंडारित किया जा करने के लिए नहीं है, क्योंकि andard वक्र (10 प्रतियां / 5 μl), बस परख प्रदर्शन से पहले तैयार किया जाना चाहिए।
  2. उपयोग करें जब तक अलग नलियों में -80 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिपल प्लाज्मिड कमजोर पड़ने अंक स्टोर। पतला ट्रिपल प्लास्मिड डीएनए में कम से कम छह महीने के लिए अत्यधिक स्थिर है।

लक्ष्य के नमूनों से 3. डीएनए निष्कर्षण

  1. परिधीय रक्त से अलग PBMC घनत्व ढाल जुदाई विधि का उपयोग EDTA के ट्यूबों में एकत्र की।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, अन्य उपयुक्त शुरुआती सामग्री का उपयोग (जैसे, लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या, पूरे रक्त हल) लक्ष्य नमूने के रूप में।
  2. 1.2 चरण में रिपोर्ट के रूप में लक्ष्य के नमूनों की PBMC से डीएनए निकालने।

TRECs और KRECs की मात्रा का ठहराव के लिए 4. वास्तविक समय पीसीआर

  1. प्लेट तैयार करने और लोड हो रहा है:
    1. प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम दो प्रतिकृति सहित एक पीसीआर थाली की व्यवस्थाविश्लेषण किया जा करने के लिए: मानक वक्र (ए → एफ 1 → 4), सकारात्मक नियंत्रण (Ctrl +; G1 के → 4) और कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी; एच 1 → 4)।
      नोट: 5 तालिका में एक ठेठ योजना का निरीक्षण करें, लेकिन विभिन्न स्वरूपों बनाया जा सकता है। TRECs और KRECs TCRAC के उन लोगों से अलग एक ही कुओं में एक साथ परिलक्षित हो जाएगा कि याद रखें।
TRECs + KRECs एक TCRAC बी TRECs + KRECs TCRAC TRECs + KRECs TCRAC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
एक 10 6 प्रतियां 10 6 प्रतियां 10 6 प्रतियां 10 6 प्रतियां 1 1 1 1 9 9 9 9
बी 10 5 प्रतियां 10 5 प्रतियां 10 5 प्रतियां 10 5 प्रतियां 2 2 2 2 10 10 10 10
सी 10 4 प्रतियां 10 <समर्थन> 4 प्रतियां 10 4 प्रतियां 10 4 प्रतियां 3 3 3 3 11 11 11 11
डी 10 3 प्रतियां 10 3 प्रतियां 10 3 प्रतियां 10 3 प्रतियां 4 4 4 4 12 12 12 12
10 दो प्रतियां 10 दो प्रतियां 10 दो प्रतियां 10 दो प्रतियां 5 5 5 13 13 13 13
एफ 10 प्रतियां 10 प्रतियां 10 प्रतियां 10 प्रतियां 6 6 6 6 14 14 14 14
जी Ctrl + Ctrl + Ctrl + Ctrl + 7 7 7 7 15 15 15 15
एच एनटीसी एनटीसी एनटीसी एनटीसी 8 8 8 8 16 16 16 16

सारणी 5 नमूना वास्तविक समय पीसीआर थाली।

    1. और अलग नलियों में TRECs / KRECs और TCRAC (6 तालिका देखें) के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें - जरूरत कुओं की कुल संख्या की गणना (संभव pipetting त्रुटियों के लिए खाते में 2 अतिरिक्त कुओं 1 शामिल हैं)।
      नोट:। TRECs, KRECs और TCRAC के लिए विशिष्ट प्राइमरों और जांच टेबल 7 में उल्लेख कर रहे हैं प्राइमर और जांच अंतिम सांद्रता में क्रमश: 900 एनएम और 200 एनएम हैं।
TRECs / KRECs TCRAC
एच 2 2 μl एच 2 4.75 μl
20 pmol / μl के लिए KRECs 1.125 μl 20 pmol / μl के लिए TCRAC 1.125 μl </ टीडी>
KRECs 20 pmol / μl फिरना 1.125 μl TCRAC 20 pmol / μl फिरना 1.125 μl
KRECs जांच 10 pmol / μl 0.5 μl TCRAC जांच 10 pmol / μl 0.5 μl
20 pmol / μl के लिए TRECs 1.125 μl 2x TaqMan यूनिवर्सल पीसीआर मास्टर मिक्स 12.5 μl
TRECs 20 pmol / μl फिरना 1.125 μl
TRECs जांच 10 pmol / μl 0.5 μl
2x TaqMan यूनिवर्सल पीसीआर मास्टर मिक्स 12.5 μl

संकेत दिया कुओं के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की तालिका 6. वॉल्यूम।

TRECs आगे 5'-सीएसी एकटीसी सी सी टी टीटीसी एएसी कैट GCT-3 '
उलटा 5'-टी जी सी AGG टी जी सी सीटीए टी जी सी एटीसी ए -3 '
जांच 5'-परिवार-एसीए सी सी टी CTG GTT TTT GTA आग GTG सीसीसी अधिनियम-Tamra-3 '
KRECs आगे 5'-टीसीसी सीटीटी AGT GGC एटीटी एटीटी टीजीटी एटीसी अधिनियम -3
उलटा 5'-AGG एजीसी कैग सीटीसी TTA सीसीसी टैग AGT-3 '
जांच 5'-हेक्स-TCT जीसीए सीजीजी जीसीए जीसीए GGT TGG-Tamra -3
TCRAC आगे 5'-TGG सी सी टी ए ए सी सी सी टी GAT सी सी टी सीटीटी-3 '
उलटा 5'-GGA TTT आगा जीटीसी TCT कैग CTG GTA के सीएसी -3
जांच 5'-परिवार-टीसीसी सीएसी आगा जैसे सीसीए GAA ने सीसीसी टीजीए सीसीसी-Tamra-3 '

वास्तविक समय पीसी के लिए प्राइमर और जांच के पटल 7. अनुक्रमआर परख।

    1. प्रत्येक मिश्रण (TRECs / KRECs और TCRAC) के 20 μl जोड़ें। अभिकर्मक तैयारी कमरा छोड़ने से पहले, एक ऑप्टिकल चिपकने वाला कवर के साथ प्रतिक्रिया थाली सील।
    2. एक न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण कमरे में, चिपकने वाला कवर उठा और जीनोमिक डीएनए नमूने के 5 μl जोड़ - वेल्स को (400 500 एनजी)। Ctrl + वेल्स को (गर्भनाल रक्त से प्राप्त PBMC से तैयार है, यानी) जीनोमिक डीएनए के 5 μl जोड़ें।
      नोट: गर्भनाल रक्त के लिए एक विकल्प के रूप में, नमूने के एक ही नाम से जाना, सकारात्मक परिधीय रक्त नमूना या पूल से डीएनए का उपयोग करें, या TREC- से जीनोमिक डीएनए के साथ ट्रिपल डालने प्लाज्मिड की एक निर्धारित राशि के मिश्रण से एक "कृत्रिम" सकारात्मक मानक को तैयार और KREC नकारात्मक सेल लाइनों।
    3. एनटीसी कुओं को पानी के 5 μl जोड़ें। ऑप्टिकल चिपकने वाला कवर के साथ फिर से प्रतिक्रिया थाली सील।
    4. प्लास्मिड डीएनए ले ओवर की रोकथाम सुनिश्चित करने के लिए एक जगह पर ले जाएं; प्रत्येक कमजोर पड़ने poin पिघलनाकेवल उपयोग करने से पहले प्लास्मिड डीएनए मानक वक्र की टी और उच्चतम कमजोर पड़ने को तैयार (10 प्रतियां / 5 μl)। केवल एक → एच 1 → चार कुओं से चिपकने वाला कवर उठा और प्लास्मिड डीएनए मानक वक्र के प्रत्येक बिंदु के कमजोर पड़ने के 5 μl जोड़ें। फिर से चिपकने वाला कवर सील।
    5. इस प्रकार अभिकर्मकों तल पर तैनात कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने, कुओं के तल पर बुलबुले के अभाव की जाँच करें।
    6. एक वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम पर परख चलाएँ। मानक प्रोटोकॉल 2 से 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 45 चक्रों के बाद मिनट, 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक हीटिंग, और एक संयुक्त प्राइमर / जांच annealing और बढ़ाव पर के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर पहला कदम के होते हैं 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।
    7. पीसीआर कार्यक्रम के अंत में डेटा को बचाओ।
      नोट:, न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए अलग-अलग क्षेत्रों / कमरों का उपयोग करें: डीएनए पार संक्रमण से बचने के लिए याद करने के लिए: मात्रात्मक पीसीआर के लिए हमेशा की तरह अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास सिफारिशों का पालन करने के लिए पीसीआर परख वास्तविक समय सेट करते समयअभिकर्मक तैयारी, प्लाज्मिड हेरफेर, प्रवर्धन प्रतिक्रिया; अलग पिपेट सेट का उपयोग करें; के रूप में उपयुक्त दस्ताने / कोट बदल जाते हैं।
  1. परिणाम और गणना:
    नोट: निम्न चरणों को सामान्य रूप में वास्तविक समय पीसीआर सामग्री तालिका में उल्लेख साधन है, लेकिन, के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग हमारे अनुभव के आधार पर कर रहे हैं, वे अन्य वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण प्लेटफार्मों और सॉफ्टवेयर के लिए आवेदन करना चाहिए। एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, भले ही आम तौर पर आवश्यक आदेश (जैसे, प्रतीक, शॉर्टकट) निष्पादित करने के लिए अधिक से अधिक एक ही रास्ता है कि, ध्यान में रखें।
    1. सॉफ्टवेयर में बचाया परिणाम फ़ाइल को खोलें और "परिणाम" टैब पर क्लिक करें। खिड़की के शीर्ष पर, "विश्लेषण" मेनू पर क्लिक करें और "विश्लेषण सेटिंग" का चयन करें। सॉफ्टवेयर "सभी" डिटेक्टरों और "ऑटो सीटी" (सीटी = दहलीज चक्र का चयन करके सीमा से स्वचालित रूप से निर्धारित करने दें। चलो सॉफ्टवेयर सेट "स्वचालित आधारभूत"; डिफ़ॉल्ट रूप से पृष्ठभूमि उन्मूलन के लिए।
    2. इसी ड्रॉप-डाउन मेनू में तीन "डिटेक्टरों" में से एक का चयन करें, विंडो के दाएँ भाग में, "प्रवर्धन साजिश" नाम टैब पर क्लिक करें और (TRECs के साथ शुरू उदाहरण के लिए)। बस के नीचे, स्वयं एक सीमा निर्धारित करने के लिए "मैनुअल सीटी" का चयन करें; विंडो के निचले भाग में जाओ और प्रवर्धन भूखंडों को दिखाने के लिए चुना डिटेक्टर के मानक वक्र कमजोर पड़ने अंक के लिए इसी कुओं का चयन करें। ऐसा करने के लिए बस क्लिक करें और मेज की इसी कोशिकाओं पर माउस खींचें।
      1. उसके बाद क्लिक करें, मैन्युअल दहलीज समायोजित ऊपर और नीचे लाल दहलीज रेखा खींचें, और करने के लिए परिणाम reanalyze करने के लिए "विश्लेषण"। दहलीज सेटिंग परिणामों को प्रभावित करता है कि कैसे जांच करने के लिए, "रिपोर्ट" टैब का चयन करें, और संबंधित मानक वक्र कमजोर पड़ने अंक के परिणामस्वरूप सीटी देखते हैं। दहलीज से चलती है, जब एक इष्टतम स्थान पाने के लिए निम्न सिफारिशों के साथ पालन करने के लिए प्रयास करें।
      2. "प्रवर्धन साजिश" टैब के लिए वापस जाओ और दहलीज पर्याप्त पृष्ठभूमि शोर से ऊपर लेकिन पठार चरण नीचे घातीय प्रवर्धन के एक क्षेत्र में है कि सत्यापित करें। प्रवर्धन साजिश लघुगणकीय पैमाने में नहीं दिखाया गया है, तो "ग्राफ सेटिंग्स" और "लॉग" के रैखिक भाग में सीमा से आधे मार्ग में सेट के रूप में पद से चलाने वाई अक्ष सेटिंग सेट को याद करने की साजिश पर राइट क्लिक करें साजिश है, और निरीक्षण प्रवर्धन घटता लगभग एक दूसरे के समानांतर।
      3. सीटी परिणाम देखने के लिए "रिपोर्ट" टैब पर क्लिक करें। दहलीज नियुक्ति प्रत्येक मानक वक्र कमजोर पड़ने अंक के दो प्रतिकृति की शुद्धता को अधिकतम परिणाम है कि उत्पादन किया है कि सुनिश्चित करें।
      4. दहलीज सबसे अच्छा मानक वक्र कमजोर पड़ने अंक (इष्टतम संवेदनशीलता) की भयावहता के चरम के आदेश को दर्शाता है, जो बिंदु पर रख दिया गया है कि जाँच करें। शेष दो डिटेक्टरों (KRECs और टी के लिए दोहराएँ चरण 4.2.2 और शेष substepsCRAC)।
      5. रिपोर्ट टैब पर जाएँ सभी डिटेक्टरों (TRECs, KRECs, TCRAC) के लिए मानक वक्र के कुओं के लिए इसी कोशिकाओं को चुनने के लिए विंडो के निचले भाग पर तालिका में फिर से माउस खींचें। तीन लक्ष्यों के परिणामस्वरूप सीटी एक ही कमजोर पड़ने बिंदुओं पर बहुत समान है सत्यापित करें कि (जैसे, फर्क नहीं अधिक से अधिक 0.5 सीटी)। अगर जरूरत थ्रेसहोल्ड मरम्मत करना और फिर से जाँच करें।
        नोट: ट्रिपल डालने प्लाज्मिड प्रत्येक लक्ष्य है और इसलिए का एक भी कॉपी क्योंकि इसमें प्रवर्धन अनुपात सैद्धांतिक रूप से एक के करीब होना चाहिए: 1: 1। कुछ मामलों में यह मैन्युअल रूप से बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए डिटेक्टरों की एक या एक से अधिक के लिए भी आधारभूत समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। बस फिर "मैनुअल बेसलाइन" सेट, समायोजन की जरूरत है जिसके लिए डिटेक्टर का चयन करें, और आरंभ और समाप्ति साइकिल (आमतौर पर 3 से 15) के लिए कस्टम मूल्यों डालें, "विश्लेषण सेटिंग" विंडो को याद करते हैं। फिर "ठीक है और reanalyze" पर क्लिक करें और पिछले अंक पुनः जाँच।
      6. केवल निम्नलिखित की पुष्टि करने के बाद प्रायोगिक सत्र स्वीकार करें:
        1. , "रिपोर्ट" टैब पर क्लिक करें विंडो के निचले भाग में जाना है, एनटीसी कुओं का चयन करें और इसी सीटी "Undet" है कि जाँच (यानी, कोई प्रवर्धन एनटीसी कुओं में मौजूद है)।
        2. "मानक वक्र" टैब का चयन करें और साजिश खिड़की के अधिकार के लिए लग रही है; ड्रॉप-डाउन मेनू से चुनें डिटेक्टरों और सूचना दी मानक वक्र ढलान -3.55 और -3.32 पर्वतमाला के बीच चाहे (91 की क्षमता पीसीआर इसी - 100%) देखें
        3. दृढ़ संकल्प (आर 2) के गुणांक (प्रत्येक डिटेक्टर चयन करने के बाद, एक ही "मानक वक्र" टैब में) सही ढलान और अवरोधन के नीचे अपने मूल्य को पढ़ने के द्वारा, 0.998 (चित्रा 2) की तुलना में अधिक है कि सुनिश्चित करें।
          वे एक उच्च "छुट्टी है (उनके misalignment के ढलान को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि अधिक आसानी से चरम कमजोर पड़ने अंक पर ध्यान दे: नोटप्रतिगमन लाइन पर रोष "प्रभाव)। विशेष रूप से, उच्चतम प्लाज्मिड कमजोर पड़ने जल्दी ही उम्मीद की तुलना में नीचा हो सकता है कि मन में रखो। हालांकि, जब भी संभव है कि यह एक तर्कसंगत दृष्टिकोण मात्रात्मक पता लगाने की सीमा के रूप में 100 विचार करने के लिए हो सकता है, क्योंकि उन्हें त्यागने के लिए उपयोगी नहीं है: 10 और 100 के बीच के नमूने के लिए दूसरे शब्दों में, परिणाम <100 या "सकारात्मक रूप में सूचित किया जा सकता है , लेकिन व्यावहारिक नहीं "से undetectable", वक्र रेंज (<10) के बाहर यह शून्य के रूप में सूचित किया जा सकता है जबकि अगर "।
          नोट: यह प्रत्येक कमजोर पड़ने बिंदु के लिए एक औसत मूल्य की गणना करने के लिए, पिछले मानक वक्र dilutions की सीटी मूल्यों का एक संग्रह रखने के लिए उपयोगी हो सकता है भविष्य के प्रयोगों के लिए इष्टतम "संदर्भ" श्रेणी या आंतरिक गुणवत्ता की जांच के एक प्रकार के रूप में रखा जाना (जैसे, Shewhart नियंत्रण चार्ट के निर्माण करने के लिए मतलब है और एसडी गणना)। तुलनात्मक रूप से, यह सकारात्मक नियंत्रण के पिछले सीटी का एक संग्रह रखने के लिए उपयोगी हो सकता है।

      चित्रा 2
      TRECs, KRECs, और TCRAC के लिए चित्रा 2. मानक घटता। मानक वक्र अंक के भूखंड और लॉग-प्रतिगमन लाइन TRECs (ए) के लिए अनुमान है, KRECs (बी), और TCRAC (सी) आदर्श घातीय के अनुपालन को सत्यापित करने के लिए बनाया जाता है 100% की दक्षता के अनुरूप होगा कि प्रवर्धन दर (ढलान = 3.32)। सीटी: दहलीज चक्र; आर 2:। दृढ़ संकल्प के प्रतिगमन गुणांक यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

          1. "रिपोर्ट" टैब पर क्लिक करें और (चार्ट के तहत तालिका के इसी कोशिकाओं में पाया जाता है) सकारात्मक नियंत्रण की सीटी एसए पर पिछले assays के परिणामों के साथ संगत है कि यह पुष्टिमुझे सकारात्मक नियंत्रण में जाना जाता है।
            नोट: "रिपोर्ट" टैब TRECs, KRECs और नमूनों की TCRAC की राशि से पता चलता सॉफ्टवेयर ठीक से सेट किया गया है दहलीज और आधारभूत बाद प्राप्त सीटी मूल्यों का उपयोग कर, संबंधित मानक वक्र से प्रक्षेप द्वारा गणना की गई है कि परीक्षण किया जा रहा है (एक एक नई दहलीज / आधारभूत के साथ नए विश्लेषण) इन परिणामों बदल जाएगा। प्रक्षेप मानक वक्र पर जगह लेता है, जहां देखने के लिए, फिर वांछित कुओं का चयन करें, "मानक वक्र" टैब का चयन करें, और प्रतिगमन लाइन पर प्रदर्शित होने वाले काले "एक्स" के लिए देखो। उनके Y अक्ष मूल्य interpolated मात्रा है। हमेशा एक ही सकारात्मक नियंत्रण का प्रयोग करते हैं, तो उचित संदर्भ पर्वतमाला और / या गुणवत्ता नियंत्रण चार्ट में सकारात्मक नियंत्रण पर निर्धारित पिछले मूल्यों पर आधारित है, का निर्माण किया जा सकता है।
        1. , "फाइल" मेनू पर क्लिक करें "सहेजें", और फिर एक .csv फ़ाइल के लिए "निर्यात" एक ते में सभी कुओं की मात्रा में निर्यात करने के लिएअल्पविराम से अलग मूल्यों से युक्त XT फ़ाइल।
        2. एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में the.csv फ़ाइल आयात और उचित रूप से निम्न सूत्र की स्थापना द्वारा 10 6 PBMC प्रति TRECs की संख्या या KRECs गणना: [(TRECs या KRECs की मात्रा मतलब है) / (TCRAC / 2 की मात्रा मतलब है)] 10 6 x
          नोट: प्रत्येक कक्ष में जैसे दो TCRAC जीन प्रतियां, प्रत्येक गुणसूत्र के लिए एक है क्योंकि वहाँ TCRAC का मतलब मात्रा 2 से विभाजित है।
          नोट: TRECs और सकारात्मक नियंत्रण के KRECs की अंतिम संख्या की संगति में माना जाता है, लेकिन मूल्यों को पूरी तरह से क्योंकि मानक वक्र कमजोर पड़ने अंक का जोड़ा परिवर्तनशीलता के मैच नहीं होगा कि मन में रखने के लिए किया जा सकता है। सकल विचलन के मामले में, प्रयोग दोहराया जाना पड़ सकता है। फिर, नियंत्रण चार्ट का एक उपयुक्त संदर्भ सीमा निर्धारित करने के लिए बनाया जा सकता है।
        3. पूर्ण रक्त गणना के परिणाम उपलब्ध हैं, तो निम्न सूत्र का उपयोग रक्त की मिलीलीटर प्रति TRECs या KRECs गणना (वैकल्पिक, लेकिन अनुशंसित):
          TRECs या 1 एक्स 10 6) एक्स (लिम्फोसाइट + monocyte प्रति KRECs रक्त के 1 मिलीलीटर) / 10 = 6 प्रतियां / एमएल में गिनते हैं।

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Representative Results

परख 87 स्वस्थ नियंत्रण के एक प्रतिनिधि नमूने में प्रदर्शन किया गया था: 42 बच्चों 0 वर्ष की आयु - 17 (पुरुष / महिलाओं: 25/17) और 24 आयु वर्ग के 45 वयस्कों - 60 (पुरुषों / महिलाओं: 29/16)। परिणाम की गणना की गई TRECs और 10 6 PBMC प्रति KRECs, और फिर रक्त की मिलीलीटर प्रति TRECs और KRECs के रूप में प्राप्त किया गया।

4 साल - TRECs की संख्या की वजह से 0-3 एक बहुत ही तेज़ फैशन में विशेष रूप से Thymic पेचीदगी, चार को उम्र के साथ कम हो जाती है। यह महिलाओं की तुलना में पुरुषों में अधिक तेजी से कम हो जाती है, क्योंकि वयस्कों में, TREC संख्या भी लिंग पर निर्भर करता है। 5 यह, उम्र और संभवतः लिंग के आधार पर भेदभाव कर एक बहुत ही सटीक अगर जाना चाहिए जो उचित संदर्भ पर्वतमाला, स्थापित करने में समस्या पैदा कर सकता है सामान्य के आकलन की जरूरत है।

चित्रा 3
स्वस्थ do में चित्रा 3. TREC मात्रा का ठहराव nors। TRECs की राशि TRECs / 10 स्वस्थ बच्चों (ए) और एक ही विषय (सी, डी) में TRECs / एमएल के रूप में गणना की तो वयस्कों (बी) और में 6 कोशिकाओं के रूप में निर्धारित किया गया था। साफ़ हलकों: महिलाओं; भरा हलकों: पुरुषों। लाइन्स लॉग तब्दील डेटा का उपयोग कर रेखीय प्रतिगमन द्वारा प्राप्त किया गया। बच्चों में, दो प्रतिगमन लाइनों उम्र के साथ बेहतर TREC कमी के चर दर प्रतिनिधित्व करने के लिए लगाया गया था। वयस्कों में, धराशायी लाइनों पुरुषों (सतत लाइन) की तुलना में धीमी है जो महिलाओं में देखा TRECs, साल की उम्र के साथ कम करने की प्रवृत्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वयस्कों में अस्थि मज्जा उत्पादन जीवन भर काफी स्थिर है और लिंग पर निर्भर नहीं करता है, जबकि KRECs की संख्या, केवल बच्चों में TRECs करने के लिए इसी तरह की एक पैटर्न के साथ उम्र के साथ कम हो जाती है।

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चित्रा 4:। स्वस्थ दाताओं में KREC मात्रा का ठहराव KRECs की राशि स्वस्थ बच्चों (ए) और एक ही विषय (सी, डी) में KRECs / एमएल के रूप में गणना की तो वयस्कों (बी) और में KRECs / 10 6 कोशिकाओं के रूप में निर्धारित किया गया था। साफ़ हलकों: महिलाओं; भरा हलकों: पुरुषों। लाइन्स लॉग तब्दील डेटा का उपयोग कर रेखीय प्रतिगमन द्वारा प्राप्त किया गया। बच्चों में, दो प्रतिगमन लाइनों उम्र के साथ बेहतर KREC कमी के चर दर प्रतिनिधित्व करने के लिए लगाया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रतिनिधि प्रयोजनों के लिए, सरल लॉग-रेखीय प्रतिगमन मॉडल उम्र के साथ TREC / KREC कमी के पैटर्न को दर्शाती लगे थे, लेकिन और अधिक परिष्कृत गैर रेखीय मॉडल मैं फिट किया जा सकता हैN एक प्रयास उम्र के साथ बेहतर प्रतीत होता है घातीय KREC / TREC कमी की भविष्यवाणी करने के लिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Histopaque-1077 Sigma Aldrich SRL 10771-500 ML density gradient separation method
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) QIAGEN 51106 DNA extraction
Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l  Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl
AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2 Applied Biosystems/Life-Technologies N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM) Applied Biosystems/Life-Technologies N8080261
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning Invitrogen/Life-Technologies K4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells Stratagene 200130
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1223
SpeI 500U New England Biolabs R0133S
HindIII-HF 10,000 U New England Biolabs R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2492
XhoI 5,000 U New England Biolabs R0146S
TRIS Utrapure Sigma Aldrich SRL T1503
EDTA Sigma Aldrich SRL E5134
TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems/Life-Technologies 4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l  Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl
NanoDrop 2000c spectrophotometer ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Applied Biosystems/Life-Technologies 4359659
Fast 7500 Real-Time PCR system Applied Biosystems/Life-Technologies
SDS Sequence Detection Software 1.4 Applied Biosystems/Life-Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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