로봇 미세 접촉 인쇄 (R-μCP)를 사용하여 복합 문화 기판 및 순차 친 핵성 치환 제조

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Bioengineering

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Knight, G. T., Klann, T., McNulty, J. D., Ashton, R. S. Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-µCP) and Sequential Nucleophilic Substitution. J. Vis. Exp. (92), e52186, doi:10.3791/52186 (2014).

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Abstract

Introduction

동시에 고유의 비 오염 특성을 유지하면서 공유 결합 생화학 적 리간드를 표시 PEG-이식 표면의 능력은 그들 문화 기판 1,2,3에 엔지니어링 사용자 정의 마이크로 환경을위한 이상적인 선택이 될 것입니다. 리간드 결합 PEG 브러쉬에 의해 매개 생물 특이 상호 작용은 개별 세포의 표현형에 생체 조직의 미세 환경에서 복잡한 내에서 발견 생화학 적 단서의 효과의 축소 된 분석을 할 수 있습니다. 또한, 바이오 - 직교 "클릭"화학 그들이 천연 배좌 4-6로 표시되도록 리간드의 고정화 지향성을 용이하게하는데 사용될 수있다. 따라서, PEG의 마이크로 공간 패턴 브러쉬 고정 생화학 적 단서 6,7에 의해 유도되는 세포 신호를 조사하기 위해 체외 틈새에서 디자이너를 만들 수있는 다양한 도구입니다.

생화학 세제곱의 공간 패턴을 생성하기위한 일반적인 방법ES는 PEG 복합 알칸 티올의 패턴으로 미세 접촉 인쇄 (μCP) 골드 코팅 된 기판을 수반한다. 그런 다음, PEG-ylated 알칸 티올의 미세 패턴 자기 조립 단분자층 (SAM을)은 만 8,9 기판의 패터닝되지 않은 지역으로, 생화학 분자, 예를 들어, 단백질의 물리적 흡착을 제한합니다. 그러나,이 기술에 의해 생성 된 SAM을 장기 세포 배양 배지에서 산화에 민감하다. 따라서, SAM에 알칸 티올 μCP'd은 종종 더 지역의 비 오염 안정성 (10)을 높이기 위해 표면 시작한 원자 이동 라디칼 중합 (SI-ATRP)을 사용하여 PEG 폴리머 브러시로 이식된다. 구체적 μCP는 알칸 티올 중합 개시제, 폴리 SI-ATRP (에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타 크릴 레이트 (PEGMEMA) 모노머 이어 금 - 코팅 된 표면에 ω-meraptoundecyl의 모이 소 부티레이트은, 미세 패턴 장기간, 안정적이며 비와 표면을 생성 오염 PEG 브러쉬. 또한,이 상기 다양한 화학 잔기 (11)를 제시하도록 변형 될 수있다.

이 속성, 샤 등을 활용. 알. 직교 "클릭"화학을 제시 성분 PEGMEMA 브러쉬와 문화 기판을 설계하는 방법을 개발했다. 이 방법에서는, 그들은 순차적 아 지드 화 나트륨, 에탄올 산재 μCP / SI-ATRP 일련의 단계를 사용하여, 복수 고정화 리간드 (6)의 마이크로 패턴을 제시 배양 기질을 만드는 핵성 치환을 propargylamine. 신규 배양 기판을 설계 할 μCP 설명서와 함께 이러한 화학 제를 사용하는 가능성이 엄청난이지만, 여러 μCP 단계들이 단일 기판 상에 정렬 될 수있는 정밀도 및 정확도에 의해 제한된다. 정밀도와 정확도가 높은 재현성이 다용도 기법을 이용하여 시험 관내에서 틈새 착체를 제조하는 것이 필요할 것이다.

e_content가 "> 이러한 한계를 해결하기 위해, 여러 자동 및 반자동 μCP 시스템 알.. 차크라 등. 생성 된 사용자 정의 스탬프 레일 시스템 상에 배치하여 금 - 코팅 슬라이드와 등각 접촉되는 μCP 시스템이 개발되어왔다 컴퓨터로 제어되는 공기압 액츄에이터. 그러나,이 방법은 정의 스탬프 디자인의 정밀한 제작이 필요하며 다수 μCP 12 단계를 수행 할 때 실현 : 정확도 보고서 10 μm의 정밀도를보고한다. 최근에는 집적 키네마 틱 커플 링 시스템을 이용하는 방법을 보고 하나의 패턴을 사용하여 1 ㎛ 이하의 정밀도,하지만 인해 (13)을 성형하는 금형 스탬프 기능을 정밀하게 제어의 부족으로 정확히 여러 패턴을 정렬 할 수 없습니다. 또한, 이전의 방법 모두 패터닝 단계 사이에 고정 된 상태로 유지하기 위해 기판을 필요로 함으로써 크게 될 수 표면 개질 화학의 다양성을 제한이용했다. 스탬프 디자인과 제조에있어서 최대의 유연성을 허용하면서 여기서는 μCP 여러 단계의 정확하고 정밀한 정렬 자동화 R-μCP 시스템이 할 설명한다. 또한, 패터닝 된 기판을 반복하여 순차 핵성 치환을 포함한 다양한 기판 변형 화학의 사용을 허용하는, 스탬핑 사이의 시스템으로부터 제거 될 수있다. 이러한 화학 물질을 사용하여 설계 기판은 우리 모두 6,147 이전에 세포 배양에 사용되어왔다. 따라서, 우리는 복잡하고 미세 패턴 생화학 단서와 함께 배양 기판의 확장 제조 방법을 개발하기 위해 R-μCP 순차적 친 핵성 치환 반응을 병합 하였다.

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Protocol

1. 생성 탄성 스탬프

  1. PDMS 스탬프의 실리콘 마스터를 생성하기 위해, 컴퓨터 이용 설계 소프트웨어를 사용하여 포토 마스크 피쳐의 패턴을 설계한다.
    1. 300 μm의 내경 (ID) 및 1200 μm의 중심 간 간격 600 μm의 OD를 가진 환형의 20 × 20 ​​배열로 제 1 패턴을 디자인.
    2. 600 μm의 ID와 1,200 μm의 중심 간 간격 900 μm의 외경과 환형의 20 × 20 ​​배열로 두 번째 패턴을 디자인합니다.
    3. 또한, 45 ° 각도에서 1,200 μm의 중심 간 코너 패턴 이격 각 배열 디자인의 네 모서리에 1 × 1mm 2 광장 참조 마크를 배치합니다.
    4. 마이크로 유체 파운드리 다른 15 협력 상세한 표준 리소그래피 기술을 사용하여 300 ㎛의 피처 깊이 상관, 종횡비 1 : 1이 실험에서 사용하기위한 실리콘 마스터를 제조.
      참고 : 기능보다 낮은 100 μm의 기판 표면과 접촉하기 전에 우표의 이상 변형으로 이어질 수 오쿠.
      참고 :이 프로토콜은 전문 장비 및 만들 수있는 클린 룸을 필요로 포토 레지스트의 설명 패턴, 이미 얻은 실리콘 마스터를 가지고 시작한다. 그것은 이러한 패턴 마스터를 제작하는 제작 업체 또는 핵심 시설에 문의하는 것이 가장 좋습니다.
  2. silanization합니다 실리콘 마스터 (트리 데카 -1,1,2,2- tetrahydroocty) 트리클로로 실란 증기와 배양 O / N.
    참고 : 실란 증기는 매우 독성이 단지 화학 흄 후드에서 처리되어야합니다.
  3. PDMS 사전 폴리머와 60 ° C에서 배양 접시의 O / N에 실릴 화 한 실리콘 마스터의 상단에 경화제 PDMS의 10 : 1 비율을 경화하여 실리콘 마스터의 역 복제본을 생성합니다.
  4. 실리콘 마스터에서 PDMS 스탬프를 제거하고 아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌에 스탬프 (ABS) 백킹 또는 기타 단단한 재료를 접합접착제를 사용하여이야.
    참고 : 선택의 재료는 투명 또는 생체 적합성이 될 필요는 없다. 그러나, PDMS보다 로봇 공구 및 높은 강성 인터페이스에 평평한 표면을 제공해야합니다.

2. 준비 Coverslides

  1. 린스 현미경 coverslides (24mm X 50mm # 1) 온화한 질소 기류하에 에탄올 및 건조 린스하기 전에 1 분 동안 아세톤, 톨루엔, 메탄올 및 초음파 처리한다.
    참고 : 화학 흄 후드에서 톨루엔과 아세톤을 처리합니다.
  2. 집속 전자 빔 증발기를 사용하여 18.0 nm의 금 (Au) 이어 ~ 3.5 nm의 티탄 (Ti)과 코트 coverslides.
    참고 :이 절차는 실리콘과 폴리스티렌을 포함하여 금 코팅 된 기판의 다양한 호환됩니다. 그것은 이러한 현장 생성하는 것이 가능하지만, 금 - 코팅 된 기판들은 상업적 공급자를 통해 가능하다.
    NOTE는 : 기판 상에 금 층이어야 반면에 Ti 층은 적어도 3 nm 두께이어야t 적어도 5 nm 두께 및 최종 기판 (16, 17)의 최적의 광학적 특성에 따라 두께 1mm 모든 방법의 범위 일 수있다. 기판은 제조를위한 광학적으로 투명 할 필요는 없습니다; 그러나, 제조 된 기판의 현미경 분석을 용이하게한다.
  3. 사용 직전에 부드러운 질소 하에서 에탄올 건조 골드 코팅 coverslides을 씻어.

3. R​​-μCP 외부 고리의

  1. 선택적 호환 관절 로봇 아암 (SCARA) 시스템과 R-μCP 전에, 시스템의 소프트웨어를 이용하여 로봇 공구 이펙터 및 첨부 된 듀얼 카메라 시스템을 교정.
    참고 :이 구현은 그림 1과 그림된다.

그림 1
그림 1. R- μCP 시스템 및 로봇 팔 공구. (A) 모든 공구 및 비품 R-μCP 시스템의 대규모보기, (A) 진공 척, (B) 시약 목욕, (C) 하향 카메라, (D) 스탬프 중첩기구, (E) 로봇 도구입니다. (B) 로봇 팔 공구 묘사 (F) 다이아몬드로 만들어진 에칭 도구 (g) 공기 흡입 도구 (H) ABS-백업 PDMS 스탬프를 들고.

  1. 수동으로 600 μm의 ID와 900 μm의 외경이 환형가 스탬프 중첩기구에서 아래로 향하게 튀어 PDMS 스탬프를 배치합니다. 수동으로도 1a에 표시된 진공 척, 상단에 갓 청소 금 코팅 coverslide을 배치하고, 접속 실험실 진공을 이용하여 그것을 고정시킨다.
  2. 로봇 제어를 이용하여,도 2a에서와 같이, 금 코팅 coverslide의 중심점을 통해 하향 카메라를 정렬.
    참고 :이 점은 처음 육안 검사로 정의 할 수 있으며 큰 정밀도를 필요로하지 않는, PDMS 스탬프가 많은 larg의 그대로금 코팅 된 슬라이드보다 어.
  3. 네 개의 기준을 에칭하는 로보트 팔 지시 "X"치수 정사각형의 정점에 마크 로봇 아암에 부착 된 다이아몬드로 만들어진 에칭 도구를 사용하여 금 - 코팅 coverslide 중심 3.8 mm 3.8 mm. (그림 2B에 묘사 된, 자동화 된 프로세스)
    참고 :이 네 가지 기준 마크가 하향 카메라 중 하나 시각적 프레임 내에 보장합니다.
  4. 로봇에게 공기 흡입 도구를 사용하여, 픽 업 및 PDMS 그림 2C와 같이 스탬프 중첩기구 위의 1mm 도장을 찍어 누르고 있습니다. (자동화 된 프로세스)
  5. 스탬프의 사각형 부호를 시각화하고 스탬프의 평균 X, Y를 결정하기 위해 카메라 소프트웨어 10 배 그들을 식별하고 각도는 중심으로부터 오프셋,도 2D 및 E에서 나온 상향 대면 카메라 및 LED 조명 링을 사용하여 로봇 공구 축. (자동화 된 프로세스)
  6. 에서와 같이 참고 : 내부 계산이 정확하게 정렬하는 로봇 시스템의 소프트웨어에 의해 수행되는 스탬프의 미래 R-μCP 단계에 커버 슬립의 X, Y 센터의 위치와 각도 오프셋 (offset).
  7. 그림 2 층에 도시 된 바와 같이 3.8)) 알칸 ATRP 개시제, ω-mercaptoundecyl의 모이 소 부티레이트 (에탄올에 2 mm의 목욕 스탬프를 놓습니다. (자동화 된 프로세스)
  8. 알칸 티올 솔루션에서 스탬프를 제거하고 그림 2G와 같이 에탄올을 증발 0.48 바 (5 PSI)에 가압 질소 스트림을 통해 놓습니다. 1 분 후, 질소 기류의 압력이 균일 한 건조를 보장하기 위해 1.03 바 (15 PSI)이다 증가. (자동화 된 프로세스)
    참고 : 불완전한 건조 패턴 충실도의 전체 또는 일부가 손실 될 수 있습니다.
  9. 건조 후, 금 - 코팅 슬라이드의 계산 된 중심 위치 위에 스탬프를 이동 및도 2H에 도시 된 바와 같이, Z 축 모터 력을 모니터링하면서 100 ㎛ 단위로 값을 낮추.
    NOTE : 이것은 Z 축 모터에 의해 경험 및 로봇 가이던스 소프트웨어에 표시된 토크로 전달된다. (자동화 된 프로세스)
  10. 79.2 인민군 소정의 압력이 달성 된 후에는 스탬프를 낮추는 중지하고 15 초 동안 금 코팅 된 슬라이드와 접촉을 유지한다. (자동화 된 프로세스)
    참고 : 압력 값이 여기에 현재 스탬프 디자인과 기능을 높이 최적화되어 있습니다. 스탬프 디자인은 시행 착오 공정에 의해 이러한 구체적 따라 높은 종횡비의 우표, 튜닝을 위해, 변경된 경우.
  11. 천천히 금 코팅 된 슬라이드에서 스탬프를 제거하고 다시 스탬프 중첩기구에서 스탬프를 배치합니다. (자동화 된 프로세스)
  12. 미세 패턴 Coverslides에 PEGMEMA 4. SI-ATRP

    1. 진공 압력 미세 패턴 coverslide를 들고 해제하고, 50 ml의 쉬 렝크 플라스크에 옮긴다. 인감 및 가스를 제거 쉬 렌크는 진공 펌프를 사용하여 플라스크.
    2. 추가로 거대 PEGMEMA (208.75 밀리몰), 물 (34.4 ㎖), 메탄올 (43.8 ㎖), 구리 (II) 브로마이드 (1 밀리몰), 및 2 ', 2- 피리딘 (3 밀리몰)을 함유하는 ATRP 반응 혼합물을 5.5 ml의 쉬 렝크 플라스크.
    3. 반응을 개시 물에 L - 아스 코르 빈산 나트륨 (454.3 mM)을 0.5 mL를 넣고는 불활성 가스 하에서 실온에서 16 시간 동안 계속 할 수 있습니다.
      NOTE :도 3A-B에 도시 된 바와 같이, L - 아스코르브 산 나트륨을 첨가 한 다음은, 반응 색이 짙은 갈색 빛 녹색에서 이동한다.
      주 : 반응은 16 시간 이상을 계속할 수 있지만, 상당히 PEG 브러시의 길이를 증가하지 않을 것이다.

    SI-ATRP 그림 3. 개시. (A) 반응 및 L - 아스코르브 산 나트륨을 첨가 한 다음에 (B) 이후의 색상 변화의 개시. SI-ATRP 절차에 따라 미세 패턴 coverslide 표면의 (C) 현미경 이미지. 스케일 바 1mm.

    1. 쉥크 플라스크에서 미세 패턴 coverslide를 제거하고 부드러운 질소 기류 하에서 에탄올, 물, 에탄올 건조 씻어.
      NOTE : SI-ATRP 다음은, 표면 수정은 눈으로 볼 수 있어야 및도 3c에서와 같이 현미경으로 촬상하고 분석 할 수있다.
      NOTE : 이것은 기판을 발현 사이 할 필요성을 제거 같이 시험의 정밀도를 테스트하는 간단한 방법이다.

    미세 패턴 PEGMEMA 체인 5. 아 지드 화 기능화

    1. 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다.
    2. N 6 mL를 넣어 반응 바이알을 100 mM의 나트륨 아 지드를 함유하는 N 디메틸 포름 아미드 (DMF). 24 시간 동안 37 ° C에서 반응을 유지한다.
      참고 : 화학 흄 후드에서 DMF를 처리합니다. 아 지드 화 나트륨을 계량 할 때주의하십시오.
    3. 완료시, 반응 바이알로부터 coverslide 미세 패턴을 제거하고, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조.

    브롬 기능화 PEGMEMA 체인의 6 패시베이션

    1. 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 마이크로 패턴 coverslide를 놓습니다.
    2. 100 mM의 에탄올 아민과 반응 바이알에 300 mM의 트리 에틸 아민을 함유하는 디메틸 술폭 시드 (DMSO)의 6 ml의 추가. 24 시간 동안 40 ° C에서 반응을 잡습니다.
      참고 : 화학 흄 후드에서 DMSO, 에탄올 아민, 트리 에틸 아민을 처리합니다.
    3. 완료되면 미세 패턴 coversl를 제거반응 바이알에서 IDE는, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조.

    내부 고리 7. R-μCP과 PEGMEMA의 SI-ATRP

    1. 작은 기능 환형가 이전에 마이크로 패턴 환형 내부에 배치되도록 300 μm의 ID 및 600 μm의 OD 돌출 된 환형와 PDMS 스탬프를 대체, 3.12 - 이전 단계 3.2 및 3.6에 설명 된대로 R-μCP 단계를 수행하십시오.
      참고 :이 우표에 대한 압력을 임계 값이 132.0 kPa의입니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 이러한 압력 설정은 스탬프 기능이 실험에서 사용되는 최적화되어있다.
    2. 4.4 - 이전 단계 4.1에 기재된 바와 같이 SI-ATRP 단계를 수행.

    미세 패턴 PEGMEMA 체인 8. 아세틸렌 기능화

    1. 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다.
    2. DMSO는 mM의 (100)를 포함하는 6 ML을 추가반응 바이알에 propargylamine. 24 시간 동안 실온에서 반응을 유지한다.
      참고 : 화학 흄 후드에서 DMSO와 propargylamine을 처리합니다.
    3. 완료시, 반응 바이알로부터 coverslide 미세 패턴을 제거하고, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조.

    9. 구리 촉매 "를 클릭"아세틸렌의 바이오 티 닐화는 PEGMEMA 체인을 종료

    1. 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다.
    2. 구리 설페이트 (15 mM)을 / 트리스 [(1- 벤질 -1- H -1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA, 30 mM)을 6 ㎖ (추가 1 : 1 V / V, 물 반응 바이알에 562 μM 지드 -4- -Biotin-PEG 접합체를 함유 / DMF). 반응을 초기화하기 위해 상기 혼합물에 물 L 아스코르브 산 (0.15 mM)을 1.2 ml의 추가.
    3. 10 초 동안 반응 용액을 통해 버블 질소, 파라 필름을 유리 병을 밀봉하고, 실온에서 24 시간 동안 반응.
    4. completio시N, 반응 유리 병에서 미세 패턴 coverslide을 제거 물로 씻어 내고 12 웰 폴리스티렌 접시에 놓습니다.

    바이오틴이 아세틸렌 그룹 10. 면역 형광 검출

    1. 실온에서 1 시간 동안 DPBS (3 % 당나귀 혈청)의 미세 패턴 coverslide을 차단합니다. 실온에서 2 시간 동안 admin으로의 스트렙 타비 딘 - 546 접합체 (2 ㎍ / ㎖) (PBS에서 3 % 당나귀 혈청)과 바이오틴 아세틸렌 그룹의 얼룩.
    2. 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 미세 패턴 coverslide에게 DPBS 5 번 씻어.
      주 :이 단계가 완료된 후도 4b는 슬라이드의 이미지를 나타낸다.

    11. 구리 무 "를 클릭"아 지드의 바이오 티 닐화는 PEGMEMA 체인을 종료

    주 : 필요한 경우,이 기판 개질 공정은 세포 배양액 중에 반응계에서 수행 될 수있다.

    1. 12 웰 P에 미세 패턴 coverslide를 남겨olystyrene 요리 다음 admin으로는 빨고.
    2. 20 μM DBCO-PEG 4 -Biotin를 포함, admin으로 (또는 세포 배양 배지) 2 mL를 넣고 반응을 실온에서 24 시간 동안 계속 할 수 있도록 (또는 인큐베이터에서 37 ° C에서).
    3. DPBS이 (또는 단순히 미디어 변경을 수행)를 완료하면, 미세 패턴 coverslide 5 번 헹군다.

    바이오틴이 아 지드 그룹 (12) 면역 형광 검출

    1. 실온에서 2 시간 동안 2 ML의 DPBS에 스트렙 타비 딘-488 접합체 (2 ㎍ / ㎖) (3 % 당나귀 혈청)과 바이오틴 아 지드 그룹의 얼룩.
    2. 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 미세 패턴 coverslide에게 DPBS에 5 번 씻어.
    3. 이미지 공 초점 형광 현미경을 이용하여 미세 패턴 coverslide.이 단계가 완료된 후도 4A-C는 슬라이드의 이미지를 도시한다.
      NOTE : 조직 배양 분석 용 기판을 사용하는 경우, 섹션 (10) 및이 프로토콜 (12)을 이동. 원하는 degre 후작용 화의 예는, 질소 기류하에 100 % 에탄올 및 건조 양측 세정하여 설계 coverslide 살균. 멸균 생물 안전 캐비닛에 슬라이드를 전송하고 세포 파종과 문화를 진행하기 전에 PBS로 5 회를 슬라이드를 씻어.

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Representative Results

수동 정렬 μCP 기술의 사용은 수직으로 작용 PEG-이식 브러쉬의 배열과 문화 기판을 설계하는 화학은 이전의 연구 (6)에서 증명되었다 "클릭". 그러나,이 패턴 방향의 최소한의 제어를 제공하고 종종 관능 화 영역의 중첩을 초래한다. 여기서, 신규 한 R-μCP 시스템은 이러한 한계를 극복하기 위해 사용하고, 그 능력을 정확하게 패턴을 300㎛ ID 및 600 μm의의 OD 600 ㎛의과 PEG 브러시 환상 체의 분리 된 배열 내에 말단 알킨기를 제시와 PEG 브러시 환형의 배열 단말 지드기를 제시 ID 900 μm의 OD는 14 설명된다. PEG를 제시 알킨의 반응을 수행하면 3 -Biotin 아 지드-PEG와 브러쉬 및 PEG를 제시 아 지드의 반응이 DBCO-PEG 4 -Biotin와 브러쉬, 기판은 F (형광 프로브를 면역 염색 및 공 초점 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다igure 4). 계산 된 맞춤 MATLAB 프로그램을 사용하여 이러한 화상의 분석은 두 PEG 브러시 어레이는 X ~ 6.4 μm의, Y ~ 1.7 μm의 하위 10 μm의 정확도, 정렬 및 θ ~ 0.02 °를, 제조업체의에있는 한계를 인용되었는지 우리의 SCARA 모델 (즉, ~ 10 μm의)와 R-μCP 시스템의 사전 성능 (14)을 나타내는의. 따라서, 우리는이 시스템의 하이 엔드 SCARAs의 사용은 더 낮은 서브 미크론 해상도를 제공 할 것이라고 생각한다. 이러한 결과는 R-μCP 시스템 및 순차 친 핵성 치환 반응의 병용으로 활성화 다목적 기판 엔지니어링 능력을 입증한다. 직교 표면 화학의 형광 표지에 의해 입증 최소 교차 - 반응성은 조직 공학 응용 프로그램에 대한 복합 배양 기질을 생성하는 생화학 큐의 정확한 고정화이 시스템의 가능성을 설명하기위한도. </ P>

그림 2
그림 2. R-μCP 공정의 개략도. 위로 향 카메라로 PDMS 스탬프 기준 마크를 시각화 - (A) 하향 카메라 고정 금 코팅 된 슬라이드를 시각화, 스탬프 중첩기구에서 PDMS 스탬프를 제거 금 코팅 coverslide에 (B) 에칭 참조 마크, (C), (E D)에 직면 , 알칸 티올 기자 욕조에 PDMS 스탬프를 배치 (F)는, (G) 건조 질소 스트림을 통해 용매 초 기자 알칸 티올, 골드 코팅 coverslide에 (H) 각인 알칸 코팅 된 PDMS 스탬프입니다.

그림 4
미세 패턴 슬라이드 그림 4. 면역 염색 이미지. (A) 아 지드와 (B) 알킨 그룹을 제시하는 작용 구리 - 무료 구리 - 매개 클릭 화학을 사용하여 바이오틴, 각각 스트렙 타비 딘-488과 -546 검출. 모두 형광 채널 (C) 오버레이. 모든 규모는 500 μm의 바.

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Discussion

조직 공학을위한 이상적인 기판 bioinspired하여 기본 조직 내에서 발견 중요한 생리 활성 리간드의 공간적 분포 요점을 되풀이 할 것이다. 또한 리간드의 시간적 조정 그들이 향하는 조직 형태 형성을 허용하기 위해 제시 공간적 세포 운명의 제한을 유도하는 공간 패턴을 가능하게 동적 특성을 갖는다 것이다. 이러한 기판의 제조는 기판에 복잡하고 높은 순서 방향에서 여러 생화학 적 단서의 고정이 필요합니다. 시험관 내에서 세포의 틈새 모든 내인성 인자를 시뮬레이션하는 것은 불합리하지만, 여기에 기재된 R-μCP 시스템은 공간 방향의 마이크로 컨트롤 직교 생물 화학의 복수의 영역의 고정화를 허용한다.

이러한 기판 증가의 유틸리티는 더 PEG 브러쉬 배열 고정 된 리간드와 결합하면서 것을 고려할 때생물 특이 상호 작용을 유도 할 수 있고, 결합되지 않은 PEG 브러쉬 단백질 흡착에 내성을 유지하고, 따라서 세포 부착 및 이동을 제어하는​​ 역할을 할 수있다. 세포 외 기질 (ECM) 단백질 또는 중합체-PEG 접합체의 수동적, 미세 패턴 흡착 세포 부착 및 이동을 제어하는 간단한 방법이지만 흡착 가역 공정 (11)이기 때문에, 이러한 기술은 단지 과도 제어를 제공한다. 또한, 분자는 예측할 수없는 방향에서 표면에함으로써 충실도와 생물 특이 상호 작용의 제어를 제한하는 임의의 농도에서 흡착. 더욱이, 통상적 인 시츄 변형에서의 포스트 흡착 제한 상기 기능화위한 지정된 반응성 부위를 가지지 않는, 예컨대 소 혈청 알부민 또는 플루로 닉 F127과 같은 비 오염 영역을 생성하는 데 사용되는 화합물. 알칸 티올의 SAM에 추가적인 표면 개질에 대한 반응성 그룹을 생성하지만, 그들도 조직 배양 CONDIT에 제한 내구성을 가질 수있다인해 그래프트 PEG 의해 수득 산화 차폐 부재에 이온은 10,11 브러쉬. 반대로, PEG-브러시 이식 순차적 친 핵성 치환 반응과의 R-μCP 플랫폼의 합병은 바이오 직교 기능과 사전 또는 현장에서 수정 될 수있다 내구성, 마이크로 cytophobic 지역으로 기판을 설계 할 수있는 기능을 제공합니다. 이 생체 조직 형태와 성장을 조절할 수 생물 특이 상호 작용을보다 강력하게 제어 할 수 있도록합니다.

순차 마이크로 콘택트 장 복사를 정렬하기위한 다른 시스템에 비해 R-μCP의 키 강도는 여전히 높은 위치 결정 정밀도 (12, 13)를 유지하면서 반복 스탬핑 사이 시스템으로부터 기판을 제거 할 수있는 능력이다. 이는 후속 메신저의 밀도를 적용 할 수있는 표면 화학 제의 종류에 다양성을 가능하게하고, 표면 개질 반응의 지속 시간은 조정 변경 될 수있다동원 리간드 6. 따라서, R-μCP은 생물 특이 상호 작용 (14)을 매개 생화학 큐들에서 국소 농도 기울기를 설정하는 데 사용될 수있다. 정확하게 위치 및 생물 특이 상호 작용의 정도를 모두 제어 할 수있는 능력으로, R-μCP 시스템은 조직 형태 형성의 생체 활성 리간드의 역할을 조사하기위한 독특한 방법을 제공하고 생물학적 큐들의 프레젠테이션을 시뮬레이션 배양 기판을 생성하기위한 강력한 시스템을 구축 생체 내 틈새.

세포 틈새의 중요한 측면은, 특히 개발 내에서 신호의 시공간 변조 (18) 요인이다. 수용성 생화학 단서가 시간적으로 정의 된 방식으로 배양 배지에 첨가 될 수 있지만, 세포가 이들 큐를 발생하는 공간을 통해 제어가 제한된다. 여기에 기재된 R-μCP 시스템으로, 그 말단의 functionaliz 가진 미세 패턴 배양 기판을 구성 할 수있다혼성 PEG는 배양 세포의 운명에 영향을주지 지드 작용기를 제시 브러쉬. 지드 기는 알킨 제시 분자와 구리 - 촉매 "클릭"반응을 견딜 수 있지만, 이는 구리의 독성 주어진 배양 세포의 존재하에 수행 될 수 없다. 그러나, dibenzocyclooctyne 같은 높은 변형 분자 (DBCO)는 매우 선택적 및 생체 적합성 구리 무 아 지드 - 알킨 고리 화 반응 (19, 20)를 받아야. DBCO - 함유 링커의 결합을 통해, 미세 패턴 배양 기재는 새로운 생물학적 리간드 21 시튜 변형 될 수있다. 세포 친화 cytophobic 영역을 렌더링 또는 다단계 신호 절차에서 사용하기 위해 다른 생화학 적 신호를 추가 할 수있는 능력으로,이 방법으로 생성 된 배양 기재는 신규 적응 능력을 가지고 있고, 따라서 시험 관내 조직 형태 형성을 지시하기위한보다 견고한 시스템을 제공한다.

거대한 냄비에도 불구하고ential 및 R-μCP 플랫폼의 유틸리티, 그것은 어떤 단점을 가지고있다. PEG-그래프트 기판을 생성하기 위해 다수의 SI-ATRP 단계의 사용은 크게 잉크젯 프린팅 또는 ECM 단백질 microdroplet 증착을 포함하는 방법에 비해 제조 시간을 증가시킨다. 잉크젯 인쇄 기술의 정밀도는 현재의 R-μCP 시스템의 라이벌 동안 ECM 단백질의 흡착함으로써 세포 - 단백질 상호 작용의 더 적은 제어를 제공 가역적이다. 또한, 잉크젯 인쇄 기술을 통해 생성 기판함으로써 공간적 시츄 수정 기판 (22)에 한정 예컨대 허용 다양한 기판 변형 화학,의 사용을 방해하는, 제조 중에 제거 될 수 없다. R-μCP 시스템이 훨씬 베티 인 반면 인해 이러한 제한에 잉크젯 기술은 문화의 짧은 기간에 주로 관심 기판, 생체 분자의 정적 배열 및 세포 유형 (23)의 빠른 생성을 위해 더 적합R은 장기, 다양한 생물학적 리간드와 2D 모두 공간과 시간 세포의 상호 작용을 통해 동적 제어를 전시하기위한 다각적 인 기판을 생성으로 적합.

마이크로 콘택트 프린팅 '잉크'는 넓은 표면 영역 위에 마련되어 있지만 항상 증착 '잉크'물질의 농도 이질성있어왔다 나노 간 마이크로 신속하게 증착 할 수있다. 그림 4에서 관찰 할 수있는이 또한 R-μCP 플랫폼의 현재 제한 사항입니다. 우리는 PEG의 형광 수정의 이질성이 브러쉬 가설 인해 전체 PDMS 스탬프를 통해 고르지 수직력의 로봇의 응용 프로그램에있는 또한 가능성이 완벽하게 평평하지. 이것에 의해 알칸 개시제의 불균일 한 증착 및 그래프트 PEG 브러시의 두께를 일으키는 후속 스탬프와 기판의 모든 영역들 사이의 불균일 한 접촉 압력을 초래한다. 에알칸 티올의에도 증착함으로써 표면 기능성 PEG 그래프트 기판을 제조하기 위하여는, 스탬핑 공구 설계는 전체 PDMS 스탬프 위에 분산 균일 수직력을 적용하기 위해 최적화 될 필요가있을 것이다. 이 스탬프 결함의 전체 인터페이스의 독립적 인에서 금 코팅 된 슬라이드와 균일 한 접촉을 촉진 할 것이다. 또한,도 4b에, 하나는 지드 말단 PEG 브러쉬 아세틸렌 기의 약간의 오염을 관찰 할 수있다. 이전 6 있듯이 교차 오염에 의한 고정화 리간드의 표면 밀도가 의도 된 PEG-브러쉬 것과 최소한 비교되고 있지만, 이것은 에탄올 패시베이션 반응의 지속 시간을 증가시킴으로써 거의 제로로 감소 될 수있다 (섹션 6 참조).

여기에 기재된 R-μCP 시스템의 주요 애플리케이션은 공간 및 시간 제어 O를 발휘하는 데 사용될 수 복잡한 조직 배양 기판의 제조이고F 세포 운명. 그러나, R-μCP 플랫폼의 높은 정밀도와 정확도는 물론 다른 응용 프로그램에 대한 매력적인 방법합니다. 이전에 불활성, cytophobic 지역의 현장 수정에 이어 차동 리간드 화학 패턴 세포 친화 영역을 할 수있는 능력은 공간 방향을 통해 엄격한 통제와 여러 세포 라인의 공동 문화 수 있습니다. 미세화의 고유의 높은 처리량 자연 결합이 단일 셀 및 다중 - 셀 (24)의 조합 모두 높은 처리량 스크리닝을위한 현재의 방법에 대한 대안을 제시한다. R-μCP 시스템 생물학의 영역에서 큰 잠재력을 가지고 있지만, 또한, 마이크로 전자 기계 시스템 (MEMS)의 분야에 적용될 수있다. MEMS 제조에있어서, 양산 용 고정밀 정밀도 MEMS 컴포넌트를 전송하는 것이 바람직하다. 신규 운동 스탬핑 기술로, 여기에 기재된 R-μCP 시스템은 효과적으로 compone를 인쇄하도록 구성 될 수있다MEMS (25)를 생성하는데 사용하기위한 실리콘 웨이퍼에 실리콘 또는 질화 갈륨 국세청. 따라서, R-μCP 플랫폼은 잠재적 광범위한 애플리케이션에 사용될 수있다.

결론적으로, R-μCP 시스템의 사용은 직교 순차 친 핵성 치환 반응을 이용하여 기능화 배양 기판 PEG가 그래프트 생성하는 제시 잠재적으로 시험관 내에서 조직 형태 및 성장을 제어하기위한 이상적인 플랫폼이지만 다수의 역할을 조사하기위한 우수한 시스템뿐만 세포 운명에 생리 활성 리간드. 독특하고 매우 정렬 된 패턴의 패턴 여러 생화학 적 단서 할 수있는 능력은 마이크론 규모로 조직 된 여러 종류의 세포와 조직 구조의 형성을 지시 할 수있는 문화 기판 구축을위한 기반을 확립한다. 이것은, 원래의 장소에 미세 패턴 기판을 수정하는 기능과 함께, 조직의 형태 형성과 CEL 비교할 수없는 제어 할 수문화의 L 운명. 여기에 설명 된 패터닝 기술들은 일일 체외에서의 Organotypic 조직 구조의 합리적이고 생산을 용이하게 재현 할 수 배양 기판을 제조하기위한 다기능 시스템을 제공한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SCARA  Epson LS3-401ST Higher end models with increased precision are available if desired. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane Gelest SIT8174.0 CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesive Co NC9020938 Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides Fisher Scientific 48393106 These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator Telemark SEC-600-RAP Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA EPSON LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate Prochimia FT 015-m11-0.2 Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. 
Schlenk Tube Flask 50 ml Synthware 60003-078 Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate Sigma Aldrich 447943 Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS) Fisher Scientific A412-4 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide Sigma Aldrich 437867 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2,2'-Bipyridine Sigma Aldrich D216305 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich A4034
20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-340-4E
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide Sigma Aldrich 227056 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine Sigma Aldrich 398136 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine Sigma Aldrich T0886 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich 276855 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine Sigma Aldrich P50900 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol University of Wisconsin Material Distribution Services 2292 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin ClickChemistryTools AZ104-100 Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate Sigma Aldrich C1297 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich A7506
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190144
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663 Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate Thermo Scientifit - NUNC 07-200-81 Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin Clickchemistytools A105P4-10 Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate Life Technologies S-11223 Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies S-11225 Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope Nikon Nikon Eclipse Ti, A1R An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.

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