Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin, Madison
* These authors contributed equally
Bioengineering

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Knight, G. T., Klann, T., McNulty, J. D., Ashton, R. S. Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-µCP) and Sequential Nucleophilic Substitution. J. Vis. Exp. (92), e52186, doi:10.3791/52186 (2014).

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Abstract

Introduction

Die Fähigkeit von PEG-gepfropften Oberflächen kovalent gebunden biochemischen Liganden angezeigt während gleichzeitig inhärente Nicht-Fouling-Eigenschaften machen sie zu einer idealen Wahl für Engineering individuelle Mikroumgebungen auf Kultursubstraten 1,2,3. Die biospezifische Wechselwirkungen von Liganden konjugiert PEG vermittelte Bürsten ermöglicht reductionistic Analyse der Wirkungen von biochemischen Hinweisen im Komplex in vivo Gewebemikroumgebung über einzelne Zell Phänotypen gefunden. Weiterhin kann bio-orthogonal "auf" Chemie verwendet werden, um Richt Immobilisierung von Liganden zu erleichtern, so dass sie im nativen Konformationen 4-6 dargestellt werden. So mikroskaligen räumlichen Strukturierung von PEG Bürsten ist ein vielseitiges Werkzeug, um Designer in vitro Nischen schaffen, um Zellsignalisierung durch immobilisierte biochemischen Cues 6,7 induzierte untersuchen.

Ein übliches Verfahren zur Erzeugung von räumlichen Mustern der biochemischen cues bringt Mikrokontakt-Drucken (mCP) gold-beschichteten Substrate mit Mustern von PEG konjugierten Alkanthiole. Dann werden die mikroselbstorganisierte Monoschichten (SAMs) von PEG-ylated Alkanthiole schränkt die physikalische Adsorption von biochemischen Molekülen, zB Proteine, nur für die nicht gemusterten Bereiche des Substrats 8,9. , Die durch diese Technik erzeugt SAMs sind jedoch empfindlich gegenüber Oxidation in der Langzeitzellkulturmedien. Somit μCP'd Alkanthiol SAMs häufig weiter mit PEG Polymerbürsten mit oberflächeninitiierte Atom Transfer Radical Polymerisation (ATRP-SI), um die Region nicht-Fouling-Stabilität 10 zu erhöhen gepfropft. Insbesondere mCP der Alkanthiol Polymerisationsinitiator erzeugt ω-meraptoundecyl bromisobutyrat, auf Gold-beschichteten Oberflächen, gefolgt von SI-ATRP von Poly (ethylenglycol) methylethermethacrylat (PEGMEMA) Monomere Oberflächen mikro langfristig stabil und nicht Fouling PEG Bürsten. Darüber hinaus sind diese sind in der Lage, die weiter modifiziert, um diverse chemische Einheiten 11 zu präsentieren.

Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft, Sha et. al. eine Methode entwickelt, um Kultursubstrate mit Mehrkomponenten PEGMEMA Bürsten präsentiert orthogonal "auf" Chemie-Ingenieur. Bei diesem Verfahren verwendet man eine Reihe von & mgr; CP / SI-ATRP Schritten mit sequentieller Natriumazid, Ethanolamin vermischt und Propargylamin nucleophile Substitutionen Kultursubstrate präsentiert Mikromuster mehrere immobilisierte Liganden 6 zu erstellen. Während das Potential der Verwendung solcher Chemikalien in Verbindung mit manuellen mgr; CP neue Kultursubstrate Ingenieur ist immens, es wird von der Präzision und Genauigkeit, mit welcher mehrere & mgr; CP Schritte können auf einem einzigen Substrat ausgerichtet werden, beschränkt. Ein hohes Maß an Präzision und Genauigkeit erforderlich wäre, um reproduzierbar herzustellen Komplex in vitro Nischen mit diesen vielseitigen Techniken werden.

e_content "> Um diese Einschränkung zu begegnen, haben mehrere automatisierte und halbautomatisierte mCP Systemen erzeugt wurden. Chakra et. al. eine mCP System, in dem kundenspezifische Stempel sind auf einem Schienensystem platziert und mit Gold-beschichtete Objektträger mit in konformen Kontakt gebracht entwickelt ein computergesteuertes pneumatisches Stellglied. Allerdings erfordert dieses Verfahren die präzise Herstellung von kundenspezifischen Stempel entwickelt und berichtet über eine Präzisions 10 um ohne Bericht der erreicht wird, wenn die Durchführung mehrerer Schritte 12 & mgr; CP Genauigkeit. Vor kurzem wurde ein Verfahren unter Verwendung eines integrierten kinematischen Kopplungssystem berichteten Genauigkeit unterhalb von 1 um unter Verwendung eines einzigen Musters, waren aber nicht in der Lage, mehrere Muster genau auszurichten aufgrund des Fehlens einer präzisen Steuerung der Stempelfunktionen von Form zu Form 13. Zusätzlich beiden vorhergehenden Verfahren erfordern das Substrat zwischen den Strukturierungsschritten fest bleiben und damit deutlich die Vielfalt der Oberflächenmodifizierung Chemie, die sein kann, begrenztverwendet. Hier beschreiben wir eine automatisierte R-mCP System in der Lage genau und präzise Ausrichtung mehrerer mCP Schritte und ermöglicht maximale Flexibilität bei der Briefmarkenentwurf und Fertigung. Weiterhin können die gemusterten Substraten wiederholt aus dem System zwischen Stanz entfernt werden, wodurch die Verwendung von verschiedenen Substratmodifikation Chemien, einschließlich sequentieller nucleophile Substitutionen erlaubt. Substrate entwickelt unter Verwendung solcher Chemikalien wurden für Zellkultur zuvor sowohl von uns 6,14 und andere 7 verwendet. So haben wir R-mgr; CP und sequenzielle nukleophile Substitutionsreaktionen zusammengeführt, um ein Verfahren zur Herstellung von skalierbaren Kultursubstrate mit komplexen biochemischen und mikro Signale zu entwickeln.

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Protocol

1. Gene Elastomere Briefmarken

  1. Um Silizium Meister der PDMS-Stempel zu erzeugen, Design-Merkmal-Muster der Photomaske ist mit Computer-Aided-Design-Software.
    1. Gestalten Sie das erste Muster als 20 x 20 Anordnung von Kreisringen mit 300 & mgr; m Innendurchmesser (ID) und 600 & mgr; m OD mit 1200 & mgr; m von Mitte zu Mitte-Abstand.
    2. Gestalten Sie das zweite Muster als 20 x 20 Anordnung von Kreisringen mit 600 um ID und 900 & mgr; m OD mit 1200 & mgr; m von Mitte zu Mitte-Abstand.
    3. Zusätzlich legen 1 x 1 mm 2 Quadratreferenzmarken an allen vier Ecken jedes Array-Design Abstand 1.200 & mgr; m von Mitte zu Mitte von der Ecke Muster in einem 45 ° -Winkel.
    4. Fabrizieren die Silizium-Master für die Verwendung in diesem Experiment mit 1: 1-Seitenverhältnisse, in Korrelation zu einem 300 um Feature Tiefe mit Standardlithographietechniken anderswo 15 oder in Zusammenarbeit mit einem mikrofluidischen Gießerei detailliert.
      HINWEIS: Feature Tiefen von weniger als 100 & mgr; m können zu abnorm Verformung Briefmarken vor mit Substratoberflächen kontaktieren führen.
      HINWEIS: Dieses Protokoll beginnt mit mit bereits erhaltenen Silizium-Master mit den beschriebenen Muster aus Fotolack, die Spezialausrüstung und saubere Zimmer zu schaffen erfordert. Am besten ist es mit einem Verarbeiter oder Core Facility, diese strukturiert Master-Dokumente erstellen zu konsultieren.
  2. Silanisieren Silizium Meister O / N durch Inkubation mit (Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydroocty) Trichlorsilan Dampf.
    HINWEIS: Silandampf ist sehr giftig und sollte nur in einer chemischen Abzugshaube gehandhabt werden.
  3. Erstellen inverse Repliken der Silizium Meister durch Härten einer 10: 1-Verhältnis von PDMS-Prepolymer und PDMS Härter auf der Oberseite der silanisierten Silizium Meister in einer Petrischale O / N bei 60 ° C.
  4. Entfernen Sie die PDMS-Stempel aus den Silizium Meister und binden die Briefmarken zu Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) Träger oder einer anderen starren Materials unter Verwendung von Klebstoff.
    HINWEIS: Das Material der Wahl nicht transparent oder biokompatibel sein. Es muss jedoch eine flache Oberfläche für die Schnittstelle mit der Roboterwerkzeuge und höhere Steifigkeit als PDMS bereitzustellen.

2. Vorbereiten Coverslides

  1. Spülen Mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) in Toluol, Methanol und beschallen in Aceton für 1 Minute vor dem Spülen mit Ethanol und Trocknen unter einem leichten Stickstoffstrom.
    Hinweis: Behandeln Toluol und Aceton nur in einer chemischen Abzugshaube.
  2. Mantel coverslides mit ~ 3,5 nm Titan (Ti), gefolgt von 18,0 nm Gold (Au) mit einem fokussierten Elektronenstrahl-Verdampfers.
    Hinweis: Dieses Verfahren ist mit einer Vielzahl von mit Gold beschichteten Substraten, einschließlich Silicium und Polystyrol kompatibel. Während es möglich ist, diese vor Ort zu erzeugen, sind ebenfalls mit Gold beschichteten Substrate über kommerzielle Lieferanten erhältlich.
    HINWEIS: Ti-Schichten sollte mindestens 3 nm dick sein, während Au-Schichten auf Substraten sollte eint mindestens 5 nm dick und kann den ganzen Weg in der Dicke in Abhängigkeit von den idealen optischen Eigenschaften des fertigen Substrats 16,17 1mm liegen. Substrate sind nicht erforderlich für die Herstellung optisch klar zu sein; jedoch ermöglicht sie mikroskopische Analyse hergestellt Substraten.
  3. Spülen Sie goldbeschichteten coverslides mit Ethanol und trocken unter leichtem Stickstoff unmittelbar vor der Verwendung.

3. R-mCP der Außenring

  1. Bevor R-mCP mit der selektiv kompatible Knickarmroboter (SCARA) System, kalibrieren Sie die Roboterwerkzeug Effektoren und begleitenden Dual-Kamera-Systeme mit der Software des Systems.
    ANMERKUNG: Diese Werkzeuge sind in Figur 1 dargestellt.

Figur 1
Abbildung 1. R- mCP System und Robotic Arm Tooling. (A) Großansicht des R-mCP System mit allen Werkzeuge und Vorrichtungen (a) Vakuumspann, (b) Reagenz Bad, (c) nach unten gerichtete Kamera, (d) Stempel Verschachtelung Halterung, (e) Roboter Werkzeug. (B) Robotic arm tooling Darstellung (f) Diamant Ätzanlage und (g) pneumatische Saugwerkzeug hält eine (h) ABS-Backed PDMS-Stempel.

  1. Manuell legen Sie eine PDMS-Stempel mit 600 um ID und 900 & mgr; m OD vorstehende Ringe nach unten im Stempel Verschachtelung Befestigung. Hand legen eine frisch gereinigte Gold beschichteten Deckglas auf der Oberseite der Vakuumspannvorrichtung, in Figur 1A dargestellt, und zu immobilisieren sie mit dem verbundenen Laborvakuum.
  2. Mit den Robotersteuerungen, richten Sie den nach unten weisenden Kamera über dem Mittelpunkt des goldbeschichteten Deckglas, wie in 2A.
    HINWEIS: Dieser Punkt kann anfänglich visuell definiert werden und erfordert keine große Genauigkeit, wie der PDMS-Stempel ist viel largER als die goldbeschichteten Folie.
  3. Weisen den Roboterarm zu vier Referenz ätzen "X" Markierungen an den Ecken eines Quadrats mit den Maßen 3,8 mm · 3,8 mm auf der Gold beschichteten Deckglas mit der Diamant Ätzanlage zum Roboterarm befestigt zentriert. (In 2B Dargestellt; automatisierten Prozess)
    HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, alle vier Referenzmarken sind innerhalb einer visuellen Rahmen der nach unten weisenden Kamera.
  4. Mit den Robotern pneumatische Absaugung Tooling, Abholung und halten die PDMS-Stempel 1 mm über der Stempel Verschachtelung Halterung wie in 2C. (Automatisierten Prozess)
  5. Mit dem nach oben zeigenden Kamera und LED-Beleuchtungsring in 2D und E abgebildet, visualisieren quadratischen Referenzmarken des Stempels und ihnen mit der Kamera-Software zu identifizieren 10 mal um durchschnittlich X des Stempels, Y zu bestimmen und von der Mitte der Winkelversatz Roboter Werkzeugachse. (Automatisierten Prozess)
  6. Wie in HINWEIS: Eine interne Berechnung wird von der Software des Robotersystems durchgeführt, um genau auszurichten der Stempel und Deckglas der X, Y-Center-Standorte und Winkelverschiebungen in künftige R-mCP Schritte.
  7. 3.8) Den Stempel in ein Bad aus Alkanthiol ATRP Initiators, ω-mercaptoundecyl bromisobutyrat (2 mM in Ethanol), wie in Abbildung 2F dargestellt. (Automatisierten Prozess)
  8. Entfernen Sie den Stempel aus der Alkanthiol-Lösung und legen Sie es über Stickstoffstrom auf 0,48 bar (5 psi) unter Druck gesetzt, um das Ethanol wie in 2G verdampfen. Nach 1 min erhöht der Stickstoffstrom Druck auf 1,03 bar (15 psi) zu einheitlichen Trockenheit zu gewährleisten. (Automatisierten Prozess)
    HINWEIS: Unvollständige Trocknung wird in vollständigen oder teilweisen Verlust der Mustertreue führen.
  9. Nach dem Trocknen bewegen der Stempel über die berechnete Mittelstellung des Gold-beschichteten Objektträger und senken es bei 100 & mgr; m-Schritten während der Überwachung Z-Achsen-Motorkraft, wie in Figur 2H dargestellt.
    ANMERKUNG: Diese wird als Drehmoment von der Z-Achsen-Motor erfahren und in die Roboterführung Software angezeigt kommuniziert. (Automatisierten Prozess)
  10. Stop Absenken der Stempel einmal der vorbestimmte Druck von 79,2 kPa erreicht worden ist, und der Kontakt mit dem Gold-beschichteten Objektträger für 15 Sekunden zu halten. (Automatisierten Prozess)
    HINWEIS: Die Druckwerte werden hier für den aktuellen Stempel Design und Funktion Höhe optimiert. Wenn der Briefmarkenentwurf ist von einem Versuch und Irrtum-Prozess verändert, speziell für hohe Seitenverhältnis Briefmarken, tune diese entsprechend.
  11. Entfernen Sie langsam den Stempel aus dem goldbeschichteten Objektträger und setzen Sie den Stempel wieder in die Stempel Verschachtelung Befestigung. (Automatisierten Prozess)
  12. 4. SI-ATRP von PEGMEMA auf mikrostrukturierten Coverslides

    1. Lassen Unterdruck hält die mikroDeckGlas, und überträgt es auf einen 50-ml-Schlenk-Kolben. Seal und entgast Schlenkkolben mit einer Vakuumpumpe.
    2. Hinzufügen von 5,5 ml ATRP Reaktionsmischung, die das Makromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), Wasser (34,4 ml), Methanol (43,8 ml), Kupfer (II) -bromid (1 mmol) und 2 ', 2-Bipyridin (3 mmol) an die Schlenk-Kolben.
    3. 0,5 ml der L-Natriumascorbat (454,3 mM) in Wasser, um die Reaktion zu starten, und lassen Sie sie 16 Stunden lang bei RT unter Schutzgas fortzusetzen.
      HINWEIS: Nach der Zugabe von L-Natriumascorbat, wird Reaktionsfarbe von hellgrün bis dunkelbraun zu verschieben, wie in 3A-B gezeigt.
      HINWEIS: Die Reaktion kann über 16 Stunden weiter, aber es wird die Länge der PEG Bürsten nicht wesentlich erhöhen.

    Abbildung 3. Einleitung SI-ATRP. (A) Einleitung der Reaktion und (B) anschließende Farbänderung nach Zugabe von L-Natriumascorbat. (C) Mikroskopische Aufnahme von mikroDeckGlas Oberfläche folgenden SI-ATRP Verfahren. Maßstabsleiste 1 mm.

    1. Entfernen Sie die mikroDeckGlas aus dem Schenk-Kolben und spülen mit Ethanol, Wasser und Ethanol und trocken unter einem leichten Stickstoffstrom.
      HINWEIS: Nach SI-ATRP, sollten Oberflächenmodifikationen für das Auge sichtbar sein und kann, wie in 3C abgebildet und unter einem Mikroskop untersucht werden.
      Anmerkung: Dies ist die einfachste Methode, um die Genauigkeit der Test testen, wie es entfällt die Notwendigkeit, die Substrate Immunfärbung.

    5. Azid Funktionalisierung von mikrostrukturierten PEGMEMA Chains

    1. Legen Sie die mikroDeckGlas in einem 20 ml Glasreaktionsflasche.
    2. 6 ml N, N-Dimethylformamid (DMF), enthaltend 100 mM Natriumazid in die Reaktionsflasche. Pflegen diese Reaktion bei 37 ° C für 24 Stunden.
      Hinweis: Behandeln DMF nur in einer chemischen Abzugshaube. Vorsicht beim Abwiegen Natriumazid.
    3. Nach Abschluss entfernen Sie die mikroDeckGlas aus dem Reaktionsgefäß und spülen mit Ethanol und dann mit Wasser und trocken unter einem Stickstoffstrom.

    6. Passivierung von Brom Funktionalisierte PEGMEMA Chains

    1. Zeigen mikrostrukturiert Deckglas in 20 ml Glasreaktionsgefäße.
    2. 6 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), die 100 mM Ethanolamin und 300 mM Triethylamin zu der Reaktionsflasche. Halten diese Reaktion bei 40 ° C für 24 Stunden.
      Hinweis: Behandeln DMSO, Ethanolamin und Triethylamin nur in einer chemischen Abzugshaube.
    3. Nach Abschluss entfernen Sie die mikro coverslide aus dem Reaktionsgefäß gründlich mit Ethanol und dann mit Wasser und trocken unter einem Stickstoffstrom.

    7. R-mCP der Innenring und SI-ATRP von PEGMEMA

    1. Durchführung R-mCP Schritte wie zuvor in den Schritten 3.2 und 3.6 - 3.12, Substitution eines PDMS-Stempel mit 300 um ID und 600 um Außendurchmesser vorstehenden Ringräume, so dass die Ringräume mit kleineren Merkmale sind in den zuvor mikrostrukturiert Ringräume angeordnet.
      HINWEIS: Die Druckschwelle für diese Briefmarke ist 132,0 kPa. Wie bereits erwähnt, werden diese Druckeinstellungen für wobei die Stempelfunktionen in diesem Experiment verwendet optimiert.
    2. Führen Sie SI-ATRP Schritte wie zuvor in den Schritten 4.1 beschrieben - 4.4.

    8. Acetylen Funktionalisierung von mikrostrukturierten PEGMEMA Chains

    1. Zeigen mikroDeckGlas in einem 20 ml Glasreaktionsflasche.
    2. 6 ml DMSO, enthaltend 100 mMPropargylamin in die Reaktionsflasche. Halten Sie diese Reaktion bei RT für 24 h.
      Hinweis: Behandeln DMSO und Propargylamin nur in einer chemischen Abzugshaube.
    3. Nach Abschluss entfernen Sie die mikroDeckGlas aus dem Reaktionsgefäß und spülen mit Ethanol und dann mit Wasser und trocken unter einem Stickstoffstrom.

    9. Kupferkatalysierte "Click" Biotinylierung von Acetylen Abgebrochene PEGMEMA Chains

    1. Zeigen mikroDeckGlas in einem 20 ml Glasreaktionsflasche.
    2. 6 ml Kupfersulfat (15 mM) / Tris [(1-Benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v Wasser / DMF) enthalten 562 uM Azid-PEG 4 -Biotin Konjugat in die Reaktionsflasche. Mit 1,2 ml L-Ascorbinsäure (0,15 mM) in Wasser zu der Mischung, um die Reaktion zu initialisieren.
    3. Bubble Stickstoff durch die Reaktionslösung für 10 sec, versiegeln die Phiole mit Parafilm und für 24 h bei RT reagieren.
    4. Nach completion entfernen mikroDeckGlas aus dem Reaktionsgefäß, mit Wasser abspülen und legen Sie sie in einem 12-Well-Polystyrolschale.

    10. Immunfluoreszenz-Nachweis von biotinylierter Acetylengruppen

    1. Block mikroDeckGlas in DPBS (3% Eselserum) 1 h bei RT. Färbung für biotinylierte Acetylengruppen mit Streptavidin-546-Konjugat (2 ug / ml) in DBP (3% Eselserum in PBS) für 2 h bei RT.
    2. Spülen mit Mikrodeckglas 5 mal mit DPBS für 10 min unter leichtem Schütteln.
      ANMERKUNG: Abbildung 4B zeigt ein Bild der Folie, nach dieser Schritt abgeschlossen ist.

    11. Kupferfreie "Click" Biotinylierung von Azid Abgebrochene PEGMEMA Chains

    HINWEIS: Wenn gewünscht, kann dieses Substrat Modifikationsschritt in situ während der Zellkultur durchgeführt werden.

    1. Lassen mikroDeckGlas in 12-Well-polystyrene Gericht folgenden DBPs spült.
    2. 2 ml DBP (oder Zellkulturmedium), enthaltend 20 & mgr; M-PEG DBCO 4 Biotin und lassen diese Reaktion für 24 h bei RT weiter (oder bei 37 ° C in einem Brutschrank).
    3. Nach Abschluss gründlich mikroDeckGlas 5 mal mit DPBS (oder einfach führen Sie einen Medienwechsel).

    12. Immunfluoreszenz-Nachweis von biotinylierter Azidgruppen

    1. Färbung für biotinylierte Azidgruppen mit Streptavidin-488-Konjugat (2 ug / ml) in 2 ml DPBS (3% Eselserum) für 2 h bei RT.
    2. Spülen mit Mikrodeckglas 5 mal in DPBS für 10 min unter leichtem Schütteln.
    3. Bildmikrodeckglas mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskops. 4A-C zeigt Bilder der Folie, nach diesem Schritt abgeschlossen.
      HINWEIS: Bei der Verwendung von Substraten für die Gewebekultur-Assays, überspringen Abschnitte 10 und 12 dieses Protokolls. Nach der gewünschten degree Funktionalisierungsgrad sterilisieren entworfen Deckglas durch Spülen beide Seiten mit 100% Ethanol und Trocknen unter einem Stickstoffstrom. Die Objektträger in einer sterilen Sicherheitswerkbank und spülen Sie die Objektträger mit PBS fünfmal, bevor mit Zellaussaat und Kultur voran.

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Representative Results

Der Einsatz von manuellen Ausrichtung mCP Techniken, um Kultursubstrate mit Arrays von PEG-gepfropft Bürsten mit orthogonaler funktionalisiert Engineer "klicken Sie auf" Chemie hat in früheren Arbeiten 6 nachgewiesen. Allerdings bietet diese minimale Steuerung der Musterausrichtung und führt oft zu einer Überlappung von funktionalisierten Bereichen. Hier wird eine neue R-mgr; CP-System verwendet, um diese Beschränkung zu überwinden, und ihre Fähigkeit, genau Muster eine Anordnung von PEG Bürstenringräume mit 300 um ID und 600 um AD präsentiert terminalen Alkin-Gruppen innerhalb einer separaten Anordnung von PEG Bürstenringräume mit 600 & mgr; m ID und 900 & mgr; m OD präsentiert Terminal Azidgruppen nachgewiesen 14. Nach der Reaktion des Alkins präsentiert PEG Bürsten mit Azid-PEG 3 Biotin und die Reaktion des Azids präsentiert PEG Bürsten mit DBCO-PEG 4 Biotin, wurde das Substrat mit fluoreszierenden Sonden immun und abgebildet mit einem konfokalen Mikroskop (Fild 4). Analyse dieser Bilder unter Verwendung einer benutzerdefinierten MATLAB-Programm berechnet, dass die beiden PEG Bürstenanordnungen wurden mit sub-10 & mgr; m Genauigkeit, dh ausgerichtet ist, X ~ 6,4 um, Y ~ 1,7 & mgr; m und θ ~ 0,02 °, der bei der Produktion des Herstellers genannte Grenze unserer SCARA-Modell (dh ~ 10 & mgr; m) und bezeichnend für gehenden Performance 14 der R-mCP Systems. Daher glauben wir, dass die Verwendung von High-End-SCARAs in diesem System wäre sogar noch niedriger, sub-micron Auflösung bereitzustellen. Diese Ergebnisse zeigen die vielseitigen Substrat Engineering-Kompetenz durch die kombinierte Verwendung der R-mCP System und sequenzielle nukleophile Substitutionsreaktionen aktiviert. Die minimale Kreuzreaktivität durch Fluoreszenzmarkierung der orthogonalen Oberflächenchemie nachgewiesen dient, das Potential des Systems für präzise Immobilisierung biochemischer Signale, komplexe Kultursubstrate für Tissue-Engineering-Anwendungen zu erzeugen, zu veranschaulichen. </ P>

Figur 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung der R- mCP Prozess. (A) nach unten gerichtete Kamera Visualisierung immobilisiert Gold-beschichteten Objektträger, (B) Ätzen Referenzmarken auf goldbeschichteten Deckglas, (C) Entfernen PDMS-Stempel von der Stempel Verschachtelung Befestigung, (D - E) Visualisierung PDMS-Stempel Referenzmarken mit nach oben gerichtete Kamera , (F) Platzieren PDMS-Stempel in Alkanthiol Initiator Bad, Alkanthiols (G) Trocknen über Stickstoffströme Initiator Lösungsmittel und (H) Präge Alkanthiols beschichteten PDMS-Stempel auf goldbeschichteten Deckglas.

Figur 4
Abbildung 4. Immungefärbte Bilder von mikro Slide. (A) Azid und (B) Alkingruppen präsentieren, biotinyliert mit kupferfreien und kupfervermittelte Klick-Chemie, und mit Streptavidin-488 und -546 detektiert. (C) Überlagerung beider Fluoreszenzkanäle. Alle Maßstabsbalken 500 um.

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Discussion

Ideale Substrate für das Tissue Engineering Bioinspiriertes würde und dadurch die räumliche Verteilung der kritischen bioaktiven Liganden innerhalb der nativen Geweben zu rekapitulieren. Sie würden auch dynamische Eigenschaften besitzen, die zeitliche Änderungen der Liganden und die räumlichen Muster in der sie präsentiert gerichtet Morphogenese ermöglichen und räumlich begrenzte Induktion von Zellschicksal zu ermöglichen. Herstellung solcher Substrate erfordert die Immobilisierung von mehreren biochemischen Signale in komplexen und hochgeordnete Orientierungen auf Substraten. Während der Simulation alle endogenen Faktoren der Nische einer Zelle in vitro unzumutbar ist, die hier beschriebenen R-mCP-System ermöglicht die Immobilisierung mehrerer Regionen der orthogonalen bioaktiven chemischen mit Mikrosteuerung der räumlichen Orientierung.

Die Nützlichkeit dieser Substrate weiter zunimmt, wenn man bedenkt, dass, während PEG Bürste Arrays mit immobilisierten Liganden gebundenkönnen biospezifische Wechselwirkungen auslösen, ungebunden bleiben PEG Bürsten resistent gegen Proteinadsorption und somit dazu dienen kann, die Zelladhäsion und Migration zu steuern. Obwohl passive, mikro Adsorption von extrazellulärer Matrix (ECM) Proteine ​​oder Polymer-PEG-Konjugaten ist eine einfachere Methode zur Steuerung der Zelladhäsion und Migration nur diese Technik bereitzustellen Gangssteuerung, da die Adsorption ist ein reversibler Prozess 11. Auch Moleküle adsorbieren auf Oberflächen unvorhersehbare Orientierungen und zufällig Konzentrationen wodurch die Treue und Steuer biospezifischer Wechselwirkungen einschränkend. Außerdem werden Verbindungen typischerweise verwendet werden, um Nicht-Fouling-Regionen, wie Rinderserumalbumin oder Pluronic F127 erstellen, nicht bezeichneten reaktiven Stellen zur weiteren Funktionalisierung Begrenzungs post-Adsorption in situ Modifikationen besitzen. SAMs mit solchen reaktiven Gruppen für zusätzliche Oberflächenmodifizierung erzeugt werden, aber auch sie haben begrenzte Haltbarkeit in Gewebekultur conditIonen aufgrund der fehlenden Abschirmung durch oxidative gepfropft PEG lieferte Bürsten 10,11. Umgekehrt ist die Fusion unserer R-mCP Plattformen mit PEG-Bürste Pfropfen und sequenzielle nukleophile Substitutionsreaktionen bietet die Möglichkeit, Substrate mit langlebigen, mikroskaligen zellabweisenden Regionen, die von vornherein oder in situ mit bioorthogonalen Funktionalitäten geändert werden können Ingenieur. Dies wird eine größere Kontrolle biospezifischer Interaktionen, die in vitro Gewebemorphologie und Wachstum regulieren zu ermöglichen.

Eine wesentliche Stärke des R-mCP Vergleich zu anderen Systemen zum Ausrichten aufeinanderMikroDrucken ist die Fähigkeit, das Substrat aus dem System zwischen wiederholten Pressteile zu entfernen, während weiterhin hohe Ausrichtungsgenauigkeit 12,13. Dies ermöglicht eine größere Vielfalt in der Art der Oberflächenchemie, die angewendet werden können, und die Dauer der Oberflächenmodifizierungsreaktionen können zu stimmen variiert werden die Dichten der anschließend immobilisiert Liganden 6. Somit kann R-mCP zur Brenn Konzentrationsgradienten in der biochemischen Signale, die biospezifische Wechselwirkungen vermitteln 14 einzurichten. Mit der Fähigkeit, sowohl die Position und den Grad der biospezifischen Wechselwirkungen genau zu steuern, bietet die R-mCP System ein einzigartiges Verfahren für die Untersuchung der Rolle von bioaktiven Liganden in Morphogenese und stellt ein robustes System zur Erzeugung von Kultursubstraten Simulieren der Darstellung der biologischen Signale in die in vivo Nische.

Ein kritischer Aspekt der zellulären Nischen, speziell in den Bereichen Entwicklung, ist raumzeitliche Modulation der Signalfaktoren 18. Obwohl lösliche biochemische Signale können Kulturmedien in einer zeitlich festgelegten Weise hinzugefügt werden kann, wird begrenzt räumliche Kontrolle darüber, welche Zellen in denen diese Signale. Mit dem hier beschriebenen R-mCP System ist es möglich, mikroKulturSubstrate mit endständig functionaliz konstruierened PEG Bürsten präsentiert Azid funktionellen Gruppen, die keinen Einfluss auf das Schicksal der Zelle in Kultur haben. Während Azidgruppen Lage ist, eine Kupfer-katalysierte "auf" Reaktionen mit Alkin präsentiert Moleküle sind, kann dies nicht in der Anwesenheit von Zellen in der Kultur aufgrund der Toxizität von Kupfer durchgeführt werden. Allerdings Hochstamm Moleküle wie dibenzocyclooctyne (DBCO) durchlaufen eine hochselektive und biokompatibel kupferfreie Azid-Alkin-Cycloaddition 19,20. Durch Konjugation DBCO enthaltenden Linkern, können mikroKulturSubstrate in situ mit neuen biologischen Liganden, 21 modifiziert werden. Mit der Fähigkeit, zellabweisenden Bereiche übertragen cytophile oder in verschiedenen biochemischen Hinweisen zur Verwendung in mehrstufigen Signalisierungsverfahren, bei diesem Verfahren erzeugten Kultursubstrate neuartige adaptive Fähigkeiten und somit ein robusteres System zum Anweisen Morphogenese in vitro.

Trotz der immensen Topfzielle und die Nützlichkeit der R-mCP Plattform, es hat gewisse Nachteile. Die Verwendung von zahlreichen SI-ATRP Schritte PEG-gepfropften Substrate erzeugen erhöht die Herstellungszeit im Vergleich zu Verfahren, die Tintenstrahldruck oder Mikrotröpfchenabscheidung von ECM-Proteinen. Während die Genauigkeit des Inkjet-Druckverfahren konkurriert mit der aktuellen R-mCP System, ist die Adsorption von ECM-Proteine ​​reversibel, wodurch weniger Kontrolle der Zell-Protein-Wechselwirkungen. Ebenso können Substrate mittels Tintenstrahldrucktechniken erzeugt während der Herstellung entfernt werden, wodurch die Verwendung von verschiedenen Substratmodifikation Chemie, die ermöglichen, beispielsweise in situ Modfizierungen 22 räumlich begrenzten behindern. Aufgrund dieser Einschränkungen Tintenstrahltechniken sind für die schnelle Erzeugung von Kultursubstraten in erster Linie mit kurzer Dauer, statischen Anordnungen von Biomolekülen und Zelltypen 23 besser geeignet, während die R-mCP System ist viel Better zu erzeugen facettenreiche Substrate entwickelt, um langfristige, dynamische Kontrolle über beide räumlichen und zeitlichen zellulären Interaktionen in 2D mit vielfältigen biologischen Liganden aufweisen geeignet.

Mikrokontaktdruck ermöglicht eine schnelle Ablagerung von nano-to-Mikro "Tinte" verfügt über große Flächen, aber es war schon immer in der Konzentration der abgeschiedenen "Tinte" Substanzen erhebliche Heterogenität. Dies ist auch eine Strombegrenzung des R-mCP Plattform wie in Abbildung 4 zu beachten. Wir vermuten, dass die Heterogenität in fluoreszierenden Modifikation der PEG Bürsten ist auf die Roboteranwendung einer unebenen Normalkraft über die gesamte PDMS-Stempel, die wird wahrscheinlich auch nicht perfekt flach. Dies führt zu einer ungleichmäßigen Kontaktdruck zwischen allen Regionen der Stempel und dem Substrat, wodurch ungleichmßige Abscheidung der Alkanthiol-Initiator und anschließende Dicke der aufgepfropften PEG Bürste verursacht. InUm PEG-gepfropften Substrate mit noch Abscheidung Alkanthiole und dadurch Oberflächenfunktionalität herzustellen, wird das Stanzwerkzeug-Design optimiert werden müssen, um eine verteilte und einheitliche Normalkraft über die gesamte PDMS-Stempel anzuwenden. Dies wird gleichmäßigen Kontakt mit den goldbeschichteten Folien über die gesamte Schnittstelle unabhängig von Stempel Unvollkommenheiten zu erleichtern. Auch in 4B, kann man leichte Kreuzkontamination von Acetylen-Gruppen auf dem Azid beendet PEG Bürsten beobachten. Während die Oberflächendichte der immobilisierten Liganden aufgrund von Kreuzkontamination minimal im Vergleich zu dem beabsichtigten PEG-Bürste kann auf nahe Null durch eine Erhöhung der Dauer der Ethanol Passivierungsreaktion reduziert werden (siehe Abschnitt 6), wie zuvor 6 gezeigt.

Die Hauptanwendung der hier beschriebenen R-mCP System ist für die Herstellung von komplexen Gewebekultursubstrate, die verwendet werden könnten, um räumliche und zeitliche Kontrolle auszuüben of Zellschicksal. Die hohe Präzision und Genauigkeit des R-mCP Plattform macht es zu einem attraktiven Verfahren für andere Anwendungen als gut aber. Die Fähigkeit, Muster cytophilen Gebieten mit Differential Ligand Chemie, gefolgt von in situ Modifikation zuvor inert, zellabweisenden Regionen ermöglicht Co-Kultur von mehreren Zelllinien mit engen Kontrolle über ihre räumliche Orientierung. Dies gekoppelt mit der inhärenten hohen Durchsatz Natur der Mikrostrukturierung eine Alternative zu gegenwärtigen Verfahren für Hochdurchsatz-Screening der beiden Einzelzellen und Mehrzellen-Kombinationen 24. Während die R-mCP System hat ein großes Potential im Bereich der Biologie, könnte sie auch auf dem Gebiet der mikroelektromechanischen Systeme (MEMS) verwendet werden. MEMS-Fertigung, ist es wünschenswert, MEMS-Komponenten mit hoher Präzision und Genauigkeit für die Massenproduktion zu übertragen. Mit neuartigen kinetischen Prägetechniken könnte der hier beschriebenen R-mCP System angepasst werden, um compone effektiv druckennts aus Silizium oder Gallium-Nitrid auf Siliziumwafern zur Verwendung bei der Erzeugung von MEMS 25. Somit könnte die R-mCP Plattform für einen weiten Bereich von möglichen Anwendungen verwendet werden.

Abschließend Verwendung des R-mCP System zur Erzeugung PEG-gepfropften Kultursubstraten mittels sequentieller nucleophile Substitutionsreaktionen orthogonal funktionalisierten stellt nicht nur eine ideale Plattform für die Steuerung potentiell Gewebemorphologie und Wachstum in vitro, aber ein ausgezeichnetes System zur Untersuchung der Rolle von Mehr bioaktiven Liganden auf Zellschicksal. Die Fähigkeit, Muster mehrere biochemische Signale in unterschiedliche und hochgeordnete Muster legt den Grundstein für Baukultur Substraten fähig Anweisen der Bildung von Gewebestrukturen mit mehreren Zelltypen an der Mikrometerskala organisiert. Dies, gepaart mit der Fähigkeit, mikro Substrate in situ zu ändern, könnten beispiellose Kontrolle über Gewebemorphogenese und cel ermöglichenl Schicksal in der Kultur. Die hier beschriebenen Strukturierungstechniken bieten ein vielseitiges System für die Herstellung von Kultursubstraten, die eines Tages könnte ermöglichen rationelle und reproduzierbare Herstellung von organotypischen Gewebestrukturen in vitro.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SCARA  Epson LS3-401ST Higher end models with increased precision are available if desired. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane Gelest SIT8174.0 CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesive Co NC9020938 Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides Fisher Scientific 48393106 These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator Telemark SEC-600-RAP Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA EPSON LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate Prochimia FT 015-m11-0.2 Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. 
Schlenk Tube Flask 50 ml Synthware 60003-078 Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate Sigma Aldrich 447943 Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS) Fisher Scientific A412-4 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide Sigma Aldrich 437867 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2,2'-Bipyridine Sigma Aldrich D216305 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich A4034
20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-340-4E
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide Sigma Aldrich 227056 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine Sigma Aldrich 398136 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine Sigma Aldrich T0886 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich 276855 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine Sigma Aldrich P50900 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol University of Wisconsin Material Distribution Services 2292 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin ClickChemistryTools AZ104-100 Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate Sigma Aldrich C1297 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich A7506
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190144
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663 Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate Thermo Scientifit - NUNC 07-200-81 Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin Clickchemistytools A105P4-10 Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate Life Technologies S-11223 Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies S-11225 Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope Nikon Nikon Eclipse Ti, A1R An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.

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