Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullanma: Kemirgenler Bir Nöroprotektiftir Tekniği

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Published 6/02/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Uzaktan iskemik önkoşullama (RIP) zarar strese karşı koşullandırma dokuların bir yöntemdir. Biz 5-10 dakika bir tansiyon aleti manşet şişirilerek, arka bacak uzaktan iskemi bir yöntem kurduk. RIP nöroprotektif yetenekleri kemirgenlerde retina dejenerasyonu modelinde gösterilmiştir.

Cite this Article

Copy Citation

Brandli, A. Remote Limb Ischemic Preconditioning: A Neuroprotective Technique in Rodents. J. Vis. Exp. (100), e52213, doi:10.3791/52213 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Öldürücü iskemi etkilenen dokuda endogen mekanizmalar yukan doğru düzenlenmesi vasıtasıyla daha sonra, daha ağır iskemiye karşı dokuları korur. Öldürücü iskemi uzaktan dokularda koruyucu mekanizmalar artırdığı gösterilmiştir. Memelilerin arka bacak iskemi (5-10 dk), kısa bir süre, beyin, akciğer, kalp ve retinada kendini koruma tepkileri indükler. etki uzak iskemik önkoşullamanın (RIP) olarak bilinir. Bu hayati organları korumak terapötik umut verici yoludur ve kalp ve beyin yaralanmaları için klinik çalışmalarda altında zaten. Bir sıçan, özellikle arka uzuv - - iskemik Bu yayın bir uzuv yapma kontrollü, minimal invaziv yöntem gösterilmektedir. İnsan yenidoğanlarda kullanılmak üzere geliştirilen bir kan basıncı manşet manuel tansiyon aleti bağlı ve arka bacak üst kısmı 160 mmHg basınç uygulamak için kullanılır. Cilt sıcaklığını tespit etmek için tasarlanmış bir sonda ischemi doğrulamak için kullanılırBir bacak arterlerinin basınç kaynaklı tıkanıklığı nedeniyle cilt sıcaklığında düşüş, ve manşet bırakılmasını takip sıcaklık artışını kaydederek. RIP Bu yöntem parlak ışık kaynaklı hasar ve dejenerasyona karşı sıçan retinaya koruma sağlamaktadır.

Introduction

En hayatta, belki de, metabolik stres karşısında dokuları subletal iskemi 1,2 bir süre ile önceden klima geliştirilebilir. Pratik açıdan İskemik önşartlama (IP) doku deneyimlerinden böyle bir sonraki iskemik hakaret olarak daha şiddetli stres, önce subletal iskemi doku maruz vardır. Hayvan modellerinde, IP beyin, retina, kalp ve akciğerler 3-6 çarpıcı bir koruma sağlar. Buna karşılık, inme hastalarında gözlemler önceki geçici iskemik atak ve daha iyi klinik sonuçlar 7,8 arasında bir bağlantı göstermiştir. IP ayrıca iskemik olmayan yaralanmalar 9 retina fotoreseptörleri korur.

Farklı doku ve yaralanmalarda IP etkinliği tüm dokuda bulunan hücre canlılığının doğuştan gelen bir mekanizma aktive olduğunu göstermektedir. Miyokardın İskemik ön şartlama, yukarı doğru düzenleme aracılığıyla koruyucu etkileri olduğu ileri sürülmüştüradenozin serbest bırakılması yoluyla veya mitokondriyal ATP potasyum kanallarının 10,11 açıklıktan çok metabolik yolları düzenleyen bilinen hipoksi indüklenebilir faktör (HIF) 'nin. Adenozin bırakma ve ATP potasyum kanalları bugüne kadar iskemik klima nöroprotektif mekanizmalar içine araştırmalar, anti-eksitotoksisitesi, anti-apoptotik ve anti-inflamatuar yolların 12,13 modifikasyon odaklanmış olan, serebral iskemi karıştığı fakat. Genel olarak, nöronlar korumak için iskemik klima moleküler sürecin anlaşılması sınırlıdır.

Uzaktan iskemik önkoşullama girişimleri daha az kritik dokularda iskemi oluşturarak uzak son derece önemli organları (kalp, beyin, akciğer) şart için. Arka bacak ile uzaktan iskemik ön şartlama (RIP) inme, 14-17 arasında, kemirgen modellerinde nöro-koruyucu olduğu gösterilmiştir. bizim tarafımızdan açıklanan yöntem, basit, güvenilir ve non-invazif Prot sağlarRIP uyarılması için ocol.

RIP protokolleri büyük çoğunluğu üst arka bacak bulunan femoral arter kolayca tespit ve cerrahi sıkıştırma ve turnike uygulama için erişilebilir muhtemelen çünkü, arka uzuv içerir. Beyin ve cilt koruma çalışmaları için invazif ekstremite iskemik çalışmalarda, iskemi, kasık ligament femoral arter ayrılması ve femoral arter 2,15,18 sıkıştırarak endüklenir.

ekstremite Kesilen ya da femoral arter ya da sıkıştırma kaynaklanan iskemi bir pals kaybı azalması oksijenlenme ve cilt sıcaklığında bir düşüş de dahil olmak üzere bacak değişiklikler ile teyit edilmiştir. Uzaktan iskemi lazer Doppler ultrason veya Doppler 17-19 kullanılarak nabız kaybı ile teyit edilebilir. Cilt sıcaklığı ilişkisi 20,21 doğrusal olmayan olmasına rağmen Doppler alternatif olarak kullanılabilir. Doğru sıcaklık kayıtları laboratuarlar ve can olağanKolayca uzak iskemik çalışmalar içine dahil edilebilir.

Cerrahi sıkma femoral bir alternatif turnike kullanılarak iskemi indüksiyon olduğunu. Turnike uygulama kabı sıkma ile elde edilene karşılaştırılabilir iskemi üretir; Kutchner ve diğ. non-invaziv turnike için sıkma invaziv femoral arter karşılaştırıldı ve her iki yöntem flep iskemi 18 bir plastik cerrahi modelinde ekstremite kan akımını ve daha az cilt hasarı durduruldu bulundu. Bacağı veya kolu ya Kesilen ve sistolik kan basıncının üzerinde manşon basıncı yükselterek domuz ve insan 17,19,22 iskemik hasara karşı koruyucu olduğu bulunmuştur.

Farklı turnike iskemik tansiyon ölçme veya elastik bant 17,22,23 kullanımını içerir uzak uyaran yaklaşımları. Ancak, iskemi ikna etmek için bir elastik bant kullanımı güvensiz bir yöntem basınç bir düzenlemesiz miktarda potansiyel veren yükselişi500 mmHg üzerinde basınç yükselir ile ekstremite, insanlarda 24 kaydedilmektedir. Bundan başka, bir elastik bant ile kol veya bacak iskemisi Evans mavi boya, myofiber geçirgenliği 25 in vivo bir işaretleyici ile değerlendirildiği gibi, bandın 23 çıkarılmasından sonra farelerde kas hasarına yol açar. Bunun aksine, turnike kontrollü bir basınç dağıtım tansiyon aleti 17,19,22,26 bağlı kan basıncı ölçümü kullanılarak elde edilebilir.

Bu çalışmada, fotoreseptör dejenerasyonu hafif bir yaralanma modeli uzaktan iskemik ön koşullandırma ve nöro-koruyucu etkinliğini göstermek için kullanılmıştır. Uzaktan iskemi hafif yaralanma hemen önce uyarılan ve retina fonksiyon testleri ile teyit gibi sonraki fotoreseptör dejenerasyonu engellenmiştir. Ekteki video non-invaziv uzaktan iskemi uygulamasını gösterecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik deyimi: protokol 5657 # AEC University of Sydney hayvan bakım kurallarına izler. Anestezi hayvan etik kurul (University of Sydney, AEC # 5657) tarafından onaylanmıştır.

1. Ekipman Hazırlığı

  1. Gerçek zamanlı cilt ısısı izleme kullanın. Bilgisayarda açın ve veri toplama donanımı.
  2. Açık sıcaklık kayıt yazılımı ve sıcaklık 30-35 arası C ayar ve her 100 msn örnekleme sıklığını ayarlayın.
  3. İsteğe bağlı: çekirdek sıcaklığını sağlamak için Ekle rektal termometre 37.5 ° C'de sabit kalır.

Manuel tansiyon aleti 2. Kalibrasyon

  1. Bir 250-550 gr sıçan için bir boyut 2 manşet sphygmomanometer.Use yenidoğan kolluğu bağlayın. Bir adaptör tansiyon aleti için manşon tüpünü bağlamak gerekli olabilir.
  2. Her iki hava tahliye vanasını gevşemesine veya uyarlamak gelen manşon tüpünü ayırarak manşeti Söndürya da. Hiçbir baskı emin olun tüp kalır ve manometre iğne oval / dikdörtgen içinde sıfır aittir.
  3. Boru, manometre ve manşet arasındaki basıncını kontrol edin. Bu manometre 100 mmHg okuyana kadar enflasyon ampul yumuşak pompalarla şişirin. Basınç sabit kalır emin olun. Yavaş yavaş hava bırakma değeri açarak manşeti söndürün.

3. Hayvan Hazırlık

Not: Koyu uyumu gerektiren hafif yaralanma geçmesi için uzaktan iskemi gece önce olan Hayvanlar. Işık hasarı geçiren Hayvanlar karanlık yetiştirme (12 saat ışık: karanlık döngüsü (5 lux)) gerektiren

  1. Uyanık veya anesteziye kemirgenlerde ya uzaktan iskemi gerçekleştirin. Hayvanlar sağlıklı bir kas tonusunu olduğundan emin olun. Yeterli kas mevcut olduğunu teyit etmek için üst arka uzuv kısma bu sağlayın. Hafif yaralanmalara karşı RIP kaynaklı koruma yaşı 6 aya kadar sedanter sıçanlarda test edilmiştir.
  2. R anesteziye hazırlıkIP
    1. 60 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin ve intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçanlarda enjekte edilir. Bacak uzatma ve ayak altındaki deriyi sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. derinden Narkoz ise hayvan yok refleksi vardır. Anestezi altında iken kornea kuruluğu önlemek için yapay gözyaşı uygulayın.
    2. Bir ısı pedi veya 37.5 ° C arasında sabit bir vücut sıcaklığını muhafaza etmek için su ısıtıcı boru dolaşım ya da üzerinde sıçanlar yerleştirin. Alt ekstremite 'ayak pedleri yukarı bakacak şekilde yüzüstü pozisyonda sıçan yerleştirin. Sağ ya da sol kol uzak iskemi uğrayabilir.
  3. RIP uyanık hazırlık
    Not: hayvan deneyleri iki kişi gerekir Uyanık. Bir kişi hayvanı kısıtlayan ve ikinci kişi manuel sfingomanometre çalışır. deneyci kısıtlama işleyicileri yaralanma riskini artırır olarak yordamı gerçekleştirmek için emin olmalıdır. Uzaktan iskemi uygulanan fareler t klimalı olmalıdıro manuel kısıtlama. Sezgisel kılavuzlar bağlı olarak el emniyet birkaç hafta içinde 5 dakikalık bir maksimum 30 saniye arasında ilerleme olmalıdır. Manuel kısıtlama acclimatise başarısız Çekingen hayvanlar uyanık deney dışında tutulmalıdır. Son olarak, manuel kısıtlama doğru RIP çalışma sonuçlarını yorumlamak için kullanılması gereken hayvanlara stres (ve potansiyel olarak çalışmaya boşa tanıtmak) ve sahte kohort (inflamasyon olmadan manşet yerleştirme) neden olabilir.
    1. 15 cm x 30-50 cm parçaya bir havlu kesin ve arka bacaklarda üstüne başını örten, sıçan omurga dik ve kısa kenarı yerleştirin.
    2. Sıçan gövde altında kısa kenarı sıkıca sokmak ve havlu kalan uzun kenarı ile sıçan sarmak başlar. Bir yatar pozisyonda kol altında sarılı hayvan sabitleyin. Sıçan sol kolunun altında tutulursa, havlu gelen sıçan sağ ekstremite özgür.

4. Uygulama of Cilt Sıcaklık Probu

  1. Iskemi geçmesi ve footpad cilt probu yerleştirmektir sıçan bacak uzatın. Sıcaklık probu ve deri arasındaki temasını maksimize etmek için cilt probunu yerleştirin. Sıkıca footpad soruşturmanın itin ve kağıt bant ile prob yapıştırmayın.
  2. Sıcaklık kayıt yazılımı sıcaklığını takip ederek cilt prob yerleşimini kontrol edin. Cilt ısısı 30-34 ° C arasında ve sabit kalır emin olun. 1-2 dakika boyunca deri sıcaklığını takip edin. Sıcaklık kararsız veya 30 ° C'nin altında ise deri probu ayarlayın.

5. Uzaktan İskemi

  1. Manşeti Deflate ve hava basınç valfi kapalı olduğundan emin olun. Bacak uzatmak ve gevşek üst arka bacak üzerinde Manşeti kuşatmak. Pozisyonda gevşek manşet tutmak için bacak ve alt basamak uzatmak için işaret parmağı ve başparmak kullanın.
  2. Uyanık hayvanlar artışlarla 160 mmHg, ve anesteziye hayvanın manşet basıncı kaldırın180 mmHg kaf basıncı ase.
    Not: sıçanların anesteziye kan basıncı 120-140 mmHg arasında değişir ve zaman bilinçli 160 mmHg yükselir. Doğru basınca ulaşıldığında zamanlayıcı ve ayak sıcaklığı kayıtları başlar.
    Not: Ayak sıcaklığı sabit basınç 5 dakika sonra 2 ° C ile damla gerekir.
  3. Iskemi boyunca hayvanın "diz" yukarıdaki manşet pozisyonunu koruyun. Manşet basıncı bir kaç dakika sonra düşmeye başlayacak, ya da sıçan uzuv hareket ediyorsa.
  4. Art arda pompalama istenen kaf basıncı tekrarlayan kısa bir patlama korumak için öbekler halinde enflasyon ampul pompa
  5. Uzaktan iskemi dk 5 ila 15 için sürekli olarak teslim edilebilir. iskemi reperfüzyon protokolü bir müdahale 5 dk reperfüzyon ile 5 dk iskemi 2 dönemlerini kapsamaktadır.
  6. Hava basıncı valfini gevşeterek kaf basıncını söndürün. Iskemi pro boyunca sıcaklık değişimini kontroltokol. Manşeti bırakın.
  7. Yaralanma deneme ile devam edin. Anestezi etkisi altında hayvanlar bir ısı pedi üzerine yerleştirilmesi gerekir. Ayaktan kadar hayvanları izlemeye devam edin. Hayvanlar yürüyüş kadar konut iade edilemez.

6. Işık Yaralanma - Retina Dejenerasyon Modeli

  1. Karanlık bir gecede hayvanları (12-15 saat) uyarlar. Hemen uzaktan iskemi klima veya sahte uzaktan iskemi (hayvan kısıtlama) yiyecek ve su ile Perspex konut yer hayvanları takip.
  2. 24 saat 9'da Perspex yuvasının altında bulunan floresan aydınlatma (1.000 lux) açın. Işığa maruz kalma sonrasında, 7 gün boyunca döngüsel aydınlatma loş hayvanların dönün.

7. Sonrası uzaktan İskemi İşlemleri

  1. Elektroretinogram (ERG) ile Vision değerlendirme:
    Not: ERG set-up ve flaş protokolü BRANDLI ve Stone 26 izledi.
    1. Koyu bir gecede hayvanları adapte (12-15 saat). AltındaBu ışıklandırma ketamin ve ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu (60 mg / kg ve 5 mg / kg, sırası ile) ile hayvanların anestezisi dim. Midriyatik (atropin sülfat% 1.0), kornea anestetik (Proxymetacaine% 0,5).
    2. Kornea hidrasyon uygulayın (Carbomer polimer) göz kornea hemen düşer. Kornea hidrasyon korumak için 20 dakika aralıklarla göz jeli uygulayın.
    3. Istikrarlı ERG kayıtları yardım etmek için göz küresi etrafında gevşek bağlanmış iplik çizin. Bir rektal prob kullanarak sıcaklığı izlemek ve 37-37,5 ° C 'de, hayvanın vücut ısısını korumak.
    4. Bir Ganzfeld entegre kürenin içinde başını yerleştirin.
      Not: Ganzfeld göze LED'ler üniforma katiyen yanıp sunan tam programlanabilir ışık uyarıcıdır.
    5. Hafifçe kornea dokunmadan ısmarlama 4 mm platin pozitif elektrot ve ağız içine yerleştirilen bir 2 mm çapında Ag / AgCl elektrot kullanılarak pelet elektroretinogram kaydedin. Paslanmaz çelik iğne her iki elektrotlar Referanskıç içine deri altından yerleştirilen.
    6. 2 kHz edinme oranı ile 0.3-1,000 Hz (-3 dB) bant geçiren ayarıyla Tutanak sinyalleri (AD Instruments). Istikrarlı bir ERG kayıt kayıtları başlamadan önce konuyu 10 dk karanlık adaptasyonu hayvan kurulduktan sonra.
    7. Daha önce BRANDLI ve Stone 26 tarafından açıklanan flaş protokolünü takip ediniz.
      1. Flaş süresini programlamak (biz yanıp söner süresi 1-2 msn kullanılır) ve -4.4 günlük scot cd.sm -2 2.0 onun yoğunluğunu ayarlayın. Retina fonksiyonu ölçmek için parlak yanıp söner (2.0 günlük scot cd.sm -2, 1 ms) kullanın. Bu çalışmada kontrol, ışık yaralanma ve RIP ile hafif yaralanma arasındaki karşılaştırma olduğunu.

8. TÜNEL tahlili

  1. Fenobarbital aşırı dozda (100 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile hayvanlar öldürülür. Gözleri enükleasyon ve% 4 paraformaldehid düzeltmek.
  2. Cyroprotecting önce PBS içinde gözleri yıkayıngözler, gece boyunca sükroz% 30 (a / h). Ekim bileşik gözleri göm ve bir kriyostat kullanılarak 20 mikron sagital kesitler halinde kesilmiş.
  3. Maslim ark protokolü takip DAPI boyama ile retina bölümlerde TÜNEL tahlil gerçekleştirin. 27
  4. Retina TÜNEL sayım için floresan mikroskobu kullanarak. TÜNEL hücreleri dış nükleer tabaka (onl) kaydedildi; fotoreseptör çekirdekleri içeren retinanın dış tabakası. Bu çalışmada, TÜNEL sayımı, her tedavi grubu için 5 gözlü, her bir göz için üç kopya halinde yapılmıştır.
  5. Karşılaştırmak istatistiksel gruba tek yönlü ANOVA kullanın kontrolü, hafif yaralanma ve hafif yaralanma + RIP sıçan anlamına geliyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

160 mmHg üzerinde yükselmiş bir kan basıncı manşet Şekil 1B açıkça görüldüğü gibi arka bacak kan akışını durdurur. doku oksijenasyonu eksikliği bir iskemi-reperfüzyon protokolü (Şekil 2) için hayvanın ayak sıcaklığını düşürerek bir sonuçlandı. Ayak sıcaklığı (33 ° C) manşet (32 ° C) sönük iken yükselen kaf basıncı yüksekliği (31 ° C) sırasında çekirdek sıcaklığından daha düşük ve güvenilir azaltılmış oldu. Tek bir 1000 lux ışık yaralanma veya uzak iskemik ön olmadan albino sıçanlar kaldırdı dim teslim edildi. Retina fonksiyonu kaydedilir ve elektroretinogram (ERG) kullanılarak değerlendirildi.

Aydınlatabiliriz sonra Şekil 3'te gösterildiği gibi, ERG ışık uyarımı retinanın iç ve dış nöronlardan kaynaklanan elektrik tepkilerin toplamıdır. ERG dalga fototransdüksiyon kaynaklanan bir erken negatif tepe sahiptir (en az yaklaşık 10 msnt flaş) yaklaşık ışık yanıp sonra 80 msn) b- dalga olarak adlandırılan bir dalga ve iç retina (maksimum gelen büyük bir pozitif zirve olarak adlandırılan. Normal bir loş karanlık adapte ERG sıçan parlak 2.0 günlük cd.sm -2 flaş (Şekil 3A) büyük bir fotoreseptör ve iç retina tepki gösterdi kaldırdı. ERG kayıtları fotoreseptör kaybı yansıtan kontrollere genlik göreli bir azalma şiddetli vardı hafif yaralanma sonrası Bir hafta; Şekil 3B bakın. Iskemi işemi ışığı yaralanmadan fotoreseptörleri korunan hemen önce, 2 x 5 dakikalık bir reperfüzyon protokolü kullanılarak, arka uzuv ön koşulları. RIP ERG amplitüdleri dalga (bkz Şekil 3C) hafif bir azalma ile, tek başına hafif yaralanma daha fazla idi. Retina dondurulan bölümlerinde terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL) deney RIP rel alıcı zarar görmüş hayvanlarda apoptotik hücrelerin bir azalma teyitiçin ative deneklerindekine tedavi ışık yaralanma hayvanlar (Şekil 4).

Şekil 1'de görüldüğü gibi arka bacak için iskemi indüksiyon, manşet doğru yerleştirme dayanır. "diz" altına yerleştirilmiş bir manşet hafif yaralanmalara karşı fotoreseptörleri korumak değil azaltılmış ERG amplitüdleri yansıtıldığı gibi, Şekil 3D bkz.

Sonuç olarak, uygulandığı zaman doğru arka bacak iskemisi ışık yaralanmalara karşı retina nöronlar korumak başardı.

Şekil 1
Şekil 1:. Manşet yerleştirme ve 160 mmHg üzerinde kaf basıncının etkisi (A) kaf basıncı yüksekliği önce arka uzuv ve ayak gösterir. (B) 160 mmHg üzerinde kaf basıncının yükselmesi sırasında ayağı gösterir. "K yukarıdaki manşet konumuna dikkat edin "nee. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2:. Iskemi sırasında cilt sıcaklığı azalır 160 mmHg 2 x 5 dakika arka bacak üzerinde manşet Ayak sıcaklığı manşet enflasyon sırasında azalır Enflasyon. (A), 2 x 5 dakika RIP ayak sıcaklık değişimleri grup ortalama gösterir. (B) 2 x 5 dk iskemi için izlemeyi (° C) bir temsilci ayak sıcaklığını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

00 "/>
Şekil 3:. 24 saat zararların retina fotoreseptör için parlak ışığa RIP ışık hasar sıçanlara kıyasla ERG gösterildiği gibi retina fonksiyonunu koruyan Poz. ERG ışık uyarısına bir elektrik yanıt (mikrovolt [mV]) olarak, iç ve dış retina sağlığı ölçer. 2.0 log cd.sm normal retinal cevap -2 (A) görülen ışık uyarımı. Küçük genlikli ERG (B) parlak ışık sonuçlarından fotoreseptör hasarı. RIP ışık hasarı (C) Aşağıdaki fotoreseptörleri kurtarmak başardı. Yaralanma (D) fotoreseptör korumak değil RIP sırasında yanlış manşet yerleştirme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

4highres.jpg "width =" 600 "/>
Şekil 4: TÜNEL + hücre sayımı. Hafif yaralanma, yaralanma + RIP grup sonucunu karşılaştıran bir çubuk grafik retina (8.000 mm) tüm açıklığı boyunca sayıldı RIP. TÜNEL + hücre ile apoptoz azalma göstermektedir. Üst panel: TUNEL + hücrelerinin grup ortalama RIP tedavi sıçanlar için düşük bulunmuştur (210 ± 4.9, n = 5), tek başına hafif yaralanma ile karşılaştırıldığında (255 ± 10, n = 5), p <0.01, tek yönlü ANOVA. Hasarsız retina (ışık yok yaralanma) çok düşük kaldı (3.0 ± 1.4, n = 5) apoptotik hücreler. Üstün ışık yaralı retinanın (A) Temsilcisi görüntü. (B) üstün RIP ışığı yaralı retinanın Temsilcisi görüntü. (C) alt ışık yaralı retinanın Temsilcisi görüntü. (D) alt RIP ışığı yaralı retinanın Temsilcisi görüntü. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızrakam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kemirgen arka bacak iskemisi başarılı bir şekilde manuel tansiyon aleti ile uyarılan ve retina fotoreseptör için nöro teslim manşet oldu. Işık yaralanma 9,28 den fotoreseptör iskemik klima kaynaklı koruma ile tutarlı bir bulgu.

Esas olarak, uzaktan iskemi dokulara kısa bir oksijen deprivasyonuna neden olur. Bu nedenle, uzak iskemik önkoşullamanın iskemik klima veya alternatif olarak adlandırılan iskemik hoşgörü, hipoksik önkoşullama ve bir dereceye kadar, anaerobik egzersiz için pek çok benzerlikleri vardır. Hücreler ya doğrudan nöro teklif veya takip eden metabolik stres 13 hoşgörülü olmaya hücrelerini etkileyen proteinleri, nükleozid ve transkripsiyon faktörlerinin büyük bir çeşitlilik bırakarak iskemik meydan cevap.

Literatürde, uzaktan iskemi protokolleri süreleri ve frekans aralığını dahil ettik. Bizim laboratuvar, 10, 5 test ettive normal retina fonksiyonunun 26 2 x 5 dk iskemi protokolleri. Bu protokollerin 2 x 5 dakika, normal sıçanlarda büyük ERG genlik değişimi üretilen ve hafif yaralanma modelinde test etmek için seçildi. Kısa ve tekrarlanan 5 dk iskemik olaylar da insanlarda vuruşlarını tekrarlanan önleyici olmak ve domuzlarda 17,22 deneysel inme infarkt boyutunu azaltmak için gösterilmiştir. Bununla birlikte, iskemik ön koşullandırma en uygun süresi, kullanılan hayvan modeline bağlı olması muhtemeldir. Örneğin, fokal iskemiye karşı enfarkt boyutunda bir azalma, en fazla 2 x 15 dakika karıştırıldı ve 3 x 15 dak protokolleri gözlenen değil, 5 x 3 dakika protokolleri sıçanlarda 15 olmuştur.

IP ve iskemik hasar arasındaki süre, aynı zamanda etkili bir nöro için dikkate alınması gerekir. İki kez pencereler IP tarafından uyarılan Kardiyoproteksiyondaki için sınıflandırılmıştır. Bunlar IP ve sonra 0-12 saat oluşuyor "klasik klima" penceresi vardırIP 29 sonra 3-4 gün meydana "ikinci pencere". Fokal inme modelinde, RIP, klasik ve ikinci pencereler 15 dışında olanlar da dahil olmak üzere, çoklu zaman noktalarında, koruyucu olduğu bulunmuştur. Ancak, RIP ve IP nöro zaman dönemlerini karşılaştırıldığında az sayıda çalışma vardır.

Uzaktan iskemi koruması için bir başka husus da yaralanma (ön koşullandırma) önce uygulanan ya da yaralanma (postconditioning) sonra olup olmadığını da dahil olmak üzere, klima zamanlaması olduğunu. Uzak iskemi test çoğunluğu çalışmaları son iki retinal ve serebral nöronların 30,31 koruyucu olduğu tespit edilmiş olan postconditioning rağmen önkoşullanma kullanmıştır.

Özetle, arka bacak iskemik şartlandırma nöro uyarılması hastalık modeli, hayvan türlerinin, iskemi süresi ve iskemi zamanlamasına özgüdür. Kaniora ark tarafından yapılan bir yorum. pUzak türler de dahil olmak üzere iskemi protokolleri, RIP protokolleri, RIP siteleri, yaralanma modelleri, yaralanma sonuçları ve önerilen koruma mekanizmaları 32 çeşitliliği hakkında daha fazla ayrıntı rovides.

arka bacak üzerinde minimal invaziv manşet hem uyanık olarak RIP için izin verir ve hayvanlar vücut ısısı korunur sağladı. Anestezi deney, hayvanın vücut sıcaklığı hipotermi önlemek için muhafaza edilmelidir. İç sıcaklık izleme hipotermiye geçiren hayvan önleyecektir. Hipotermi ve hipertermi inme modelleri ve hafif yaralanma 33-36 hem iyi bilinen ön şartlandırma uyaranlara vardır. Sunulmuştur jove yöntemi, böylece vücut ısısı boşa önlenmesi uyanık hayvanlarda gerçekleştirilebilir.

Anestezikler RIP deney karıştırıcıların farklı bir dizi tanıtmak olabilir. İzofluran ATP'ye duyarlı potasyum ch açılması ile miyokard koruması katılabilirannels iskemik klima 37'de açıklanan benzer koruyucu bir mekanizması. Inme modellerinde infarkt büyüklüğü izofluran verilen sahte tedavi edilen hayvanlarda büyük olmasına rağmen, moleküler mekanizma altında yatan uzak iskemik klima anestezik etkisi ile maskelenmiş olabilir. Ketamin, bir NMDA antagonisti, mTOR yolu aktive ve serum 39-41 içine BDNF bırakın nöron eksitotoksisiteyi önlemek için potansiyel dahil vivo 38 koruyucu etkileri çok sayıda vardır. Ketamin insanlarda beyin travması, aşağıdaki nöronal hayatta kalmayı arttırmak ve kemirgen fotoreseptörlerin 42,43 ışık hasarı azaltmak için rapor edilmiştir. Uyanık kan basıncı cuffing uzaktan iskemik klima mekanizması soruşturmalar anestezik boşa önlemek olacaktır.

Etkili arka bacak iskemisi manşet doğru yerleştirme dayanır, manşet basıncı ve systo üstünde kaf basıncı yüksekliği tutarlılığıAzaltılmış Elektroretinogram (ERG) genlikleri yansıtıldığı gibi Şekil 1'de görüldüğü gibi lic tansiyon. "diz" altına yerleştirilmiş bir manşet hafif yaralanmalara karşı fotoreseptörleri korumaz. manşet konumuna dayalı klima farkı nedeniyle femoral arter kas kitlesi ve yakınlık farklılıklar muhtemeldir. Buna ek olarak, hayvan yaşı, ağırlığı, vücut sıcaklığının ve cinsiyet için standardize edilmelidir.

Özetle, uzaktan iskemi kas hasarı önler ve uyanık veya anestezi deneyler için esnekliğe sahiptir non-invaziv kan basıncı manşet, tarafından uyarılan edilebilir. Uzaktan iskemik önkoşullama yükselen bir nöro-koruyucu stratejidir ve bu protokol onun mekanizmalar ve uygulamalar içine daha fazla çalışmaları sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer Welch Allyn DS56 Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack Welch Allyn 5082-102-1 Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor Welch Allyn 5082-178 Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod AD Instruments ML 309 skin tempertature unit
Skin temperture probe AD Instruments MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Towel optional: awake remote ischemia
Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) Abbot Animal Health 05260-05 optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4, (1), 40-50 (2013).
  2. Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32, (5), 851-859 (2012).
  3. Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35, (6), 1264-1273 (2002).
  4. Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74, (5), 1124-1136 (1986).
  5. Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29, (9), 1937-1950 (1998).
  6. Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39, (5), 777-785 (1998).
  7. Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35, (3), 616-621 (2004).
  8. Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30, (9), 1851-1854 (1999).
  9. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  10. Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890, (1), 118-129 (2001).
  11. Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70, (2), 212-221 (2006).
  12. Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (10), 4666-4670 (1995).
  13. Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26, (5), 248-254 (2003).
  14. Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33, (5), 514-519 (2011).
  15. Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151, (4), 1099-1103 (2008).
  16. Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
  17. Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123, (7), 714-721 (2011).
  18. Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109, (7), 2398-2404 (2002).
  19. Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106, (23), 2881-2883 (2002).
  20. Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5, (2), 211-230 (1965).
  21. Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94, (10), L78-L80 (2008).
  22. Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79, (18), 1853-1861 (2012).
  23. Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42, (10), 921-929 (2009).
  24. Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A, (6), 865-868 (1986).
  25. Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200, (1), 69-79 (2002).
  26. Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55, (4), (2014).
  27. Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38, (9), 1667-1677 (1997).
  28. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  29. Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16, (3-4), 251-254 (2011).
  30. Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42, (2), 439-444 (2011).
  31. Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50, (1), 63-74 (2006).
  32. Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84, (4), 445-458 (2007).
  33. Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29, (10), 2171-2180 (1998).
  34. Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347, (8999), 422-425 (1996).
  35. Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241, (4874), 1817-1820 (1988).
  36. Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24, (7), 730-735 (2002).
  37. Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283, (1), H61-H68 (2002).
  38. Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
  39. Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18, (4), 479-483 (1993).
  40. Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11, (10), 666 (2010).
  41. Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32, (1), 140-144 (2008).
  42. Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 5, (10), 747-757 (2004).
  43. Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats