마이크로 컴퓨터 단층 촬영과 누드 마우스에 인간의 지방 주입의 생존 능력의 평가

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Atashroo, D. A., Paik, K. J., Chung, M. T., McArdle, A., Senarath-Yapa, K., Zielins, E. R., Tevlin, R., Duldulao, C. R., Walmsley, G. G., Wearda, T., Marecic, O., Longaker, M. T., Wan, D. C. Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography. J. Vis. Exp. (95), e52217, doi:10.3791/52217 (2015).

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Abstract

Lipotransfer는 몸 전체의 연부 조직 결손의 치료를 위해 외과 의사의 필수품 전반에 중요한 도구입니다. 지방은, 쉽게 사용할으로 쉽게 구할 수있는 저렴하고, 본질적으로 생체 적합성 그대로 이상적인 부드러운 조직 필러입니다. (1) 그러나, 그 싹 트는 인기에도 불구하고, 지방 이식술을 10에서 어디까지 공개 유지율과, 예측할 수없는 결과가 변수 이식 생존에 의해 방해된다 -80 %. 1-3

지방에 조사 래프팅을 촉진하기 위하여, 우리는 따라서 주입 된 지방 부피 보존 실시간 분석을 허용 동물 모델을 개발 하였다. 간단히, 작은 상처가 CD-1 누드 마우스의 두피에서 만든 가공 리포 애스 퍼 레이트의 200 ~ 400 μL은 두개골 위에 배치됩니다. 두피 때문에 에이즈 두 개관에서 제공하는 훌륭한 배경의 대비로 인해 고유의 피하 지방의 부재로받는 사이트로 선정하고,분석 과정. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT)는베이스 라인에서 이식 2 주에 한 번씩 스캔하는 데 사용됩니다. CT 이미지는 재구성 및 이미징 소프트웨어는 그래프트 양을 정량화하는 데 사용된다.

전통적으로, 생체 외 기술은 실제 측정에 의해 그래프트 중량과 체적의 단지 하나의 평가를 제공하기 위해 연구 동물을 안락사 필요로 한 지방 그래프트 량을 평가. 생화학 적 및 조직 학적 비교는 마찬가지로 안락사 할 수있는 연구의 동물이 필요했다. 설명이 영상 법은 연구 동물을 희생하지 않고도 시각화 객관적 초기 그 래프팅 후에 여러 시점에서 볼륨을 정량화 이점을 제공한다. 이식 기술은 더 큰 위험과 지방 피부 괴사로 주입 될 수 이식편의 크기에 의해 제한된다. 이 방법은 지방 이식 가능성 및 볼륨 유지를 평가하는 모든 연구를위한 유틸리티를 가지고있다. 그것은 특히 providi에 적합하다지방 이식의 시각적 표현 겨와 시간에 따른 볼륨의 변화를 다음과 같습니다.

Protocol

참고 : 실험 프로토콜과 지방 얻기위한 환자 동의서를 검토하고 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회 (프로토콜 # 2188)에 의해 승인되었다. 모든 동물의 절차는 프로토콜 # 9999에서 실험 동물 관리 (APLAC)의 스탠포드 행정 패널에 의해 승인되었다. 모든 실험은 동물의 안전과 인도적인 치료 가이드 라인을 엄격하게 준수하여 실시 하였다.

1. 지방 수확

  1. 콜맨 절차 17-19을 사용하여, 선택 과목 지방 흡입 수술을받은 건강한 여성 환자의 복부, 옆구리, 및 / 또는 허벅지의 영역에서 인간 지방 조직을 구하십시오.
  2. 이식에 대한 리포 애스 퍼 레이트를 처리하기 위해, 지방은 30 분 동안 정착 할 수 있도록하여 시작합니다.
  3. 리포 애스 퍼 레이트는 일반적으로 아래에서 위쪽에 오일, 중간에 지방, 혈액으로, 세 개의 층으로 정착. 대기음 오일은 상부 층 및 하부 층을 피 버린다.
  4. 더 남아 tumesc를 제거하려면엔트 유체 또는 세포 파편은 350 XG에 5 분, 4 ° C의 지방을 원심 분리하고, 바닥 수성 층을 대기음.
  5. 20 %의 전달을 허용 오차, 그라프 필요한 지방의 양을 계산하고, 50ml의 원뿔형 (들)에 지방의 전송을 원하는 볼륨. 그라프 필요한 지방 마이크로 리터를 수득 연구에서 쥐의 숫자로 400을 곱한다.
  6. 이 시점에서, 수행하는 세포가 Lipotransfer (20, 21)를 보조하는 경우, 얼음에 접목 지방을 대신 볼륨. 이어서 Zuk (22)에 의해 설명 된 표준 기술을 사용하여 잔여 지방에서 지방 - 유래 기질 세포 (ASC를)를 수확.

2. 지방 이식술

  1. 여성, 실험 연구를위한 동형 접합 CD-1 누드 마우스를 가져옵니다. 나이 8-12주 사이에 마우스를 선택합니다.
  2. 약 10 분 동안 2 L / 분으로 2.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물로 최저 상자에 마취, 도시를 유도하도록 마우스. 그 추천 isof 유의하시기 바랍니다lurane 용량은 마우스의 변형에 따라 달라집니다.
  3. 마우스의 호흡 속도가 둔화되면, 발가락 핀치와 적절한 진정 작용을 확인합니다. 마우스의 두 눈에 동물 윤활 안과 연고를 적용합니다.
  4. 마우스가 발가락 핀치에 대한 응답으로 움찔​​하지 않는 경우,이 마취의 충분한 비행기를 확인합니다. / 분 1-2 L에서 2.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물을 제공하는 노즈콘에 마우스의 코를 놓습니다. 마우스가 발가락 핀치에서 후퇴하는 경우, 5 분 후 최저 상자와 재시험로 돌아갑니다.
  5. 70 % 에탄올 용액 다음에 2.5 % 포비돈 - 요오드와 두피를 소독 한 후 마우스의 무균 영역을 설정합니다. 두 번 더 반복합니다.
  6. 마우스 위에 대한 수술 드레이프를 놓고 멸균 필드를 유지 보수하는 데주의해야합니다. 무균 악기, 장갑 및 PPE는 항상 사용되어야한다.
  7. 지방 볼륨이 이전에 얼음에 배치 된 이식 할 경우, 먼저 배달하기 전에 실온으로 조정하는 지방 수 있습니다.
  8. 1 mL를 1 ml의 루어 로크 시린지를 Backload의 지방.
  9. 주사기의 끝으로 14 G, 8cm 긴 지방 이식 정맥을 연결합니다.
  10. 지방의 200 사이의 400 μL까지 주사기 플런저를 누름으로써 국무 시스템은 주사기에 남아 있습니다. 주사기 플런저를 누르면서 캐 뉼러가 완전히 말초 정맥 구멍을 빠져 나가는 지방을 관찰하여 지방으로 가득 것을 확인합니다.
  11. 미세 집게를 사용하여 두개골의 꼬리 - 대부분의 측면을 덮는 중간 선에서 등쪽 피부를 들어 올립니다. 미세 가위를 사용하여 피부를 잘라 1.5 mm를 확인합니다.
  12. 나중에 이식이 수행 된 후 상처의 가장자리는 함께 가지고하는 데 사용되는 컷의 중간을 통해 하나의 6-0 나일론 봉합사를 놓습니다. 봉합사를 묶어하지 마십시오.
  13. 피부 절개를 통해 정맥을 삽입하고 상부의 피부에 대한 모든 결합 조직의 첨부 파일을 무료로 두개골을 통해 팬 모양의 패턴으로 앞뒤로 캐 뉼러를 전달하여 두개골을 통해 피하 주머니를 만듭니다.
  14. 포켓이 생성되면, (C)를 위치직접 팁까지 두개골 위에 마우스의 중간 선에서 annula는 눈 사이에 그려진 라인 뒤에 있어야 포켓의 주동이의 가장 측면에 자리 잡고 있습니다. (도 1a)
  15. 천천히 다시 캐 뉼러를 잡아 당기면서 플런저를 전진, 역행 방식으로 지방을 주입. 집게를 사용하여, 함께 상처 가장자리를 가져오고 주머니에서 누출 어떤 지방을 유지하도록 올립니다.
  16. 이전에 첫 번째 매듭이 피부에 가볍게있는 것을 확인하고, 배치 된 봉합사를 묶어. 3 개의 광장 매듭을 묶어 3mm 꼬리 봉합사를 잘라. (그림 1B)
  17. 시각화 및 포켓 수량이 초과되지 않고 주머니를 덮는 피부가 긴장하지 않다 매뉴얼 촉진으로 확인합니다. 포켓 수량이 초과 된 경우에는 봉합을 잘라 주머니 내에서 모든 지방을 제거합니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.4 주머니를 씻어 내고 지방의 작은 볼륨을 다시 주입.
  18. 에서 마우스를 제거그 자체로 깨끗한 케이지의 후면 또는 측면에 nesthesia과 장소. 규칙적인 호흡, 정상 운동, 출혈의 부재, 그리고 통증이나 고통의 징후 동물을 모니터링합니다. 동물이 고통에있는 경우 최대 48 시간 동안 프레 노르 핀 0.1 ㎎ / ㎏ 피하 매 6 시간을 관리 할 수​​ 있습니다.
  19. 동물이 무인 떠나기 전에 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분히 깨어 있는지 확인하십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에 동물을 올려 놓지 마십시오.
  20. 4 시간 후, 동물이 먹고, 이동 음료, 정상적으로 호흡 할 수 있는지 확인하지 않고 수술 부위에서 출혈이 더 있다는 것을. 동물 보호 시설로 돌려줍니다.

3. 마이크로 CT

  1. 스캔 수술 후 3 일째되는 날 기준 볼륨 마우스 및 수술 후 2 주, 4, 6, 8에서 검사를 반복한다.
  2. 각 시점에서 마우스를 이미징하는 경우, S에서 앞서 설명한 바와 같이 전후 절차 진정 및 동물 관리 지침을 따르2.2-2.4 및 2.17-2.19를 TEPS.
  3. 100 ㎛ 이상의 재구성 복셀 크기의 마이크로 CT 스캐너에 스캔을 수행합니다.
  4. 80 KVP의 피크 X 선 kilovoltage 450 μA의 양극 전류로, 각 마우스에 9 분 스캔 중에 약 5 centiGy의 배급 복용량을 관리 할 수​​ 있습니다. 이 값은 스캔 프로토콜에 따라 달라질 유의하시기 바랍니다.
  5. 첫 번째 스캔을 수행하기 전에, 공기, 물, 및 뼈 강도 구별 촬상 팬텀 마이크로 CT를 교정.
  6. 두 상단에 마우스 및 바닥에 두와 복부 위치에 스캐너로 네 마우스를 놓습니다. 주사 베드 용이 마우스 본체 노즈 콘과 같은 10 ㎖ 주사기를 보유하는 60 ㎖를 주사기를 사용하여 구성 될 수있다. (23)
  7. 분당 1-2 L에서 2.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물로 마취 쥐를 유지한다.
  8. 스카우트 이미지와 함께 확인 첫 번째 경추에 코에서, 그리고 두개골의 상단에서 SKU의베이스에 마우스의 전체 두개골,LL, 이미지를 만들 것입니다.

4. 마이크로 CT 분석

  1. 화소 강도에 대한 임계 값을 사용하여 복셀을 선택하여 관심 영역의 생성을 허용하는 마이크로 CT 영상 분석 소프트웨어 (ROI 'S)로 재구성 된 이미지를 연다. 소프트웨어는 또한 3D 생성이 선택된 복셀의 보간 표면 및 볼륨 분석 할 수 있습니다.
  2. 2 차원 코로나, 축, 및 시상 뷰에서 재구성 된 CT 이미지를로드하여 시작한다. (도 2a)
  3. 가이드로 축 슬라이스를 사용하여 지방 이식의 가장 왼쪽 측면에 해당하는 시상 슬라이스로 이동합니다. 지방 이식에 대응하는 모든 복셀을 캡처 픽셀 강도에 대한 상위 및 하위 임계 값을 선택,하지만 그 주변 조직과 뼈를 제외합니다. (그림 2B)
  4. 이전에 정의 된 화소 강도 임계치를 이용하여 지방 그래프트에 대응 시상 관점에서 ROI를 정의한다. R이식의 가장 오른쪽 측면에 도달 할 때까지 탐색이 절차마다 다섯 번째 시상 슬라이스를 EPEAT. (그림 2C)
  5. 하나의 결합 된 3D ROI에 모든 2D ROI의에서 선택된 복셀 보간. (그림 2D)
  6. 소프트웨어에 의해 계산 된 기록 ROI 볼륨.
  7. 최종 그래프트 지방 부피를 시각화 된 3D 렌더링있는 isosurface. (그림 2E)
  8. 후속의 분석에서, 화소 강도 최대 및 최소 임계 값 기준 분석에 사용 된 것과 동일하게 유지해야.

5. 지방 수확

  1. 생쥐 8 주 시점 (24, 25)을 검사 한 후에, 이전 단계에서 2.2-2.4 2.17-2.19 및 전술 한 바와 같이 쥐를 마취.
  2. APLAC 지침에 따라, 자신의 척추 열을 분리하여 쥐를 안락사.
  3. 수술 필드에 마우스를 놓습니다. 건 절단술 가위를 사용하여 조심스럽게 주머니를 열고 t을 해부그는 지방 이식에서 피부와 결합 조직의 첨부 파일을 덮는.
  4. 이 시점부터, 그래프트의 추출을 돕기 위해 상부 등쪽 피부 패치를 절제하는 데 도움이 될 수있다. (그림 3A)
  5. 살짝 집게로 이식에 견인을 유지하고 가위로 출시 할 필요가 긴장의 연속 포인트를 시각화하기 위해 좌우로 이식을 켭니다.
  6. 그라프로 촬영 한 결합 조직을 최소화하기 위해 절개 할 때 가능한 이식에 가깝게있어. (그림 3B)
  7. 이식을 절개 한 후, 적어도 0.01 그램 정확한 칭량 규모에 질량을 측정한다.
  8. 질량 측정 값을 이용하여 지방 그래프트의 부피 및 전환율 인간 지방의 평균 밀도 (0.9 g / ㎖)를 계산.
  9. 마이크로 CT를 사용하여 얻은 것과 지방 이식의 계산 된 볼륨을 비교.
  10. 필요한 경우 지방 이식 조직 또는 조직 학적 분석을 위해 추가로 처리 될 수있다.

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Representative Results

지방 이식은 점진적으로 8 주 스캔이 완료되면 주 (8) (그림 4A)로 62.2 %의 평균 생존율 (24)의 결과, 연구의 과정을 통해 볼륨 감소, 각 지방 이식은 하나의 조각으로 추출 하였다. Wilcoxan 순위 합 시험 중 마이크로 CT에 의해 얻어진 또는 물리적 질량으로부터 산출 이식 지방의 체적 측정의 차이를 비교하기 위해 사용 하였다. 유의 한 차이는 이러한 두 가지 방법 (양면 페이지 - 값 = 0.9362) 사이에서 발견되지 않았다. (그림 4B)

스캔 당 5 centiGy 다섯 스캔 시점으로, 각 마우스는 연구의 과정을 통해 25 centiGy 총보다는 더 이상 수신되지. 이과 일치, 마우스 중 어느 것도 피부 방사선 화상의 총 증거가 표시되지 않습니다.

그림 1
도 1 (A) (B) 완료 지방 이식시 누드 마우스, 하나의 나일론 봉합사와 상처를 가지고하는 데 사용 함께 가장자리. 주머니 가득하지만 긴장하지되었습니다.

그림 2
재구성 된 이미지 초기 축, 관상, 시상보기에 표시 그림 2. (A). (B) 시상보기에 이식의 가장 왼쪽 측면으로 이동하는 가이드로 축보기를 사용. 모든 복셀 따라서, 지방 조직을 나타내는 지방 그래프트 볼륨의 경계에 대한 허용 임계 값 범위 내에서 선택되도록 (C). 화소 강도에 대한 임계치를 설정 ROI의 그래프트의 가장 왼쪽 측면에서 시작 시상 뷰 정의 계속 이제까지그래프트의 타 단부로 이동 Y 다섯째 슬라이스. (D) 2D ROI의 단일 3D ROI로 보간에서 선택된 모든 복셀. (E)은 삼차원 표면 전체 지방 그래프트 볼륨을 시각화하는 큐빅 스플라인 보간을 사용하여 생성 된 .

그림 3
제거 피부 등의 패치를 적출하기 전에 그림 3. (A) 지방 이식,. (B) 적출 후 지방 이식.

그림 4
그림 4. (A) 마이크로 CT 부피 분석 8 주에 걸쳐 지방 이식 볼륨의 점진적 감소를 보여 주었다. 마이크로 CT로 측정 (B)가 최종 지방 이식 볼륨, 외식 지방 이식의 질량을 계산 볼륨에 밀접하게 대응의. 인간 지방 (0.9 g / ㎖)의 평균 밀도는 전환율을 사용 하였다.

표 1
실제 측정 된 지방의 양 (24) 대 표 1. 계산 된 마이크로 CT 볼륨

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Discussion

이 시점까지는 대부분의 연구는 지방 이식의 장기 생존을 정량화하는 비 영상 방식에 의존하지만, 이러한 방법은 연구 동물의 희생을 필요로하고 단 하나의 측정을 얻을 수있다. 3,10-12 우리의 연구가 나타내는 마우스 모델에서 지방 이식편 생존의 대물 실시간 정량을 허용 개선 분석 방법.

이 과정에서 중요한이 그대로 면역 체계가 마우스를 사용하는 경우 발생할 수있는 이식 거부를 방지로 충분히 면역 마우스, 연구에 사용되는 것을 보장한다. 지방 무결성을 보존하는 것은 이식의 수확, 처리 및 배치 단계에서 중요하다. 전통적으로 허용 기준에 따라, 그 래프팅을위한 지방 흡입은 지방 흡입술 (SAL)에 의해 수득한다. 배치하는 동안 지방이 더 빨리 0.5 ㎖ / 초보다 안정된 유량으로 주입해야한다. 게이지 (14)는 캐 뉼러 I 그래프트 바람직하다NA 마우스, 그러나 더 큰 직경의 캐뉼라는 지방에 부상없이 사용될 수있다. 그들은 증가로 인해 전단 응력에 고장 지방의 원인이 될 수 작은 캐 뉼러 및 바늘은 특히 사람들은보다 좁은 1​​6 게이지 아르 배치하는 동안 낙담. 우리는, 상기 침강, 원심 분리 및 / 또는 여과의 임의의 조합을 처리하기위한 우리의 바람직한 기술을 설명했지만만큼 오일과 혈액 층 적절 종래 래프팅에 지방으로부터 분리되어 사용될 수있다.

지방 이식으로 인해 지방 이식의 일관성 특성 결과의 분산을 최소화하기 위해 크기가 최소 200 ㎕를해야합니다. 400 μL 크기까지 확대 이식편 사용될 수 있지만,이 볼륨 위에, 손상된 혈관 공급 과도한 장력은 피부 지방 및 피부 괴사 될 수있다. 궁극적으로, 최대 지방 그래프트 크기는 표면적 및 포켓의 체적에 의해 결정된다. , 포를 안전하게 전달 될 수 이식의 볼륨을 높이려면cket는 더 광범위한 절개로 확장 할 수 있습니다. 그러나, 이는 그라프 덜 명확한 주변 조직 사이의 콘트라스트를 만들 것이다 두개골의 위쪽의 경계를 넘어 지방 배치 할 수있다. 따라서, 후속 복셀 선택은 더 어려워 질 것이다.

초기 피부 절개가 충분히 작 으면, 봉합사 지방 함유 남아 주머니 누출 보지되는 한 필요하지 않을 수있다. 봉합이 배치되어있는 경우,주의, 그렇지 않으면 피부 고장이 발생할 수 있습니다, 너무 꽉 첫 매듭을 묶어하지 않도록주의해야합니다. 이 염증 반응을 제한하고, 감염 잠복하기 어려운 등의 나일론과 같은 비 흡수성 봉합사 모노 필라멘트가 바람직하다. 절개의 재 상피화가 24 시간 내지 48 수술후 내에서 발생되며, 봉합이 시점에서 제거 될 수있다. 흡수성과 꼰 봉합은 사용할 수 없습니다. 피부는 항상 필요한 최소한의 힘으로 처리해야하며, 의사는 피부를 분쇄하지 않도록주의해야상처 가장자리를 들고있다.

연구자 '영상 분석 소프트웨어에 따라, 픽셀 강도 및 조직의 밀도 사이의 정확한 관계는 다를 수 있습니다. 조사자 가장 정확하게 주변 조직으로부터 지방 그래프트 구별 최대 및 최소 범위를 획득하기 위해 픽셀 강도 임계치를 선택한다. 전체 볼륨의 일관성을 유지하기 위해 분석하는 동안 동일한 최대 및 최소 임계 값이 사용되어야한다.

화소 강도 임계 값을 설정 한 후 그래프트 볼륨을 선택하기 위해 여러 방법이있다. 우리는 우리의 손에 가장 시상보기에서 브러시 도구를 사용하여 그림을 찾을 수 있지만, 다른 복셀 선택 방법은 투자 수익 (ROI)이 축보기에서 스플라인 도구 나 그림 그리기 등 사용할 수 있습니다 만들 수 있습니다. 한 사람이 모든 볼륨이 측정 오차를 감소시키기 위해 가능한 한 일관되게 해석 수행하면 바람직하다.

비이 방법과 이식 진화의 실시간 시각화의 침략 본성은 기존의 기술에 비해 많은 이점을 제공한다. 그러나,이 기술은 잔여 이식편 생존 및 건강을 식별 할 수있는 능력이 제한된다. 또한, 이식 혈관 재 형성을 보여 상대적인 수 없다. 모양과 이식 밀도의 변화는 지방 괴사, 감염, 낭종 형성, 또는 액화 암시 수 있지만, 그것은 혼자 마이크로 CT에서 정확한 결론을 도출하기는 어렵다.

우리는이 기술이 향후 연구가 더 나은 지방 이식의 생존과 손실의 원인이되는 요인을 이해하기 위해 실시 될 수있는 기반이 될 것입니다 바랍니다. 이 테마의 변형 세포, 성장 인자, 사이토 카인 유전자가 줄기 역할을 규명 할 수 있고, 세포 표면 마커는 지방 그래프트 볼륨 보전 궁극적에서 재생. 가설을 대조 시험이 개선 된 도구로, 우리는 변압기의 지방 이전에 대한 이해를 기대합니다보다 예측 하나에 연부 조직의 결손을 치료하는 변덕 기술을 실효.

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Acknowledgments

본 연구는 ACS 프랭클린 H. 마틴 교수 연구 활동, Hagey에 의해 지원되었다 오크 재단, 소아 재생 의학 Hagey 연구소와 MTLDCW에 국민 건강, 보조금 NIHR21DE019274, NIHR01DE019434, NIHR01DE021683 연구소 및 NIHU01HL099776에 의해 지원되었다 소아 재생 의학 및 스탠포드 대학 아동 건강 연구소 학부 학술 상 실험실. 마이크로 CT는 생체 이미징 혁신 스탠포드 센터에서 실시했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SAL lipoaspirate
Centrifuge Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA
50 ml conical tubes BD Biosciences, San Jose, CA
CD-1 nude mice (Crl:CD1-Foxn1nu) Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA
Isoflurane Henry Schein, Dublin, OH
2.5% Betadine Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT
70% Ethanol solution  Gold Shield, Hayward, CA
1cc luer-lock syringe BD Biosciences, San Jose, CA
14 gauge cannula Shippert Medical, Centennial, CO
Forceps Fine Science Tools, Heidelberg, Germany
Tenotomy scissors Fine Science Tools, Heidelberg, Germany
6-0 nylon suture Ethicon, Blue Ash, OH
Phosphate buffered saline Gibco, Carlsbad, CA
micro-CT scanner  Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Phantom  TriFoil Imaging, Northridge, CA
Imaging analysis software IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Scale  Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH

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References

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