A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

A junção neuromuscular (JNM) é o grande, sinapse relé colinérgicos através do qual os neurônios motores mamíferos controlar a contração muscular voluntária. As mudanças estruturais na JNM pode resultar em falha da neurotransmissão, resultando em fraqueza, atrofia e até mesmo a morte da fibra muscular. Muitos estudos têm investigado como modificações genéticas ou doença pode alterar a estrutura do JNM rato. Infelizmente, pode ser difícil comparar os resultados directamente a partir destes estudos, uma vez que eles frequentemente utilizados diferentes parâmetros e métodos analíticos. Três protocolos estão descritos aqui. O primeiro utiliza projecção de intensidade máxima imagens confocais para medir a área de receptor de acetilcolina (AChR) da membrana pós-sinápticos domínios ricos em na placa terminal e a área de coloração das vesículas sinápticas no terminal do nervo pré-sináptico sobrejacente. O segundo protocolo compara as intensidades relativas de imunocoloração para proteínas sinápticas na membrana pós-sináptica. O terceiro protocol usa Transferência de Fluorescência de Ressonância Energia (FRET) para detectar alterações na embalagem de AChRs pós-sinápticos na placa motora. Os protocolos foram desenvolvidos e aperfeiçoados ao longo de uma série de estudos. Fatores que influenciam a qualidade e consistência dos resultados são discutidos e dados normativos são fornecidos para NMJs em ratos adultos jovens e saudáveis.

Introduction

A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse relé crítico que medeia a comunicação entre o sistema nervoso e no músculo esquelético. Ela é necessária para todo o movimento voluntário. A microscopia de fluorescência tem sido utilizada para estudar os efeitos de transgenes no rato JNM 1-3 ou para comparar os efeitos da idade, dieta, exercício e doença agravada por NMJs roedor 4-11. Tais estudos têm nos ensinado muito sobre a fisiologia e fisiopatologia da JNM, mas os diversos parâmetros relatados (por exemplo, a área AChR, área de placa motora, comprimento perímetro, os índices de fragmentação), muitas vezes tornam difícil comparar os resultados desses estudos. Existe a expectativa de aumentar para os investigadores pré-clínicos para ser capaz de demonstrar a reprodutibilidade, particularmente em estudos com modelos de roedores de doença 12. Os protocolos descritos aqui foram refinados através de uma série de estudos que investigaram ch desenvolvimento, fisiológico e fisiopatológicoanges ao JNM. Tais estudos exigem medição da área de especializações sinápticas na placa motora do mouse, a densidade relativa de embalagem de proteínas sinápticas dentro especializações pós-sinápticos 13-15.

A utilidade destes métodos é ilustrada por estudos recentes em um modelo de rato anti-almíscares miastenia gravis. Injeções diárias de IgG de miastenia anti-Musk-positivo gravis pacientes em camundongos adultos fez com que eles se tornam fracos dentro de 2 semanas 16. Imagens de projecção máxima das secções confocais musculares que foram duplamente marcadas para a sinaptofisina (a-terminais nervosas) e pós-sinápticos AChRs revelou um declínio progressivo na área de coloração AChR como a principal alteração. É importante salientar a taxa de declínio foi suficiente para explicar declínios comparáveis ​​na amplitude dos potenciais sinápticos, falha da transmissão sináptica e fraqueza muscular 17,18. Qualitativamente achados semelhantes foram relatados por outros grupos de pesquisa10,19. Os mesmos métodos de medição JNM já foram utilizadas para avaliar o impacto de três fármacos para o tratamento anti-almíscares miastenia gravis neste modelo de ratinho 20,21.

Envelhecimento sedentário pode levar à perda de conexões neuromusculares. Os protocolos descritos aqui revelaram um declínio associado à idade na área do terminal nervoso synaptophysin em placas motoras como ratos progredir na velhice. Os mesmos métodos revelou que o exercício voluntário poderia, em grande parte impedir a redução da área terminal do nervo pré-sináptico 22, de acordo com o trabalho anterior por outros grupos de quatro. Perda de conexões neuromusculares também ocorre no modelo de rato SOD1G93A esclerose lateral amiotrófica 9,23.

Os estudos citados demonstram que uma variedade de condições de saúde pode levar a reduções na área de uma das especializações pré ou pós-sinápticos no NMJ. Isso pode resultar em diversão sináptica prejudicadacção ou podem anunciar perda completa da ligação neuromuscular. Três protocolos estão descritos que permitem a quantificação da área e densidade de especializações sinápticos. O objectivo do primeiro protocolo é o de proporcionar uma medida prática e reprodutível das áreas de pré- e pós-sinápticos especializações e o seu alinhamento em NMJs de mamífero, utilizando microscopia de fluorescência. Bidimensionais imagens máximos projeção confocal e análise de imagem com NIH ImageJ é usado para detectar mudanças na área de coloração synaptophysin (vesículas sinápticas), AChRs pós-sinápticos e área de sobreposição sináptica. Parâmetros confocal de imagem (ganho e nível de deslocamento) são optimizados para cada NMJ de modo a maximizar a informação visual usado para discernir a área de especialização sináptica. Falha neuromuscular também pode resultar de alterações na densidade do RACh pós-sináptico e / ou outras proteínas sinápticas. O segundo protocolo pode ser aplicado para detectar alterações na densidade relativa de proteínas pós-sinápticos taiscomo almíscares, rapsyn, distroglicana, fosforilado Src quinase e fosforilado AChR 18,21.

Em pacientes com miastenia gravis, uma densidade reduzida de AChR dentro da membrana pós-sináptica é a causa imediata da falha sináptica e fraqueza muscular. O terceiro protocolo descreve um método de transferência de Fluorescência de Ressonância Energia (FRET) para avaliar mudanças na proximidade do AChRs adjacentes dentro das membranas pós-sinápticos 14,15. Este método detecta transferência de energia entre AChRs vizinhos marcados com fluorescência-α-bungarotoxina (BGT). FRET ocorre apenas quando os doadores e aceitadores de sondas fluorescentes estão a menos de 10 nm de intervalo. Isso pode revelar alterações submicroscópicas () no aperto de embalagem AChR que podem se relacionam diretamente com a amplitude dos potenciais sinápticos.

Estes três protocolos, refinados ao longo da última década, fornecer medidas complementares a integridade NMJ de uma forma consistente e reproduzível. A utilização de protocolos padronizados dend parâmetros deve facilitar a comparação dos efeitos dos genes e intervenções ambientais sobre a JNM mamíferos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: concepção, realização e divulgação de experiências com animais devem ter em conta as diretrizes atuais 24. Esse trabalho deve ser previamente aprovado pela autoridade de bem-estar animal local (no nosso caso, o Comité de Ética Animal da Universidade de Sydney).

1. A eutanásia do animal e Dissection Muscle

  1. Transferir o rato da sala de exploração para uma sala separada onde é sacrificado com uma injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital (30 mg / kg), utilizando o método de manuseio do mouse detalhado por Shimizu 25. Posicione o mouse de volta para sua gaiola.
  2. Uma vez que a respiração do rato parou por mais de 1 min, testar o reflexo de pé-de retirada por beliscar suavemente a pé, e do reflexo corneal por escovando levemente a córnea. Só quando as respostas reflexas estão ausentes pode o mouse esteja preparado para dissecção.
  3. Consulte um atlas de anatomia roedor como Chiasson 26 e / ou procurar a ajuda de um experienanatomista ced antes de tentar dissecção do músculo de interesse. Em cada caso, remover os pêlos da pele que recobre usando uma pequena máquina de barbear eléctrica antes da abertura da pele para expor o músculo.
    NOTA: A dissecção será diferente para cada músculo anatomicamente distintos.
  4. Utilizando uma pinça sem corte liberar o músculo que recobre as membranas e tecidos circundantes. Agarrar e cortar o tendão distai do músculo para separar a partir da sua inserção.
  5. Delicadamente, provocar e cortar o músculo livre de tecido circundante de volta à sua origem. Resumidamente colocar o músculo recentemente dissecados em solução 0,1 M de solução salina de fosfato tamponada (PBS) ou solução de Ringer, antes de posterior processamento.

2. Preparar o músculo por cryosectioning

NOTA: preservação estrutural óptima pode ser conseguida por toda a perfusão dos animais tal como anteriormente descrito 27, ou imersão fixação (para pequenos músculos) como descrito no passo opcional 2.1. No entanto,4% de paraformaldeído fixação pode prejudicar a coloração subsequente com muitas sondas de anticorpo fluorescente com e-BGT. Glutaraldeído particularmente deve ser evitada. Se os músculos não são para ser fixa devem ser imediatamente congeladas rapidamente (proceder a 2,3).

  1. Fixação imersão Opcional: Pin o músculo a cera em uma placa de Petri com comprimento de repouso. Cobrir o músculo com 2% w / v de paraformaldeído (dissolvida de fresco em PBS) durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar com 3 mudas de PBS durante 30 min (3 x 10 minutos) e depois substituir o PBS com 30% w / v de sacarose em PBS e incubar O / N a 4 ° C.
  2. Adicione moldes ("barcos") com antecedência por dobragem dois centímetros x 1.5 cm pedaços de folha de alumínio, como mostrado na Figura 1. Colocar um pedaço de membrana de nitrocelulose na parte inferior do barco. Suavemente para cryostat incorporação matriz (tabela de materiais) para o barco a uma profundidade de 2 mm, tendo o cuidado de evitar bolhas de ar. Coloque o músculo para o barco, alinhando-o com as linhas de caneta esferográfica sobrea nitrocelulose. Adicionar mais matriz de incorporação, de modo a cobrir completamente o músculo (Figura 1).
  3. Tubos de polipropileno pré-label com um marcador indelével. Colocar uma gota de água em cada tubo e relaxar o tubo em azoto líquido.
    NOTA: A gota de água congelada mantém a pressão de vapor e impede a dessecação durante prolongada -80 ° C de armazenamento
  4. Usando uma máscara para o rosto, luvas grossas e um grande par de fórceps sem corte, reduzir parcialmente um pequeno balão de metal (3 cm de diâmetro, 8 cm de profundidade) contendo 2 cm de profundidade de isopentano em um recipiente de nitrogênio líquido por 30 s. Retirar o copo e coloque-o na bancada. Utilizando um par de pinças menor rombas colocar o molde contendo o músculo e a incorporação da matriz no isopentano arrefecido. Tome cuidado para evitar a mistura de nitrogênio líquido com o isopentano.
  5. Permitir 2 min para o bloco de congelar completamente antes de usar uma pinça sem corte para levantar o bloco congelado para fora e feche-o na pr corretarotulado-e e tubo de pré-arrefecida (passo 2.3).
  6. Armazenar temporariamente os tubos em azoto líquido antes da transferência para -80 ° C. Registra todas as amostras em uma planilha de conteúdos congelador.

3. cryosectioning e fluorescência de coloração para en face Imagens de NMJs

  1. Descascar o molde de alumínio. Dentro da câmara de -20 ° C criostato anexar o bloco congelado para o mandril criostato, de modo a cortar 20 mm criocortes paralelas ao eixo longo das fibras musculares (Figura 1). Pegue as seções sobre poli-L-lisina ou gelatina revestido lâminas de microscópio.
  2. NOTA: Ignore essa etapa se o tecido é fixado antes do congelamento. Depois de 30 min para permitir secções para secar nas lâminas, corrigi-los, colocando uma gota de 2% de paraformaldeído em PBS, sobre cada secção durante 15 min à TA.
  3. Lave as lâminas 3 x 10 min em PBS num frasco Coplin, e, em seguida, mergulhar as lâminas em PBS contendo 0,1 M de glicina durante 30 min para bloquear grupos aldeído residual.
  4. Lavar as lâminas durante 10 minutos em PBS, em seguida, imersas em metanol (arrefecida a -20 ° C) durante 7 min. Esta etapa permeabilização é parte da rotina de marcação dupla com fluorescente-BGT e anti-synaptophysin mas pode afetar adversamente imunomarcação para algumas outras proteínas.
  5. Lavagem das lâminas 2 x 10 min em PBS, em seguida, colocar cada slide em uma câmara úmida estável e nivelada. Imediatamente cobrir cada secção com 20 ul de solução de bloqueio (0,2% de Triton X-100, 2% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS) durante 1 h à TA. Cortes não devem ser autorizados a secar em qualquer fase do processo immunostaining.
  6. Realizar a primeira incubação: Tomando um slide de cada vez retire cuidadosamente a solução de bloqueio excesso de mais de cada seção e substituí-lo com 20 l de coelho anti-synaptophysin (diluído 1: 200 na solução de bloqueio).
  7. Incluir um slide-controle negativo que serão incubadas apenas com solução de bloqueio. Este "não-primário controle anticorpo"É essencial em cada corrida imunomarcação.
  8. Tomando cuidado para que o anticorpo primário permanece no local sobre cada seção, feche a câmara úmida e incubar por 1-2 dias a 4 ºC.
  9. Inspecione cada seção para confirmar que o anticorpo primário continua em vigor. Use uma pipeta Pasteur para lavar cuidadosamente cada slide com PBS e colocá-lo em um frasco Coplin. Lavar todos os diapositivos 3 x 10 min em PBS.
  10. Realizar incubação secundário. Tomando uma lâmina de cada tempo, retire cuidadosamente o excesso de PBS, colocá-lo na câmara úmida e cobrir cada seção com 20 l de uma mistura contendo FITC conjugado IgG de burro anti-coelho e BGT conjugado com tetrametilrodamina ou outro fluoróforo vermelho (TRITC- / redBGT; 5 g / ml) diluídas em solução de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente durante 2 horas.
  11. Lavagem das lâminas 3 x 10 min em PBS em frascos Coplin.
  12. Tomando uma lâmina de cada tempo, retire cuidadosamente o excesso de PBS e montar com uma lamela usando um volume mínimo de, gliccroà base de l, fade-resistindo meio de montagem. Sele as bordas das lamelas com clara verniz. Deixe-o secar duro.
  13. Guarde os slides no escuro a 4 ºC por até uma semana, ou a -20 ºC por períodos mais longos de armazenamento (até vários meses).

4. Imparcial Amostragem e En Face Imagem de Motor endplates

  1. Cegar os slides, rotulando cada slide com um número de código aleatório que permanece conhecido apenas por um segundo pesquisador (que não estão envolvidos na análise). Como resultado, o operador permanece cego para os grupos de tratamento até a quantificação dos parâmetros JNM está completa para todas as amostras.
  2. Coloque o slide no palco microscópio e visualizá-lo sob iluminação de campo de largura, com o conjunto de filtros TRITC (63X óleo 1.3 NA objetivo). Mova progressivamente (campo por campo) da esquerda para a direita e para trás até que uma placa terminal aparece no campo (Figura 2A).
    Critério de amostragem:: NOTA Toda estrutura AChR manchadas de que é relativamenteplano e enfrenta o objetivo (ou seja, se estende <15 m de dimensão z) é considerada uma placa terminal e é fotografada para análise (crescentes de coloração AChR representam secções transversais através de placas finais e, portanto, estão excluídos).
  3. Com o conjunto de pinhole confocal a 1,0 unidade de Airy e baixa potência do laser otimizar o ganho e offset níveis para TRITC / red-BGT (laser de 532 nm) na placa terminal que está a ser trabalhada. Próximo optimize FITC / fluorescência synaptophysin utilizando o laser de 488 nm. Colete um z-stack da placa terminal com um intervalo de 0,7 mm entre cada fatia óptica. Salve as imagens com um nome de arquivo que inclui a data da sessão de imagem, o nome de código do slide e o número da placa motora.
    NOTA: As digitalizações usando a 488 nm e 532 nm lasers (ITCF e TRITC) devem ser recolhidas sequencialmente (não simultaneamente) para evitar a contaminação do canal FITC por fluorescência do fluoróforo vermelho e vice-versa (sangrar-through).
  4. Repetir a uma amostragemnd imagens de passos 4,2-4,3 até 20 de placas terminais são recolhidos a partir do slide / amostra.
  5. Mude para o próximo slide codificados e repetir 4,2-4,4. Repita esse procedimento para cada uma das lâminas codificadas.
  6. Coletar algumas imagens de placas terminais da lâmina de controlo (sem-primário controle anticorpo) usando as configurações confocal que foram encontrados óptima para os slides experimentais (o canal de fluorescência FITC deve aparecer escuro).
  7. No final da sessão de transferência confocal os arquivos de imagem para outro computador e faça backup dos arquivos originais em uma unidade ou servidor externo.

5. Medição da Área de Synaptic Especializações em en face Images

  1. Use NIH ImageJ gratuito (http://imagej.nih.gov/ij/) para preparar projeção máxima (MIP) as imagens de cada pilha z. Salvá-los como arquivos TIFF (Figura 2A e B). Os nomes de arquivo deve incluir a data da sessão de imagem, código de exemplo, número de placa terminal e do canal fluorescente (por exemplo, 060414_5723_7_FITC.tiff).
  2. Abra a imagem z-projeção no ImageJ. Selecione a imagem do canal receptor de acetilcolina (Figura 3A) e selecione: Imagem> Tipo> 8-bit para converter a imagem de cor RGB de 24 bits em três imagens em escala de cinza de 8 bits na tela.
  3. Usando a ferramenta polígono ImageJ desenhar um esboço em torno da placa terminal de interesse no redBGT manchado (CADH) canal de modo a incluir todas as regiões manchadas aparentes de placa terminal indivíduo em particular, excluindo qualquer coloração que não se originam a partir da placa terminal de interesse ( Figura 3C).
  4. Aplicar um limite mínimo de intensidade para a imagem selecionando: Image> Adjust> Threshold (Figura 3E e screenshots ImageJ associados).
  5. Ajuste o nível de limiar, de modo a isolar as porções AChR coradas enquanto excluindo circundante sinal de fundo como sub-limite (Figura 3E). Abra um segundo fôlegoow com a imagem original (de tom contínuo) imediatamente ao lado da janela para comparação, para facilitar a decisão sobre o valor de limiar. Grave o valor limite para utilização posterior em co-localização analisa.
  6. Mantendo o esboço polígono ao redor da placa terminal selecione: Analisar> Analisar Partículas. No menu pop-up especificar o intervalo de tamanhos como: 50 a infinidade pixels (isso elimina minúsculos artefatos decorrentes do ruído elétrico no photomultiplier).
  7. Analisar Partículas comando gera uma janela com uma lista de áreas supralimiares discretos e seus valores de intensidade de fluorescência numerados como eles aparecem na imagem binária (Figura 3G e tela ImageJ associado). Copie este dados em uma planilha rotulados.
  8. Medir a área placa terminal Total (área dentro do polígono) selecionando: Analisar> Medida. Isto produz a área total da placa terminal. Copiar e colar os dados para as áreas RACh e intensidades emuma planilha certificando-se de rotular as colunas de forma adequada, as linhas serão utilizadas para placas finais individuais para slides específicos.
  9. Mudar para o canal de fluorescência anti-sinaptofisina e repetir os passos 5,1-5,5, mas para o canal FITC (Figura 3B, D e F). O objetivo é ajustar o limite para que ele cria uma imagem binária que, tanto quanto possível, coincide com os limites da coloração percebida pelo olho. Grave o valor limite.
  10. Medir a área de sobreposição, aplicando as seguintes etapas: Abra o arquivo original que contenha as duas imagens dos canais e dividi-lo em duas imagens separadas, selecionando: Imagem> Pilhas> pilha para Images.
  11. Usando o plugin co-localização (baixado e instalado a partir da página web ImageJ) Selecione: Pluggin> co-localização de entrada e os valores limite previamente gravada para os canais RACh e nervosas no respectivo canal de consulta bboi. O resultado será uma imagem sobreposição de pixels brancos (Figura 3H e screenshots ImageJ associados).
  12. Converter a imagem sobreposição recém-criado em um formato em tons de cinza e aplicar um limite para o valor máximo. O limite máximo só seleccionará os pixels brancos, correspondendo a zona de sobreposição dos dois canais anteriores. Ficha na folha de cálculo o valor da área resultante de "co-localização ', o que representa a área de sobreposição de pixels.
  13. Prepare uma folha de cálculo de médias das amostras de dados, calcular e definir os desvios-padrão e os erros padrão como histogramas ou scatterplots 20,22. Note-se que o valor de n representa geralmente o número de murganhos por grupo de amostras para fins estatísticos.
  14. Lote placa terminal em áreas RACh como diagramas de dispersão ou histogramas de frequência para determinar se os dados são distribuídos normalmente antes do teste estatístico (Figura 6).

6. Coloração RelativaIntensidades comparadas usando transversais secções ópticas

NOTA: Para este processo do protocolo de todas as amostras de músculo juntos e imagem em uma única sessão confocal. No planejamento de um experimento permitem até tempo de imagem 30 min por amostra muscular.

  1. Cortar 15 mm criocortes transversal ao eixo longo das fibras musculares e recolher em lâminas tal como descrito no passo 3.1.
  2. Realizar a coloração de fluorescência como descrito nos passos 3,2-3,13.
  3. Código lâminas coradas de modo que as imagens e as análises são realizadas com o operador cego para o grupo de tratamento, tal como descrito na etapa 4.1.
  4. Usando um objetivo fluorescência 40X (NA 0,75) examinar brevemente uma seção de cada slide para determinar um único ganho e offset definição do nível de AChR que será adequado para todas as placas terminais em todas as lâminas de amostra. A placa terminal mais brilhante deve, então, ser um pouco abaixo de 256 cinza na escala. Esta optimização deve ser realizado separadamente para a segundo fluorescence canal (recolhidos sucessivamente). Grave o ganho fixo e compensar as definições de nível e não alterá-los durante toda a sessão de imagem.
  5. Recolhe imagens de um slide padrão de fluorescência (por exemplo, não-esferas fluorescentes de branqueamento), utilizando os mesmos parâmetros, no início e no fim da sessão confocal para detectar qualquer possível variação na intensidade do laser.
  6. Use o canal AChR para digitalizar o slide progressivamente para localizar placas terminais.
  7. Concentre-se para encontrar o plano de corte óptico único em cada campo do microscópio que contém o maior número de placas terminais AChR coradas.
  8. Digitalizar esta seção óptico único duas vezes e salvar a imagem em média (Figura 4G).
  9. Mantendo a mesma opção de plano focal para o segundo canal de fluorescência (proteína de interesse) e recolher a imagem como no passo 6.8. Salve o arquivo de imagem, incluindo o nome do arquivo: data de sessão de imagem, código de exemplo, o número de imagem e um símbolo para indicar o canal fluorescente. F mostra exemplos da distribuição de placa terminal de AChR comparação com rapsyn, almíscar ou -dystroglycan (-DG).
  10. Mova o estágio para o próximo campo que contém um ou mais placas terminais e repita o passo 6,8-6,9. Repita este procedimento até um total de 60 placas terminais são gravadas.
  11. No final da transferência sessão de imagens de todos os arquivos para outro computador e apoiá-los.
  12. Abra cada arquivo de imagem original e durante a exibição do canal AChR, selecione: Imagem> Pilhas> pilha para Images, para dividir os canais.
  13. Selecione: Imagem> Tipo> 8bit para converter para o formato em tons de cinza de 8 bits na tela. Faça isso para ambos os canais de fluorescência.
  14. Selecione: Imagem> Pilhas> Imagens de pilha. Abra uma nova pilha de duas imagens de 8 bits previamente separados. Pode-se então convenientemente alternar entre os dois canais de fluorescência dentro da janela única.
  15. Use a ferramenta polígono para desenhar uma line firmemente em torno do perímetro do RACh coloração (Figura 4I).
  16. Selecione: Analisar> Medir para medir a intensidade média dos pixels para AChR na zona delimitada (observe a importância do desenho da linha firmemente). Copie esse valor em uma planilha rotulados.
  17. Mantendo o mesmo esquema polígono (para definir a área a ser medido), mude para o segundo canal fluorescente (por exemplo, a Figura 4B, D, F) e selecione: Analisar> medida. Isto vai produzir a intensidade média de coloração para a proteína de interesse dentro da área definida pela coloração sináptica AChR.
  18. Escolha uma área longe de coloração visível placa terminal em seguida, selecione: Analisar> Medir para medir a intensidade média de fundo de fluorescência. Repita esse procedimento para o outro canal de fluorescência / s e copiar os valores de fundo para a planilha de valores de fluorescência.
  19. Submarinotrato os valores médios a partir do fundo da placa terminal para se obter os valores das intensidades corrigidos para AChR e a proteína de interesse em cada placa terminal.
  20. Dividir os valores de intensidade de placa terminal corrigidos para a proteína de interesse, a intensidade de fluorescência corrigida BGT para se obter os rácios de intensidade de fluorescência 14,21

7. A comparação da densidade da membrana pós-sináptico AChR Usando FRET

NOTA: Este protocolo avalia o grau ao qual estão intimamente AChRs embalado (<10 nm espaçamento) na membrana pós-sináptica. A combinação precisa fluoróforo dador e o aceitador é crítico para este ensaio de FRET. Nomes e detalhes dos fluoróforos são dadas na tabela de Materiais. Suas propriedades espectrais, em relação a FRET, são discutidos em nossos trabalhos anteriores 14,15.

  1. Prepare criosecções transversais fixos como descrito na seção 6.1. Todos os grupos de amostras devem ser processadas em conjunto e imagemd na mesma sessão confocal.
  2. Misture bem 2,5 g / ml-BGT vermelho (FRET doador) com 10 g / ml vermelha extrema-BGT (FRET aceitante) com a solução em um pequeno tubo de plástico bloqueio por pipetagem cima e para baixo 12 vezes. Esta mistura 1: 4 molar maximiza a eficiência da TERF 14.
  3. Colocar cada lâmina numa câmara humidificada, cobrir cuidadosamente cada secção com uma gota (12 ul) da mistura acima e incubar durante 1,5 horas à temperatura ambiente.
  4. Seções de controle: cobrir um pequeno número de seções com 2,5 g / ml red-BGT (único doador; controles C1 marcados), e também algumas seções com 10 g / ml far-red-BGT (único receptor; controles C2 marcados). Incubar esses controles como no passo 7.3.
  5. Lavagem das lâminas 3 x 10 min em PBS e montar em baseado em glicerol, fade-resistindo meio de montagem (veja o passo 3.12).
  6. Obtenção de amostras de placas terminais como no passo 6.7. A fluorescência do dador e aceitador deve ser perfeitamente co-localizado no placas terminais devido à ligação aleatória de moléculas fluorescentes-BGT.
  7. Imagens de Controle: Usando a objetiva de 40X e laser de baixa potência otimizar ganho redBGT e compensar as definições de nível para endplates de um C1 controle slide. Otimizar ganho far-redBGT e compensar os níveis de placas terminais de controle de deslizamento C2. Confirmar a ausência de qualquer fluorescência através de sangria.
  8. Sem alterar a potência do laser, ganhar ou configurações de nível de compensar passar para os slides experimentais e recolher imagens (pré-photobleach) para ambos os canais de fluorescência.
  9. Seletivamente photobleach a extrema-vermelho-BGT sobre uma porção de uma única placa terminal fazendo zoom na área de digitalização, em seguida, a digitalização de 10 vezes com o laser de 633 nm a 100% de energia. A fluorescência na área digitalizada deve tornar-se fraca.
  10. Repor a potência do laser e zoom e coletar imagens de pós-branqueamento em ambos os canais fluorescentes usando as configurações confocal estabelecidos em 7,7.
  11. Calcule a eficiência FRET (E) a partir do aumento percentual de doadores (red-BGT) fluorescência seguinte photobleach do aceitante (far-red-BGT) de acordo com a seguinte fórmula *:
    Equação 1
    * Para todas as situações em que a fluorescência do dador aumenta após fotobranqueamento do aceitador.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Medição do Synaptic Area no NMJ

Qualquer estimativa de área depende do desenho de um limite para definir a extensão de especializações sinápticas. Em músculos adultos jovens saudáveis ​​imagens JNM deve exibir limites bem definidos para ambos AChR e coloração sinaptofisina (Figura 2A e B). A intensidade da fluorescência para ambos AChR e sinaptofisina aumenta acentuadamente no limite entre a parte de peri-sináptica e sináptica da placa motora (Figura 5A 'e B'). Para essas imagens um limiar mínimo (um pouco acima do fundo extrasynaptic fluorescência) irá prontamente isolar a área AChR-rico ou rica em sinaptofisina da placa terminal (linhas tracejadas na horizontal (Figura 5A 'e B')). Em camundongos com idade e em alguns estados de doença coloração placa terminal para AChR pode ser menos intensa, RACh bordas de cluster pode aparecer turva e oRe pode representar um dos níveis mais elevados de autofluorescência extrasynaptic (Figura 5D; 17,22). Coloração por fluorescência com fronteiras indistintas podem introduzir erros em estimativas da área sináptica. Em todos os casos, o objectivo consiste em escolher um limiar que produz uma imagem binária semelhante em forma e tamanho para a AChR- ou áreas ricas em sinaptofisina como eles aparecem ao olho na imagem original, de tom contínuo. Conduzindo a análise cego para o grupo de tratamento deveria reduzir o risco de viés subjectiva no passo de limiar (passo 4.1). Às vezes, imagens de placa terminal de desmaio ou borradas pode resultar de processamento sub-óptima. Figura 2C e D mostra um exemplo de uma imagem de baixa qualidade a partir de uma placa terminal 2 meses de idade rato saudável. Bordas borradas e coloração synaptophysin fraco pode ter surgido nesta instância de descongelamento parcial e recongelamento do músculo antes cryosectioning. Algumas seções (controle positivo) músculo jovem saudável deve ser seccionado umnd processadas em paralelo com as amostras experimentais para assegurar que qualquer deterioração evidente nas imagens JNM não é devida a problemas com a imunocoloração. Lotes de imagens comprometidas pelo processamento sub-óptima devem ser excluídas das análises.

Para en cara imagens z-stack, 15-20 endplates é uma amostra razoável para estimar áreas sinápticas. Uma grande diversidade de formatos e tamanhos de NMJs são encontrados dentro de qualquer músculo dado. Scatterplots revelam uma gama considerável na área AChR-rico entre placas terminais do músculo tibial anterior de qualquer ratinho individual (Figura 6A). No entanto, a área média AChR (com base em 15-20 en imagens rosto de placa terminal) foi semelhante entre os sete camundongos amostra (~ 200 m 2; Figura 6A). A área de synaptophysin coloração placa terminal também variou consideravelmente entre as placas terminais de um determinado músculo. Mais uma vez, usando uma amostra de 15-20 placas terminais a área média da placa terminal synaptophysin foi similar entre os ratos 7 estudaram (~ 170m 2; Figura 6B). Histogramas de frequência de dados agrupados revelou distribuições aproximadamente normais para a área de AChR placa motora e sinaptofisina (Figura 6A 'e B'). No entanto, uma distribuição normal das zonas sinápticas não pode ser assumido em estados de doença, tais como a miastenia gravis 16,20. Isto pode afectar a escolha do teste estatístico.

Tabela I enumera áreas de especializações pré e pós-sinápticos para NMJs para saudável 2 meses de idade (jovem adulto) feminino camundongos C57BL / 6J de estudos anteriores. As áreas de especializações ambos pré e pós-sinápticos declinou com sedentário envelhecimento 22. Área AChR também foi marcadamente reduzida nos ratos injectados com IgG de anti-almíscares pacientes com miastenia gravis 17,21. Miastênicas ratinhos tratados com o inibidor da colinesterase, piridostigmina, exibida mais uma redução significativa na área da placa terminal 20 AChR </ Sup>.

Intensidade relativa de Recirculador Fluorescência Labeling

A intensidade relativa de imunofluorescência pode revelar alterações na densidade de uma proteína de interesse-de-sináptica com a idade, genótipo e / ou estado de doença. AChR fluorescência (red-BGT ou far-red-BGT) é usado pela primeira vez para definir o local do MNJ. O brilho de fluorescência dentro de 8 bits área do RACh-rico é então utilizado para avaliar as mudanças na concentração da proteína de interesse, em relação aos animais de controlo. Em secções transversais a placa terminal AChRs aparecem normalmente como uma forma crescente, mas esta forma é muitas vezes irregular (Figura 4A, C, E, H). Baixa intensidade fluorescência de fundo geralmente revela se uma mancha de coloração AChR representa uma única placa motora, ou duas placas terminais separados localizados em fibras musculares adjacentes. Muitas proteínas sinápticas (como rapsyn, almíscar e Src) sãocolocalized com AChR na placa terminal (Figura 4A - D). Coloração de imunofluorescência com anticorpos fosfo-especificos, também podem ser utilizadas para comparar o efeito de intervenções experimentais sobre o estado de fosforilação de determinadas proteínas da membrana pós-sinápticos 21.

A fiabilidade e a reprodutibilidade das medições da intensidade de fluorescência depende fortemente da integridade do músculo congelado e a qualidade da imunocoloração. Músculos devem ser dissecados e snap-congelado imediatamente ou (a poucos minutos da morte do animal) fixa-paraformaldeído para evitar alterações degenerativas do MNJ. A imunocoloração depende altamente sobre a qualidade dos reagentes e optimizar o protocolo de coloração para anticorpos específicos. Para qualquer novo lote de anticorpo primário experimentos de positividade piloto são necessários. Criocortes recém-cortadas de músculos jovens e saudáveis ​​são incubadas com diluições em série de duas vezes do anticorpo primário. Aconhecido anticorpo secundário fiável é usado e os resultados são comparados. Se a proteína de interesse é conhecida por ser restrita ao JNM seguida, a melhor concentração de anticorpo é aquela que produz o rácio mais elevado de JNM intensidade de fluorescência relativa à encontrada em partes extrasynaptic do músculo (fluoresccia de fundo). Extrasynaptic intensidade de fluorescência (não específica presumivelmente) não devem exceder 15% da intensidade de fluorescência placa terminal. Da mesma forma 'nenhum controle anticorpo primário' seções (incubadas apenas com o anticorpo secundário) deve aparecer escuro, confirmando que o anticorpo secundário não se ligam não especificamente. A qualidade de diferentes lotes de anticorpos secundários (policlonais) podem variar acentuadamente lotes alternativos de anticorpos secundários devem ser comparados antes de estabelecer um protocolo padrão. O teste ideal para a especificidade de imunofluorescência envolve uma comparação directa das secções de ratinhos de tipo selvagem e as secções de controlo negativo a partir de ratinhos tchapéu falta o (knockout gene) proteína de interesse. As seguintes referências descrevem a quantificação da coloração de fluorescência placa terminal de almíscar, rapsyn, dystroglycan, src e AChR 13,14,18,21.

Pequenas amostras introduzir erro em estimativas de intensidade de fluorescência relativa. Placas terminais individuais variou consideravelmente em intensidade de fluorescência. Presumivelmente, essa variabilidade entre placas terminais dentro de um determinado músculo reflete a diversidade da estrutura e oportunidade JNM diferenças na secção óptica amostrados. No entanto, o aumento do número de placas terminais da amostra resulta numa estimativa mais estável de intensidade média de fluorescência (Figura 7). Para estimar a intensidade de fluorescência placa terminal média 40-60 placas terminais de cada amostra muscular deve ser calculada a média.

AChR-AChR FRET

Cada AChR é um pentâmero, com dois sítios de ligação para BGT (localizados um em cada subunidade alfa). A ligação dered-BGT e far-red-BGT para estes dois locais renderia uma separação entre o doador eo receptor de cerca de 9nM 28-30. Assim, a baixa eficiência FRET pode ser detectado antes mesmo AChRs montar em clusters 14. No entanto, a eficiência da TERF em placas terminais de murino praticamente duplicou após o nascimento, consistente com a incorporação mais eficiente de AChRs numa gelosia membrana pós-sináptica embaladas apertadamente 14. Usando red-BGT e far-red-BGT como doador e receptor FRET (respectivamente), as placas terminais de 1-2 meses de idade camundongos produzidos eficiências médias FRET variando 20-37% (Tabela 2). Eficiências traste 20% ou mais são pensados ​​para representar embalagem apertado de AChRs 14. Eficiência placa terminal FRET foi ligeiramente reduzida após a desnervação 14, e acentuadamente reduzida após camundongos foram injetados com IgG de miastenia anti-Musk-positivo gravis 18. Estas são as condições em que AChRs individuais são menos bem embalado para o postsyandaime membrana naptic pelo sistema MuSK / rapsyn pós-sináptico 31.

Figura 1
Figura 1. Incorporação e músculos de congelamento para cryosectioning (1-5) Preparando moldes ('barcos') antes do congelamento de um lote de músculos:. (1) A folha de alumínio é cortada em retângulos (2,0 x 3,0 cm) e (2). Dobrada como indicado para criar um molde / barco (3). (4) retângulos de papel immunoblotting nitrocelulose são cortadas para caber no molde e uma caneta esferográfica é usado para governar linhas para orientar o músculo. (5) O rectângulo de nitrocelulose é colocada no molde. (6-8) A incorporação de congelação e os músculos: (6) O criostato incorporação de fluido matriz é vertida cuidadosamente para dentro do molde (na parte superior da nitrocelulose) a uma profundidade de 2 mm. (7) fórceps finos são utilizados para baixar o músculo, tendão pela sua incorporação na matriz, em alinhamento com o nitrocelluperder decisões (8), matriz incorporação adicional é gentilmente derramado no molde para cobrir o músculo, tendo o cuidado de evitar a criação de bolhas. O músculo é depois incorporado congeladas rapidamente, seladas em tubos e armazenados a -80 ° C, conforme descrito no texto. (9-12) A preparação para cryosectioning: (9) fórceps finos são utilizados para descascar o molde de alumínio e o bloco congelado é então colocado na câmara de -20 ° C criostato, (10) As marcações na nitrocelulose são usados ​​para alinhar o músculo paralela à face do mandril (11) para o corte longitudinal (12). A gota de meio-incorporação crio líquido é usado para prender o bloco para o chuck gelada. Fórceps Blunt são usados ​​para manipular o bloco músculo congelado. Para obter secções transversais, o bloco está montado de modo que, em vez do músculo é perpendicular à superfície do mandril (não mostrado).

Figura 2
Figura 2. En imagens de rostos de NMJs do músculo tibial anterior de 2 meses de idade camundongos C57Bl6J do sexo feminino. O músculo fresco foi congeladas rapidamente e as seções fixas no slide como descrito no passo 3.2. Máximo de imagens de projecção de intensidade z pilhas foram obtidos como descrito no primeiro protocolo. Coloração (A) BGT-vermelho revela uma única placa terminal motora que consiste em dois conjuntos de AChR-ricos calhas pós-juncional primárias (en vista de frente). (B) Sinaptofisina coloração com anticorpo secundário conjugado com FITC revela o terminal nervoso pré-sináptico, ocupando as calhas sinápticas primários. Uma porção do axónio pré-terminal é também visível na parte superior do painel. (C & D) Um exemplo de uma imagem de qualidade pobre JNM a partir de um ratinho jovem saudável. A coloração é fraco e os limites das especializações pré e pós-sinápticos estão desfocadas. Isto foi atribuído a deficiências na tele processamento do tecido e / ou o tempo permitido inadequada para a incubação do anticorpo primário. Barra de escala no painel D representa 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Passos no processamento de imagens en cara JNM (como previsto no protocolo 1). (A & B) originais imagens tom MIP contínuas mostram fluorescência vermelha-BGT revelando AChR e imunofluorescência verde para synaptophysin respectivamente. (C) coloração AChR após a conversão para uma imagem em escala de cinza de 8 bits e uso da ferramenta polígono para delinear a placa motora (linha amarela fina). (D) Recirculador linha de fronteira transitado para a imagem synaptophysin verde. (E) Applicação de um comando mínimo limiar de intensidade para criar uma imagem binária que isola suprathreshold red-BGT (AChR) fluorescência. A seqüência de ImageJ screenshots da interface do usuário é exibido à esquerda das imagens. Image synaptophysin Binary após a aplicação de um limite separado (F). (G) Identificação de suprathreshold discreta domínios AChR ricos dentro da placa motora através da aplicação do comando Analisar partículas à imagem red-BGT binário. O ImageJ correspondente (à esquerda do painel (G) mostra os dados de entrada necessários. O tamanho mínimo de áreas de pixels suprathreshold exigidos devem ser inseridos. (H) Identificação das regiões de sobreposição da synaptophysin binário e imagens CADH. Sobreposição é representado por pixels brancos . ImageJ screenshots da interface do usuário (abaixo do painel H) mostram os passos para chegar ao imagem sobreposição binário. Os limiares de intensidade mínimos escolhidos para cada fluorescência channel deve ser inserido dentro da janela de 'co-localização ". Barra de escala representa 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Os exemplos de secções transversais ópticos utilizados para comparar intensidades de fluorescência relativas (protocolo 2). O músculo foi congelado rapidamente e as secções fixadas na corrediça, como descrito no passo 3.2. (A e B) Uma única placa terminal duplamente marcada com longe -red-BGT (RACh, mostrado em azul pseudo) e FITC anti-rapsyn ilustra a co-localização destas duas proteínas que interagem na membrana pós-sináptica (C & D) Duas placas terminais sobre as fibras musculares adjacentes visor co-localizadas AC. RH e almíscar. (E & F) Uma placa terminal duplamente marcada para AChR e -dystroglycan (-DG). O -DG estende à direita em torno do perímetro de fibra muscular, mas é enriquecido na placa motora (barra de escala no F, para os painéis AF: 25 mm) (G - I) Isolando uma placa terminal para a medição da intensidade (G) Um microscópio de campo típica.. contendo três endplates far-red-BGT-coradas (barra de escala no painel G: 40 mm (H) Uma imagem ampliada da placa terminal em caixa (I) A mesma placa terminal convertido em uma imagem em tons de cinza de 8 bits e delineado usando o polígono.. . ferramenta de ImageJ (fina linha amarela) e de média intensidade de fluorescência é medida dentro desta linha de fronteira. (barra de escala para a H & I: 10 mm) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ontent "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 5
Figura 5. Influência da qualidade de imagem na avaliação da área sináptica. (A & B) de alta qualidade en imagens de rostos de um NMJ saudável a partir de um mouse antigo dois meses visualizados no red-BGT e canais de fluorescência anti-sinaptofisina. (A '& B ') A intensidade de fluorescência perfis correspondente à linha traçada através da placa terminal por A e B, respectivamente. O tracejado vermelho linha horizontal indica o limite mínimo utilizado para criar a imagem binária. (C & D) Recirculador de um rato idosos. Coloração sinaptofisina Recirculador geralmente é menos intenso. (C '& D') perfis de intensidade mostram um elevado nível de extrasynaptic (linha de base) na flutuação da fluorescência (FITC) canal sinaptofisina (voltado solo) que afecta a determinação de um limite adequado. Muito disso é amplo espectro autofluorescência de tecidos. Barras de escala representam 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. A variabilidade das áreas sinápticas entre NMJs dentro de um músculo e entre ratos. (A) Scatterplots mostrar a área total AChR-rico de placas terminais do músculo tibial anterior de sete ingênuas 2 meses de idade do sexo feminino camundongos C57BL / 6J obtidos pelo autor NT. Cada símbolo representa uma placa terminal. Cada barra representa a média ± SD para endplates amostrados de um mouse. (B) Scatterplots mostrando área rica em synaptophysin para as mesmas placas terminais. (A ') (B ') Distribuição de frequência para a área rica em synaptophysin de placas terminais (dados agrupados). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. Efeito do tamanho da amostra nas estimativas de intensidade de fluorescência da placa terminal. Secções ópticas transversais foram usadas para medir a intensidade de fluorescência (em unidades arbitrárias) em 40 placas terminais 60 a partir do músculo tibial anterior de um rato 2 meses de idade saudáveis. Médias cumulativas são representados graficamente em função do número de placas terminais incluídos na média. (A) Recirculador vermelho-BGT intensidade de fluorescência obtida por autor AV. (B) Anti-synaptophysin intensidade de imunofluorescência para as mesmas placas terminais como no painel A. intensidade (C) Recirculador far-red-BGT fluorescência obtida a partir de uma segunda amostra do músculo pelo autor NG. (D) Anti-rapsyn intensidade imunofluorescência das mesmas placas terminais como no painel C.

Estudo Músculo número de murganhos Área AChR Área Sinaptofisina Área de sobreposição
média ± DP (um2) média ± DP (um2) média ± DP (um2)
Morsch et al. (2012) 1 gastrocnêmio 3 181 ± 7 163 ± 24
diafragma 3 130 ± 41 102 ± 21 76 ± 26
Morsch et al. (2013) 1 tibial anterior 3 166 ± 26 117 ± 21 nd
Cheng et al. (2013) 2 tibial anterior 4 226 ± 18 150 ± 44 110 ± 34
Tse (inédito) 2 tibial anterior 7 213 ± 27 157 ± 23 111 ± 11
1 de imagens em uma Zeiss LSM 510 microscópio Meta mas com ganho fixo e compensar os níveis. Thresholding e áreas sinápticas medições usadas Metamorph software pelo MM.
2 de imagens em um microscópio Leica DM IRE2 e analisados ​​seguindo o protocolo atual pelo primeiro autor indicado, cego para grupo de tratamento.
nd não determinado.

Tabela 1. áreas sinápticos para NMJs de dois meses de idade do sexo feminino camundongos C57BL / 6J (controles saudáveis)

Estudo Músculo FRET eficiência (%) * Range (%)
(Média ± SEM)
Brockhausen et al. (2008) tibial anterior 24 ± 1 n / d
Cole et al. 2010 tibial anterior 26 ± 1 22 - 30
Morsch (não publicado) diafragma 37 ± 1 24-47
Ghazanfari (não publicado) tibial anterior 30 ± 1 20 - 45
* FRET entre (raio Förster red-BGT e far-red-BGT para FRET par = 51A (Life Technologies).
dados nd não disponível

Tabela 2. Os ganhos de eficiência para AChR FRET de ratos ratos adultos jovens C57Bl6J

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Os protocolos descritos aqui nos permitiram medir de forma confiável e quantificar mudanças nas propriedades do NMJ através de uma série de condições, incluindo estados normais de envelhecimento e doenças. Os métodos descritos para en enfrentar imagens JNM vai permitir aos pesquisadores comparar a área de especializações pré e pós-sinápticos e da área de sináptica sobreposição / alinhamento. Para comparar a intensidade relativa de proteínas pré e pós-sinápticos O segundo protocolo, que usa cortes ópticos transversais, é o preferido. O terceiro protocolo testa especificamente para mudanças na proximidade da embalagem de AChRs na membrana pós-sináptica.

Controles especificidade são vital em microscopia de imunofluorescência. Ao utilizar qualquer anticorpo primário por imunofluorescência indirecta é necessário primeiro garantir que se liga especificamente à sua proteína alvo nas secções musculares. Diferentes tipos de processamento de tecidos e fixação diferencialmente podem alterar a especificidade deanticorpos. É importante confirmar que imunofluorescência (para dizer rapsyn) realmente está concentrado com AChR na placa motora. Secções de controlo negativo também deve ser inspeccionado para assegurar que a ligação do anticorpo é específico. Por exemplo, o melhor controle negativo para rapsyn imunofluorescência seria seções de rapsyn - / - ratos. Estes devem mostrar nenhuma mancha placa terminal com anti-rapsyn. Fluorescência não específica, também pode surgir a partir de produtos químicos fluorescentes endógenos no tecido (autofluorescência) ou de ligação não específica do conjugado de anticorpo secundário fluorescente. Esta fluorescência é frequentemente agravada pela fixação aldeído. Além disso, TRITC-BGT coloração de placas terminais podem, por vezes, ser detectado no canal de fluorescência fluorescente FITC e esta purga-through pode ser confundida com a imunofluorescência de FITC específico. Para se proteger contra as três últimas formas de fluorescência não específica, todos os lotes de slides que são corados deve incluir algum 'nseções de controle anticorpo o-primário "(passos 3.7 e 4.6). Imagens de placas terminais dessas secções de controlo devem ser comparados com os das lâminas experimentais para assegurar que a coloração de imunofluorescência indirecta da NMJs reflecte verdadeiramente a ligação do anticorpo primário.

Transversal secções confocais são particularmente úteis para avaliar diferenças na intensidade relativa de imunocoloração na sinapse. Em secções transversais confocal é mais fácil avaliar a co-localização precisa de proteínas sinápticas. O perfil de placa terminal em forma de crescente representa apenas uma amostra cut-through a NMJ em questão. No entanto, o fundo (extrasynaptic) fluorescência é geralmente mais baixos em comparação com en cara imagens z-projeção. Assim, pode ser mais fácil para discriminar immunostaining (específico) 'real' e estabelecer ganho confocal fixo e valores de deslocamento utilizando seções transversais ópticos 13-15,18. Por exemplo, em um modelo de rato com miastenia gravis (where placa terminal AChR coloração é acentuadamente reduzida) endplates foram claramente delineadas nas seções transversais ópticos 18,21. As diferenças na intensidade média de fluorescência na JNM são susceptíveis de reflectir densidade alterada da proteína alvo dentro da especialização sináptica. Uma desvantagem é que, em algumas situações, uma alteração estrutural na proteína alvo ou oclusão da ligação do anticorpo por proteínas vizinhas pode explicar a intensidade da coloração alterada.

O projeto de experimentos requer alguma consideração. Em muitos casos, o experimento teria como objectivo testar o impacto de um transgene, knockdown gene ou estado de doença, do tamanho do MNJ. O grupo de amostra experimental pode então ser comparado com jovens (tipo selvagem) ratos saudáveis ​​do mesmo sexo e antecedentes genéticos. Os valores de base para a área de sinaptofisina placa terminal, AChR e sobreposição sináptica durante vários músculos são dadas na Tabela 1. O tamanho da amostra irá depender do grau de animaisvariação -para-animais dentro dos grupos de tratamento e o tamanho do efeito (diferença de meios para o experimental versus os grupos de controlo por desvio padrão). Quando a análise é restrita a imagens de boa qualidade um bom grau de consistência foi encontrada na amostra para as zonas de placa terminal entre os dois meses de idade camundongos C57Bl6J saudáveis ​​do sexo feminino (Figura 6A e B). Assim, foi possível demonstrar significativas reduções de 30-40% na área sináptica em camundongos injetados com IgG de miastenia anti-Musk-positivo gravis pacientes, em comparação com os controles com um tamanho de amostra de três ratos 17,20,32. Camundongos idosos apresentou maior variação de animal para animal em parâmetros de placa terminal de ratos jovens 22. Consequentemente experimentos envolvendo camundongos com idade pode exigir amostras maiores.

Se a principal preocupação é o de medir o tamanho da face da placa terminal en seguida, o ganho e configurações de nível de compensação deve ser optimizado para cada indivíduo JNM. IndivNMJs idual podem variar consideravelmente no brilho da AChR e coloração synaptophysin, particularmente quando estados de doença são examinados. Além disso, a intensidade de fluorescência extra-sináptica (não específica) é muitas vezes maiores e mais variáveis ​​em músculos de animais idosos, em comparação com os dos animais jovens saudáveis ​​(Figura 5C e D). O 1-256 escala de cinza deve ser plenamente explorado, de modo a maximizar a informação tonal que será retida nas imagens finais. Isto irá envolver ajustar o ganho e desvio níveis para cada JNM para que uma pilha-z tem de ser recolhido. A Figura 5D mostra um exemplo de uma imagem em que a informação JNM tonal pode ser crítico para a definição dos limites da área de pré- e pós- especializações sináptica.

As medições das zonas sinápticas podem ser aplicadas a diferentes preparações de músculo e experiências. A maioria das nossas medições de áreas sinápticas têm empregado criosecções longitudinais de pressão músculos congelados. Congelamento do músculo antes da fixação mantém a antigenicidade de uma ampla gama de proteínas. Quando compatível com o antígeno, fixação paraformaldeído e infiltração de sacarose antes cryosectioning (passo 2.1) pode proporcionar uma melhor preservação da estrutura NMJ. Estrutura de preservação óptima pode ser obtido por perfusão cardíaca com paraformaldeído. Artefactos de congelamento e de corte podem ser completamente evitados por placas terminais de rotulagem na superfície do músculo e de imagem NMJs intactas em fascículos provocavam a partir do músculo fixo 21. Independentemente da preparação, os procedimentos de amostragem, tratamento de imagens e quantificação área permanecem inalteradas (protocolo passos 4-5). Para uma aplicação sistemática de protocolos de amostragem, de imagem e análise cegos (utilizando diferentes operadores, diferentes amostras de ratos e tempos diferentes), pode resultar em valores médios bastante reproduzíveis (comparar Cheng et al. E Tse resultados na Tabela 1).

"> Placas terminais foram descritos como tornando-se" fragmentado "numa variedade de estados de doença. Por exemplo, o envelhecimento em músculos de rato, degeneração esporádico de uma fibra muscular (seguido pela sua regeneração) resultou na remodelação do recirculador, como o pretzel-RACh placa de formar aglomerados múltiplos menor RACh 6. Em ratinhos injectados com IgG de anti-almíscares pacientes com miastenia gravis, a fragmentação do recirculador, foi bastante diferente. A placa terminal AChR pretzel largamente disperso, deixando para trás uma constelação de pequenos (<4 m 2) microagregados RACh ' '20,21. Estes dois exemplos destacam a necessidade de comparar as distribuições de tamanho para clusters RACh em placas terminais de controle versus animais experimentais 21.

Outros métodos têm sido relatados para a avaliação da área sináptica ou intensidade de coloração na NMJ. Placas motoras às vezes pode ser dobrada de modo que as imagens de projecção z bidimensionais usados ​​aqui pode subestimar synáreas aptic. Reconstruções confocal tridimensionais pode fornecer medidas mais precisas se absoluta área sináptica deve ser definido 33. Uma vantagem chave do protocolo z projecção descrito aqui, no entanto, é a sua relativa simplicidade, que tem permitido a um grande número de placas terminais a ser medido a partir de vários grupos de tratamento e uma identificação fiável dos potenciais alterações. O protocolo para avaliar as intensidades de coloração de placa terminal pode ser adaptado para estudar as alterações nos níveis de muitas proteínas diferentes sinápticos. O método é, contudo, limitada pela exigência de que todas as amostras são processadas para imunofluorescência então fotografada durante a mesma sessão confocal. Um estudo recente da Yampolsky et al. 5 descreveu um método para medir a densidade de placa terminal AChR que possam ajudar a superar esta limitação. Neste estudo, os mesmos campos de placas terminais foram fotografadas em várias configurações de energia do laser diferentes. A inclinação da relação entre a potência do laser e rhodamine-BGT intensidade de fluorescência foi utilizado para avaliar mudanças relativas de densidade AChR em placas terminais em diferentes camundongos 5. Este método pode ser útil para a comparação AChR intensidade em amostras fotografada em diferentes momentos ao longo de um estudo prolongado.

AChR-AChR FRET fornece informações específicas e complementares sobre a organização do AChRs placa terminal. Electron auto-radiografia microscópica usando 125. I-α-BGT mostrou AChRs a ser embalados hermeticamente com uma densidade planar de 10 4 m -2 imediatamente sob cada local pré-sináptica da liberação do transmissor, enquanto adjacentes invaginações da membrana conter densidades muito mais baixos de AChR 34. AChR-AChR FRET torna relativamente fácil de detectar alterações (sub-microscópicos) em embalagem AChR. A redução da eficiência da TERF reflecte uma redistribuição sub-microscópico de AChRs na membrana pós-sináptica, que não poderia ser detectado por uma alteração na intensidade de fluorescência média BGT. Multiple fagentes pode causar uma alteração na eficiência de TERF. Estes incluem o espaçamento dador-aceitador e orientações relativas, assim como o ambiente molecular 35,36. A redução da eficiência da placa terminal FRET pode eventualmente surgir a partir de uma alteração na geometria da estrutura AChR. No entanto, é mais provável que seria devido a uma redução na percentagem de AChRs que são embalados em nano-escala estrutura molecular 14 pós-sináptica.

Perda da conexão entre os neurônios motores e fibras musculares parece ser a causa imediata da fraqueza muscular na doença do neurônio motor e em sedentário envelhecimento 9,22,23. Métodos e parâmetros comuns para NMJs medição deve tornar mais fácil para os diferentes grupos de pesquisa para comparar e achados contraste publicado. A partilha de protocolos detalhados (e futuras melhorias sobre eles) podem ajudar a acelerar o progresso na compreensão dos mecanismos de manutenção NMJ e como ele pode ser afetado em estados de doença.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning confocal microscope Leica DM 2000 with  TCS SP2 system Most scanning confocal microscopes should be suitable. 
Zeiss LSM 510 Meta 
Leica SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) Life technologies B35451 Used for labelling AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) Life technologies B35450 Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece 
rabbit anti-synaptophysin Life technologies 18-0130 Different batches of primary antibody differ in effective working dilution
FITC-anti-rapsyn mab1234 Milipore FCMAB134F Monoclonal antibody conjugated to FITC
FITC-donkey anti-rabbit IgG Jackson 711-095-152 Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) ProSciTech IA018 Cryostat embedding matrix for freezing  muscles
DABCO Sigma 10981 Mounting medium that slows photobleaching of fluorophores

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
  2. Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
  3. Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
  4. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
  5. Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
  6. Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
  7. Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
  8. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
  9. Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
  10. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  11. Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
  12. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  13. Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
  14. Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
  15. Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
  16. Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
  17. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
  18. Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
  19. Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
  20. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
  21. Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
  22. Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
  23. Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
  24. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
  25. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hedrich, H. J., Bullock, G. Elsevier. (2004).
  26. Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. Brown. Dubuque, Iowa. (1988).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  28. Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
  29. Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
  30. Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
  31. Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
  32. Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
  33. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
  34. Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
  35. Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
  36. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).

Comments

1 Comment

  1. Tips for experimenters (based upon feedback and queries regarding our JoVE publication):

    Please ensure before attempting any image quantification measurements that all images are set to the same scale-factor. ImageJ or Fiji often uses default scaling factors that are inherent to the image file. We recommend that all scaling is removed before attempting any image analysis which can be done by following the steps below:

    1. With your image opened in ImageJ select 'Analyze' from the toolbar and then select 'Set Scale'
    2. In the new Set Scale pop-up menu select 'Click to Remove Scale'. From now on, any area or length measurements made on the image will be outputted as pixel count measurements.
    3. To ensure that future images opened in the same ImageJ session also have scaling factors removed, tick the 'Global' box in the same pop-up menu

    Some researchers have also been experiencing issues where the ‘Measure’ command is not measuring the area within the set threshold of an image, but rather, it measures that area of the selected polygon area. This often leads to area measurements to be larger than what was expected. One problem that can lead to this issue is that ImageJ is set to measure the polygon selection and thus overrides the thresholded selection by ignoring it. To fix this issue:

    1. Select ‘Analyze’ from the ImageJ toolbar menu
    2. Now select ‘Set Measurements’
    3. In the new Set Measurements pop-up menu ensure that the ‘Limit to Threshold’ option is ticked. This will ensure that all measurements (area, intensity, etc..) will be made to regions defined by the threshold rather than the polygon selection.

    Reply
    Posted by: Nigel T.
    April 20, 2015 - 10:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics