Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) по изучению РНК-белковых взаимодействий: ИРЭ / IRP примера

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы приводим протокол для анализа РНК / белковые взаимодействия. Сдвиг анализа электрофоретической подвижности (EMSA) основан на дифференциальной миграции РНК / белковые комплексы и свободной РНК в процессе электрофореза нативного гель. При использовании радиоактивно помеченных РНК-зонда, РНК / белковые комплексы могут быть визуализированы с помощью авторадиографии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

РНК / белковые взаимодействия являются критическими для посттранскрипционных регуляторных путей. Среди наиболее изученных цитозольными РНК-связывающих белков железные регуляторные белки, IRP1 и IRP2. Они связывают гладить реактивные элементы (IRES) в нетранслируемых регионов (НТО) нескольких целевых мРНК, тем самым управляя перевод или стабильность мРНК. IRE / ПИВТ взаимодействия были широко изучены EMSA. Здесь мы опишем протокол EMSA для анализа ИРЭ-связывающую активность в IRP1 и IRP2, которые могут быть обобщены для оценки активности других РНК-связывающих белков, а также. Неочищенный лизат белков, содержащих РНК-связывающий белок, или очищенный препарат этого белка, инкубируют с избытком 32 P-меченного зонда РНК, что позволило для образования комплекса. Гепарин добавляется исключает неспецифическое белок, чтобы исследовать связывание. Затем смесь анализируют без денатурации электрофорезом на полиакриламидном геле. Бесплатно зондмигрирует быстро, в то время как РНК / белковый комплекс экспонатов отсталых мобильности; Таким образом, процедура также называется "гель задержка" или "bandshift" анализа. После завершения электрофореза гель сушат и РНК / белковые комплексы, а также свободный зонда, обнаруживаются с помощью авторадиографии. Общая цель протокола заключается в выявлении и количественной IRE / IRP и другие РНК / белковые взаимодействия. Кроме того, EMSA также может быть использован для определения специфичности, аффинности связывания и стехиометрию взаимодействия РНК / белок изучаемого.

Introduction

EMSA был первоначально разработан для изучения связи ДНК-связывающих белков с последовательностями ДНК-мишени 1,2. Принцип одинаков для РНК / белковые взаимодействия 3, которая является предметом данной статьи. Вкратце, РНК отрицательно заряженные и будет мигрировать к аноду при не-денатурирующих электрофореза в полиакриламидном (или агарозных гелей). Миграция в геле зависит от размера РНК, которая пропорциональна его заряда. Специфическое связывание белка с РНК изменяет свою подвижность, и комплекс мигрирует медленнее по сравнению со свободной РНК. Это, главным образом, за счет увеличения молекулярной массы, но также к изменениям в ведении и, возможно, конформации. Используя меченой РНК в качестве зонда позволяет легко мониторинг "задержки в геле" или "bandshift". Использование 32 P-меченой РНК зондов является очень распространенным явлением и обладает высокой чувствительностью. Миграция РНК / белковые комплексы и свободной РНК обнаруженыавторадиографией. Недостатки являются короткий период полувыведения из 32 P (14,29 дней), постепенное ухудшение качества зонда из-за радиолиза, требование лицензии радиоактивности и инфраструктуры на предмет радиоактивности работы, и потенциальных проблем биобезопасности. Таким образом, альтернативные-изотопные методы мечения РНК-зонда были разработаны, например, с флуорофорами или биотин, которые позволяют обнаружение флуоресцентной или хемилюминесцентной изображений 4,5. Ограничения этих методов более высокую стоимость и часто пониженная чувствительность по сравнению с изотопной метки, и потенциал неизотопных этикеток вмешиваться взаимодействия РНК / белок. Неденатурирующем гели полиакриламида подходят для большинства применений EMSA и обычно используются. В отдельных случаях, гели агарозы могут представлять собой альтернативу для анализа больших комплексов.

Основным преимуществом EMSA является то, что он сочетает в себе простоту, чувствительность и надежность 4 </ SUP>. Анализ может быть завершена в течение нескольких часов и не требует сложного инструментария. РНК / белковые взаимодействия могут быть обнаружены с помощью EMSA в таких низких концентрациях, как 0,1 нМ или менее, и в широком диапазоне условий связывания (рН 4,0 - 9,5, концентрация соли одновалентного 1 - 300 мм, а температура 0 - 60 ° С).

РНК / белок образование комплекса также может быть изучена с фильтром анализа связывания. Это просто, быстро и недорого процедура, основанная на сохранении РНК / белковых комплексов в нитроцеллюлозный фильтр, в то время как свободной РНК зонд проходит через 6. По сравнению с EMSA, оно ограничено в случаях, когда РНК-зонда содержит несколько сайтов связывания, или неочищенный экстракт содержит более одного РНК-связывающие белки, которые связываются с зондом в том же месте. В то время как несколько РНК / белковые взаимодействия будет избежать обнаружения фильтра-анализе связывания, они могут быть легко визуализированы с помощью EMSA. В некоторых случаях, визуализация наканунеп возможно, когда два РНК / белковые комплексы со мигрируют (например, человек IRP1 / IRE и IRP2 / IRE комплексы), добавляя антитела против одного из РНК-связывающих белков в реакции EMSA, уступая дальнейшее замедление на геле ( "supershift") 7.

EMSA широко используется для изучения IRP1 и IRP2, которые являются пост-транскрипционные регуляторы метаболизма железа 8-10. Они работают путем связывания с ИРЭС филогенетически консервативных шпилька структур в UTRs нескольких мРНК 11. Ires были впервые обнаружены в мРНК, кодирующих ферритина 12 и рецептора трансферрина 1 (TfR1) 13, белки хранения железа и поглощения, соответственно. Позже, Ires были найдены в эритроидных конкретных аминолевулинат синтазы (ALAS2) 14, митохондриальная аконитазы 15, Ferroportin 16, двухвалентный металл транспортера 1 (DMT1) 17, индуцируемого гипоксией фактора 2 18, и других генов 19-21. Н прототип и L-ферритина мРНК содержат один IRE в их 5 'UTR, а TfR1 мРНК содержит несколько Ires в своей 3' UTR. IRE / ПИВТ взаимодействия специфически ингибируют ферритина перевод мРНК пространственно блокируя его ассоциацию 43S субъединицы рибосомы; Кроме того, они стабилизируют TfR1 мРНК против эндонуклеолитическим расщепления. IRP1 и IRP2 доля сходство обширная последовательности и обладают высокой ИРЭ-связывающей активности железосодержащих голодали клеток. В железо-изобилует клеток, IRP1 собирает кубан Fe-S кластер, который преобразует его в цитозоле аконитазы за счет его ИРЭ-связывающей активности, в то время как IRP2 деградирует протеасомной. Таким образом, IRE / ПИВТ взаимодействия зависит от состояния клеточного железа, но также регулируются другими сигналами, такими как H 2 O 2, окись азота (NO) или гипоксии. Здесь мы опишем протокол для оценки ИРЭ-связывающей активности от неочищенных клеточных и тканевых экстрактов EMSA. Мы использовали 32 P-меченого Н-ферритина IRE зонд, который был создан путем транскрипции в пробирке из шаблона плазмидной ДНК (I-12.CAT), где последовательность ИРЭ был первоначально введенного в смысле ориентации ниже по потоку от полимеразы Т7 РНК-сайта путем Клонирование отожженных синтетических олигонуклеотидов 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Экспериментальные процедуры с мышами были утверждены Care комитета животных Университета МакГилл (протокол 4966) мимо.

1. Получение белковых экстрактов из культивируемых клеток

  1. Промыть культивируемые клетки дважды 10 мл охлажденного на льду забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
  2. Собрать прилипшие клетки или с резиновой полицейского или пластмассовым скребком клеток в 1 мл охлажденного льдом PBS, передачи суспензии в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  3. Спина в микроцентрифужных в течение 5 мин при 700 мкг, при 4 ° С. Отберите PBS.
  4. Добавить 100 мкл ледяной цитоплазматической буфера для лизиса (Таблица 1) в 10 7 клеток, и пипеткой вверх и вниз.
  5. Инкубируют на льду в течение 20 мин.
  6. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при 4 ° С.
  7. Отменить осадок. Трансфер супернатант в новую 1,5 мл трубки микроцентрифужных и держать на льду.
  8. Detгорностай концентрацию белка (обычно 1 - 10 мкг / мкл) с помощью 23 Бредфорда.
  9. Кратные и хранить клеточные экстракты при -80 ° С до использования.

2. Подготовка белковые экстракты из мышиной печени и селезенки

  1. Эвтаназии мышь с CO 2 ингаляции.
  2. Положите эвтаназии животных на чистую площадку над вскрытии борту. Откройте живота с ножницами.
  3. Проанализируйте печени и селезенки с помощью ножниц и щипцов и промойте каждой ткани примерно в 50 мл ледяной PBS.
  4. Сразу сократить ткани на мелкие кусочки скальпелем (например: примерно 1 - 2 мм 3).
  5. Без задержек, положить куски ткани в свежем криоскопической пробирки, а затем оснастки заморозить их в жидком азоте. Магазин оснастки замороженных аликвот ткани при температуре -80 ° С до использования.
  6. Перемешать один кусок замороженной ткани (примерно 1 - 2 мм 3) в 0,25 - 0,5 млледяной цитоплазматический буфера для лизиса (Таблица 1) с тканевом гомогенизаторе в течение 10 сек.
  7. Передача гомогената в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и охладить на льду в течение 20 мин.
  8. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при 4 ° С.
  9. Отменить гранул и передачи супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Держите на льду.
  10. Определить концентрацию белка (обычно 1 - 10 мкг / мкл), используя Бредфорда 23.
  11. Кратные и хранить клеточные экстракты при -80 ° С до использования.

3. Получение радиоактивно меченного зонда ИРЭ-

  1. Линеаризации ИРЭ-содержащей плазмиды I-12.CAT 22 путем инкубации при 37 ° С в течение 1 ч с рестриктазой XbaI (1 U на мкг плазмиды), которая расщепляет ниже последовательности IRE. Линеаризованной плазмидной будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции в пробирке.
  2. Настройкап ин витро транскрипции реакцию в общем объеме 20 мкл. С помощью растворы, приведенные в таблице 2, и добавить: 1 мкл линеаризованной плазмидной шаблона, 4 мкл буфера транскрипции; 1 мкл смеси АТФ / CTP / GTP смеси 10 мкл [α- 32 P] -UTP, 2 мкл дитиотреитола, РНКазы ингибитор 1 мкл и 1 мкл РНК-полимеразы Т7. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз.
  3. Инкубируют при 40 ° С в течение 1 ч 24.

4. Очистка радиоактивной ИРЭ-зонда

  1. Завершить в пробирке реакция транскрипции путем добавления 1 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8. перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
  2. Добавить 10 мкл 10 мг / мл тРНК, в качестве носителя для лучшего осаждения. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз.
  3. Добавить 82,5 мкл 3 М ацетата аммония. Смешайте встряхиванием.
  4. Добавить 273 мкл этанола. Смешайте встряхиванием.
  5. Пусть стоять при комнатной температуре в течение 5 мин.
  6. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при комнатной температуре. Удалите супернатант.
  7. Вымойте гранул с 100 мкл 70% этанола.
  8. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при комнатной температуре. Удалите супернатант.
  9. Воздух сухой осадок в течение 10 мин.
  10. Ресуспендируют осадок в 100 мкл бидистиллированной, ранее в автоклаве H 2 O.
  11. Количественная радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном счетчике, аликвоту радиоактивно меченного зонда IRE и хранят при -80 ° С до использования. Замороженные аликвоты могут быть использованы на срок до 3 недель.

5. Получение нативного полиакриламидном геле в EMSA

  1. Соберите гель (16 х 16 см) с помощью 1,5 мм проставки и гребень.
  2. Чтобы приготовить 6% полиакриламидном геле родным, использовать растворы, приведенные в таблице 3 Смешайте 7,5 мл 40% акриламид:. Бис-акриламида, 5 мл 5-кратным КЭ и 37,5 млдвойную дистилляцию H 2 O.
  3. Добавить 0,5 мл 10% свежеприготовленного персульфата аммония (APS) и 25 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED).
  4. Сразу залить раствор акриламида в геле и пусть он полимеризации. Подождите примерно 30 минут.
  5. Соберите электрофореза с гелем, заполните танки с 0,5 × КЭ и соединиться с источником питания.

6. электрофоретической подвижности сдвига Анализ

  1. Развести 25 мкг белкового экстракта из клеток или тканей с цитоплазматической буфере для лизиса (таблица 1) в общем объеме 10 мкл (более низкие концентрации белка также могут быть использованы). Держите на льду. При необходимости добавить 1 мкл 1: 4 разбавляют 2-меркаптоэтанола (2-Me), чтобы активировать спящий IRP1 (конечная концентрация: 2%) 25.
  2. Развести меченых IRE зонд в дважды дистиллированной H 2 O в 200 000 копий в минуту / мкл, тепло денатурация при 95 °С в течение 1 мин, и остыть при комнатной температуре в течение по меньшей мере 5 мин.
  3. Настройка реакции EMSA, добавив 1 мкл меченого ИРЭ зонда выписке белка.
  4. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
  5. Добавить 1 мкл 50 мг / мл гепарина в реакции (ингибировать неспецифические белковые взаимодействия с зондом 9) и продолжают инкубацию в течение еще ​​10 мин. Алиготе исходного раствора гепарина (50 мг / мл) и хранят при -80 ° С.
  6. При использовании длинных радиоактивными зондами (> 60 нуклеотидов), добавляют 1 мкл РНКазы Т1 (1 ед / мкл) и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы уменьшить неспецифическую белок связывания с зондом, и чтобы лучшее разделение РНК / белок Комплекс во время электрофореза.
  7. Добавить 3 мкл загрузочного буфера (80% глицерин + бромфенола синего), перемешать и нагрузка на 6% неденатурирующем полиакриламидном геле.
  8. Запустите гель в течение 60 мин при 130 V (5 В / см).
  9. Transfer гель на большой фильтровальной бумаги и сухим.
  10. Expose в пленку и развивать радиоавтографии. Время экспозиции может находиться в диапазоне от 1 часа (или меньше) до O / N.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Радиоактивно IRE проба была приготовлена, как описано в разделах 3 и 4 протокола. Последовательность зонда 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC СГГ C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; в выделенные жирным шрифтом нуклеотиды представляют собой непарный C остаток и цикл, которые являются критическими IRE особенности. Удельная активность зонда была 4,5 × 10 9 имп / мкг РНК.

Для оценки влияния железа возмущений на ИРЭ-связывающей активностью, мышиные RAW264.7 макрофаги не лечить, или лечить с гемина (источник железа) или десферриоксамин (железо хелатора). Лизаты получают и анализируют с помощью EMSA с зондом IRE (8000 импульсов в минуту / мкг белка). Типичные данные приведены на рисунке 1, с более короткими и более длинных экспозиций авторадиограмм на левой и правой панелей, соответственно. Мышиные IRE / IRP1 и IRE / IRP2 комплексы обладают различной подвижностью и два отдельные полосывидны в полосе 1, что соответствует необработанных клеток. Утюг комплексообразования глубоко побудило IRE-связывающих деятельность как IRP1 и IRP2 (дорожка 2), в то время как препараты железа уменьшается их (дорожка 3). Предварительное 2% 2-МЕ полностью активном IRP1 (нижняя панель), даже в экстрактах железных клетках, обработанных. Это свидетельствует о том, что железо возмущения не попадают на стабильность IRP1, а также служит в качестве контроля нагрузки. В отличие от предварительной обработки 2-МЕ ингибирует ИРЭ-связывающую активность в IRP2. БЫСТРЫЙ мигрирующие неспецифические полосы не зависит от железа.

Далее, мы проанализировали ИРЭ-связывающей активности в печени дикого типа, Irp1 - / - и Irp2 - / - мышей, ранее кормили в течение одной недели со стандартом или обогащенной железом диете (рис 2). Irp1 - / - и Irp2 - / - мышей были любезно предоставлены доктором МВт Hentze (EMBL, Гейдельберг). В диких экстрактов печени типа, IRP1 приходится на крупной фракции ИРЭ-связывающей активности и IRE / IRP2 комплексов были едвавидимые (дорожки 1, 2), что согласуется с предыдущими наблюдениями 26. IRP2 выставлены мощный ИРЭ-связывающей активности в экстрактах печени Irp1 - / - мышей (дорожки 3, 4). В этих условиях, не наблюдалось IRE / IRP1 комплексы. Кроме того, нет ИРЭ / IRP2 комплексы не образовывались в экстрактах печени Irp2 - / - мышей (дорожки 5, 6). Кормление мышей с высоким содержанием железа диете снижение печени ИРЭ-связывающая активность обоих IRP1 и IRP2; Этот эффект был более драматичным на IRP2 (полосы 7-12). Следует отметить, что после обработки дикого типа или Irp2 - / - экстрактов печени с 2-МЕ, ИРЭ-связывающая активность IRP1 была увеличена до точки, где она смещается почти все IRE зонд (это отчетливо наблюдается в более короткий воздействия авторадиограмм На левой панели).

Наконец, мы оценивали ИРЭ-связывающей активности в печени и селезенке дикого типа и Hjv - / - мышей (рис 3). Hjv - / - мышей были любезно предоставлены доктором НК-Эндрюс (Университет Дьюка, Северная Каролина). Эти животные представляют собой модельнаследственной гемохроматоз 27, болезнь системной перегрузки железом, где избыточное железо накапливается в паренхиматозных клеток, в то время как макрофаги ретикулоэндотелиальной остается дефицит железа 28. Как и ожидалось, печень Hjv - / - мышей (с железом загружен гепатоцитов) выставлены уменьшилось ИРЭ-связывающую активность по сравнению с дикого типа (полосы 1-4). С другой стороны, ИРЭ-связывающая активность была выше в селезенке Hjv - / - мышей (содержащие железо-дефицитной макрофаги; дорожки 5-8). Здесь опять, лечение 2-ME способствует почти полное смещение зонда IRE в экстрактах печени (см короче экспозиции авторадиограммах на левой панели).

Таблица 1. Цитоплазма буфера для лизиса.

1% Triton X100
25 мМ Трис-HCl, рН 7,4
40 мМ KCl
  1. Решение следуетавтоклавировать и хранить при комнатной температуре.
  2. Ингибиторы протеазы, такие как 10 мкг / мл лейпептина и 0,1 мМ фенилметансульфонилфторид (PMSF) могут быть добавлены перед использованием.
  3. Добавление свежего 1 мМ dithiotheritol рекомендуется для обнаружения IRP2 деятельности.

Таблица 2. Исходные растворы для в пробирке реакции транскрипции.

1 мкг / мкл линеаризовать шаблон плазмиду
5x буфера транскрипции (поставляется вместе с T7 РНК-полимеразы)
20 мМ смесь АТФ, CTP и GTP
3000 Ки / ммоль [α-32P] -UTP
100 мМ дитиотреитола
10 U / мкл ингибитора РНКазы
20 ед / мкл РНК-полимеразы Т7


<сильные> Таблица 3. Стоковые растворы для не-денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле.

40% акриламида: бис-акриламида (37,5: 1)
5x КЭ (Трис / Борат / ЭДТА)

Для изготовления 1 л 5x КЭ, использовать 54 г трис-основани, 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).

Рисунок 1
Рисунок 1. Железная зависимая регуляция IRE-связывающий деятельность в RAW264.7 макрофагов. 10 7 клеток были либо не лечить или лечить O / N с 100 мкМ гемина или десферриоксамин. Цитоплазматическая лизаты получали и анализировали с помощью EMSA с 32 P-меченного зонда ИРЭ в отсутствие (вверху) или в присутствии 2% 2-МЕ (нижней). Позиции ИРЭ / IRP1 и IRE / IRP2 комплексов и свободного ИРЭ зонда обозначены стрелками. Звезда указывает на неспецифическую группу. Более короткие и более длинные разоблачения авторадиограммах показаны в левой и правой панелях, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Анализ ИРЭ-связывающий деятельность в печени дикого типа (WT), Irp1 - / - и Irp2 - / -. Мышей в возрасте 5 недель мышей (п = 2 для каждого генотипа), все в C57BL / 6 фоне 29, помещали на стандарт или высокой железа диете (содержащей 2% карбонильного железа). После одной недели животные были умерщвлены. Печеночные белковые экстракты получали и анализировали с помощью EMSA с 32 P-меченного зонда ИРЭв отсутствие (вверху) или в присутствии 2% 2-ME (внизу). Позиции ИРЭ / IRP1 и IRE / IRP2 комплексов и свободного ИРЭ зонда обозначены стрелками. Звезда указывает на неспецифическую группу. Более короткие и более длинные разоблачения авторадиограммах показаны в левой и правой панелях, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Анализ ИРЭ-связывающий деятельность в печени и селезенке дикого типа (WT) и Hjv - / - мышей. 10 недель старых мышей (п = 2 для каждого генотипа), все в C57BL / 6 фоне 30, были подвергнуты эвтаназии. Печеночная и селезенки белковые экстракты получали и анализировали с помощью EMSA с 32 P-меченного зонда ИРЭ в отсутствие (вверху) или в присутствии2% 2-МЕ (внизу). Позиции ИРЭ / IRP1 и IRE / IRP2 комплексов и свободного ИРЭ зонда обозначены стрелками. Звезда указывает на неспецифическую группу. Более короткие и более длинные разоблачения авторадиограммах показаны в левой и правой панелях, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы опишем протокол, который был разработан для изучения IRE-связывающих деятельности IRP1 и IRP2, и мы показываем репрезентативные данные. С помощью различных зондов, этот протокол также может быть скорректирована для изучения других РНК-связывающих белков. Важным шагом является размер зонда. Использование длинных зондов, который является общим, когда точное место связывания неизвестно, может привести к РНК / белковые комплексы, которые не мигрируют по-другому, чем в свободной РНК. В этом случае, желательно, для удаления несвязанного РНК путем обработки РНКазой Т1 (этап 6.6). Качество зонда также очень важно. Наилучшие результаты получены со свежеприготовленным радиоактивно помеченных РНК. Очистка гель 10 не является необходимым, но может улучшить внешний вид EMSA, если реакция в пробирке транскрипции для подготовки зонда дающий Досрочное прекращение продукты (и если нет пищеварение шаг РНКазы T1 не входит в комплект). Запуск электрофореза родной гель слишком быстро май привести к перегреву, что может привести к диссоциации РНК / белковые комплексы и привести в нечетких полос.

Количественные результаты могут быть получены путем анализа интенсивности запаздывающих полос с phosphorimaging. Количественными действительны только при Проба РНК присутствует в избытке, и не ограничивает для связывания РНК. Близость взаимодействия РНК / белок, в лице константы диссоциации K D, который связан со свободной энергией ΔG о, может быть оценена в равновесных условиях путем титрования РНК-связывающей активности с уменьшением количества меченого зонда 3. Взаимодействие IRE / IRP1 широко характеризуется физико-химическим 9,31. Титрование EMSA эксперименты с различными количествами белка РНК-связывающего могут быть выполнены, чтобы вычислить стехиометрию 3. Специфика для связывания может быть легко подтверждено конкурентных экспериментах с избытком немеченого «холодной» компetitor РНК 3. Только конкретные участники должны снизить интенсивность запаздывающего радиоактивного группы. Специфичность можно также контролировать включением антитела против РНК-связывающего белка в реакции EMSA, который даст "supershift" 7. Это также может быть использована для определения идентичности РНК-связывающего белка. Нет "supershift" не должно наблюдаться с не-специфических антител или предварительно иммунной сыворотки.

В заключение, EMSA является мощным средством анализа РНК / белковые взаимодействия. Это сравнительно легко выполнять и требует минимального инфраструктуры. Это не так просто, как с фильтром, анализ связывания, но даст более информативные и точные данные, когда несколько РНК-связывающие белки специфически взаимодействовать с зондом (таких, как IRP1 и IRP2). Следует отметить, что в отличие от мышей, человека IRE / IRP1 и ИРЭ / IRP2 комплексов совместно мигрировать в EMSA. Тем не менее, они могут быть разделены "supershifts̶1; со специфическими антителами 7. EMSA не ценно для детального отображения РНК / белковые взаимодействия; другие методы, такие как анализ защиты РНКазы, toeprinting или сшивания 32 являются более подходящими. Тем не менее EMSA является отличным выбором для открытия новых РНК / белковые взаимодействия, как это было в случае с ИПР 8, но также и для подтверждающих данные, полученные с вычислительной или высокой пропускной экспериментальных подходов. Кроме того, EMSA превосходит для анализа специфичности и физико-химические свойства РНК / белковые взаимодействия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics