التحول التنقل الكهربي الفحص (EMSA) لدراسة التفاعلات RNA-البروتين: حفيظة / IRP مثال

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا نقدم بروتوكول لتحليل التفاعلات RNA / البروتين. ويستند هذا التحول فحص التنقل الكهربي (EMSA) على الهجرة التفاضلية المجمعات RNA / البروتين والحمض النووي الريبي مجانا خلال الأصلي الكهربائي للهلام. باستخدام مسبار RNA رديولبلد، RNA المجمعات / البروتين يمكن تصور من قبل تصوير الإشعاع الذاتي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التفاعلات RNA / بروتين حاسمة لمسارات التنظيمية ما بعد النسخي. بين البروتينات ملزم RNA عصاري خلوي أفضل وصف هم البروتينات التنظيمية الحديد، IRP1 وIRP2. كانت ملزمة لتسوية عناصر الاستجابة (IRES) داخل المناطق غير مترجمة (UTRs) من عدة أنواع من mRNAs الهدف، وبالتالي السيطرة على الترجمة من mRNAs أو الاستقرار. تم التفاعلات IRE / IRP درس على نطاق واسع من قبل EMSA. هنا، نحن تصف بروتوكول EMSA لتحليل النشاط IRE ملزم من IRP1 وIRP2، والتي يمكن تعميمها على تقييم نشاط البروتينات الأخرى ملزم RNA كذلك. والمحللة البروتين الخام التي تحتوي على البروتين ملزم RNA، أو إعداد النقي من هذا البروتين، وحضنت مع وجود فائض من 32 ف المسمى RNA التحقيق، والسماح لتشكيل تعقيدا. يضاف الهيبارين لمنع البروتين غير محددة للتحقيق ملزمة. وفي وقت لاحق، ويتم تحليل خليط من غير تغيير طبيعة-الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد. التحقيق الحرةيهاجر بسرعة، في حين أن RNA / البروتين المعارض معقدة التنقل المتخلفين. وبالتالي، يتم استدعاء الإجراء أيضا "التخلف هلام" أو "bandshift" الفحص. بعد الانتهاء من الكهربي، وجفت جل ويتم الكشف عنها المجمعات RNA / البروتين، وكذلك التحقيق الحرة، من خلال تصوير الإشعاع الذاتي. ويتمثل الهدف العام من البروتوكول هو لكشف وتحديد IRE / IRP وغيرها من التفاعلات RNA / البروتين. وعلاوة على ذلك، EMSA يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد النوعية وتقارب ملزم، ورياضيات الكيمياء للتفاعل RNA / البروتين قيد التحقيق.

Introduction

وقد تم تطوير EMSA في الأصل لدراسة العلاقة من البروتينات الحمض النووي ملزم مع تسلسل الحمض النووي الهدف 1،2. والمبدأ هو مماثل لتفاعلات RNA / البروتين الذي هو محور من هذه المادة. لفترة وجيزة، واتهم RNA سلبا وسوف يهاجر نحو القطب الموجب خلال عدم تغيير طبيعة-الكهربائي في بولي أكريلاميد (أو الاغاروز) المواد الهلامية. الهجرة داخل هلام تعتمد على حجم الحمض النووي الريبي، والذي يتناسب مع شحنتها. ملزمة محددة من البروتين لRNA يغير التنقل بها، ويهاجر المعقدة أبطأ بالمقارنة مع RNA مجانا. ويرجع ذلك أساسا إلى زيادة في الكتلة الجزيئية، ولكن أيضا إلى تغييرات في تهمة وربما التشكل هذا. الاستفادة من RNA وصفت بأنها التحقيق يتيح رصد سهل من "التخلف هلام" أو "bandshift". استخدام 32 تحقيقات RNA المسمى P شائع جدا ويوفر حساسية عالية. تم الكشف عن هجرة RNA / مجمعات البروتين والحمض النووي الريبي مجاناعن طريق تصوير الإشعاع الذاتي. السلبيات هي قصيرة العمر النصفي لل32 P (14.29 يوما)، وتدهور تدريجي في نوعية التحقيق بسبب الإنحلال الإشعاعي، واشتراط وجود رخصة النشاط الإشعاعي والبنية التحتية للعمل الإشعاعي، والمخاوف المحتملة للسلامة الأحيائية. لذلك، تم تطوير أساليب غير النظائر بديلة لوصفها التحقيق RNA، على سبيل المثال مع fluorophores أو البيوتين، والتي تتيح الكشف عن طريق الفلورسنت أو chemiluminescent التصوير 4،5. القيود المفروضة على هذه الأساليب هي تكلفة أعلى، وغالبا ما خفض حساسية مقارنة مع وضع العلامات النظائر، واحتمال من التسميات غير النظائر للتدخل في التفاعل RNA / البروتين. غير تغيير طبيعة المواد الهلامية بولي أكريلاميد هي مناسبة لمعظم التطبيقات EMSA وتستخدم بشكل شائع. في بعض الأحيان، قد المواد الهلامية الاغاروز تشكل بديلا لتحليل المجمعات الكبيرة.

والميزة الرئيسية لEMSA هو أنه يجمع بين البساطة، والحساسية، ومتانة 4 </ سوب>. الفحص يمكن أن تكتمل في غضون ساعات قليلة و لا يتطلب أجهزة متطورة. يمكن الكشف عن التفاعلات RNA / البروتين EMSA في تركيزات منخفضة تصل إلى 0.1 نانومتر أو أقل، وضمن مجموعة واسعة من الشروط الملزمة (درجة الحموضة 4،0-9،5، أحادي التكافؤ تركيز الملح 1-300 ملم، ودرجة حرارة 0-60 درجة مئوية).

ويمكن أيضا RNA / البروتين تشكيل معقد دراستها من قبل مقايسة ملزمة التصفية. هذا هو إجراء بسيط، سريع، وغير مكلفة على أساس الإبقاء على المجمعات RNA / البروتين في مرشح النيتروسليلوز، في حين يمر التحقيق RNA مجانا إلى 6. مقارنة EMSA، هي محدودة في الحالات التي يحتوي التحقيق RNA مواقع ملزمة متعددة، أو استخراج النفط الخام يحتوي على أكثر من البروتينات ملزم RNA التي تربط إلى التحقيق في نفس الموقع. في حين متعددة التفاعلات RNA / البروتين سوف يعدم قبل الفحص ملزمة التصفية، يمكن تصور بسهولة عن طريق EMSA. في بعض الحالات، والتصور هو عشيةن ممكن عندما مجمعين RNA / البروتين شارك في ترحيل (على سبيل المثال، IRP1 البشرية / IRE وIRP2 / المجمعات غضب)، وذلك بإضافة الأجسام المضادة ضد واحد من البروتينات ملزم RNA إلى رد فعل EMSA، مما أسفر عن مزيد من التخلف على هلام ( "supershift") 7.

وقد تم EMSA تستخدم على نطاق واسع لدراسة IRP1 وIRP2، والتي هي المنظمين ما بعد النسخي من استقلاب الحديد 8-10. وهي تعمل عن طريق ملزمة لIRES، والهياكل دبوس الحفاظ phylogenetically داخل UTRs العديد من mRNAs 11. تم اكتشاف IRES لأول مرة في من mRNAs ترميز الفيريتين 12 و ترانسفيرين مستقبلات 1 (TfR1) 13، والبروتينات من تخزين الحديد وامتصاص، على التوالي. في وقت لاحق، تم العثور على IRES في محمر محددة أمينوليفولينات سينسيز (ALAS2) 14، أكونيتاز الميتوكوندريا 15، ferroportin 16، نقل معدن ثنائي التكافؤ 1 (DMT1) 17، نقص الأكسجة عامل محرض 2 18، وغيرها من mRNAs 19-21. وH- النموذج و-L فيريتين من mRNAs احتواء غضب واحدة في حياتهم 5 'UTR، في حين TfR1 مرنا يحتوي IRES متعددة في تقريرها 3' UTR. التفاعلات IRE / IRP تمنع تحديدا الفيريتين الترجمة مرنا من خلال منع sterically ارتباطه من 43S الوحيدات الريباسي. وعلاوة على ذلك، فإنها استقرار TfR1 مرنا ضد الانقسام endonucleolytic. IRP1 وحصة IRP2 تسلسل واسعة التشابه وعرض عالية النشاط ملزم غضب في الخلايا المتعطشة الحديد. في الخلايا من الحديد حافل، IRP1 يجمع على cubane الحديد-S العنقودية التي تحولها إلى أكونيتاز عصاري خلوي على حساب النشاط IRE ملزم، في حين IRP2 يخضع لتدهور proteasomal. وهكذا، فإن التفاعلات IRE / IRP تعتمد على حالة الحديد الخلوي، ولكن يتم تنظيمها أيضا إشارات أخرى، مثل H 2 O وأكسيد النيتريك (NO) أو نقص الأكسجة. هنا، نحن تصف بروتوكول لتقييم النشاط IRE ملزم من خلية النفط الخام والأنسجة مقتطفات عن طريق البريدMSA. استخدمنا 32 ف المسمى التحقيق غضب H-فيريتين التي تم إنشاؤها بواسطة النسخ في المختبر من قالب DNA البلازميد (I-12.CAT)، حيث تم إدخال تسلسل غضب في الأصل بمعنى التوجه المصب لموقع البلمرة T7 RNA من قبل استنساخ [أليغنوكليوتيد الاصطناعية صلب 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمت الموافقة على إجراءات تجريبية مع الفئران عن طريق لجنة رعاية الحيوان من جامعة ماكجيل (بروتوكول 4966).

1. إعداد مقتطفات البروتين من الخلايا المستزرعة

  1. غسل الخلايا المستزرعة مرتين مع 10 مل من الفوسفات الجليد الباردة مخزنة المالحة (PBS).
  2. كشط الخلايا الملتصقة مع أي شرطي المطاط أو مكشطة الخلية البلاستيكية في 1 مل من برنامج تلفزيوني، ونقل تعليق الجليد الباردة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  3. تدور في microcentrifuge لمدة 5 دقائق في 700 x ج، في 4 درجات مئوية. نضح PBS.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من تحلل العازلة حشوية الجليد الباردة (الجدول 1) لكل 10 7 خلايا، وماصة صعودا وهبوطا.
  5. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  6. تدور لمدة 10 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge في 4 درجات مئوية.
  7. بيليه تجاهل. نقل طاف في أنبوب جديد microcentrifuge 1.5 مل والحفاظ على الجليد.
  8. ديتتركيز البروتين القاقم (عادة 1 - 10 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام مقايسة برادفورد 23.
  9. قسامة وخلية متجر مقتطفات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. إعداد مقتطفات من البروتين ماوس الكبد والطحال

  1. الموت ببطء ماوس مع CO 2 الاستنشاق.
  2. وضع الحيوان الموت الرحيم على وسادة نظيفة على متن تشريح. فتح البطن مع مقص.
  3. تشريح الكبد والطحال باستخدام مقص وملقط، وشطف كل الأنسجة في برنامج تلفزيوني ما يقرب من 50 مل الجليد الباردة.
  4. قطع على الفور الأنسجة الى قطع صغيرة مع مشرط (على سبيل المثال: ما يقرب من 1 - 2 مم 3).
  5. دون تأخير، ووضع قطعة من الأنسجة في cryotube طازج و المفاجئة ثم تجميدها في النيتروجين السائل. متجر مأخوذة الأنسجة المجمدة الأداة الإضافية في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. التجانس قطعة واحدة من الأنسجة المجمدة (حوالي 1 - 2 مم 3) في ،25-،5 مل منالجليد الباردة العازلة تحلل حشوية (الجدول 1) مع الخالط الأنسجة لمدة 10 ثانية.
  7. نقل جناسة إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والبرد على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  8. تدور لمدة 10 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge في 4 درجات مئوية.
  9. تجاهل بيليه ونقل طاف في أنبوب جديد microcentrifuge 1.5 مل. الحفاظ على الجليد.
  10. تحديد تركيز البروتين (عادة 1 - 10 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام مقايسة برادفورد 23.
  11. قسامة وخلية متجر مقتطفات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. إعداد رديولبلد غضب مسبار

  1. خطي IRE التي تحتوي على البلازميد I-12.CAT 22 التي يحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع نوكلياز داخلية تقييد XbaI (1 U في ميكروغرام البلازميد)، الذي يشق المصب من تسلسل غضب. وسوف تستخدم البلازميد خطي كقالب لفي المختبر النسخ.
  2. تشكيل لن في المختبر رد فعل النسخ في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر. استخدام الحلول الأسهم هو مبين في الجدول رقم 2 وإضافة: 1 ميكرولتر قالب البلازميد خطي، 4 ميكرولتر العازلة النسخ. 1 ميكرولتر مزيج من ATP / CTP / GTP المزيج، 10 ميكرولتر [α- 32 P] -UTP، 2 ميكرولتر dithiothreitol، 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع و 1 ميكرولتر T7 RNA البلمرة. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  3. احتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 1 ساعة 24.

4. تنقية رديولبلد غضب مسبار

  1. إنهاء النسخ في المختبر رد فعل عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الحمض الريبي النووي النقال، والناقل لهطول الأمطار أفضل. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  3. إضافة 82.5 ميكرولتر من خلات الأمونيوم 3 M. مزيج من قبل vortexing.
  4. إضافة 273 ميكرولتر من الايثانول. مزيج من قبل vortexing.
  5. اسمحوا الوقوف في RT لمدة 5 دقائق.
  6. تدور لمدة 10 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge في RT. طاف تجاهل.
  7. غسل بيليه مع 100 ميكرولتر من الايثانول 70٪.
  8. تدور لمدة 10 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge في RT. طاف تجاهل.
  9. الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة.
  10. بيليه resuspend في 100 ميكرولتر من ضعف المقطر، تعقيمها قبل H 2 O.
  11. قياس النشاط الإشعاعي في عداد التلألؤ السائل، قسامة رديولبلد غضب التحقيق وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. مأخوذة المجمدة يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 3 أسابيع.

5. إعداد هلام بولي أكريلاميد الأصلي للEMSA

  1. تجميع هلام (16 × 16 سم) باستخدام 1.5 ملم الفواصل والمشط.
  2. لإعداد 6٪ هلام بولي أكريلاميد الأصلي، استخدم الحلول الأسهم هو مبين في الجدول 3 مزيج 7.5 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد: bisacrylamide، 5 مل من 5X TBE و 37.5 ملمزدوج H المقطر 2 O.
  3. إضافة 0.5 مل من 10٪ بيرسلفات الطازجة الأمونيوم (APS) و 25 ميكرولتر tetramethylethylenediamine (TEMED).
  4. صب فورا الحل الأكريلاميد إلى هلام والسماح لها تتبلمر. انتظر حوالي 30 دقيقة.
  5. تجميع الجهاز الكهربائي مع هلام، وملء خزانات مع 0.5X TBE والتواصل مع امدادات الطاقة.

6. الكهربي التنقل التحول الفحص

  1. تمييع 25 ميكروغرام من استخراج البروتين من الخلايا أو الأنسجة مع حشوية العازلة تحلل (الجدول 1) في الحجم الكلي للفي 10 ميكرولتر (يمكن أن تستخدم أيضا تركيزات بروتين أقل). الحفاظ على الجليد. إذا لزم الأمر، إضافة 1 ميكرولتر من 1: 4 المخفف 2-المركابتويثانول (2-ME) لتنشيط IRP1 نائمة (تركيز النهائي: 2٪) 25.
  2. تخفيف غضب التحقيق في رديولبلد مزدوج المقطر H 2 O إلى 200،000 نسخة في الدقيقة / ميكرولتر، بدل طبيعة الحرارة على 95 درجةC لمدة 1 دقيقة، ويبرد في RT لمدة 5 دقائق على الأقل.
  3. إعداد رد فعل EMSA بإضافة 1 ميكرولتر من التحقيق غضب رديولبلد لاستخراج البروتين.
  4. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
  5. إضافة 1 ميكرولتر من 50 ملغ / مل الهيبارين إلى رد فعل (لكبح تفاعلات البروتين غير محددة مع التحقيق 9) والاستمرار في الحضانة لمدة 10 دقيقة أخرى. قسامة حل سهم الهيبارين (50 ملغ / مل) وتخزينها في -80 ° C.
  6. عند استخدام تحقيقات رديولبلد طويلة (> 60 النيوكليوتيدات)، إضافة 1 ميكرولتر ريبونوكلياز T1 (1 U / ميكرولتر) واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT للحد من البروتين غير محددة ملزمة لجنة التحقيق، والسماح فصل أفضل من الحمض النووي الريبي / البروتين مجمع خلال الكهربائي.
  7. إضافة 3 ميكرولتر من العازلة تحميل (80٪ الجلسرين + برموفينول الأزرق)، ومزيج الحمل على 6٪ غير تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد.
  8. تشغيل هلام لمدة 60 دقيقة في 130 V (5 V / سم).
  9. تيransfer هلام على ورقة مرشح كبيرة وجافة.
  10. فضح لفيلم وتطوير تصوير الإشعاع الذاتي. زمن التعرض قد تتراوح بين 1 ساعة (أو أقل) حتى O / N.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إعداد IRE التحقيق رديولبلد، كما هو موضح في المادتين 3 و 4 من البروتوكول. كان تسلسل التحقيق 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '؛ النيوكليوتيدات الغامق تمثل C بقايا المفردة والحلقة، التي هي ملامح غضب حرجة. وكان النشاط الإشعاعي محدد من التحقيق 4.5 × 10 9 في الدقيقة / ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.

لتقييم آثار الاضطرابات الحديد على النشاط IRE ملزم، تركت الضامة RAW264.7 الفئران غير المعالجة، أو تعامل مع هيمن (المصدر الحديد) أو ديفيروكسامين (خالب الحديد). تم إعداد لست] وتحليلها بواسطة EMSA مع التحقيق IRE (8،000 في الدقيقة البروتين / ميكروغرام). وتظهر بيانات تمثيلية في الشكل 1، مع التعرض أقصر وأطول من autoradiograms على لوحات اليسار واليمين، على التوالي. المجمعات الفئران IRE / IRP1 وIRE / IRP2 يحمل التنقل مختلف وشريطين متميزةهي واضحة في حارة 1، الموافق الخلايا غير المعالجة. الحديد عملية إزالة معدن ثقيل يسببها عميقا في الأنشطة غضب ملزم لكلا IRP1 وIRP2 (حارة 2)، في حين أن مكملات الحديد تضاءلت لهم (حارة 3). المعالجة مع IRP1 2٪ 2-ME تفعيلها بالكامل (اللوحة السفلية)، وحتى في مقتطفات من الخلايا المعالجة الحديد. هذا يدل على أن الاضطرابات الحديد لا تمس استقرار IRP1 وأيضا بمثابة تحكم التحميل. على النقيض من ذلك في المعالجة 2-ME تثبيط النشاط IRE ملزم من IRP2. لا تتأثر المهاجرة بسرعة العصابات غير محددة من الحديد.

وبعد ذلك، قمنا بتحليل النشاط IRE ملزم في كبد النوع البري، Irp1 - / - وIrp2 - / - الفئران، تغذية سابقا لمدة أسبوع واحد مع معيار أو نظام غذائي التخصيب الحديد (الشكل 2). وIrp1 - / - وIrp2 - / - تم الفئران تفضلت التي تقدمها الدكتور MW Hentze (EMBL، هايدلبرغ). في نوع البرية مقتطفات الكبد، وشكلت IRP1 لجزء كبير من النشاط IRE ملزم وغضب المجمعات / IRP2 كانت بالكادمرئية (حارات 1، 2)، وذلك بالاتفاق مع الملاحظات السابقة 26. IRP2 عرضت قوية النشاط IRE ملزم في مقتطفات الكبد من Irp1 - / - الفئران (الممرات 3، 4). في ظل هذه الظروف، لم يلاحظ أي IRE / المجمعات IRP1. وبالمثل، تم تشكيل أي المجمعات IRE / IRP2 في مقتطفات الكبد من Irp2 - / - الفئران (حارات 5، 6). تغذية الفئران مع اتباع نظام غذائي عالية من الحديد انخفض النشاط الكبدي غضب ملزم لكلا IRP1 وIRP2. كان هذا تأثير أكثر مأساوية على IRP2 (الممرات 7-12). لاحظ أنه بعد العلاج من النوع البري أو Irp2 - / - مقتطفات الكبد مع-ME 2، تم تعزيز النشاط IRE ملزم من IRP1 إلى نقطة حيث تحولت كلها تقريبا التحقيق غضب (وهذا ما لوحظ بشكل واضح في التعرض أقصر من autoradiograms على اللوحة اليسرى).

وأخيرا، قمنا بتقييم النشاط IRE ملزم في الكبد والطحال من النوع البري وHjv - / - الفئران (الشكل 3). وHjv - / - تم الفئران تفضلت التي تقدمها الدكتور NC اندروز (جامعة ديوك، NC). هذه الحيوانات تمثل نموذجامن داء ترسب الأصبغة الدموية وراثي 27، وهو مرض من الحديد الزائد النظامية، حيث يتراكم الحديد الزائد في الخلايا متني، في حين لا تزال الضامة شبكية بطانية نقص الحديد 28. كما هو متوقع، كبد Hjv - / - الفئران (مع خلايا الكبد محملة الحديد) عرضت انخفضت النشاط IRE ملزم مقارنة مع النوع البري (الممرات 1-4). على العكس من ذلك، كان النشاط IRE ملزم العالي في الطحال من Hjv - / - الفئران (التي تحتوي على الضامة نقص الحديد، الممرات 5-8). هنا مرة أخرى، شجعت المعاملة 2-ME تحول شبه كامل من التحقيق غضب في مقتطفات الكبد (انظر التعرض أقصر من autoradiograms على اللوحة اليسرى).

الجدول 1. حشوية تحلل العازلة.

1٪ تريتون X100
25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4
40 ملي بوكل
  1. الحل يجبيتم تعقيمها وتخزينها في RT.
  2. مثبطات الأنزيم البروتيني، مثل 10 ميكروغرام / مل leupeptin و 0.1 ملي phenylmethanesulfonyl الفلورايد (PMSF) ويمكن إضافة مسبق للاستخدام.
  3. و recomended إضافة جديدة dithiotheritol 1 ملم للكشف عن النشاط IRP2.

الجدول 2. الحلول المالية لفي المختبر النسخ رد الفعل.

1 ميكروغرام / قالب البلازميد خطي ميكرولتر
5X العازلة النسخ (مرفق مع T7 RNA البلمرة)
20 ملي مزيج من ATP، CTP وGTP
3،000 تسى / مليمول [α-32P] -UTP
100 ملي dithiothreitol
10 U / ميكرولتر ريبونوكلياز المانع
20 U / ميكرولتر T7 RNA البلمرة


<قوية> الجدول 3. الحلول المالية لغير تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي.

40٪ مادة الأكريلاميد: bisacrylamide (37.5: 1)
5X TBE (تريس / بورات / EDTA)

لصنع 1 L من 5X TBE، استخدم 54 غرام من قاعدة تريس، 27.5 غرام من حمض البوريك، و 20 مل من EDTA 0.5M (الرقم الهيدروجيني 8.0).

الشكل (1)
الرقم تنظيم 1. الحديد التي تعتمد على الأنشطة غضب ملزم في الضامة RAW264.7. وكانت 10 7 خلايا إما الأيسر O غير المعالجة أو المعالجة / N مع 100 ميكرومتر هيمن أو ديفيروكسامين. تم إعداد لست] حشوية وتحليلها بواسطة EMSA مع 32 ف المسمى غضب التحقيق في غياب (أعلى) أو وجود 2٪ 2-ME (القاع). يشار إلى مواقف IRE / IRP1 والمجمعات IRE / IRP2، والتحقيق غضب المجاني من السهام. النجم يشير إلى وجود الفرقة غير محددة. وترد التعرض أقصر وأطول من autoradiograms في لوحات اليسار واليمين، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل الأنشطة غضب ملزم في كبد النوع البري (وزن)، Irp1 - / - وIrp2 - / -. الفئران الفئران من العمر 5 أسبوع (ن = 2 لكل الوراثي)، وكلها في C57BL / 6 الخلفية 29، وضعت على معيار أو اتباع نظام غذائي عالية من الحديد (التي تحتوي على 2٪ الحديد الكربونيل). بعد أسبوع واحد الموت الرحيم كانت الحيوانات. أعدت مقتطفات من البروتين الكبدية وتحليلها بواسطة EMSA مع 32 ف المسمى غضب التحقيقفي غياب (أعلى) أو وجود 2٪ 2-ME (القاع). يشار إلى مواقف IRE / IRP1 والمجمعات IRE / IRP2، والتحقيق غضب المجاني من السهام. النجم يشير إلى وجود الفرقة غير محددة. وترد التعرض أقصر وأطول من autoradiograms في لوحات اليسار واليمين، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تحليل الأنشطة في الكبد والطحال من النوع البري (بالوزن) وHjv غضب ملزم - / -. الفئران الفئران الأسبوع 10 من العمر (ن = 2 لكل الوراثي)، وكلها في C57BL / 6 الخلفية 30، والموت الرحيم. أعدت الكبد والطحال مقتطفات من البروتين وتحليلها بواسطة EMSA مع 32 ف المسمى غضب التحقيق في غياب (أعلى) أو وجود2٪ 2-ME (القاع). يشار إلى مواقف IRE / IRP1 والمجمعات IRE / IRP2، والتحقيق غضب المجاني من السهام. النجم يشير إلى وجود الفرقة غير محددة. وترد التعرض أقصر وأطول من autoradiograms في لوحات اليسار واليمين، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نحن تصف البروتوكول الذي تم تطويره لدراسة الأنشطة غضب ملزم من IRP1 وIRP2، ونحن نبين بيانات تمثيلية. باستخدام مجسات مختلفة، يمكن هذا البروتوكول أيضا أن تعدل لدراسة أخرى البروتينات ملزم RNA. والخطوة الحاسمة هي حجم التحقيق. استخدام تحقيقات طويلة، وهو أمر شائع عند موقع ملزم الدقيق غير معروف، يمكن أن يؤدي في المجمعات RNA / البروتين التي لا تهاجر بشكل مختلف عن الحمض النووي الريبي مجانا. في هذه الحالة، فإنه من المستحسن لإزالة RNA غير منضم عن طريق العلاج مع ريبونوكلياز T1 (الخطوة 6.6). نوعية التحقيق مهمة جدا أيضا. ويتم الحصول على أفضل النتائج مع الطازجة RNA رديولبلد. هلام تنقية 10 ليست ضرورية، ولكن قد تحسن مظهر من EMSA إذا كان النسخ في المختبر رد فعل لإعداد التحقيق غلة المنتجات إنهاء المبكرة (وإذا تم تضمين أي خطوة عملية الهضم ريبونوكلياز T1). تشغيل الأصلي الكهربائي للهلام سريع جدا مAY يؤدي إلى ارتفاع درجة الحرارة، مما قد يؤدي إلى تفكك RNA المجمعات / البروتين ويؤدي في نطاقات غامض.

ويمكن الحصول على النتائج الكمية من خلال تحليل كثافة من عصابات المتخلفين مع phosphorimaging. Quantifications صالحة فقط عندما يكون التحقيق RNA موجودة في الزائدة وليس يحد عن RNA ملزم. تقارب للتفاعل RNA / البروتين، ممثلة التفكك المستمر K د مرتبط إلى الطاقة الحرة ΔG س، يمكن تقييم في ظل ظروف التوازن عن طريق المعايرة النشاط ملزم RNA مع تناقص كميات من التحقيق رديولبلد 3. وقد تفاعل IRE / IRP1 يتميز نطاق واسع physicochemically 9،31. المعايرة التجارب EMSA مع كميات متفاوتة من البروتين ملزم RNA يمكن أن يؤديها لحساب رياضيات الكيمياء 3. خصوصية للربط يمكن التحقق من صحة بسهولة من خلال التجارب المنافسة مع فائض من غير المسماة شركات "الباردة"etitor الرنا 3. منافسين معينين فقط يجب أن تقلل من شدة الفرقة المشعة المتخلفين. يمكن أيضا رصد خصوصية من قبل بما في ذلك الأجسام المضادة ضد بروتين ملزم RNA في رد فعل EMSA، والتي سوف تسفر عن "supershift" 7. هذا ويمكن أيضا أن تستغل لتحديد هوية من البروتين ملزم RNA. يجب أن يلاحظ أي "supershift" مع الأجسام المضادة غير محددة أو المصل قبل المناعي.

في الختام، EMSA هو وسيلة قوية لتحليل التفاعلات RNA / البروتين. فمن السهل نسبيا لأداء وتتطلب الحد الأدنى من البنية التحتية. أنها ليست بسيطة مثل الفحص ملزمة التصفية، ولكن سوف تسفر عن المزيد من البيانات معلومات ودقيقة عندما تتفاعل البروتينات متعددة ملزم RNA تحديدا مع التحقيق (مثل IRP1 وIRP2). وتجدر الإشارة إلى أن المجمعات عكس الفئران، IRE البشرية / IRP1 وIRE / IRP2 المشارك تهاجر في EMSA. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تكون مفصولة "supershifts̶1؛ مع الاجسام المضادة المحددة 7. وEMSA ليس قيما لرسم خرائط تفصيلية للتفاعلات RNA / البروتين. تقنيات أخرى، مثل فحص حماية ريبونوكلياز، toeprinting أو عبر ربط 32 هي أكثر مناسبة. ومع ذلك فإن EMSA هو خيار ممتاز لاكتشاف التفاعلات الجديدة RNA / البروتين، كما كان الحال مع المعاد توطينهم عنوة ولكن أيضا لتأييد البيانات التي تم الحصول عليها مع النهج التجريبية الإنتاجية الحسابية أو عالية. علاوة على ذلك، EMSA متفوقة لتحليل خصوصية والفيزيائية خصائص التفاعلات RNA / البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics