Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

Biology

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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.

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Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

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Abstract

RNA / Protein-Interaktionen sind entscheidend für die Post-Transkriptionsregulationswege. Unter den am besten charakterisierten zytosolische RNA-bindende Proteine ​​sind Eisen regulatorischen Proteinen, IRP1 und irp2. Sie binden an responsive Elemente (IRES) innerhalb der untranslatierten Regionen (UTR) von mehreren Ziel-mRNAs bügeln, damit die mRNA Translation oder Stabilität Steuerung. IRE / IRP Wechselwirkungen wurden weitgehend von der EMSA untersucht. Hier beschreiben wir die EMSA-Protokoll für die Analyse der IRE-Bindungsaktivität von IRP1 und irp2, die generali können, um die Aktivität von anderen RNA-bindenden Proteinen und zu beurteilen. A Rohprotein Lysat eine RNA-Bindungsprotein, oder ein gereinigtes Präparat des Proteins enthält, wird mit einem Überschuss von 32 P-markierten RNA-Sonde inkubiert, wobei zur Komplexbildung. Heparin zugesetzt wird, um nicht-spezifische Protein ausschließen zu Sondenbindung. Anschließend wird die Mischung durch nicht-denaturierende Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel analysiert. Die freien Sondewandert schnell, während die RNA / Proteinkomplex Exponate verzögert Mobilität; daher wird das Verfahren auch als "Gelretardation" oder "Bandshift" -Assay. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel getrocknet und RNA / Protein-Komplexe, sowie freier Sonde durch Autoradiographie detektiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, nachzuweisen und zu quantifizieren IRE / IRP und andere RNA / Protein-Interaktionen. Außerdem kann EMSA verwendet, um die Spezifität, Affinität und Stöchiometrie des RNA / Protein-Wechselwirkung untersucht bestimmen.

Introduction

Die EMSA wurde ursprünglich entwickelt, um die Assoziation von DNA-bindenden Proteinen mit DNA-Zielsequenzen 1,2 studieren. Das Prinzip ist ähnlich für RNA / Protein-Interaktionen 3, die im Mittelpunkt dieses Artikels ist. Kurz gesagt wird RNA negativ geladen und werden in Richtung der Anode während der nicht-denaturierenden Elektrophorese in Polyacrylamid (oder Agarose) Gelen wandern. Migration innerhalb des Gels hängt von der Größe der RNA, die proportional zu ihrer Ladung ist. Spezifische Bindung eines Proteins an RNA verändert seine Mobilität und der Komplex wandert langsamer als das freie RNA. Dies ist vor allem auf eine Erhöhung der Molekularmasse, sondern auch Änderungen in der Ladung und ggf. Konformation. Mit Hilfe eines markierten RNA als Sonde ermöglicht eine einfache Überwachung des "Gelretardation" oder "Bandshift". Verwendung von 32 P-markierten RNA-Sonden ist sehr verbreitet und bietet hohe Empfindlichkeit. Die Migration von RNA / Protein-Komplexen und freien RNA nachgewiesen werdendurch Autoradiographie. Nachteile sind die kurze Halbwertszeit von 32 P (14,29 Tage), die allmähliche Verschlechterung der Qualität der Sonde durch Radiolyse, das Erfordernis einer Radioaktivität Lizenz und die Infrastruktur für die Radioaktivität der Arbeit, und potentielle biologische Sicherheit betrifft. Daher alternative nichtisotopische Methoden zur Markierung der RNA-Sonde entwickelt, zum Beispiel mit Fluorophoren oder Biotin, der Nachweis durch Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Abbildungs ​​4,5 ermöglichen. Beschränkungen dieser Verfahren sind die höheren Kosten und oft eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Isotopenmarkierung, und das Potential des nicht-isotopische Markierungen, mit der RNA / Protein-Wechselwirkung stören. Nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelen sind für die meisten Anwendungen EMSA und werden häufig verwendet. Gelegentlich kann Agarosegelen eine Alternative für die Analyse von großen Komplexen darstellen.

Der große Vorteil der EMSA ist, dass es kombiniert Einfachheit, Sensitivität und Robustheit 4 </ Sup>. Der Test kann innerhalb weniger Stunden abgeschlossen werden kann und keine ausgeklügelte Instrumentierung erforderlich. RNA / Protein-Interaktionen können von der EMSA bei Konzentrationen von nur 0,1 nM oder weniger erkannt werden, und in einem weiten Bereich von Bindungsbedingungen (pH 4,0 bis 9,5, monovalente Salzkonzentration von 1 bis 300 mM, und die Temperatur 0 - 60 ° C).

RNA / Protein-Komplexbildung kann ebenfalls durch den Filter-Bindungsassay untersucht werden. Dies ist ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren auf der Basis der Beibehaltung der RNA / Protein-Komplexen in einem Nitrocellulose-Filter, während eine freie RNA Sonde durch 6 durchläuft. Im Vergleich zu EMSA, ist es in Fällen, wo die RNA-Sonde enthält mehrere Bindungsstellen oder der Rohextrakt enthält mehrere RNA-Bindeproteine, die an die Sonde binden, an der gleichen Stelle begrenzt ist. Während mehrere RNA / Protein-Interaktionen werden Erkennung durch den Filter-Bindungstest entgehen, können sie leicht durch EMSA visualisiert werden. In einigen Fällen ist die Visualisierung Vorabendn möglich, wenn zwei RNA / Protein-Komplexe co-migrieren (zum Beispiel menschliche IRP1 / IRE und irp2 / IRE-Komplexe), durch Zugabe eines Antikörpers gegen eines der RNA-Bindeproteine ​​zu der EMSA Reaktion, wodurch man weitere Retardierung auf dem Gel ( "Supershift") 7.

Die EMSA wurde weithin verwendet, um IRP1 und irp2, die nach der Transkriptionsregulatoren des Eisenstoffwechsels 8-10 sind zu studieren. Sie funktionieren über die Bindung an IREs phylogenetisch konservierten Haarnadelstrukturen innerhalb der UTRs mehrerer mRNAs 11. IREs wurden zuerst in den mRNAs Ferritin 12 und Transferrin-Rezeptor 1 (TfR1) 13, Proteinen von Eisen Lagerung und Aufnahme beziehungsweise kodiert entdeckt. Später IREs wurden in erythroiden spezifische Aminolaevulinat Synthase (ALAS2) 14, mitochondrialen Aconitase 15. Ferroportin 16, zweiwertige Metall Transporter 1 (DMT1) 17, Hypoxie-induzierbaren Faktors 2 gefunden 18 und anderen mRNAs 19-21. Der Prototyp H- und L-Ferritin-mRNAs enthalten ein IRE in ihren 5'-UTR, während TfR1 mRNA enthält mehrere IREs in ihrem 3'-UTR. IRE / IRP Wechselwirkungen spezifisch hemmen Ferritin-mRNA-Translation durch sterisch Sperrung der Assoziation der 43S ribosomalen Untereinheit; Darüber hinaus stabilisieren sie TfR1 mRNA gegen endonukleolytische Spaltung. IRP1 und irp2 Aktien umfassende Sequenzähnlichkeit und weisen eine hohe IRE-Bindungsaktivität in eisenversorgten Zellen. In eisenversorgten Zellen versammelt IRP1 eine Cuban Fe-S-Cluster, der es um cytosolische Aconitase wandelt auf Kosten der IRE-Bindungsaktivität, während irp2 erfährt proteasomalen Abbau. Somit hängen die IRE / IRP Wechselwirkung bei der zellulären Eisenstatus, sondern auch durch andere Signale, wie zum Beispiel H 2 O 2, Stickstoffmonoxid (NO) oder Hypoxie. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Beurteilung der IRE-Bindungsaktivität von Rohöl Zell- und Gewebeextrakten von EMSA. Wir verwendeten eine 32 P-markiertem H-Ferritin-IRE-Sonde, die durch in vitro-Transkription von Plasmid-DNA-Matrize (I-12.CAT), wobei der IRE-Sequenz wurde ursprünglich in Sense-Orientierung stromabwärts des T7-RNA-Polymerase-Stelle durch eingeführten generated Klonen von geglüht synthetische Oligonukleotide 22.

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Protocol

Experimentelle Verfahren mit Mäusen wurden von der Animal Care Committee der McGill University (Protokoll 4966) zugelassen.

1. Herstellung von Proteinextrakten aus kultivierten Zellen

  1. Waschen kultivierten Zellen zweimal mit 10 ml eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
  2. Kratzen Sie anhaftenden Zellen entweder mit einem Gummiwischer oder einem Kunststoffzellschaber in 1 ml eiskaltem PBS, Transfer Suspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. In einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten bei 700 × g bei 4 ° C. Absaugen PBS.
  4. 100 l eiskaltem Zytoplasma-Lysepuffer (Tabelle 1) pro 10 7 Zellen und Pipette auf und ab.
  5. Inkubieren auf Eis für 20 min.
  6. Spin für 10 min bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C.
  7. Verwerfen Pellet. Überstand in neue 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis halten.
  8. DetHermelins Proteinkonzentration (gewöhnlich 1 - 10 & mgr; g / & mgr; l) unter Verwendung des Bradford-Assay 23.
  9. Aliquot und Speichern von Zellextrakten bei -80 ° C bis zur Verwendung.

2. Herstellung von Proteinextrakten aus Maus Leber und Milz

  1. Euthanize eine Maus mit CO 2 Inhalation.
  2. Legen Sie das Tier eingeschläfert auf eine saubere Unterlage über einen Seziersaal Bord. Öffnen Sie den Unterleib mit einer Schere.
  3. Präparieren Sie die Leber und die Milz mit einer Schere und Pinzette, und spülen Sie jedes Gewebe in ca. 50 ml eiskaltem PBS.
  4. Unmittelbar geschnitten Gewebe in kleine Stücke mit einem Skalpell (zB etwa 1-2 mm 3).
  5. Unverzüglich, legte Stücke von Gewebe in einem frischen Kryoröhrchen und Schnapp frieren sie in flüssigem Stickstoff dann. Shop schockgefroren Gewebe Aliquots bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  6. Homogenisieren einem Stück gefrorenes Gewebe (ungefähr 1 bis 2 mm 3) in 0,25 bis 0,5 mleiskaltem zytoplasmatischen Lysepuffer (Tabelle 1) mit einem Gewebe-Homogenisator 10 sec.
  7. Übertragen Homogenat 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Chill auf Eis für 20 min.
  8. Spin für 10 min bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C.
  9. Entsorgen Pellet und Überstand in neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie auf dem Eis.
  10. Bestimmen Proteinkonzentration (gewöhnlich 1 - 10 & mgr; g / & mgr; l) unter Verwendung des Bradford-Assay 23.
  11. Aliquot und Speichern von Zellextrakten bei -80 ° C bis zur Verwendung.

3. Herstellung von radioaktiv markierten IRE-Sonde

  1. Linearisieren des IRE-haltigen Plasmid I-12.CAT 22 durch Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde mit der Restriktionsendonuklease XbaI (1 U pro ug Plasmid), spalt hinter der IRE-Sequenz. Das linearisierte Plasmid wird als Matrize für die in vitro-Transkription verwendet werden.
  2. Richten Sie einn in vitro-Transkriptions-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 ul. Verwenden Sie die in Tabelle 2 angegebenen Stammlösungen und hinzuzufügen: 1 ul linearisierte Plasmid-Vorlage, 4 ul Transkriptionspuffer; 1 & mgr; l Mischung aus ATP / CTP / GTP-Mix, 10 & mgr; l [α- 32 P] -UTP, 2 & mgr; l Dithiothreitol, 1 ul RNase-Inhibitor und 1 ul T7 RNA-Polymerase. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren.
  3. Inkubiere bei 40 ° C für 1 h 24.

4. Reinigung von radioaktiv markierten IRE-Sonde

  1. Enden in vitro-Transkriptions-Reaktion durch Zugabe von 1 ul 0,5 M EDTA, pH 8 Mix durch Auf- und Abpipettieren.
  2. Zugabe von 10 ul 10 mg / ml tRNA, die als Träger für eine bessere Niederschlag. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren.
  3. Hinzufügen 82,5 ul 3 M Ammoniumacetat. Durch Vortexen mischen.
  4. Hinzufügen 273 ul Ethanol. Durch Vortexen mischen.
  5. Stehen lassen bei Raumtemperatur für 5 min.
  6. Spin für 10 Minuten bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei RT. Überstand verwerfen.
  7. Waschen Sie das Pellet mit 100 ul 70% Ethanol.
  8. Spin für 10 Minuten bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei RT. Überstand verwerfen.
  9. Luft trocknen Pellet für 10 min.
  10. Pellet in 100 & mgr; l doppelt destilliertes, zuvor autoklaviert H 2 O.
  11. Quantifizierung der Radioaktivität in einem Flüssigszintillationszähler, aliquoten radioaktiv markierten IRE Sonde und bei -80 ° C bis zur Verwendung. Gefrorene Aliquots für 3 Wochen verwendet werden.

5. Herstellung von einem nativen Polyacrylamidgel für die EMSA

  1. Montieren Sie das Gel (16 x 16 cm) unter Verwendung von 1,5 mm Abstandshalter und Kamm.
  2. Um eine 6% nativen Polyacrylamidgel vorzubereiten, mit den in Tabelle 3 gezeigten Stammlösungen mischen 7,5 ml 40% Acrylamid. Bisacrylamid, 5 ml 5 x TBE und 37,5 mldoppelt destilliertem H 2 O.
  3. 0,5 ml von 10% frisch zubereitet Ammoniumpersulfat (APS) und 25 ul Tetramethylethylendiamin (TEMED).
  4. Gießen Sie sofort die Acrylamidlösung zum Gel und lassen Sie es zu polymerisieren. Warten für ungefähr 30 min.
  5. Montieren Sie die Elektrophorese-Vorrichtung mit dem Gel, füllen Sie die Tanks mit 0,5x TBE und eine Verbindung mit der Stromversorgung.

6. Electrophoretic Mobility Shift Assay

  1. Verdünne 25 & mgr; g Proteinextrakt aus Zellen oder Geweben mit der zytoplasmatischen Lysepuffer (Tabelle 1) in einem Gesamtvolumen von 10 ul (niedrigeren Proteinkonzentrationen können auch angewandt werden). Halten Sie auf dem Eis. Falls erforderlich, fügen Sie 1 ul 1: 4 verdünnt 2-Mercaptoethanol (2-ME) zum ruhenden IRP1 (Endkonzentration: 2%) aktivieren 25.
  2. Verdünnen Sie die radioaktiv markierten Sonde IRE in doppelt destilliertem H 2 O zu 200.000 cpm / ul, Hitze denaturieren bei 95 °C für 1 min und Abkühlen bei Raumtemperatur für mindestens 5 min.
  3. Bis ein EMSA Reaktion durch Zugabe von 1 ul radioaktiv markierten Sonde an die IRE Proteinextrakt ein.
  4. Inkubieren für 20 min bei RT.
  5. 1 ul 50 mg / ml Heparin zu dem Reaktions (um nicht-spezifische Protein-Wechselwirkungen mit der Sonde 9 inhibieren) angeschlossen und die Inkubation für weitere 10 min. Aliquot der Stammlösung von Heparin (50 mg / ml) und bei -80 ° C.
  6. Wenn lange radiomarkierten Sonden (> 60 Nukleotide), Zugabe von 1 & mgr; l RNase T1 (1 U / ul) und Inkubation für 10 min bei RT, um unspezifische Proteinbindung zu reduzieren, um die Sonde und eine bessere Trennung des RNA / Protein ermöglichen Komplex während der Elektrophorese.
  7. In 3 ul Auftragspuffer (80% Glycerin + Bromphenolblau), mischen und Last auf der 6% nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel.
  8. Führen Sie das Gel für 60 min bei 130 V (5 V / cm).
  9. Transfer das Gel auf eine große Filterpapier und trocken.
  10. Expose an einen Film und entwickeln Autoradiographie. Belichtungszeit kann von 1 Stunde (oder weniger) bis O / N liegen.

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Representative Results

Ein radioaktiv markiertes IRE Sonde hergestellt wurde, wie in den Abschnitten 3 und 4 des Protokolls beschrieben. Die Sequenz der Sonde war 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; die fettgedruckten Nukleotide stellen einen ungepaarten C-Rest und die Schleife, die kritische IRE Merkmale sind. Die spezifische Radioaktivität der Probe betrug 4,5 x 10 & sup9; cpm / ug RNA.

Um die Auswirkungen von Störungen auf Eisen IRE-Bindungsaktivität zu bewerten, wurden murine Makrophagen RAW264.7 unbehandelt, oder mit Hämin (Eisenquelle) oder Desferrioxamin (Eisenchelator) behandelt. Die Lysate wurden präpariert und von der EMSA mit der IRE-Sonde (8000 cpm / ug Protein) analysiert. Repräsentative Daten sind in Figur 1 gezeigt, mit kürzeren und längeren Belichtungen der Autoradiogramme auf der linken und rechten Platten, jeweils. Murine IRE / IRP1 und IRE / irp2 Komplexe weisen unterschiedliche Mobilität und zwei verschiedene Bandssind in Spur 1 ersichtlich, entsprechend den unbehandelten Zellen. Eisenchela zutiefst induziert die IRE-Bindungsaktivitäten sowohl IRP1 und irp2 (Bahn 2), während die Eisensubstitution vermindert sie (Bahn 3). Die Vorbehandlung mit 2% 2-ME vollständig aktiviert IRP1 (unten), auch auszugsweise Eisen behandelten Zellen. Dies zeigt, daß Eisen-Störungen nicht auf die Stabilität von IRP1 auftreffen und dient auch als Ladekontrolle. Im Gegensatz dazu die 2-ME Vorbehandlung hemmte die IRE-Bindungsaktivität von irp2. Die schnelle Migration unspezifische Banden werden von Eisen beeinflusst.

Als nächstes untersuchten wir IRE-Bindungsaktivität in der Leber von Wildtyp IRP1 - / - und irp2 - / - Mäuse, die zuvor für eine Woche mit einem Standard oder einer Eisen angereicherte Diät (Bild 2) zugeführt. Die IRP1 - / - und irp2 - / - Mäuse wurden freundlicherweise von Dr. MW Hentze (EMBL, Heidelberg) zur Verfügung gestellt. In Wildtyp-Leberextrakten entfielen IRP1 für den Hauptanteil der IRE-Bindungsaktivität und IRE / irp2 Komplexe kaumsichtbar (Bahnen 1, 2), in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen 26. Irp2 zeigte eine hohe IRE-bindende Aktivität in Leberextrakten von IRP1 - / - Mäusen (Bahnen 3, 4). Unter diesen Bedingungen wurden keine IRE / IRP1 Komplexe beobachtet. / - - Wurden ebenfalls keine IRE / irp2 Komplexe in Leberextrakten von irp2 gebildet Mäusen (Bahnen 5, 6). Füttern von Mäusen mit einem High-Eisen-Diät verringerte Leber IRE-Bindungsaktivität sowohl IRP1 und irp2; dieser Effekt noch dramatischer auf irp2 (Spuren 7-12). Beachten Sie, dass nach der Behandlung von Wildtyp oder irp2 - / - Leberextrakten mit 2-ME, das IRE-Bindungsaktivität von IRP1 wurde an einen Punkt, an dem es verschoben fast alle IRE-Sonde erweitert (dies wird deutlich in der kürzeren Belichtungs der Autoradiogramme beobachtet auf der linken Seite).

Schließlich untersuchten wir die IRE-Bindungsaktivität in Leber und Milz von Wildtyp und hjv - / - Mäusen (Abbildung 3). Die hjv - / - Mäuse wurden freundlicherweise von Dr. NC Andrews (Duke University, NC) zur Verfügung gestellt. Diese Tiere stellen ein Modellder hereditären Hämochromatose 27. mangelhaft eine Erkrankung der systemischen Eisenüberladung, an denen übermäßige Eisen reichert sich in Parenchymzellen, während retikuloendothelialen Makrophagen bleiben Eisen 28. Wie erwartet, Lebern hjv - / - Mäusen (mit Eisen beladene Hepatozyten) eine verminderte IRE-Bindungsaktivität im Vergleich zum Wildtyp (Spuren 1-4). Umgekehrt war IRE-Bindeaktivität höher in Milzen hjv - / - Mäusen (enthaltend Eisen-defizienten Makrophagen, Spuren 5-8). Auch hier förderte die 2-ME Behandlung fast vollständige Verschiebung des IRE-Sonde in Leberextrakten (siehe kürzere Belichtungs der Autoradiogramme auf der linken Seite).

Tabelle 1 Zytoplasmatische Lysepuffer.

1% Triton X100
25 mM Tris-HCl, pH 7,4
40 mM KCl
  1. Die Lösung sollteautoklaviert und bei RT gelagert werden.
  2. Protease-Inhibitoren, wie beispielsweise 10 & mgr; g / ml Leupeptin und 0,1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) kann vor der Verwendung zugesetzt werden.
  3. Zugabe von frischem 1 mM dithiotheritol ist für den Nachweis von irp2 Aktivität empfohlen.

Tabelle 2 Stammlösungen für die in vitro-Transkriptionsreaktion.

1 ug / ul linearisierte Plasmid Template
5x Transcription Buffer (mit T7 RNA Polymerase mitgeliefert)
20 mM Mischung von ATP, CTP und GTP
3000 Ci / mmol [α-32P] -UTP
100 mM Dithiothreitol
10 U / ul RNase-Inhibitor
20 U / ul T7 RNA-Polymerase


<strong> Tabelle 3. Auf Lösungen für nicht-denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

40% Acrylamid: Bisacrylamid (37,5: 1)
5x TBE (Tris / Borat / EDTA)

Für die Herstellung von 1 Liter 5x TBE, verwenden Sie 54 g Tris-Base, 27,5 g Borsäure und 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0).

Figur 1
Abbildung 1. Eisen-abhängige Regulation von IRE-Bindungsaktivitäten in RAW264.7 Makrophagen. 10 7 Zellen wurden entweder unbehandelt oder behandelt O / N mit 100 uM Hämin oder Desferrioxamin. Zytoplasmatischen Lysate wurden durch EMSA mit einem 32 P-markierten Sonde IRE in Abwesenheit (oben) oder in Gegenwart von 2% 2-ME (unten hergestellt und analysiert). Die Positionen der IRE / IRP1 und IRE / irp2 Komplexen und der freien IRE Sonde sind durch Pfeile angezeigt. Der Stern zeigt eine nicht-spezifische Bande. Kürzere und längere Belichtungszeiten der Autoradiogramme sind in den linken und rechten Fenster gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Analyse der IRE-Bindungsaktivitäten in der Leber von Wildtyp (wt), IRP1 - / - und irp2 - / -. Mäusen 5 Wochen alten Mäusen (n = 2 für jeden Genotyp), die alle in C57BL / 6 Hintergrund 29, wurden auf einem Standard- oder einem hohen Eisen Nahrung (enthaltend 2% Carbonyleisen) platziert. Nach einer Woche wurden die Tiere eingeschläfert. Leberproteinextrakte wurden von der EMSA mit einem 32 P-markierten Sonde IRE aufbereitet und analysiertin Abwesenheit (oben) oder in Gegenwart von 2% 2-ME (unten). Die Positionen der IRE / IRP1 und IRE / irp2 Komplexen und der freien IRE Sonde sind durch Pfeile angezeigt. Der Stern zeigt eine nicht-spezifische Bande. Kürzere und längere Belichtungszeiten der Autoradiogramme sind in den linken und rechten Fenster gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Analyse der IRE-Bindungsaktivitäten in Leber und Milz von Wildtyp (wt) und hjv - / -. Mäuse 10 Wochen alten Mäusen (n = 2 für jeden Genotyp), die alle in C57BL / 6 Hintergrund 30 wurden eingeschläfert. Leber- und Milz-Proteinextrakte wurden durch EMSA mit einem 32 P-markierten Sonde IRE in Abwesenheit (oben) oder in Gegenwart von hergestellt und analysiert2% 2-ME (unten). Die Positionen der IRE / IRP1 und IRE / irp2 Komplexen und der freien IRE Sonde sind durch Pfeile angezeigt. Der Stern zeigt eine nicht-spezifische Bande. Kürzere und längere Belichtungszeiten der Autoradiogramme sind in den linken und rechten Fenster gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das entwickelt wurde, um die IRE-Bindungsaktivitäten von IRP1 und irp2 studieren, und wir zeigen repräsentative Daten. Durch die Verwendung von verschiedenen Sonden, kann dieses Protokoll auch für die Untersuchung von anderen RNA-bindenden Proteinen eingestellt werden. Ein kritischer Schritt ist die Größe der Sonde. Verwendung von langen Sonden, die gemeinsam ist, wenn die genaue Bindungsstelle nicht bekannt ist, kann in der RNA / Protein-Komplexe, die nicht anders migrieren als die freie RNA führen. In diesem Fall ist es ratsam, um ungebundene RNA durch Behandlung mit RNAse T1 (Schritt 6.6) zu entfernen. Die Qualität der Sonde ist auch sehr wichtig. Beste Ergebnisse werden mit frisch hergestellten radiomarkierte RNA erhalten. Gelreinigung 10 ist nicht notwendig, kann jedoch das Aussehen der EMSA, wenn die in vitro-Transkriptionsreaktion zur Sondenherstellung ergibt vorzeitiger Produkte zu verbessern (und wenn keine RNAse T1 Verdauungsschritt ist enthalten). Das Ausführen des native Gelelektrophorese zu schnell may zu Überhitzung, die Dissoziation von RNA / Proteinkomplexen führen und in Fuzzy-Bands könnte.

Quantitative Ergebnisse können durch Analysieren der Intensität der retardierten Banden mit Phosphorimaging erhalten werden. Quantifizierungen sind nur gültig, wenn die RNA-Sonde im Überschuss vorhanden ist und nicht für die RNA-Bindung einschränkend. Die Affinität der RNA / Protein-Interaktion, durch die Dissoziationskonstante K d, die an der freien Energie & Delta; G o verknüpft dargestellt werden, können unter Gleichgewichtsbedingungen durch Titration der RNA-Bindungsaktivität mit abnehmenden Mengen von radioaktiv markierten Sonde 3 bewertet werden. Das IRE / IRP1 Wechselwirkung wurde ausgiebig physikochemisch 9,31 gekennzeichnet. Titration EMSA-Experimente mit unterschiedlichen Mengen an einem RNA-bindenden Protein kann durchgeführt werden, um die Stöchiometrie 3 berechnen. Spezifität für die Bindung können durch Konkurrenzexperimente mit einem Überschuss an unmarkierten "kalt" comp validiert werdenetitor RNAs 3. Nur bestimmte Wettbewerber sollte die Intensität der verzögerten radioaktive Bande zu reduzieren. Spezifität kann auch durch Aufnahme eines Antikörpers gegen das RNA-Bindeprotein in der EMSA-Reaktion, die eine "Supershift" 7 ergeben werden überwacht. Dies kann auch genutzt werden, um die Identität des RNA-bindenden Proteins zu bestimmen. No "Supershift" sollte mit unspezifischen Antikörpern oder Präimmunserum beachten.

Zusammenfassend ist die EMSA eine leistungsfähige Methode für die Analyse von RNA / Protein-Interaktionen. Es ist relativ einfach durchzuführen und erfordert nur eine minimale Infrastruktur. Es ist nicht so einfach wie die Filterbindungsassay, wird aber mehr informative und genaue Daten zu erhalten, wenn mehrere RNA-Bindeproteinen interagieren spezifisch mit der Sonde (wie IRP1 und irp2). Es ist zu beachten, dass im Gegensatz zu murinen, humanen IRE / IRP1 und IRE / irp2 Komplexe Co-Migration in EMSA werden. Allerdings können sie mit "supershifts̶ getrennt werden1; mit spezifischen Antikörpern 7. Die EMSA ist nicht wertvoll für die detaillierte Kartierung von RNA / Protein-Wechselwirkungen; andere Techniken, wie die RNAse-Schutzassay, toeprinting oder Vernetzungs 32 sind besser geeignet. Dennoch ist die EMSA ist eine ausgezeichnete Wahl für die Entdeckung neuer RNA / Protein-Interaktionen, wie dies bisher der Fall mit IRPs 8, sondern auch für die übereinstimmende Daten mit Rechen oder Hochdurch experimentelle Ansätze erhalten. Darüber hinaus ist die EMSA superior zum Analysieren Spezifität und physikochemischen Eigenschaften der RNA / Protein-Interaktionen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

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References

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