Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we een protocol om RNA / eiwit interacties te analyseren. De elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) is gebaseerd op de differentiële migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA in natieve gelelektroforese. Door een radioactief gemerkte RNA-probe, kan RNA / eiwit-complexen worden gevisualiseerd door autoradiografie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNA / eiwit-interacties cruciaal zijn voor post-transcriptionele regulerende pathways. Onder de best gekarakteriseerde cytosole RNA-bindende eiwitten zijn ijzer regulerende eiwitten, IRP1 en IRP2. Ze binden aan reagerende elementen (IRES) in het niet-getranslateerde gebieden (UTR) van verschillende doelwit mRNA strijken, waardoor de mRNA translatie of stabiliteit beheersen. IRE / IRP interacties zijn uitgebreid bestudeerd door EMSA. We beschrijven hier de EMSA protocol voor de analyse van de IRE-bindende activiteit van IRP1 en IRP2, die kan worden gegeneraliseerd tot de activiteit van andere RNA-bindende eiwitten bepalen ook. Een ruw eiwit lysaat bevattende een RNA bindend eiwit, of een gezuiverd preparaat van dit eiwit wordt geïncubeerd met een overmaat van 32P-gemerkte RNA-probe, waardoor complexvorming. Heparine wordt toegevoegd om niet-specifieke eiwit uitsluit sonderen binding. Vervolgens wordt het mengsel geanalyseerd door niet-denaturerende elektroforese op een polyacrylamidegel. De gratis sondemigreert snel, terwijl de RNA / eiwitcomplex exposities achterlijk mobiliteit; vandaar, wordt de procedure ook wel "gelretardatie" of "bandverschuiving" test. Na voltooiing van elektroforese wordt de gel gedroogd en RNA / eiwit-complexen, alsmede vrij probe worden gedetecteerd door autoradiografie. Het algemene doel van het protocol is op te sporen en te kwantificeren IRE / ITC en andere RNA / eiwit interacties. Bovendien kan EMSA ook worden gebruikt om de specificiteit, bindingsaffiniteit en stoichiometrie van de interactie RNA / eiwit onderzochte bepalen.

Introduction

Het EMSA werd oorspronkelijk ontwikkeld om de vereniging van DNA-bindende eiwitten met doel DNA-sequenties 1,2 bestuderen. Het principe is vergelijkbaar voor RNA / eiwit-interacties 3, dat de focus van dit artikel. In het kort wordt RNA negatief geladen en migreren naar de anode tijdens niet-denaturerende elektroforese in polyacrylamide (of agarose) gels. Migratie in de gel hangt af van de grootte van het RNA, die evenredig is met de lading. Specifieke binding van een eiwit RNA verandert de mobiliteit en het complex migreert langzamer dan de vrije RNA. Dit is voornamelijk te wijten aan een toename van het molecuulgewicht, maar ook veranderingen in de lading en eventueel conformatie. Gebruik makend van een gelabelde RNA als probe maakt een eenvoudige controle van de "gelretardatie" of "bandverschuiving". Het gebruik van 32P-gemerkte RNA-probes is heel gebruikelijk en biedt een hoge gevoeligheid. De migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA gedetecteerddoor autoradiografie. Nadelen zijn de korte halfwaardetijd van 32 P (14.29 dagen), de geleidelijke achteruitgang van de kwaliteit van de probe door radiolyse, het vereiste van een vergunning radioactiviteit en infrastructuur voor radioactiviteit werken en potentiële biologische veiligheid betreft. Daarom zijn alternatieve, niet-isotopische werkwijzen voor het labelen van de RNA probe ontwikkeld, bijvoorbeeld met fluoroforen of biotine, die detectie van fluorescerende of chemiluminescerende beeldvorming 4,5 inschakelen. Beperkingen van deze werkwijzen zijn de hogere kosten en vaak lagere gevoeligheid dan isotopische labeling en het potentieel van niet-isotopische labels om de interactie RNA / eiwit. Niet-denaturerende polyacrylamide gels zijn geschikt voor de meeste toepassingen EMSA en worden vaak gebruikt. Soms kan agarosegels alternatief voor de analyse van grote complexen vormen.

Het grote voordeel van EMSA is dat combineert eenvoud, gevoeligheid en robuustheid 4 </ Sup>. De test kan worden voltooid binnen een paar uur en niet verfijnd instrumentarium nodig. RNA / eiwit interacties kunnen worden gedetecteerd door EMSA bij concentraties van 0,1 nM of minder, en in een groot aantal bindende voorwaarden (pH 4,0-9,5, monovalente zoutconcentratie 1-300 mM, en 0 - 60 ° C).

RNA / eiwit complexvorming kan ook worden bestudeerd door het filter-bindingstest. Dit is een eenvoudige, snelle en goedkope procedure gebaseerd op het behoud van RNA / eiwit-complexen in een nitrocellulose filter, terwijl een vrije RNA sonde passeert 6. Vergeleken met EMSA wordt beperkt wanneer het RNA probe bevat meerdere bindingsplaatsen of het ruwe extract bevat meerdere RNA-bindende eiwitten die binden aan de probe op dezelfde locatie. Terwijl meerdere RNA / eiwit-interacties worden gedetecteerd door de filter binding assay, kunnen ze gemakkelijk worden gevisualiseerd door EMSA. In sommige gevallen, visualisatie is vooravondn mogelijk wanneer twee RNA / eiwit-complexen co-migreren (bijvoorbeeld menselijke IRP1 / IRE en IRP2 / IRE complexen), door toevoeging van een antilichaam tegen één van de RNA-bindende eiwitten aan de EMSA reactie, waardoor verdere vertraging op de gel ( "supershift") 7.

De EMSA is op grote schaal gebruikt om IRP1 en IRP2, die post-transcriptionele regulatoren van ijzer metabolisme 8-10 zijn te bestuderen. Ze werken door te binden aan IRES, fylogenetisch geconserveerd haarspeldstructuren binnen de UTR's van verschillende mRNA's 11. IRES werden voor het eerst ontdekt in de mRNAs coderend ferritine 12 en transferrine receptor 1 (TfR1) 13 eiwitten ijzer opslag en toepassing, respectievelijk. Later, IRES werden gevonden in erythroid-specifieke aminolevulinaat synthase (ALAS2) 14, mitochondriale aconitase 15, ferroportin 16, tweewaardige metalen transporter 1 (DMT1) 17, hypoxie induceerbare factor 2 18 en andere mRNA's 19-21. Het prototype H- en L-ferritine mRNAs bevatten één IRE in het 5 'UTR, terwijl TfR1 mRNA meerdere IRES in de 3' UTR. IRE / IRP interacties specifiek remmen ferritine mRNA vertaling door sterisch blokkeren van de associatie van de 43S ribosomale subunit; Bovendien, ze stabiliseren TfR1 mRNA tegen endonucleolytische splitsing. IRP1 en IRP2 aandeel uitgebreide sequentie-overeenkomst en vertonen een hoge-IRE bindende activiteit in-ijzer uitgehongerd cellen. In ijzergehalte cellen IRP1 assembleert een cubaan Fe-S cluster dat converteert naar cytosolische aconitase ten koste van de IRE-bindingsactiviteit, terwijl IRP2 ondergaat proteasomale degradatie. Dus de IRE / IRP interacties afhangen van de cellulaire ijzerstatus, maar ook gereguleerd door andere signalen, zoals H 2 O 2, stikstofoxide (NO) of hypoxie. We beschrijven hier het protocol voor de beoordeling IRE-bindingsactiviteit van ruwe cel- en weefselextracten van EMSA. We gebruikten een 32P gelabelde H-ferritine IRE probe die werd gegenereerd door in vitro transcriptie van een plasmide DNA matrijs (I-12.CAT), waarbij het ​​IRE sequentie oorspronkelijk geïntroduceerd in sense oriëntatie stroomafwaarts van de T7 RNA polymerase plaats van klonen versmolten synthetische oligonucleotiden 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimentele procedures met muizen werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van McGill University (protocol 4966).

1. Voorbereiding van eiwitextracten van gekweekte cellen

  1. Was de gekweekte cellen tweemaal met 10 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Schraap hechtende cellen met ofwel een rubberen spatel of kunststof celschraper in 1 ml ijskoude PBS, overdracht suspensie in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  3. Spin in een microcentrifuge gedurende 5 minuten bij 700 xg bij 4 ° C. Aspireren PBS.
  4. Voeg 100 ul ijskoude cytoplasmatische lysis buffer (tabel 1) per 10 7 cellen en pipet op en neer.
  5. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
  6. Centrifugeren gedurende 10 minuten bij volle snelheid in een microcentrifuge bij 4 ° C.
  7. Discard pellet. Transfer supernatans in nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en blijf op ijs.
  8. DetHermelijn eiwitconcentratie (gewoonlijk 1-10 ug / ul) met de Bradford assay 23.
  9. Aliquot en bewaar celextracten bij -80 ° C tot gebruik.

2. Voorbereiding van eiwitextracten van Mouse lever en milt

  1. Euthanaseren een muis met CO2 inhalatie.
  2. Leg de geëuthanaseerd dier op een schone pad over een dissectie board. Open de buik met een schaar.
  3. Prepareer de lever en de milt met een schaar en forceps, en spoel elk weefsel in ongeveer 50 ml ijskoude PBS.
  4. Onmiddellijk gesneden weefsels in kleine stukjes met een scalpel (bijvoorbeeld ongeveer 1-2 mm 3).
  5. Onverwijld te zetten stukjes weefsel in een frisse cryotube en dan snap vries ze in vloeibare stikstof. WINKEL ingevroren weefsel monsters bij -80 ° C tot gebruik.
  6. Homogeniseren een stuk bevroren weefsel (ongeveer 1-2 mm 3) in 0,25-0,5 mlijskoude cytoplasmatische lysis buffer (tabel 1) met een weefselhomogenisator gedurende 10 sec.
  7. Overdracht homogenaat 1,5 ml microcentrifugebuis en chill op ijs gedurende 20 min.
  8. Centrifugeren gedurende 10 minuten bij volle snelheid in een microcentrifuge bij 4 ° C.
  9. Gooi pellet en overdracht supernatant in nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Houden op het ijs.
  10. Bepaal eiwitconcentratie (gewoonlijk 1-10 ug / ul) met de Bradford assay 23.
  11. Aliquot en bewaar celextracten bij -80 ° C tot gebruik.

3. Bereiding van radiogelabelde IRE-probe

  1. Lineariseren de IRE-bevattende plasmide I-12.CAT 22 door incubatie bij 37 ° C gedurende 1 uur met de restrictie-endonuclease XbaI (1 U per ug plasmide), die stroomafwaarts van de IRE sequentie splitst. Het gelineariseerde plasmide wordt gebruikt als template voor in vitro transcriptie.
  2. Het opzetten van eenn in vitro transcriptie reactie in een totaal volume van 20 pl. Gebruik de voorraadoplossingen in tabel 2 en voeg 1 pl gelineariseerde plasmide sjabloon, 4 ui transcriptiebuffer; 1 pi mengsel van ATP / CTP / GTP mix, 10 gl [α- 32 P] UTP, 2 ui dithiothreitol, 1 pl RNase-remmer en 1 pl T7 RNA polymerase. Meng door en neer te pipetteren.
  3. Incubeer bij 40 ° C gedurende 1 uur 24.

4. Zuivering van radiogelabeld IRE-probe

  1. Eindigen in vitro transcriptie reactie door toevoeging van 1 pi 0,5 M EDTA, pH 8. Meng door en neer te pipetteren.
  2. Voeg 10 ul van 10 mg / ml tRNA als drager voor een betere neerslag. Meng door en neer te pipetteren.
  3. Voeg 82,5 pl 3 M ammoniumacetaat. Meng door vortexen.
  4. Voeg 273 ui ethanol. Meng door vortexen.
  5. Laat staan ​​bij RT gedurende 5 minuten.
  6. Spin gedurende 10 minuten bij volle snelheid in een microcentrifuge bij KT. Discard supernatant.
  7. Was de pellet met 100 pl 70% ethanol.
  8. Spin gedurende 10 minuten bij volle snelheid in een microcentrifuge bij KT. Discard supernatant.
  9. Lucht drogen pellet gedurende 10 min.
  10. Resuspendeer pellet in 100 ul van dubbel gedestilleerd, die eerder geautoclaveerd H 2 O.
  11. Kwantificeren radioactiviteit in een vloeistof scintillatieteller hoeveelheid radioactief gemerkte probe IRE en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. Bevroren aliquots kan voor maximaal 3 weken.

5. Voorbereiding van een native polyacrylamide gel voor EMSA

  1. Monteer de gel (16 x 16 cm) met behulp van 1,5 mm spacers en kam.
  2. Een 6% natieve polyacrylamidegel bereiden, gebruikt de voorraadoplossingen in tabel 3 Meng 7,5 ml van 40% acrylamide. Bisacrylamide, 5 ml 5x TBE en 37,5 mldubbel gedestilleerd H 2 O.
  3. Voeg 0,5 ml 10% vers bereide ammoniumpersulfaat (APS) en 25 gl tetramethylethyleendiamine (TEMED).
  4. Giet onmiddellijk de acrylamide oplossing van het gel en laat polymeriseren. Wacht ongeveer 30 minuten.
  5. Monteer de elektroforese apparaat met de gel, vul de tanks met 0,5x TBE en verbinden met de voeding.

6. elektroforetische mobiliteit Shift Assay

  1. Verdun 25 ug eiwit extract uit cellen of weefsels met cytoplasmatische lysis buffer (tabel 1) in een totaal volume van 10 pl (lagere eiwitconcentraties kunnen ook worden gebruikt). Houden op het ijs. Indien nodig, voeg 1 pl van 1: 4 verdund 2-mercapto-ethanol (2-ME) naar slapende IRP1 (uiteindelijke concentratie: 2%) te activeren 25.
  2. Verdun de radioactief gemerkte probe IRE met tweemaal gedestilleerd H2O 200.000 cpm / gl, warmte gedenatureerd bij 95 °C gedurende 1 min en afkoelen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 minuten.
  3. Maak een EMSA reactie door toevoeging van 1 pi radioactief gemerkte probe IRE het eiwit extract.
  4. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Voeg 1 ul van 50 mg / ml heparine aan de reactie (niet-specifiek eiwit interacties met de sonde 9 remmen) en verder de incubatie nog 10 min. Aliquot de voorraadoplossing van heparine (50 mg / ml) en bewaar bij -80 ° C.
  6. Bij lange radioactief gemerkte probes (> 60 nucleotiden), voeg 1 pl RNase T1 (1 U / ul) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om niet-specifieke eiwit verminderen binding aan de probe, en betere scheiding van de RNA / eiwit toestaan complex tijdens elektroforese.
  7. Voeg 3 ui laadbuffer (80% glycerol + broomfenolblauw), meng en belasting van de 6% niet-denaturerende polyacrylamidegel.
  8. Laat de gel gedurende 60 minuten bij 130 V (5 V / cm).
  9. Transfer de gel op een groot filter papier en droog.
  10. Blootstellen aan een film en ontwikkelen autoradiografie. De blootstelling kan variëren van 1 uur (of minder) tot O / N.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een radioactief gemerkte IRE sonde werd bereid, zoals beschreven in de paragrafen 3 en 4 van het protocol. De sequentie van de probe was 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; de vetgedrukte nucleotiden vertegenwoordigen een ongepaard C residu en de lus, die zijn kritische IRE functies. De specifieke radioactiviteit van de probe was 4,5 x 10 9 cpm / ug RNA.

Om de effecten van ijzer verstoringen op IRE-bindende activiteit uitoefent, zijn murine RAW264.7 macrofagen onbehandeld gelaten of behandeld met hemine (ijzerbron) of deferoxamine (ijzercheleringsmiddel). Lysaten werden bereid en EMSA geanalyseerd met de IRE probe (8000 cpm / ug eiwit). Representatieve gegevens worden getoond in figuur 1, met kortere en langere blootstelling van de autoradiogrammen aan de linker en rechter panelen resp. Muizen IRE / IRP1 en IRE / IRP2 complexen vertonen verschillende mobiliteit en twee verschillende bandszichtbaar in laan 1, overeenkomend met onbehandelde cellen. Ijzerchelatie diep geïnduceerde het IRE-bindende activiteiten van beide IRP1 en IRP2 (baan 2), terwijl het ijzer suppletie verminderd hen (baan 3). Voorbehandeling met 2% 2-ME volledig geactiveerd IRP1 (onderste paneel), zelfs in extracten van ijzer behandelde cellen. Dit toont dat ijzer verstoringen niet van invloed op de stabiliteit van IRP1 en dient ook als een beladingscontrole. Daarentegen remde de 2-ME voorbehandeling het IRE-bindende activiteit van IRP2. De snelle migratie van niet-specifieke banden worden niet beïnvloed door ijzer.

Vervolgens analyseerden we IRE-bindingsactiviteit in levers van wildtype, IRP1 - / - en Irp2 - / - muizen, eerder gevoed gedurende één week met een standaard of een aan ijzer verrijkte dieet (Figuur 2). De IRP1 - / - en Irp2 - / - muizen werden welwillend ter beschikking gesteld door Dr. MW Hentze (EMBL, Heidelberg). In wild type lever extracten, IRP1 goed voor de belangrijkste fractie van IRE-bindende activiteit en IRE / IRP2 complexen waren nauwelijkszichtbare (lanen 1, 2), in overeenstemming met eerdere waarnemingen 26. IRP2 tentoongesteld potente IRE-bindende activiteit in de lever extracten van IRP1 - / - muizen (lanen 3, 4). Onder deze omstandigheden werd geen IRE / IRP1 complexen waargenomen. Evenzo werden geen IRE / IRP2 complexen gevormd lever extracten van Irp2 - / - muizen (lanen 5, 6). Voeden van muizen met een high-ijzer dieet verminderde lever- IRE-bindende activiteit van zowel IRP1 en IRP2; Dit effect was dramatischer op IRP2 (lanen 7-12). Merk op dat na behandeling van wildtype of Irp2 - / - lever extracten met 2-ME, het IRE-bindende activiteit van IRP1 werd verhoogd tot een punt waar het verschoven bijna alle IRE probe (dat duidelijk wordt waargenomen in de kortere blootstelling van de autoradiogrammen op het linker paneel).

Tot slot evalueerden wij de IRE-bindende activiteit in lever en milt van wildtype en HJV - / - muizen (Figuur 3). De HJV - / - muizen werden welwillend ter beschikking gesteld door Dr. NC Andrews (Duke University, NC). Deze dieren vormen een modelvan erfelijke hemochromatose 27, een ziekte van systemische ijzerstapeling, waar overmatig ijzer zich ophoopt in parenchymcellen, terwijl reticuloendotheliale macrofagen blijven ijzertekort 28. Zoals verwacht, levers van HJV - / - muizen (met ijzer beladen hepatocyten) vertoonden verminderde IRE-bindende activiteit vergeleken met wildtype (lanen 1-4). Omgekeerd, IRE-bindende activiteit was hoger in milten van HJV - / - muizen (die ijzer-deficiënte macrofagen; lanen 5-8). Hier weer, de 2-ME behandeling bevorderd bijna volledige verschuiving van het IRE sonde in de lever extracten (zie kortere blootstelling van de autoradiogrammen op het linker paneel).

Tabel 1. cytoplasmatische lysis buffer.

1% Triton X100
25 mM Tris-HCl, pH 7,4
40 mM KCl
  1. De oplossing moetworden geautoclaveerd en bewaard bij kamertemperatuur.
  2. Proteaseremmers, zoals 10 ug / ml leupeptine en 0,1 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) kan voor gebruik worden toegevoegd.
  3. Toevoeging van vers 1 mM dithiotheritol wordt aangeraden voor de detectie van IRP2 activiteit.

Tabel 2. De oplossingen voor in vitro transcriptie reactie.

1 ug / ul gelineariseerd plasmide sjabloon
5x transcriptie buffer (geleverd met T7 RNA-polymerase)
20 mM mix van ATP, CTP en GTP
3000 Ci / mmol [α-32P] UTP
100 mM dithiothreitol
10 U / ul RNase inhibitor
20 U / pl T7 RNA polymerase


<strong> Tabel 3. De oplossingen voor niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese.

40% acrylamide: bisacrylamide (37,5: 1)
5x TBE (Tris / boraat / EDTA)

Voor het maken van 1 liter 5x TBE Gebruik 54 g Tris-base, 27,5 g boorzuur en 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0).

Figuur 1
Figuur 1. Iron-afhankelijke regulatie van IRE-bindend activiteiten in RAW264.7 macrofagen. 10 7 cellen werden onbehandeld gelaten of behandeld O / N met 100 uM hemine of desferrioxamine. Cytoplasmatische lysaten werden bereid en geanalyseerd door EMSA met 32P gemerkte probe IRE in afwezigheid (bovenste) of aanwezigheid van 2% 2-ME (bottom). De posities van IRE / IRP1 en IRE / IRP2 complexen, en van vrije IRE sonde zijn aangegeven met pijlen. De ster geeft aan een niet-specifieke band. Kortere en langere belichtingen van autoradiogrammen worden getoond in de linker en rechter panelen, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Analyse van IRE-bindende activiteiten in levers van wildtype (wt), IRP1 - / - en Irp2 - / -. Muizen 5 weken oude muizen (n = 2 per genotype), alle in C57BL / 6 achtergrond 29 werden op een standaard of hoge-ijzer dieet (dat 2% carbonylijzer) geplaatst. Na een week werden de dieren geëuthanaseerd. Hepatische eiwitextracten werden bereid en geanalyseerd door EMSA met een 32P gelabelde probe IREin afwezigheid (bovenste) of aanwezigheid van 2% 2-ME (onder). De posities van IRE / IRP1 en IRE / IRP2 complexen, en van vrije IRE sonde zijn aangegeven met pijlen. De ster geeft aan een niet-specifieke band. Kortere en langere belichtingen van autoradiogrammen worden getoond in de linker en rechter panelen, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Analyse van IRE-bindende activiteiten in lever en milt van wildtype (wt) en HJV - / -. Muizen 10 weken oude muizen (n = 2 per genotype), alle in C57BL / 6 achtergrond 30, werden gedood. Lever en milt eiwitextracten werden bereid en geanalyseerd door EMSA met 32P gemerkte probe IRE in afwezigheid (bovenste) of aanwezigheid van2% 2-ME (onder). De posities van IRE / IRP1 en IRE / IRP2 complexen, en van vrije IRE sonde zijn aangegeven met pijlen. De ster geeft aan een niet-specifieke band. Kortere en langere belichtingen van autoradiogrammen worden getoond in de linker en rechter panelen, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hierin beschrijven we een protocol dat is ontwikkeld om het IRE-bindende activiteiten van IRP1 en IRP2 bestuderen, en laten we representatieve gegevens. Met verschillende probes, kan dit protocol worden aangepast voor de studie van andere RNA-bindende eiwitten. Een kritische stap is de grootte van de probe. Het gebruik van lange probes, die gemeenschappelijk wanneer de precieze bindingsplaats bekend, kan resulteren in RNA / eiwit-complexen die niet verschillend migreren dan de vrije RNA. In dit geval is het raadzaam om ongebonden RNA verwijderd door behandeling met RNAse T1 (stap 6.6). De kwaliteit van de probe is ook zeer belangrijk. De beste resultaten worden verkregen met vers bereide radioactief gemerkt RNA. Gelzuivering 10 is niet noodzakelijk, maar kan het uiterlijk van de EMSA als de in vitro transcriptie reactie probe preparaat levert voortijdige beëindiging te verbeteren (en indien geen RNAse T1 digestie stap is inbegrepen). Het uitvoeren van de inheemse gelelektroforese te snel may leiden tot oververhitting, wat kan leiden tot dissociatie van RNA / eiwitcomplexen en resulteren in fuzzy bands.

Kwantitatieve resultaten kunnen worden verkregen door analyse van de intensiteit van het vertraagde banden met phosphorimaging. Kwantificeringen zijn alleen geldig wanneer de RNA-sonde is in overmaat aanwezig en is niet beperkend voor RNA bindend. De affiniteit van de interactie RNA / eiwit, vertegenwoordigd door de dissociatieconstante Kd die is gekoppeld aan de vrije energie Ag o, kan onder evenwichtsomstandigheden worden bepaald door titreren van de RNA-bindende activiteit met afnemende hoeveelheden radioactief gemerkte probe 3. Het IRE / IRP1 interactie is uitgebreid fysicochemisch 9,31 gekarakteriseerd. Titratie EMSA experimenten met verschillende hoeveelheden van een RNA-bindende proteïne kan worden uitgevoerd om stoechiometrie 3 berekenen. Specificiteit voor binding kan eenvoudig worden bevestigd door competitie-experimenten met een overmaat ongelabelde "koude" competitor RNAs 3. Alleen specifieke concurrenten moet de intensiteit van de achterlijke radioactieve band te verminderen. De specificiteit kan worden gecontroleerd door het opnemen van een antilichaam tegen het RNA bindend eiwit in de EMSA reactie, die een "supershift" oplevert 7. Dit kan ook worden benut om de identiteit van de RNA-bindende eiwit te bepalen. No "supershift" worden waargenomen met niet-specifieke antilichamen of pre-immune serum.

Concluderend, de EMSA is een krachtige methode voor de analyse van RNA / eiwit interacties. Het is relatief gemakkelijk uit te voeren en vereist een minimale infrastructuur. Het is niet zo eenvoudig als het filter bindingstest, maar informatiever en accurate gegevens opleveren wanneer meerdere RNA-bindende eiwitten interageren specifiek met de probe (zoals IRP1 en IRP2). Opgemerkt moet worden dat in tegenstelling tot muizen, menselijke IRE / IRP1 en IRE / IRP2 complexen co-migreren EMSA. Zij kunnen echter worden gescheiden door "supershifts̶1; specifieke antilichamen 7. De EMSA is niet waardevol voor de gedetailleerd in kaart brengen van RNA / eiwit interacties; andere technieken, zoals de RNAse bescherming assay toeprinting of verknoping 32 geschikter. Toch is de EMSA is een uitstekende keuze voor het ontdekken van nieuwe RNA / eiwit-interacties, zoals het geval was met de IRP's 8 is geweest, maar ook voor de bevestigende gegevens verkregen met computationele of hoge doorvoer experimentele benaderingen. Bovendien is de EMSA superieur voor het analyseren specificiteit en fysicochemische eigenschappen van RNA / eiwit interacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics