IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNA / 단백질 상호 작용은 전사 후 조절 경로에 대한 중요합니다. 가장 특징 세포질 RNA 결합 단백질 중 철 조절 단백질, IRP1과 IRP2입니다. 그들은하여 mRNA를 번역 또는 안정성을 제어하는​​ 여러 대상의 mRNA의 번역되지 않은 지역 (UTRs) 내에서 반응 요소 (IRES)을 다림질 결합한다. IRE / IRP 상호 작용은 널리 EMSA에 의해 연구되고있다. 여기서, 우리는 다른 RNA 결합 단백질의 활성을 평가하기 위해 일반화 될 수 IRP1과 IRP2 IRE의 결합 활성을 EMSA 분석 프로토콜을 설명한다. RNA 결합 단백질, 또는이 단백질의 정제 된 제제를 함유하는 조단백질 해물, 복합체 형성을 가능하게 표지 된 32 P-RNA 프로브의 과량과 함께 배양된다. 헤파린 결합 프로브 비 특정 단백질을 배제하기 위해 추가됩니다. 이어서, 혼합물을 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 비 변성 전기 영동에 의해 분석된다. 무료 프로브, 빠른 마이그레이션하는 동안 RNA / 단백질 복합체 전시 지체 이동; 그러므로, 절차는 또한 "겔 위상차"또는 "bandshift"분석 불린다. 전기 영동 완료 후, 겔을 건조 및 RNA / 단백질 복합체,뿐만 아니라 자유 프로브는, 오토 래디오 그래피에 의해 검출된다. 프로토콜의 전반적인 목적은 감지 IRE / IRP 및 기타 RNA / 단백질 상호 작용을 정량화하는 것이다. 또한, EMSA는 조사중인 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 결합 친화력 및 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다.

Introduction

EMSA는 원래 타겟 DNA 서열과 1,2- DNA 결합 단백질의 관계를 연구하기 위해 개발되었다. 원리는이 문서의 초점이다 RNA / 단백질 상호 작용 3, 비슷합니다. 간단히, RNA는 음전하 폴리 아크릴 아미드 (또는 아가로 오스) 겔에서 전기 영동 비 변성 중에 애노드쪽으로 이동한다. 겔 내에서 마이그레이션 충전량에 비례하는 RNA의 크기에 따라 달라집니다. 특정 RNA에 단백질의 결합은 무료 RNA에 비해 복잡한 마이그레이션하는 느린 이동성을 변경합니다. 이는 분자량의 증가뿐만 아니라, 충전 및 가능한 입체 구조의 변화에​​ 주로 기인한다. 프로브로 표지 된 RNA를 활용하여 "젤 지연"또는 "bandshift"쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 32 P - 라벨 RNA 프로브의 사용은 매우 일반적이며 높은 감도를 제공합니다. RNA / 단백질 복합체 무료 RNA의 이동이 감지된다오토 라디오로. 단점 32 P (14.29 일), 방사선 분해로 인해 프로브의 품질의 점진적인 열화의 짧은 반감기이다 방사능 라이센스 방사능 작업 인프라 및 잠재적 생물 안전성 문제의 요구. 따라서, RNA 프로브 레이블을 대체 비 동위 원소 방법은 형광 또는 화학 발광 영상 4,5의 검출을 가능하게 형광 물질이나 바이오틴,와 예를 들어, 개발되었다. 이러한 방법의 제한은 높은 비용과 동위 원소 라벨에 비해 자주 감소 감도 및 RNA / 단백질 상호 작용을 방해하는 비 동위 원소 라벨의 가능성이 있습니다. 비 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔은 가장 EMSA 애플리케이션에 적합하며 일반적으로 사용된다. 경우에 따라, 아가 로스 젤 큰 단지의 분석을위한 대안을 제기 할 수 있습니다.

EMSA의 주요 장점은 단순성, 감도 및 안정성을 겸비한 4 점이다 </ SUP>. 분석은 몇 시간 내에 완료 될 수 있고, 정교한 장비를 필요로하지 않는다. RNA / 단백질 상호 작용은 0.1 nm 이하의 낮은 농도에서 EMSA에 의해 검출 될 수 있고, 광범위한 결합 조건의 범위 내에서 (pH가 4.0-9.5, 가의 염 농도 1-300 ㎜, 온도 0-60 ℃).

RNA / 단백질 복합체 형성은 필터 결합 분석에 의해 연구 할 수있다. 자유 RNA 프로브가 6을 통과하면서는 니트로 셀룰로오스 필터 RNA / 단백질 복합체의 유지에 기초하여, 간단하고, 빠르고, 저렴한 절차이다. EMSA에 비해, 그것은 RNA 프로브가 다중 결합 부위를 포함하거나 조 추출물이 동일한 사이트에서 프로브에 결합하는 하나 이상의 RNA 결합 단백질이 들어 가지 경우에 한정된다. 여러 RNA / 단백질 상호 작용은 필터 결합 분석에 의해 탐지되지 것이지만, 그들은 용이 EMSA에 의해 시각화 될 수있다. 어떤 경우에는, 시각화 이브이다N 가능한 경우, 겔에 더 지체를 산출, EMSA 반응에 RNA 결합 단백질 중 하나에 대한 항체를 추가하여 공동 마이그레이션 (예를 들어, 인간의 IRP1 / IRE 및 IRP2 / IRE 단지) 두 RNA / 단백질 복합체 ( "supershift") 7.

EMSA 널리 철 대사 8-10의 전사 후 레귤레이터이다 IRP1과 IRP2을 연구하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지의 mRNA (11)의 UTRs 내에서 IRES, 계통 발생 학적으로 보존 헤어핀 구조에 결합함으로써 작동합니다. IRES 먼저 페리틴 (12)와 트랜스페린 수용체 1 (TfR1) (13), 각각 철 저장 및 흡수의 단백질을 암호화하는 mRNA를 발견했다. 나중에, IRES는 적혈구 특정 aminolevulinate 신타 (ALAS2) 14 미토콘드리아 aconitase 15 ferroportin 16, 2가 금속 수송 체 1 (DMT1) 17, 저산소증 유도 성 인자 (2)에서 발견 된 (18), 및 기타의 mRNA 19-21. UTR 'TfR1의 mRNA는 3에서 여러 IRES를 포함하는 동안, UTR'프로토 타입 H-와 L-페리틴의 mRNA는 5 일 IRE가 포함되어 있습니다. IRE / IRP의 상호 작용은 특히 입체 43S 리보솜 서브 유닛의의 연결을 차단하여 페리틴 mRNA의 번역을 억제; 또한, 그들은 endonucleolytic 분열에 대한 TfR1 mRNA의 안정화. IRP1과 IRP2 공유 광범위한 서열의 유사성과 철에 굶주린 세포에서 높은 IRE 결합 활성을 나타낸다. IRP2은 프로 테오 열화를 겪는 동안 철 구비 세포에서, IRP1는 그것 IRE 결합능 희생 aconitase 세포질로 변환 쿠반의 Fe-S 클러스터를 조립한다. 따라서, IRE / IRP 상호 작용은 세포 철 상태에 의존 할뿐만 아니라, H 2 O 2, 산화 질소 (NO) 또는 저산소증과 같은 다른 신호들에 의해 조절된다. 여기서는 E에 의해 조 세포 및 조직 추출물에서 IRE - 결합 활성을 평가하기위한 프로토콜을 묘사MSA. 우리는 IRE 서열은 원래 의해 하류 T7 RNA 중합 효소 사이트의 센스 방향에 도입 된 플라스미드 DNA 템플릿 (I-12.CAT)로부터 시험 관내 전사에 의해 생성 된 32 P - 표지 H-페리틴 IRE 프로브를 사용 어닐링 합성 올리고 뉴클레오티드 (22)의 복제.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

쥐 실험 절차는 맥길 대학 (프로토콜 4966)의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.

배양 된 세포에서 단백질 추출물 1. 준비

  1. 얼음처럼 차가운 인산 완충 생리 식염수 10 ㎖ (PBS)로 두 번 배양 세포를 씻으십시오.
  2. 고무 경찰관 또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 얼음처럼 차가운 PBS, 전송 현탁액 1 ㎖의 플라스틱 셀 스크레이퍼 중 하나에 부착 된 세포를 다 쳤어요.
  3. 4 ° C에서 700 XG에 5 분의 microcentrifuge에 스핀. 대기음 PBS.
  4. 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 세포질 용해 버퍼 100 ㎕ (표 1)를 추가하고 아래로 피펫.
  5. 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션.
  6. 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀.
  7. 취소 펠렛. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 얼음에 보관하십시오.
  8. DET브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 순백의 단백질 농도.
  9. 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다.

마우스 간 및 비장에서 단백질 추출물 2. 준비

  1. CO 2 흡입으로 마우스를 안락사.
  2. 해부 보드 위에 깨끗한 패드의 안락사 동물을 놓습니다. 가위로 복부를 엽니 다.
  3. 가위 집게를 사용하여 간 및 비장을 해부하고, 약 50 ml의 빙냉 PBS에서 각 조직을 헹군다.
  4. 즉시 메스 작은 조각으로 조직을 절단 (예 : 약 1-2mm 3).
  5. 지체없이 신선한 cryotube에 조직의 조각을 넣고 액체 질소를 고정 스냅. 스토어 스냅인 냉동 조직 씩을 사용할 때까지 -80 ° C에서.
  6. 0.5 ㎖의 - 0.25 - (2 내지 3mm 정도 1) 동결 조직의 한 조각 균질화세포질 빙냉 용해 완충액 (표 1) 10 초 동안 조직 균질화.
  7. 20 분 동안 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관과 진정으로 균질을 전송합니다.
  8. 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀.
  9. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 펠렛 및 전송 상층 액을 제거한다. 얼음에 보관하십시오.
  10. 브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 단백질 농도를 결정합니다.
  11. 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다.

방사성 표지 IRE 프로브 3. 준비

  1. 제한 효소 XbaI으로 (플라스미드 당 1 μg의 U), IRE 서열의 하류로 절단하여, 1 시간 동안 37 ° C에서 배양하여 IRE 함유 플라스미드 I-12.CAT 22 선형화. 선형화 된 플라스미드는 시험 관내 전사를위한 템플릿으로 사용됩니다.
  2. 설정N 체외 20㎕의 전체 부피에서 전사 반응. 표 2에 나타낸 스톡 솔루션을 사용하고 추가 1 μL 선형화 된 플라스미드 주형 4 μL 전사 버퍼; ATP / CTP / GTP 믹스 1 ㎕를 혼합, 10 ㎕의 [α- 32 P] -UTP, 2 μL 디티 오 트레이 톨, 1 ㎕의 RNA 분해 효소 억제제 및 1 μL의 T7 RNA 폴리머 라제. 로 pipetting 아래로 섞는다.
  3. 1 시간 24 40 ° C에서 품어.

방사성 표지 IRE 프로브 4. 정제

  1. 피펫 팅 아래로 0.5 M EDTA, pH가 8 믹스 1 μl를 추가하여 시험 관내 전사 반응을 종료합니다.
  2. 더 나은 침전 캐리어로, 10 ㎎ / ㎖의 tRNA의 10 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다.
  3. 3 M 암모늄 아세테이트 82.5 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다.
  4. 에탄올 273 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다.
  5. 5 분 동안 RT에 서 보자.
  6. RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액.
  7. 워시는 70 % 에탄올 100 ㎕로 펠렛.
  8. RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액.
  9. 10 분 동안 공기 건조 펠렛.
  10. 이중 증류수 100 ㎕에 재현 탁 펠릿은, 이전에 H 2 O를 멸균
  11. 사용할 때까지 -80 ° C에서 액체 섬광 계수기의 방사능, 나누어지는 방사성 동위 원소 표지의 IRE 프로브와 저장소를 정량화. 냉동 분취 최대 3 주 동안 사용될 수있다.

EMSA에 대한 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 5. 준비

  1. 1.5 mm 스페이서와 빗을 사용하여 겔 (16 × 16cm)를 조립합니다.
  2. 표 3에 도시 된 원액을 사용하여, 6 % 폴리 아크릴 아미드 겔 네이티브을 제조 7.5 ㎖의 40 % 아크릴 아미드의 혼합 :. 비스 아크릴 아미드, 5X TBE 5 ㎖과 37.5 ml에더블 증류수 H 2 O
  3. 10 % 새롭게 제조 된 황산 암모늄 (APS) 25 μL의 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)의 0.5 ML을 추가합니다.
  4. 즉시 젤에 아크릴 아미드 솔루션을 붓고 중합 할 수 있습니다. 약 30 분 동안 기다립니다.
  5. 상기 겔 전기 영동 장치를 조립하여 0.5X TBE의 탱크를 채우기와 전원 연결.

6. 전기 이동 기동성 교대 분석 실험

  1. 10 μL의 총 부피에서 세포질 또는 세포 용해 완충액 (표 1)과 조직으로부터의 단백질 추출물의 25 μg의 희석 (저급 단백질 농도도 사용될 수있다). 얼음에 보관하십시오. 25 : 4 휴면 IRP1 (2 % 최종 농도)를 활성화 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME)로 희석 : 필요한 경우, 1의 1 μl를 추가합니다.
  2. 95 °에서 두 번 증류수에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브를 희석 2 O 200,000 CPM / μL, 열 변성에1 분 C, 그리고 적어도 5 분 동안 실온에서 냉각.
  3. 단백질 추출물에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브의 1 μl를 추가하여 EMSA 반응을 설정합니다.
  4. 실온에서 20 분 동안 품어.
  5. 반응 50 ㎎ / ㎖ 헤파린의 1 μl를 추가 (프로브 (9)와 비 특정 단백질 상호 작용을 억제하기 위해) 또 다른 10 분 동안 배양을 계속합니다. -80 ° C에서 스톡 헤파린 용액 (50 ㎎ / ml) 및 저장소 나누어지는.
  6. 긴 방사성 표지 된 프로브 (> 60 개 뉴클레오티드)를 사용하는 경우, 1 μL의 RNase T1 (1 U / μL)를 첨가하고, RT에서 10 분 동안 인큐베이션 프로브 비특이적 결합 단백질을 줄이기 위해, 및 RNA / 단백질의 잘 구분할 수 있도록 전기 영동시 복잡한.
  7. 로딩 버퍼 (80 % 글리세롤 + 브로 모 페놀 블루)의 3 μl를 추가, 혼합 6 % 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에로드.
  8. 130 V (5 V / cm)에서 60 분 동안 젤을 실행합니다.
  9. 티를 ransfer 큰 필터 종이 건조 위에 젤.
  10. 필름에 노출 및 오토 라디오를 개발한다. 노출 시간은 1 시간 (이하)에서 O / N까지의 범위 일 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

섹션 3 및 4 프로토콜에 기재된 방사성 표지 된 프로브 IRE 제조 하였다. 프로브의 서열은 5'-CUG GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC UUCAA C C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '이었다; 굵은 뉴클레오티드는 중요한 IRE 기능입니다 짝이없는 C 잔류 루프를 나타냅니다. 프로브의 특정 방사능 4.5 × 109 CPM / μg의 RNA의이었다.

활성 IRE는 결합에 철 교란의 효과를 평가하기 위해, 뮤린 RAW264.7 대 식세포는 방치 또는 헤민 (철 공급원) 또는 desferrioxamine (철 킬 레이터)으로 처리 하였다. 용 해물을 제조하고 IRE 프로브 (8,000 CPM / μg의 단백질)와 EMSA에 의해 분석 하였다. 대표 데이터는 각각 좌측 및 우측 패널의 autoradiograms 짧고 긴 노출이,도 1에 도시되어있다. 쥐 IRE / IRP1과 IRE / IRP2 단지 다른 이동성과 두 가지 대역을 전시처리되지 않은 세포에 해당하는 1 레인에서 볼 수 있습니다. 철분 보충을 감소하면서 철 킬레이트 뿌리깊, (레인 3) IRP1과 IRP2 (레인 2) 모두의 IRE 결합 활동을 유도. 심지어 철 처리 된 세포 추출물 2 % 2-ME가 완전히 활성화 IRP1 (하단 패널)와 전처리. 이것은 철분이 섭동 IRP1의 안정성에 충돌하지 않는 것을 보여주고 또한 로딩 대조군으로서 작용한다. 반면에 2-ME의 전처리 IRP2의 IRE 결합 활성을 억제 하였다. 빠른 마이그레이션 비특이적 밴드는 철의 영향을받지 않습니다.

다음으로, 우리는 야생형의 간에서 활성을 IRE가 결합 분석, Irp1 - / - 및 Irp2 - / - 이전에 표준 또는 철 풍부한 다이어트 (그림 2)와 함께 일주일 동안 공급 마우스. Irp1 - / - 및 Irp2 - / - 마우스는 친절 박사 MW Hentze (EMBL, 하이델베르크)에 의해 제공되었다. 야생형 간 추출물에서 IRP1은 IRE 결합 활동과 IRE / IRP2 단지의 주요 부분을 차지 거의 없었다이전의 관찰 (26)와 계약에 표시 (차선 1, 2). - / - 생쥐 (레인 3, 4) 간 IRP2 Irp1 추출물의 효능 IRE - 결합 활성을 나타내었다. 이러한 조건 하에서, 더 IRE / IRP1 착물은 관찰되지 않았다. - / - 마찬가지로, 어떠한 IRE / IRP2 착물 간 Irp2 추출물에 형성되지 않을 때 생쥐 (레인 5, 6). 모두 IRP1과 IRP2의 간 IRE-바인딩 활동이 높은 철 다이어트와 마우스를 감소 먹이; 이 효과는 IRP2 (차선 7-12)에 더 극적이었다. 참고 야생형 또는 Irp2의 치료 후 -이 명확하게 autoradiograms의 짧은 노출 관찰 (2-ME, IRP1의 IRE 결합 활동이 거의 모든 IRE 프로브를 이동 점으로 향상되었습니다와 간 추출물 - / 왼쪽 패널).

- / - 마우스 (그림 3) 마지막으로, 우리는 간과 야생형과 Hjv의 비장의 IRE 결합 활성을 평가 하였다. Hjv - / - 마우스는 친절 박사 NC 앤드류스 (듀크 대학, NC)에 의해 제공되었다. 이 동물 모델을 대표유전 혈색소 침착증 (27), 세망 내피 대 식세포가 철을 유지하면서 과도한 철, 실질 세포에 축적 전신 철 과부하의 질병은 28 결핍. 예상대로, Hjv의 간 - / - 전시 (철로드 간세포와) 마우스는 야생형 (차선 1-4)에 비해 활동을 IRE가 결합 감소했다. 반대로, IRE 결합 활동은 Hjv의 비장에서 더 높았다 - / - 마우스 (철 결핍 된 대 식세포를 포함, 5-8 차선). 여기에서 다시, ME-2 치료는 간 추출물 (왼쪽 패널의 짧은 노출 autoradiograms 참조) IRE 프로브의 거의 완전한 전환을 촉진.

표 1. 세포질 용해 버퍼입니다.

1 % 트리톤 (Triton) X100
25 mM 트리스 -HCl, pH 7.4
40 mM의 KCl을
  1. 해결해야멸균 및 RT에 저장 될 수있다.
  2. 프로테아제 억제제, 예컨대 10 ㎍ / ml의 류 펩틴, 0.1 mM의 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)를 사용하기 전에 첨가 할 수있다.
  3. 신선한 1 밀리미터 dithiotheritol 첨가 IRP2 활동의 검출을위한 시스템 권장된다.

시험 관내 전사 반응 표 2. 증권 솔루션을 제공합니다.

/ μL 선형화 플라스미드 템플릿 1 μg의
5 배 전사 버퍼 (T7의 RNA 중합 효소와 함께 제공)
ATP, CTP 및 GTP의 20 mM의 믹스
3000 CI / 밀리몰 [α-32P] -UTP
100 mM의 디티 오 트레이 톨
10 U / μL의 RNase 억제제
20 U / μL의 T7 RNA 폴리머 라제


<폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 비 변성 강한> 표 3 모액.

40 % 아크릴 아미드 : 비스 아크릴 아미드 (37.5 : 1)
5 배 TBE (트리스 / 보레이트 / EDTA)

5X TBE 1 L의 제조 트리스베이스 54g, 붕산 27.5 g 및 0.5 M EDTA (PH 8.0) 20 ㎖을 사용한다.

그림 1
RAW264.7 대 식세포의 활동을 IRE가 결합 그림 1. 철 따라 규제. 10 7 세포 / 100 μM 헤민 또는 desferrioxamine와 N 중 왼쪽 치료 또는 치료 O했다. 세포질 해물 2 % 2-ME를 (아래의 부재 (위) 또는 존재 하에서 32 IRE P 표지 된 프로브와 EMSA에 의해 제조 및 분석 하였다). IRE / IRP1과, 무료 IRE 프로브의 IRE / IRP2 단지의 위치는 화살표로 표시됩니다. 스타 비특이적 밴드를 나타낸다. autoradiograms의 짧은 긴 노출은 왼쪽과 오른쪽 패널에 표시됩니다, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 분석 야생형 (중량)의 간에서 활동을 IRE 결합, Irp1 - / - 및 Irp2는 - / -. 마우스 오주 된 마우스 (N = 2 각 유전자형의 경우), C57BL / 6 배경 (29)의 모든, 표준 또는 고 다이어트 철 (2 %, 카르 보닐 철을 포함)에 배치했다. 일주 후 동물은 안락사시켰다. 간장 단백질 추출물을 32 IRE P 표지 된 프로브와 EMSA에 의해 제조 및 분석 하였다2 % 2-ME (아래)의 부재 (위) 또는 존재. IRE / IRP1과, 무료 IRE 프로브의 IRE / IRP2 단지의 위치는 화살표로 표시됩니다. 스타 비특이적 밴드를 나타낸다. autoradiograms의 짧은 긴 노출은 왼쪽과 오른쪽 패널에 표시됩니다, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
- / -. 간에서의 활동과 야생 유형 (중량) 및 Hjv의 비장 IRE가 결합 그림 3. 분석 마우스 (각 유전자형에 대한 N = 2) 십주 된 생쥐를 C57BL / 6 배경 (30) 모두, 안락사시켰다. 간과 비장 단백질 추출물 부재 (위)의 존재하에 또는 P-32 IRE 표지 프로브와 EMSA에 의해 제조 및 분석 하였다2 % 2-ME (아래). IRE / IRP1과, 무료 IRE 프로브의 IRE / IRP2 단지의 위치는 화살표로 표시됩니다. 스타 비특이적 밴드를 나타낸다. autoradiograms의 짧은 긴 노출은 왼쪽과 오른쪽 패널에 표시됩니다, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

여기서, 우리는 IRP1과 IRP2의 IRE 결합 활동을 연구하기 위해 개발 된 프로토콜을 설명하고 우리는 대표적인 데이터를 보여줍니다. 다른 프로브를 사용함으로써,이 프로토콜은 다른 RNA 결합 단백질의 연구를 위해 조정될 수있다. 중요한 단계는 탐침의 크기이다. 정확한 결합 부위를 알 수없는 경우 일반적인 긴 프로브의 사용은 무료 RNA 다르게 마이그레이션되지 않습니다 RNA / 단백질 복합체가 발생할 수 있습니다. 이 경우, RNAse가 T1 (단계 6.6)으로 처리함으로써 미 결합 RNA를 제거하는 것이 바람직하다. 프로브의 품질도 매우 중요하다. 최상의 결과를 새로 제조 된 방사성 동위 원소 표지 된 RNA를 얻을 수 있습니다. 겔 정제 (10)는 필요하지 않지만 (더 RNAse가 T1 소화 단계가 포함되지 않은 경우 등)을 검사 준비를위한 시험 관내 전사 반응이 조기 종료되는 제품을 산출하는 경우 EMSA의 외관을 향상시킬 수있다. 기본 겔 전기 영동 너무 빨리 m 실행님이 RNA / 단백질 복합체의 해리 리드하고 퍼지 밴드가 발생할 수 있습니다 과열을 초래한다.

정량적 결과는 phosphorimaging와 지연 밴드의 강도를 분석함으로써 얻어 질 수있다. RNA 프로브를 초과 존재하고 RNA 바인딩에 대한 제한되지 않은 경우 정량화에만 유효합니다. 자유 에너지 ΔG 연결되어 해리 상수 K를 D로 표시 RNA / 단백질 상호 작용의 친화도는, 방사성 표지 된 프로브 (3)의 양이 감소함에 따라 RNA 결합 활성을 적정하여 평형 조건에서 평가 될 수있다. IRE / IRP1의 상호 작용은 광범위하게 물리 화학적 9,31 특징으로하고있다. RNA 결합 단백질 양의 변화와 EMSA 적정 실험 화학량 셋을 계산하기 위해 수행 될 수있다. 바인딩에 대한 특이성은 쉽게 레이블이없는 "콜드"빌려 과잉 경쟁 실험에 의해 검증 될 수있다etitor RNA를 3. 특정 경쟁은 지체 방사성 밴드의 강도를 감소시켜야한다. 특이성은 또한 7 "supershift"를 산출 할 것이다 EMSA 반응에서 RNA 결합 단백질에 대한 항체를 포함하여 모니터링 할 수있다. 이것은 또한 RNA 결합 단백질의 신원을 결정하는 데 이용 될 수있다. 없음 "supershift는"비 특이 항체 또는 사전 면역 혈청으로 관찰 될 수 없습니다.

결론적으로, EMSA는 RNA / 단백질 상호 작용 분석을위한 강력한 방법이다. 그것은 수행 비교적 쉽게 최소한의 인프라가 필요합니다. 이 필터 결합 분석하는 것만 큼 간단하지 않지만 여러 RNA 결합 단백질 (예 : IRP1과 IRP2 등) 프로브를 구체적으로 상호 작용을 할 때 더 유익하고 정확한 데이터를 얻을 것입니다. 이 뮤린 달리, 인간 IRE / IRP1 IRE 및 / IRP2 착체 EMSA의 동일 이주 주목해야한다. 그러나, 그들은 "supershifts̶ 의해 분리 될 수있다1; 특정 항체 7. EMSA는 RNA / 단백질 상호 작용의 상세한 매핑 유용한 아니다; toeprinting 32 또는 가교 등의 RNAse 보호 분석과 같은 다른 기술들이 더 적합하다. 그럼에도 불구하고 EMSA는 IRP를 8의 경우되고, 또한 계산 또는 높은 처리량 실험 방법으로 얻은 데이터를 확증을위한 것처럼, 새로운 RNA / 단백질 상호 작용을 발견하기위한 최적의 선택이 될 것입니다. 또한, EMSA는 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 및 물리 화학적 특성을 분석하기위한 우수하다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics