Manipulation du Rat coton en études pour l'évaluation pré-clinique de virus oncolytiques

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Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

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Abstract

Introduction

Les virus oncolytiques (OV) se répliquent sélectivement dans des cellules tumorales en exploitant les différences biochimiques entre les cellules normales et tumorales 1,2. Il existe deux types de VO: ceux qui ne nécessitent pas une mutation pour atteindre oncolyse sélective, dénommé naturels des virus de type sauvage et celles qui doivent être conçus pour atteindre oncolyse sélective. La collection de mutations au sein d'un type de tumeur donné détermine la nature de l'avantage sélectif de croissance pour les cellules normales pour une VO 2. La sécurité et l'avantage d'utiliser VO a été démontrée dans des essais cliniques 3-7. Malgré les progrès dans le domaine de virothérapie oncolytique il existe des écarts entre les résultats pré-cliniques et cliniques, ce qui suggère que de meilleurs modèles sont nécessaires pour évaluer l'efficacité antitumorale de VO.

Herpèsvirus bovin de type 1 (BHV-1) est un membre de la famille des Herpesviridae, et Alphaherpesviridae sous-famille. BHV-1 initiAtes bovin de complexe des maladies respiratoires chez les bovins, se manifestant dans une grande variété de symptômes ressemblant à un mauvais rhume 8,9. BHV-1 se lie à des récepteurs fixation et d'entrée utilisées par le HSV-1, comme le sulfate d'héparane et nectin-1 10. Cependant, il se lie CD155 à la place de nectin-2 10. BHV-1 a une gamme d'hôtes très étroit de telle sorte qu'elle est incapable d'entrer efficacement et initier la réplication dans les cellules murines normales et transformées 3,4,10. Cela rend l'utilisation de modèles murins classiques problématique. La capacité oncolytique de BHV-1 a été démontrée in vitro 11,12. BHV-1 a été montré pour initier la réplication et à tuer des cellules tumorales humaines provenant de diverses origines histologiques, comprenant des cellules de cancer du sein et le cancer du sein cellules initiatrices 11,12. Cependant, la capacité anti-tumorale de BHV-1 doit être évaluée in vivo dans le cadre d'un hôte immunocompétent.

Adénovirus humain (Ad), pour lesquelsil ya 57 sérotypes identifiés, provoque le plus souvent une maladie respiratoire chez les humains. Vecteurs Ad oncolytiques ont été évalués pour leur efficacité antitumorale avec plusieurs avançant dans les essais cliniques de 13 à 15. Malgré des données pré-cliniques prometteurs, les résultats cliniques ont été à la hauteur des attentes. Des modèles de xénogreffes tumorales humaines sont généralement utilisés pour étudier l'efficacité antitumorale de vecteurs Ad, bien qu'ils présentent une atténués réponses immunitaires au virus 16,17. En outre, les modèles murins syngéniques sont non permissif à l'infection de l'annonce, ce qui rend l'évaluation des réponses immunitaires de l'hôte en utilisant ces modèles irréalisables 17,18.

Le système immunitaire de l'hôte a été identifié comme le mécanisme le plus influent par lequel VO provoquent la mort des cellules tumorales 19. les réponses antitumorales et entre rendues tolérantes antigène associé à une tumeur non rendues tolérantes (TAA) et modèles diffèrent peuvent influer grandement sur le succès de la thérapie OV. Le HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 en 1814 20) 20,21 provoqué une régression des tumeurs chez 80% des souris porteuses de tumeurs dans un modèle de cancer mammaire 22 de l'antigène T du polyome Moyen murin. Cependant, dans ses deux modèles-/ neu, l'efficacité antitumorale de KM100 a varié entre 20% régression complète chez des souris syngéniques et la stase tumorale dans transgénique, souris HER2-rendues tolérantes. Ensemble, ces données soulignent l'importance d'évaluer pleinement VO utilisant des modèles animaux qui récapitulent mieux le paysage immunitaire humain pour bien comprendre quelles sont les caractéristiques déterminer le succès thérapeutique.

Le rat de coton (Sigmodon de hispidus), indigène de l'Amérique du Nord et du Sud, est le plus souvent utilisé comme un modèle de l'infection par le virus respiratoire syncytial (tel que revu à 5). rats de cotonniers sont également utilisés dans le BHV-1-anti- recherche de vaccination qu'ils récapitulent la pathologie associée à la maladie respiratoire bovine complexe 6,23. En outre, le BHV-1 chez des rats de cotonest immunogène, induisant des muqueuses et soutenue des réponses immunitaires systémiques 6,23-25. Les lignées cellulaires ont été tirés de fibrosarcome spontanée et ostéosarcomes de la glande mammaire (de LCRT) et d'os (CCRT et TRCV), respectivement 26. rats de coton ont été utilisés pour évaluer l'efficacité in vivo des vecteurs Ad oncolytiques comme ils sont sensibles à l'infection annonce et présentent une pathologie semblable aux humains 27-29. L'utilisation de modèles immunodéprimés pour l'évaluation pré-clinique de VO sont non seulement moins indicative de réponses cliniques au traitement mais ils ne parviennent pas à prendre en compte le rôle du système immunitaire dans virothérapie oncolytique 30,31. Par conséquent, le coton et les modèles syngéniques de rats rendus tolérants tumeur de carcinome mammaire et l'ostéosarcome sont des modèles pertinents pour évaluer l'efficacité préclinique de VO, comme BHV-1 et des annonces qui ne peut être étudiée en utilisant des modèles murins classiques.

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Protocol

NOTE: Les protocoles utilisés ont été approuvés par notre comité d'éthique de la recherche animale institutionnelle à l'Université McMaster en fonction de Conseil canadien sur les lignes directrices de protection des animaux. Les expériences ont été effectuées à l'installation de l'Université McMaster centrale animale.

1. Culture de cellules LCRT

  1. Culture de cellules LCRT dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Maintenir les cellules dans des flacons T-150 de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO 2. Passage des cellules quand elles forment une monocouche confluente à 90% (tous les 2-3 jours, Figure 1).
  2. Préchauffer le phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS), la trypsine et 1x milieu dans un bain d'eau à 37 ° pendant 10 minutes avant le fractionnement des cellules.
  3. Aspirer le milieu du flacon et rincer les cellules avec 5 ml de PBS 1x.
  4. Après rinçage, aspirer PBS et incuberles cellules avec 2 ml de trypsine jusqu'à ce que les cellules 1x dissocient de la fiole (~ 2 min).
  5. Resuspendre les cellules dans 8 ml de milieu (pour un total de 10 ml de suspension cellulaire) et doucement pipette de haut en bas pour briser amas de cellules.
  6. Maintenir les cellules dans un flacon T-150 en ensemençant 1 ml de suspension cellulaire dans 24 ml de milieu (pour un total de 25 ml par T-150) et le rock flacon doucement d'un côté à l'autre. Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à la prochaine fente.

2. Évaluation Virus réplication et de cytotoxicité dans des cellules LCRT

  1. Virus réplication
    REMARQUE: constructions de virus exprimant un marqueur fluorescent, telles que la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de promoteurs viraux endogènes faciliter la visualisation de l'infection virale et la propagation utilisant des lecteurs de plaques à fluorescence.
    1. Semences cellules LCRT dans des plaques de culture, laissant un puits pour le comptage. des cellules de semences de telle sorte qu'ils seront de 80 à 90% de confluence un jour plus tard. Utiliser une concentration de 10 5 cells / ml (100 ul par puits) pour produire la confluence souhaitée un jour plus tard en plaques 96 puits à fond plat.
    2. Le lendemain, préchauffer PBS 1x, 1x trypsine, et un milieu complet sans sérum dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 min avant de commencer l'expérience.
    3. Aspirer le milieu de comptage des cellules bien et rincer avec 5 ml de PBS 1x par le basculant sur la surface du puits.
    4. Après rinçage, aspirer PBS et on incube les cellules avec 2 ml de trypsine jusqu'à ce que les cellules 1x dissocient de la fiole (~ 2 min).
    5. Resuspendre les cellules dans le volume approprié de milieu complet pour donner une densité cellulaire dans la plage dénombrable en utilisant un hémocytomètre. Afin d'assurer un comptage de cellules précis, bien mélanger la suspension de cellules avant l'inoculation de la hémocytomètre en pipetant de haut en bas.
    6. Déterminer le volume de stock de virus nécessaire pour l'infection à la multiplicité désirée d'infection (MOI).
      Requis Paque Unités Formant (pfu) = nombre de cellules étalées * MOI(Pfu / cellule)
      Volume de stock de virus nécessaires = obligatoire pfu / stock de virus titre (pfu / ml)
    7. Préparer un inoculum de virus dans du milieu sans sérum dans des tubes. Mélanger soigneusement au vortex ou pipetage avant d'ajouter inoculum aux cellules.
    8. Infecter les cellules pendant 1 heure à 37 ° C, après quoi appliquer un revêtement d'entretien de DMEM + 1% de FBS.
    9. Plaques de numérisation et une après l'infection de deux jours (pi) de visualiser la fluorescence de la GFP.
  2. Virus cytotoxicité
    REMARQUE: Effectuez le test de cytotoxicité résazurine dans des conditions de lumière faible que le composé est photosensible. Un milieu puits contenant ne doit être inclus pour corriger la fluorescence de fond.
    1. Préparer une solution à 5% (v / v) de la résazurine dans 1 x PBS. Mélanger la solution par pipetage.
    2. milieu de Aspirer à partir de cellules et d'appliquer la solution de résazurine 5%. Inclure un support puits contenant seulement pour corriger la fluorescence de fond.
    3. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C, aprèsqui se lisent fluorescence en utilisant un lecteur de plaques de fluorescence (excitation 530 nm, émission 595 nm).
    4. Analyser les données par rapport à des témoins non infectés correction pour la fluorescence de fond.

3. Logement et Manipulation

  1. Logement et alimentation
    1. Maison rats de coton individuellement à diminuer en combats dans des cages de rats en polycarbonate contenant de la literie de rongeurs (1/8 "de literie épi de maïs), une section de tube PVC ne est plus de 8 pouces et nestlets que l'enrichissement (Figure 2).
    2. Utilisez un panier en acier pouvant être fixé à asseoir overtop de la cage et contenir des aliments de rongeurs et une bouteille d'eau.
      NOTE: Cette installation permettra de cage pour la capture sûre et facile des animaux, avec le placement du tube d'enrichissement contre l'extrémité de la cage être de la plus haute importance.
  2. Manipulation
    1. Poignée rats de coton dans la matinée, avant tours par des techniciens de l'animalerie pour éviter les exciter avantune procédure.
    2. Au cours de toutes les procédures, porter des gants de cuir épais de protection.
    3. Comme les animaux restent principalement dans les tubes d'enrichissement, les utiliser pour transférer les rats dans une nouvelle cage pendant le nettoyage de routine. Sinon, ouvrez la cage légèrement pour permettre le gestionnaire à atteindre leur main dans, l'animal peut alors être freinée par gommante la peau juste au-dessus des épaules et en poussant vers le bas. soins de pratique de ne pas utiliser une force excessive que l'animal peut mordre leur langue.
    4. Soyez patient et utiliser une main ferme que les animaux ont une forte réponse de vol ou de combat et vont essayer d'éviter la capture par courir et sauter hors de la cage. Surtout, ne pas manipuler les animaux par la queue comme dégantage se produira.
    5. Piéger les animaux dans leurs enrichissements tubes plus de la manipulation directe. Cela diminue considérablement les blessures et se échapper.

4. capture et anesthésie

  1. Capture
    1. Porter des gants de cuir épais pour protectionion pendant toutes les procédures.
    2. Utilisez un grand récipient en plastique transparent avec des trous pour l'air et un couvercle, une chambre d'induction de l'anesthésie assez grand pour accueillir le récipient et un cône de nez sur le tuyau de sortie de gaz (Figure 3).
    3. Travailler en paires de rendre la procédure plus efficace et de réduire le temps d'exposition des animaux à l'isoflurane, un anesthésique par inhalation. Assurez-vous un chercheur est responsable de l'ouverture et de replacer le couvercle en acier sur la cage et le couvercle de la chambre de l'induction (gestionnaire # 1) et leur associé est responsable de la capture de l'animal dans le tube et le transport à la chambre d'induction (gestionnaire # 2).
    4. Placez la cage sur une surface plane et retirer le couvercle extérieur. Soulevez le bac d'alimentation en acier légèrement et manœuvrer lentement le tube de l'enrichissement de sorte qu'il est parallèle avec les côtés de la cage et contre le dos. Si nécessaire, utilisez un objet à manœuvrer le tube d'enrichissement sans ouvrir la cage pour éviter l'agitation de l'animal (poignéer # 1).
    5. Si l'animal se agite et laisse le tube, suffisamment de temps pour l'animal pour se détendre et une fois de plus se installer dans le tube (gestionnaire n ° 1).
    6. Lentement et délibérément soulever le bord le plus éloigné du couvercle de l'acier du tube de l'enrichissement, en maintenant l'autre extrémité en contact avec la cage. Faites un espace assez grand pour le récipient en plastique (gestionnaire 2 #).
    7. Dans un mouvement souple et rapide, pousser le récipient en plastique overtop du tube d'enrichissement. Maintenir le contact du récipient avec le côté de la cage, le piégeage de l'animal dans le tube. Effectuer les étapes 4.1.6 et 4.1.7 le plus rapidement possible (gestionnaire 2 #).
    8. Retirez le bac d'alimentation de l'acier et de donner le couvercle du récipient en plastique pour handler # 2 (gestionnaire n ° 1). Faites glisser le couvercle en plastique entre le côté de la cage et le récipient, en étant conscient des appendices de l'animal pris au piège dans le processus. Ne pas sceller le conteneur car cela rendrait la prochaine étape plus difficile (gestionnaire # 2).
  2. Anesthesia
    1. Assurez-vous que le conteneur reste fermé et transporter l'animal à la chambre de l'induction. Placer rapidement l'animal dans la chambre et retirez le couvercle de conteneur dans un mouvement fluide (gestionnaire 2 #). Ouvrir et remplacer immédiatement le couvercle de la chambre d'induction (gestionnaire n ° 1).
    2. Tournez sur le flux de l'isoflurane à la chambre d'induction (5 L / min) et de surveiller l'animal pour des signes de léthargie, à quel point glissent rapidement l'animal du tube et contenant, en supprimant à la fois de la chambre d'induction pour faciliter la circulation de gaz.
    3. Lorsque le rat est complètement anesthésié, le déplacer à la surface de travail et placer le nez et la bouche dans le cône de nez (Figure 3). Le rat est complètement anesthésié quand il ne répond pas à un pincement de l'orteil énergique.
    4. Placez vétérinaire vaseline pommade ophtalmique sur les yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse et abrasions. Ce est une étape essentielle que les rats de coton ont de grands yeux qui peuvent être vulnérables à l'infection en cas de dommage.
    5. <li> surveiller attentivement et de maintenir un taux de respiration constante et se assurer que le nez de l'animal reste en montage pendant toute la procédure le cône de nez. Réglez le taux d'isoflurane de flux appropriée. Le montant de l'isoflurane nécessaire pour anesthésier chaque animal peut varier.
    6. Post-procédure, revenir à l'animal de sa cage et se assurer qu'il retrouve une mobilité totale et décubitus sternal.

5. Préparation des cellules de tumeur sous-cutanée pour LCRT Formation

REMARQUE: Un T-150 flacon de LCRT (90% de confluence) donne environ 2 x 10 7 cellules. Basez le nombre de flacons T-150 nécessaires sur le nombre total de cellules nécessaires. Ensemencer des flacons supplémentaires pour assurer que le nombre total de cellules souhaitée soit atteinte et à accueillir cellules perdues lors de la préparation et de celles qui sont nécessaires pour des injections supplémentaires. Gardez cellules sur la glace chaque fois que possible pour prolonger la viabilité cellulaire.

  1. Pour récolter les cellules, le milieu de l'aspiration d'un ballond cellules de rinçage avec 5 ml de PBS 1x.
  2. Aspirer le PBS et on incube les cellules avec 2 ml de trypsine jusqu'à ce que les cellules 1x dissocient de la fiole (~ 2 min).
  3. Resuspendre les cellules dans 8 ml de milieu (pour un total de 10 ml de suspension cellulaire) et doucement pipette de haut en bas pour briser amas de cellules. Continuer à récolter les cellules des flacons supplémentaires.
  4. Rassembler toutes les suspensions cellulaires dans un tube conique, environ 4 T-150 par 50 ml tube conique.
  5. Centrifuger le tube à 160 x g pendant 10 min à 4 ° C.
  6. Aspirer milieu et remettre en suspension le culot cellulaire dans le volume approprié de PBS (10 ml de PBS par T-150) pour donner une densité cellulaire dans la plage dénombrable en utilisant un hémocytomètre. Afin d'assurer un comptage de cellules précis, bien mélanger la suspension de cellules avant de charger le hémocytomètre en pipetant de haut en bas.
  7. Calculer le nombre total de cellules:
    Nombre total de cellules récoltées = nombre de cellules (cellules / ml) x remise en suspension volume (ml)
  8. Déterminerle volume de la suspension cellulaire requis pour toutes les injections. Faire 2-3 doses supplémentaires par expérience. Un total de 5 x 10 5 cellules injectées en sous-cutané LCRT formera des tumeurs palpables au bout de 3-4 jours.
    Nombre total de cellules nécessaires = 5 x 10 5 cellules x nombre total de doses
    suspension cellulaire de volume requis (ml) = (nombre total de cellules requis * somme des volumes d'injection) / (nombre total de cellules récoltées)
  9. Pipet le volume requis de suspension cellulaire dans un tube conique contenant PBS et mélanger soigneusement. Aliquotes injections individuelles (100 pi) dans des tubes Eppendorf. Maintenir tubes sur la glace durant la procédure d'injection.

6. Injections

REMARQUE: Effectuez les procédures avec deux chercheurs, l'un pour effectuer les injections tandis que les autres moniteurs taux de respiration de l'animal et l'état général sous anesthésie. Utiliser des seringues d'insuline (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) pour toutes les injections et une nouvelle aiguille pourchaque animal.

  1. Injections sous-cutanées
    1. Capturer et anesthésier l'animal (section 4).
    2. Rasez le site d'injection aide de tondeuses. Fourrure du rat du coton est épaisse et nécessite une coupe nette pour obtenir une surface lisse pour préparations injectables. Nettoyez le site d'injection avec 70% d'éthanol en utilisant un coton-tige et laisser se évaporer complètement avant de procéder.
    3. seringues de charge (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) avec les cellules par l'élaboration lentement et régulièrement. Si des bulles sont flick évidente la seringue avec une certaine force. Une fois que les bulles sont à la poussée supérieure le piston jusqu'à ce que le liquide est au sommet de l'aiguille.
    4. Soulevez la peau au site d'injection (dénommé tentes de la peau) et insérer l'aiguille de biseau vers le haut. Assurez-vous que l'aiguille se déplace librement sous la peau pour éviter d'injecter par voie intramusculaire.
    5. Expulser le contenu de la seringue de manière uniforme et doucement. Retirer le côté biseau de l'aiguille vers le bas.
  2. Injections intra-tumorales
    1. Capturer uneD anesthésier l'animal (section 4).
    2. Nettoyez le site d'injection avec 70% d'éthanol en utilisant un coton-tige et laisser se évaporer complètement avant de procéder.
    3. seringues de charge (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) avec l'inoculum de virus en élaborant lentement et régulièrement tout en maintenant l'aiguille dans une position verticale. Si des bulles sont flick évidente la seringue avec une certaine force. Une fois que les bulles sont à la poussée du haut, puis piston jusqu'à ce que le liquide est au sommet de l'aiguille.
    4. Insérez le côté aiguille conique vers le haut dans la tumeur et expulser le contenu de la seringue de manière uniforme et doucement tout en déplaçant l'aiguille dans une configuration en éventail, en retirant partiellement l'aiguille avant chaque mouvement pour éviter la lacération de la tumeur. Retirer le côté biseau de l'aiguille vers le bas.
      REMARQUE: les tumeurs sous-cutanées sont LCRT, atteignant environ 100 mm 3 en 5-7 jours à croissance rapide. De plus, les centres de hémorragiques et nécrotiques se forment souvent sur la surface de la tumeur à l'intérieur de plusieurs jours et ne nécessitent caREFUL surveillance (figure 4).
  3. Injections intra-péritonéales
    1. Capturer et anesthésier l'animal (section 4).
    2. Nettoyez le site d'injection avec 70% d'éthanol en utilisant des cotons-tiges et laisser se évaporer complètement avant de procéder.
    3. seringues de charge (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) avec le médicament en élaborant lentement et régulièrement. Si des bulles sont flick évidente la seringue avec une certaine force. Une fois que les bulles sont à la poussée du haut, puis piston jusqu'à ce que le liquide est au sommet de l'aiguille.
    4. Insérez l'aiguille dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen. Tirez sur le piston pour que le sang ou les selles ne sont pas aspirés, cela indique mauvais placement de l'aiguille. Si cela se produit, retirer l'aiguille et de préparer une nouvelle seringue. Lorsque l'aiguille est correctement placée, expulser le contenu de la seringue de manière uniforme et doucement.

7. tumeur excision et autopsie

  1. Recueillir et nettoyer all outils avec 70% d'éthanol avant l'euthanasie de l'animal.
  2. Euthanasier l'animal par la méthode souhaitée, inhalation de CO 2 (2 L / min pendant 5-10 min) est recommandé. Examiner l'animal pour des anomalies de l'état corporel.
  3. Placez l'animal en décubitus dorsal sur une planche de dissection et nettoyer l'animal avec 70% d'éthanol.
  4. Utilisez des pinces pour soulever la peau au bas-ventre. Couper à travers la peau et le muscle à l'aide des ciseaux et faire une incision médiane sur toute la longueur de l'animal (anus au menton).
  5. Couper la cage thoracique en faisant deux coupes, une latéralement sur le côté de la cage thoracique et une pour les sternum afin d'exposer le coeur et les poumons. Examiner les lobes du poumon pour toutes les métastases 27,29.
  6. Examinez tous les organes pour des anomalies et enregistrer les variations de couleur, la taille, et la cohérence. Si nécessaire, inciser les organes avec un scalpel pour examiner les tissus internes. Plus précisément, examiner le foie, les reins, la rate et le tractus gastro-intestinal.
  7. Inspectez les ganglions lymphatiques de métastases et de l'élargissement 27,29.
  8. Pour récupérer la tumeur, faire des incisions de flanc ci-dessus et en dessous de la tumeur de sorte que la peau peut être arraché du corps avec des pincettes. Tout en tenant fermement la peau avec des pincettes, utiliser un scalpel pour enlever soigneusement la tumeur en coupant entre la tumeur et le derme (figure 5).
  9. Placer immédiatement la tumeur dans un récipient de 10% du formol tamponné neutre.
  10. Selon la taille de la tumeur, permettre 1-2 jours (≤ 2 mm, de petites 5-6 jours) ou (> 2 mm, grand) pour la fixation de sections avant de préparer pour l'analyse histologique (figure 6).

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Representative Results

En raison de la nature extrêmement excitable de rats de coton, être familier avec et en utilisant des procédures optimisées pour réduire le stress des animaux facilitera leur utilisation comme un modèle animal pré-clinique. Utilisation de techniques de manipulation appropriées également minimiser les risques pour le chercheur.

Lors de l'utilisation des rats de coton, il est impératif de rester calme. Les rats sont très excités et vont tenter d'échapper à leur cage. Utilisation d'un tube d'enrichissement et nestlets minimiseront tentatives de fuite. La figure 2 montre la configuration optimale de la cage pour faciliter la capture de rats du coton, y compris le placement du tube d'enrichissement. En outre, travailler dans une petite pièce si possible pour aider à la récupération. Si évasion se produit, attendez pour l'animal de se calmer et de rester immobile, puis couvrir avec le récipient de capture clair ou couvrir avec des mains gantées, en faisant attention de ne pas utiliser une force excessive.

Contrairement à une souris, le rat du coton a un museau allongé wHICH nécessite le montage de livrer le gaz anesthésique un autre nez. La figure 3 représente un cône de nez conçu pour se adapter correctement un rat de coton et de maximiser la prestation de l'isoflurane. Utilisation d'une membrane de caoutchouc en tant que raccord peut entraîner un traumatisme du nez du rat.

Si possible obtenir des animaux rejets (ceux qui ne suffit par d'autres chercheurs, les rats de coton ou autres) à pratiquer des techniques d'injection avant de les essayer sur les rats. Cela permettra aux chercheurs de se familiariser avec des aiguilles et la façon de gérer en toute sécurité. Les seringues d'insuline sont suggérées pour injections chez des rats de coton comme leur peau est épaisse et dure par rapport à une souris. Cependant, une plus grande aiguille (21 G x 1 ') peut être utilisé pour l'injection de cellules tumorales pour éviter la perte de la viabilité cellulaire dus à un cisaillement lors de l'injection des cellules. Consignes de sécurité doivent être suivies, comme ne pas rechapage aiguilles et l'élimination appropriée dans un récipient pour objets tranchants.

L 'injectiontion de cellules tumorales viables est important pour la formation de tumeur approprié. La figure 1A montre une monocouche de cellules en bonne santé LCRT qui peuvent être préparées pour l'injection dans le rat du coton. Par rapport la figure 1B représente des cellules qui ont une faible LCRT viabilité et ne doivent pas être utilisées pour les injections. Il est important de vérifier la viabilité des cellules tumorales en utilisant une méthode telle que la coloration au bleu Trypan lors du comptage des cellules pour préparations injectables.

Les tumeurs formées à partir de cellules LCRT sont à croissance rapide et des centres nécrotiques forment souvent (figure 4A). En tant que tel, la formation de tumeur doit être surveillée avec soin pour éviter une ulcération (figure 4B). En cas d'ulcération se produit l'animal doit être sacrifié pour éviter l'infection et la mort possible de septicémie.

Les effets des traitements anti-tumoraux sont souvent mieux examinées par l'analyse histologique. Cela nécessite l'excision de la tumeur après mortem. Le maintien de l'intégrité des tissus de la tumeur sera result dans un échantillon qui est une représentation plus précise de la tumeur in vivo. La figure 5 montre une technique d'excision de la tumeur qui est soigneusement séparé du tissu environnant à l'aide d'un scalpel et des pinces. Retrait de la tumeur en la tirant par la force du tissu environnant en utilisant des pinces peut rompre la tumeur ou perturber l'intégrité des tissus de la tumeur, affectant analyse histologique appropriée. La structure dense et hautement vascularisé de la tumeur, comme le montre la figure 6, est maintenu par cette technique d'excision. Ceci est important dans l'analyse des traitements qui affectent le système vasculaire tumoral, comme ce est le cas avec de nombreux VO.

Figure 1
Figure 1:. Image de microscopie Bright-champ des cellules LCRT (A) phénotype de santé (~ 90%) des cellules viables LCRT prêts pour la préparation pour injection à des rats de coton. (B) phénotype indésirable des cellules LCRT pas apte à injection. Cellules arrondies sont morts ou mourants (indiqué par une flèche). Les images ont été capturées à un grossissement de 10X; barre d'échelle = 1 mm.

Figure 2
Figure 2: Exemple de configuration de la cage pour faciliter la capture de rats du coton placement optimal des tubes enrichissement contre l'extrémité de la cage et l'inclusion des aides à nestlets capture des animaux..

Figure 3
Figure 3:. Approprié pour la livraison de l'isoflurane à des rats de coton anesthésiés anesthésie cône Fabriqué cône se adapte museau allongé du coton rat pour assurer la livraison précise de gaz isoflurane sans traumatisme au nez.

Figure 4:. Le tissu nécrosé sur une tumeur de LCRT sous-cutanée (A) Les premières étapes de la nécrose du tissu tumoral. L'animal doit être surveillé attentivement pour éviter la progression vers (B) ulcération complètement ouverte. L'animal doit être sacrifié si ulcère tumorales que l'infection et une septicémie peuvent en résulter.

Figure 5
Figure 5:. Excision d'une tumeur LCRT sous-cutanée pour l'histologie, la tumeur sous-cutanée sur le flanc d'un rat du coton est soigneusement retirée de la peau à l'aide d'un scalpel pour maintenir l'intégrité du tissu tumoral, ce qui permet une meilleure représentation de l'architecture de la tumeur pour l'analyse histologique.

Figure 6 Figure 6:. Coupe de tissu histologique d'une tumeur sous-cutanée LCRT La morphologie du tissu tumoral LCRT examinée en utilisant des sections de paraffine colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H & E). L'image a été capturée à 20X; barre d'échelle = 1 mm.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

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References

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