Härrör näthinnans pigmentepitel (RPE) från inducerade pluripotenta stamceller (iPS) Celler med olika storlekar av Embryoid organ

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Syftet med denna rapport är att beskriva de protokoll att härleda näthinnans pigmentepitel (RPE) från inducerade pluripotenta stammen (iPS-celler) med olika storlekar av embryoidkroppar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Muñiz, A., Ramesh, K. R., Greene, W. A., Choi, J. H., Wang, H. C. Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (96), e52262, doi:10.3791/52262 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) är en typ av pluripotenta stamceller härstammar genom omprogrammering vuxna celler med yttre faktorer 1. I motsats, embryonala stamceller (ESCS), en annan typ av pluripotenta stamceller, genereras från den inre cellmassan av blastocysten 2-3. Trots deras olika ursprung, iPS-celler och ekonomiska och sociala råd är jämförbara i sin obegränsade förmåga att föröka sig in vitro och in deras förmåga att differentiera till någon celltyp 4-5. Dessa egenskaper hos iPS-celler gör dem idealiska kandidater för applikationer i personlig regenerativ medicin. Senaste forskningsinsatser är inriktade på att utveckla robusta differentieringsprotokoll för att producera specialiserade vuxna celler inklusive retinal pigment epitel (RPE) 6-11.

För potentiella kliniska tillämpningar av iPS härledda celler, är väsentligt en riktad differentiering för den specifika celltyp. Det finns olika metoderpublicerat för riktad differentiering av både ekonomiska och sociala råd och iPS-celler i RPE som varierar stort i deras effektivitet 6-7, 12-16. Vi vet fortfarande inte många av de molekylära händelser som styr cellen / vävnaden öde under utveckling eller differentiering. Under de senaste åren har ansträngningar gjorts för att utveckla differentiering protokoll som kan härma embryologiska utveckling så mycket som möjligt. Under blastocysten fasen obekräftat population av stamceller är tillsammans i en tredimensionell mikroomgivning. Så har olika strategier för att göra dem ESC / iPS-celler monterade ihop och odla dem i tre dimensioner. Dessa stamcells aggregat kallas embryoidkroppar (EBS). Studier har visat att EB differentiering av stamceller härma tidigt stadium av embryots utveckling och kan spontant ge upphov till primitiva endoderm på sin utsida. Senare, när EB utveckling fortskrider, differentierade cell fenotyper av alla tre bakterie härstamningar visas 17-18. Therefore, har EBS baserade differentiering protokoll fått mycket uppmärksamhet för in vitro differentiering av ESC / iPS-celler och är en bra kandidat för RPE generering från pluripotenta stamceller 13.

EB kan göras med hjälp av flera metoder från ESC / iPS-celler. Inledningsvis var EB gjordes genom att skrapa bort fastsittande kolonier och behålla dem i icke-vidhäftande suspensionskultur. Dock ger detta tillvägagångssätt heterogen population av EBS som orsakar låg reproducerbarhet. Hängande droppe cellodling och mikro baserade EB bildning är andra populära tekniker för EB formation som ger homogena EB av definierade storlekar som är mycket reproducerbara. Vidare kan mikrotekniken ge stort antal aggregat med mindre ansträngning.

Differentiering av celler inom EBS regleras av en multiplex av morfogena signaler från den extracellulära och intracellulära mikromiljö. I motsats till differentiering i ett monolayer format, EBS ger en plattform för komplex sammansättning av celler och intercellulära signalering ske 17. Intressant nog var antalet av pluripotenta stamceller som används för att göra individuella EB observeras att påverka ödet för cellerna. Till exempel, i en hematopoetisk differentiering studiet av mänskliga ESCs, observerades det att 500-celler EB främjade differentiering mot myeloid härkomst medan 1000-cell EB skjuts mot erytroid härstamning 20. I en annan studie, mindre EB gynnade endoderm differentiering medan större EB främjas mot neuro ektoderm differentiering 11, 17.

Dessa tidigare studier tyder starkt på att antalet ESC / iPS-celler används för att göra individuella EB påverkar EBS baserade differentiering eventuella celltyper. Men till vår kunskap, det finns inga aktuella studier som har klar effekten av EBS storlek i dess benägenhet att skilja mot RPE. Målet med denna studie är att karakterisera påverkan avEB storlek på inducerade pluripotenta stammen (iPS-celler) - retinal pigment epitel (iPS-RPE) differentiering och att identifiera den optimala antalet celler att göra EBS för riktad differentiering mot RPE härstamning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av reagens kultur och odlingsplattor

  1. Förbered feeder-fria stammen cellodlingsmedium genom att tillsätta 100 ml av 5x serumfritt tillägg till 400 ml av stamceller basmedium. Mediet är stabil vid 4 ° C i upp till två veckor och vid -20 ° C under 6 månader.
  2. Lägg 10 iM lösning av rho-associerad, ringlad-spole innehållande proteinkinas (Rock) hämmare (Y-27362) för att kommersiellt tillgänglig embryoid kropp (EB) bildande mediet.
  3. Förbered differentieringsmedium genom att tillsätta 0,1 mM β-merkaptoetanol, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 2 mM L-glutamin, 10% knockout serumersättning (KSR) och 10 | ig / ml gentamicin till Dulbeccos Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12).
  4. Förbered iPS-RPE-medium genom tillsats 1x N1 komplettera, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 250 | ig / ml taurin, 13 ng / ml trijodo-L-tyronin-natriumsalt, 20 ng / ml hydrokortison, 5 mikrogram / ml gentamicin, och 15% Fetalt bovint serum (FBS) <sup> 21 till Minimum Essential Medium Eagle (MEM). Justera pH till 7,4.
  5. Förbered trijod-L-tyronin-natriumsalt stamlösning. Lös 1 mg trijod-L-tyronin-natriumsalt i 1 N natriumhydroxid genom att snurra. Lägg 49 ml MEM för att göra 50 ml av 20 ^ g / ml trijodo-L-tyronin-natriumsalt. Förbered portioner och frysa vid -20 ° C tills det behövs. Använd lämplig volym för att uppnå önskad koncentration i slutodlingsmedium.
  6. Bered hydrokortison stamlösning. Solubilisera 1 mg av hydrokortison i en ml av 100% etanol genom försiktig skakning. Lägg 19 ml MEM för att göra 20 ml av 50 | ig / ml hydrokortison förrådslösning. Alikvotera och frysning vid -20 ° C tills de behövdes. Använd lämplig volym för att uppnå den önskade koncentrationen i den slutliga odlingsmedium.
  7. Bered en arbetslösning av dispas av 1 mg / ml i DMEM / F12.
  8. Framställning av matrisbelagda plattor
    1. Förbered proteinmatris utvinns ur Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouSE sarkomceller i DMEM / F12 till 0,08 mg / ml. Coat varje brunn i en 6-brunnsplatta med 1 ml av matrislösningen. Inkubera de belagda plattorna vid RT under 1 h.
    2. Efter 1 h inkubation, aspirera överskottet DMEM / F12. Lägg 0,5 ml feeder-fria stammen cellodlingsmedium för att förhindra torkning av brunnarna. Matris belagda plattor är klara för användning.
  9. Förbered mikrobrunnplattor, genom att skölja varje brunn med 2 ml av DMEM / F12. Avlägsna DMEM / F12 och tillsätt 0,5 ml EB bildande medium kompletterat med Rock-inhibitor till varje brunn. Centrifugera plattan vid 2000 xg under 5 minuter för att avlägsna eventuella luftbubblor.
  10. Bered FACS färgning buffert genom att blanda 2% FBS, och 0,09% natriumazid i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Justera buffert till pH 7,4.
  11. Förbered trypsin neutraliseringslösning genom att tillsätta 10% FBS till DMEM / F12.

2. iPS Kultur

  1. Före iPS cellsådd, varm feeder-fria stammen cellodlingsmedium till 37 ° C, och har den matrix belagda plattor redo.
  2. Snabbt tina de IMR90-1 iPS-celler i en 37 ° C vattenbad. Ta sedan bort kryo-flaskan ur vattenbadet och torka flaskan med 70% etanol. Överför cellerna till en 15 ml koniska rör med användning av en 2 ml pipett för att minimera brytning av cellklumpar.
  3. Lägg 5 ml varmt feeder-fria stammen cellodlingsmedium till cellerna droppvis och försiktigt blanda. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid RT och avlägsna supernatanten.
  4. Försiktigt resuspendera cellklumpar i 2 ml feeder-fria stammen cellodlingsmedium och ympa cellklumpar i brunnarna i matris-belagd platta. Placera plattan i en 37 ° C inkubator med 5% CO2, 95% luftfuktighet.
  5. Ändra iPS cellodlingsmediet dagligen. Observera odifferentierade kolonier fem till sju dagar efter sådd. Kontrollera om odifferentierade kolonier som är redo för passage (kolonier med en tät centrum) under ett ljusmikroskop.

3. Passaging av iPS-celler

  1. Före början till passage av iPS-celler, värma dispas lösningen, DMEM / F12 och matare fria stamcellsodlingsmedium till 37 ° C i vattenbad.
  2. Innan passage iPS-celler, ta bort alla områden av differentiering genom att skrapa området och aspirera mediet. Skölj försiktigt iPS-celler med 2 ml DMEM / F12.
  3. Tillsätt 1 ml 1 mg / ml dispas till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 7 min. Aspirera dispas och försiktigt skölja cellkolonierna med 2 ml DMEM / F12 två gånger. Efter sköljning, tillsätt 2 ml av feeder-fria stammen cellodlingsmedium till varje brunn.
  4. Med hjälp av en 5 ml pipett försiktigt skrapa kolonierna av plattan för att bilda cellklumpar. Överför de lösgjorda cellklumpar till en 15 ml koniskt rör. Tillsätt tillräcklig feeder-fria stammen cellodlingsmedium för att ympa nästa passage av celler.

4. Generering av EBS Använda Mikrobrunnsremsorna Plates

  1. Beredning av en enda cell suspension av iPS-celler
    1. Avlägsna medium från iPS-celler och skölj iPS-celler med 2 ml DMEM / F12. Lägg 750 pl Accutase till iPS-celler vid varje brunn på 6-brunnar. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 för att tillåta cellerna att lossna från plattan (ca 5-10 min).
    2. Använd en pipett för att försiktigt dissociera eventuella återstående celler och för att lösgöra eventuella återstående celler på plåtytan. Överför cellerna till en 50 ml koniskt rör. Skölj plattan med 5 ml DMEM / F12 och kombinera den sköljda DMEM / F12 med cellerna i det koniska röret. Passera cellsuspensionen genom en 40 ìm cell sil för att ta bort eventuella kvarvarande cellklumpar.
    3. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid RT för att avlägsna Accutase. Resuspendera cellpelleten i EB formation medium så att cellkoncentrationen är ca 0,5-1,0 x 10 7 celler / ml.
    4. Bestäm antalet livskraftiga celler genom att räkna cellerna med trypanblått och en hemocytometer.
  2. Adjusting celltäthet i mikrobrunnar för att bilda storleksstyrda EBS
    1. Justera antalet celler i varje brunn av mikroplattan för att generera de önskade EB storlekarna. Lägg celler till mikrobrunnarna av plattorna framställda i steg 1.9, jämnt fördela cellerna genom att försiktigt pipettera cellerna flera gånger.
      OBS: Antalet celler som krävs per brunn = önskat antal celler per EB x antal mikrobrunnar per brunn.
    2. Justera EB bildande medium kompletterat med Rock-inhibitor i brunnarna till en slutlig volym av 2,0 ml. Omfördela cellerna genom att försiktigt pipettera varje brunn. Centrifugera mikrobrunnplattorna vid 100 xg under 3 min. Placera plattorna i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 95% fuktighet under 24 h.
  3. Avverknings EBS från mikroplattor
    1. Harvest EBS från mikrobrunnar genom att pipettera mediet i brunnen upp och ned med en 1 ml mikropipett att avlägsna det mesta av EBS. Passera EB suspensionen genom en inverterad 40 pm cellsil på toppen av en 50 ml koniskt rör för att avlägsna enstaka celler.
    2. Tvätta mikroplattan fem gånger med 1 ml DMEM / F12 för att ta bort alla EBS. Samla tvättar och passera över den inverterade cell sil. Vänd cell sil högra sidan uppåt till en ny 50 ml koniska rör. Samla EBS genom tvättning med EB bildande mediet. Räkna EBS att bestämma avkastningen.

5. Plating EBS och Initiera Differentiering

  1. Plate EBS på proteinmatris belagd sex brunnsplattor (som i steg 1.8.1) vid en densitet av <1,000 EBS / brunn i EB bildande medium plus 10 iM Rock hämmare. Inkubera EBS vid 37 ° C med 5% CO2 och 95% fuktighet under 24 h.
  2. 24 timmar efter EB plätering, ersätt med differentiering medium för att initiera differentiering. Ändra hälften av differentieringsmediet varannan dag tills cellerna samlas in för vidare analys.
  3. Samla prover vid dag 6, 17, 29 och 60 för att genomföra RT-PCR, immunocytochemistry och FACS att validera uttryck av karaktäristiska RPE gener och proteiner.

6. RNA-extraktion och PCR

  1. Utdrag RNA från EB prov enligt anvisningarna i kommersiellt tillgängliga kit. Bestäm RNA-koncentration genom användning av en spektrofotometer.
  2. Utför omvänd transkription på 100 ng totalt RNA enligt kommersiellt tillgängligt RNA till cDNA omvända avskriften kit.
  3. Utför PCR med 10 ng av cDNA med användning av följande primrar (tabell 1) vid en koncentration av 10 | imol / 10 ng cDNA. Ställ in PCR enligt följande: denaturera DNA vid 95 ° C under 5 min, amplifiera med 35 cykler vid 95 ° C under 15 sek, 60 ° C under 30 sek, 72 ° C under 1 min, följt av en slutlig cykel vid 72 ° C i 10 min. Kör PCR-produkten på en 1% agarosgel.

7. Immunocytokemi

  1. Tvätta EBS med PBS två gånger vid RT. Fäst EBS vid RT under 4% paraformaldehyde under 10 min. Skölj en gång med PBS vid RT. Förvara proverna i PBS vid 4 ° C tills de användes för färgning.
  2. Den färgning dag, behandla de fasta celler med fixering och permeabilisering reagenser. Inkubera proverna med blockeringslösning (10% getserum i permeabilization lösning) under 1 h vid RT.
  3. Utför immunokemi i 10% get serum i permeabilization lösning med hjälp av följande primära antikroppar vid de indikerade späd: anti-Pax6 (1:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (1:30), och anti- ZO1 (1: 100). Inkubera proverna med motsvarande antikroppar O / N vid 4 ° C.
  4. Nästa dag, ta bort den primära antikroppen från cellerna och skölj proverna tre gånger med PBS. Inkubera proverna med fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar under 1 h vid RT.
  5. Avlägsna sekundär antikropp från cellerna och skölj proverna tre gånger i PBS. Montera täckglas på objektglas med DAPI innehåller monteringsmedium och låta prover för att fastställa O / N i en mörk kammare.Använd ett fluorescensmikroskop för att visualisera färgning.

8. Färgning för FACS-analys

  1. Tvätta de odlade EBS i PBS två gånger. Inkubera EBS med 0,5 ml av 0,25% trypsin under 5-10 minuter för att göra en enkelcellsuspension. Neutralisera trypsin med trypsin neutraliserande lösning (1 ml / brunn).
  2. Överför den enda cellsuspension till en 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 600 xg under 10 min.
  3. Kasta bort supernatanten och tillsätt 10 ml av DMEM / F12 till cellerna i röret. Vänd försiktigt för att blanda celler. Centrifugera vid 600 x g. Efter centrifugering, kassera supernatanten och suspendera cellerna i FACS färgning buffert.
  4. Räkna det totala antalet celler. Centrifugera vid 600 xg under 10 min. Efter centrifuge kassera supernatanten. Fixera cellerna omedelbart genom att tillsätta 0,5 ml av 4% paraformaldehyd. Blanda väl genom försiktig virvling. Inkubera cellerna vid 4 ° C under 20 min.
  5. Centrifugera vid 600 xg under 10 min och avlägsnasupernatanten. Vortex försiktigt för att störa cellpelleten. Permeabilisera cellerna genom tillsats av 1 ml av kyld permeabilization lösning. Vortex försiktigt för att blanda och inkubera på is under 30 min.
  6. Centrifugera vid 600 xg under 10 min och avlägsna supernatanten. Lägg 3 ml FACS färgning buffert och återsuspendera. Upprepa detta steg för en gång. Resuspendera cellerna i FACS färgning buffert vid en slutlig koncentration av 5 x 10 6 celler / ml.
  7. Överför 100 pl av cellsuspensionen (0,5 x 10 6 celler) till varje mikrofugrör och tillsätt den rekommenderade volymen av primär antikropp. För Pax6, tillsätt 5 pl av PE anti-Pax6 i 100 | il av cellsuspension. För MITF, tillsätt 5 pl av anti-MITF i 100 | il av cellsuspension.
  8. Blanda och inkubera vid RT i 60 min. Lägg 3 ml av FACS-färgningsbuffert. Blanda och centrifugera vid 600 xg under 10 min. Avlägsna supernatanten och upprepa 8.16 för ytterligare två gånger.
  9. För MITF färgning, inkubera cellerna i sekundär Antibody, get-anti-mus-Alexa Fluor 488 vid en utspädning av 1: 2000 under 1 h vid 4 ° C. För Pax6 färgning, undvika detta steg.
  10. Tvätta cellerna med 5 ml FACS-färgning buffert och centrifugera vid 600 xg under 10 min. Upprepa processen för två gånger till.
  11. Resuspendera cellerna i 500 | il FACS-färgningsbuffert och vortexa försiktigt för att störa cellpelleten. Prover är redo för flödescytometrisk analys.

9. iPS-RPE Isolering och kultur

  1. Vid dag 29, försiktigt skära runt de valda pigmente kolonier från odlingsplattan med hjälp av en 200 l pipettspets. Överför de flytande kolonierna till en 15 ml koniskt rör. Centrifugera kolonierna vid 600 xg under 10 min vid RT och avlägsna supernatanten.
  2. Resuspendera cellkolonier i 10 ml DMEM / F12 och centrifugera vid 600 xg under 10 min. Avlägsna supernatanten.
  3. Bered en enda cellsuspension genom att inkubera kolonier med 2 ml av 0,25% trypsin vid 37 ° C under 7-10 min. Virvel försiktigt cellsuspensionen att dissociera kolonierna.
  4. Neutralisera trypsin genom att tillsätta 2 ml iPS-RPE medium. Centrifugera vid 600 xg under 10 min och kasta bort supernatanten. Resuspendera enskilda celler i 2 ml iPS-RPE medium. Överför cellerna in i en proteinmatris belagd 6-brunnsplatta och placera i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% fuktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I detta experiment, iPS-celler odlades och differentierats till RPE härstamning från EBS. EB av kontrollerade storlekar bildades med användning av mikrobrunnplattor. Såsom framgår av fig 1 EB Bildningen var homogena i mikrobrunnplattorna. Dessa EB uppsamlades därefter och ströks ut på 6-brunnars plattor (fig 2).

RPE kan identifieras genom sin klassiska sexkantiga morfologi, pigmentering och uttryck av RPE markörer. Efter 12 veckors odling hade 200-cells EB utvecklat astrocyternas och fibroblast morfologi. Ingen pigmenteobserverades i dessa celler (figur 3A). Större EB utvecklat ett monoskikt av klassisk RPE morfologi och pigmente (figur 3B och C) Immuncytokemi att detektera RPE markörer, MITF och ZO1 avslöjade samexpression av dessa proteiner som hade härletts från 500-celler och 3000-celler EB (Figur 4) .

EXpressions av ögonområdet och RPE-gener övervakades genom PCR. Figur 5 visar genuttryck profil neuroektodermalt, ögonfält prekursorer, och RPE markörer i olika storlekar av EBS. Viktigt var den specifika RPE markör, RPE65 detekteras med början på dag 17.

För att kvantifiera utbytet av celler som hade differentieras till RPE härstamning ades FACS-analys utfördes för att detektera de neuroektodermala och RPE prekursor markörer, Pax6 och MITF respektive. Figur 6A visar neuroektodermala markör Pax6 i olika storlekar av EB vid olika tidpunkter. Cirka 50% av de analyserade cellerna var positiva för Pax6 på dag 6 av kultur i de 3.000-cell EBS. Dessutom, FACS-analys av RPE markör, MITF på varierande EB storlekar avslöjade att 20% av cellerna uttryckte MITF vid dag 60 av differentiering.

Odlade RPE kännetecknas också av sin förmåga att förlora sin pigment och polygonal morfologi och få enfibroblast fenotyp vid passage. Därför, för att avgöra om de iPS härrör RPE besitter dessa egenskaper, vi mekaniskt isolerat och passe cellerna. Figur 7A visar de nyligen passe cellerna har förlorat pigment och fick fibroblast morfologi. Dessutom dessa celler frodats och återtog den klassiska polygonal morfologi vid sammanflödet (figur 7B). Inom några veckor, dessa celler återfick sin pigmente (figur 7C).

TATTTTGC
Gene Nicb referens Sekvens (5'-3 ') Storlek (bp)
Pax6 NM_001258465.1 F CGGAGTGAATCAGCT
CGGTG
300
R
RPE65 NM_000329.2 F GCCCTCCTGCACAAG
TTTGACTTT
259
R AGTTGGTCTCTGTGC
AAGCGTAGT
RX NM_013435.2 F GAATCTCGAAATCTC
AGCCC
279
R CTTCACTAARRRGCT
CAGGAC
MITF NM_198178.2 F TTCACGAGCGTCCTG
TATGCAGAT
106
R TTGCAAAGCAGGATC
CATCAAGCC
GAPDH NM_001256799.1 F ACCACAGTCCATGCC
ATCAC
452
R TriklorisocyanursyraCCACCCTGTTG
CTGTA

Tabell 1. PCR-primersekvenser för Pax6, RPE65, RX, MITF och GAPDH-gener.

Figur 1
Figur 1. Bildande av EBS med mikroplattor. Innehåller Varje mikro (A) 100 celler, (B) 200 celler, (C) 500 celler, och (D) 3000 celler. Celler inkuberades 24 h vid 37 ° C och 5% CO2 under bildning av EBS. (Förstoring 100X, skal bar = 400 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. EB skördade från mikrobrunnplattor. (A) 200-cell EB, (B) 500-cell EB, (C) 3000-cell EB, och (D) 15000-cell EB. (Förstoring 200X, skal bar = 200 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. iPS-härledda RPE från olika storlekar av EBS. EB odlades under 12 veckor. (A) 200-cell EB hade bara utvecklat astrocyternas och fibroblast morfologi utan pigmente; medan 80% - 90% av cellerna i de 500-cell EB (B och C) utvecklat ett monoskikt av polygonala pigmenterade celler. (A & B: Förstoring 100X, skal bar= 400 pm; (C):. Förstoring 200X, skal bar = 200 nm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Samexpression av MITF och ZO1. 500- och 3000-cell EB uttryckt MITF och ZO1 efter 17 dagar av differentiering. (Förstoring 400X, skal bar = 20 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Genuttryck profilen för olika storlekar av EB vid olika punkter av differentiering tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. FACS analys av varierad EB storlek för RPE differentiering. (A) FACS uppgifter av neuroektodermal markör Pax6 i olika storlekar av EB under differentiering. (B) FACS-analys av RPE markör MITF på varierande EB storlekar vid dag 60 av differentiering. Den högsta nivån av MITF nått 20% och var konstant mellan EB storlek 500, 3000, och 15.000 celler.

Figur 7
Figur 7. Fortsatt kultur av manuellt isolerade RPE. (A) RPE subodlades och förvärvade fibroblast morphology efter passage. (B & C) Celler utvecklat polygonal morfologi och pigmente över tiden. (Förstoring 100X, skal bar = 400 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att förverkliga utsikterna av pluripotenta stamceller för cellterapi, är det nödvändigt att reglera deras differentiering på ett konsekvent och reproducerbart sätt. Denna rapport beskriver protokoll för att bilda storleksstyrda EB använder mikrobrunnsplatta teknik startar differentiering mot RPE och identifiera protein och genmarkörer av RPE. För att synkronisera differentiering in vitro, var homogena storlekar av EB bildas av kända antal iPS-celler centrifuge i mikroplattor med tvångs aggregering. Immuncytokemi och reverse-transkription polymerase chain reaction (RT-PCR) används för att övervaka uttrycken RPE proteiner och gener av förklaras. Slutligen tillsattes effektiviteten av differentiering i olika storlekar av EBS analyserades genom FACS-analys. Dessa tekniker kan underlätta differentiering av iPS-celler i RPE för framtida tillämpningar.

Det finns flera viktiga punkter i denna metod som måste noggrant utförda till eNsure framgången av detta protokoll och uppnå korrekta uppgifter. Den första viktigt steg sker under iPS cellodling. iPS-celler måste hållas i ett pluripotent tillstånd att behålla sin stemness. Cellerna måste ha mediet byttes dagligen för att upprätthålla lämpliga nivåer av bFGF och noggrant inspekteras dagligen för tecken på differentiering. Odifferentierade iPS-celler växa som kompakta flercelliga kolonier. Cellerna bör ha en hög kärnkrafts till cytoplasman förhållande och framträdande nukleolerna. IPS kolonier kännetecknas av en distinkt gräns, med flera lager av celler i mitten. Tecken på differentiering är förlust av definierade koloni gränser, olikformig cellmorfologin, och uppkomsten av uppenbara celltyper, såsom nervceller och fibroblaster. Enstaka celler som har differentierade kan avlägsnas genom dispas och sköljning dock kolonier med dessa egenskaper måste avlägsnas manuellt från kulturen 22. Beredning av en enda iPS cellsuspension for bilda EBS är nästa avgörande steg. Det är viktigt att framställa en suspension utan cellaggregat för att exakt leverera det önskade antalet celler till mikrobrunnsplatta och förbereda önskad storlek EB. RNA förberedelser för PCR-analys är också viktiga. Inkonsekvent RNA kvalitet är en viktig källa till variabilitet i PCR-data. RNA-extraktion ska ge minimalt degraderas RNA för bästa resultat. Framgångsrik RNA-extraktion kommer att ge total RNA med minimal nedbrytning och fri från kontaminerande RNaser. Efter bestämning av RNA-koncentration genom spektrofotometri vid 260 nm, bör renheten hos provet bestämmas vid 230 och 280 nm för att detektera kontaminering med polysackarider eller protein. Den 230: 260: 280-förhållande för RNA bör vara 1: 2: 1 för att indikera hög kvalitet RNA med ingen förorening 23. Slutligen är det viktigt att på ett adekvat fixera cellerna för FACS-färgning. Under denna fixeringssteget, måste cellerna separeras för att förhindra klumpning. Insufficient cell resuspension före permeabilisering kommer att leda till cell klumpar och felaktig färgning.

Vi rekommenderar att protokollet följas som beskrivs dock några modifieringar kan göras vid behov. Under alstringen av EBS beskrivits i Steg 4, kan antalet celler per EB variera mellan 500 till 3000 för att uppnå ett högt utbyte av celler differentieras till RPE. Om antalet iPS-celler är begränsad, kommer 500-cell EB producera RPE jämförbar med de 3.000-cell EBS. Extra försiktighet måste iakttas under RNA-extraktion process som beskrivs i Steg 6. Prov bör köras i tre exemplar för att säkerställa att hög kvalitet RNA kan förvärvas. Under immunocytokemi som beskrivs i steg 7, kan koncentrationerna primär och sekundär antikropp justeras efter behov för att förbättra signalstyrkan och minska bakgrunden. De lämpliga positiva och negativa kontroller bör ingå i analysen. Under Steg 8, FACS-analys, om de förväntade resultaten inte ACQuired efter färgning, kan ett litet urval av de färgade cellerna placeras på ett objektglas och ses med ett mikroskop för att visualisera färgning. De lämpliga positiva och negativa kontroller bör ingå i analysen. Om cellerna inte färgas som förväntat, kan de antikroppskoncentrationer ökas eller minskas efter behov.

Den teknik som beskrivs i denna rapport kommer att resultera i en högre avkastning på RPE än spontan differentiering, utan användning av tillsatta kemikalier. Emellertid är den huvudsakliga begränsningen med detta tillvägagångssätt att det också kommer att finnas ett stort antal icke-RPE-celler genererades. Därför måste RPE väljas omsorgsfullt ut och berikas som beskrivs i steg 9 för att säkerställa en homogen population.

Betydelsen av detta synsätt är att ett högre utbyte av RPE kan härledas från iPS-celler än spontana differentieringstekniker. Användningen av små molekyler för att härleda RPE från iPS har också rapporterats för att ge ett högt utbyte avdifferentierade celler, är dock att tekniken mycket mer komplex och kräver timing och koncentrationer av de små molekyler som ska optimeras för att uppnå de önskade resultaten 7,10. Dessutom, de små molekyler som används i dessa metoder har pleiotropa effekter som kan omintetgöra resultaten.

Den beskrivna metoden kan användas för att göra EB av önskade storlekar med hög reproducerbarhet. Denna teknik genererat EB enhetliga storlekar som användes för att optimera differentiering av iPS-celler mot RPE härstamning utan användning av ytterligare kemikalier. IPS-RPE celler från EBS kan sedan användas vidare i transplantations studier för att bekräfta deras integration i näthinnan i en funktionell organisation. Dessa celler kan också ge en god forskningsmodell för att studera patogenesen av olika RPE sjukdomar in vitro. Nyttan av denna metod kan tillämpas på den riktade differentiering till många andra celltyper, beroende påstorleken på EBS och ursprunget för cellen i blastocysten in vivo. Celler av ektoderm kommer att ge upphov till nervceller, överhud, hår och bröstkörtelceller; endoderm kommer att ge upphov till magen, tjocktarmen, lungor och tarmceller; mesoderm kommer att ge upphov till skelettmuskel, hjärta, njure, och bindvävsceller 3,11,19. När korrekt EB storlek har bestämts, de differentierade cellerna behöver bara analyseras genom immuncytokemi eller FACS för rätt uttryck av markörproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5x supplement Stem Cell Technologies 5850
Y-27632 (Rock Inhibitor) Stem Cell Technologies 72304
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-Mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
L-Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine sodium  salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Aggrewell 400 plate Stem Cell Technologies 27940
AggreWell medium Stem Cell Technologies 5893
Accutase Stem Cell Technologies 7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714
Mouse Anti-PAX6 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX antibody Abcam Ab23340
Mouse  Anti-MITF antibody Thermo Scientific MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 40-2200
RNeasy plus mini kit Qiagen 74134
PCR master mix Promega M7502
High capacity RNA to cDNA kit Life Technologies 4387406

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2, (12), 3081-3089 (2007).
  2. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (4), 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  6. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, (10), 2427-2434 (2009).
  7. Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1, (2), 96-109 (2012).
  8. Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, (22), 3385-3396 (2013).
  9. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, (2), 327-332 (2011).
  10. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
  11. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26, (9), 2300-2310 (2008).
  12. Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
  13. Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (12), e8152 (2009).
  15. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (1), 198-209 (2014).
  16. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (39), 16698-16703 (2009).
  17. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25, (1), 43-51 (2009).
  18. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, (5), 389-398 (2007).
  19. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, (2), 88-95 (2000).
  20. Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, (5), 1601-1603 (2005).
  21. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (8), 3612-3624 (2006).
  22. Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
  23. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics