TIRFM и рН-чувствительные GFP-зонды для оценки нейромедиатора пузырька динамики в SH-SY5Y клеток нейробластомы: Сотовый изображений и анализ данных

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52267, doi:10.3791/52267 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Synaptic пузырьки выпустить нейротрансмиттеров на химических синапсов с помощью динамического цикла синтеза и поиска. Мониторинг синаптической активности в режиме реального времени и рассечения различные этапы экзо-эндоцитоза на уровне одного пузырька имеют решающее значение для понимания синаптические функции в норме и патологии.

Генетически кодируется рН-чувствительных датчиков, непосредственно направленные на синаптических пузырьков и полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM) обеспечивают пространственно-временным разрешением необходимую для отслеживания динамики пузырьков. Мимолетны поле, создаваемое полного внутреннего отражения может только возбудить флуорофоров, размещенные в тонком слое (<150 нм) выше стеклянной крышкой, на которой клетки придерживаться именно там, где имеют место процессы экзо-эндоцитоза. В результате высокая контрастность изображения идеально подходит для пузырьков отслеживания и количественного анализа событий слияния.

В этом протоколе, SH-SY5Y человек пeuroblastoma клетки предлагаются в качестве полезной моделью для изучения высвобождение нейромедиаторов на уровне одного пузырька по TIRFM, из-за их плоской поверхности и в присутствии дисперсных пузырьков. Способы выращивания SH-SY5Y как адгезивные клетки, а также для трансфекции их synapto-pHluorin предоставляются, а также методики для выполнения TIRFM и визуализации. Наконец, стратегия стремится выбрать, рассчитывать и анализировать события в стиле фьюжн в уровнях цельноклеточных и одного пузырька представлены.

Для проверки метода анализа процедуры визуализации и передачи данных, динамика pHluorin-меченых везикул анализироваться в рамках отдыха и стимулировали (деполяризующими концентрации калия) условия. Деполяризацию мембраны увеличивает частоту событий слитых и вызывает параллельное повышение чистого сигнала флуоресценции, записанной в целой клетки. Анализ Single-пузырек показывает изменения поведения Fusion-событий (увеличение максимальной высоты и ширины). Эти данные свидетельствуют о йв деполяризации калия не только вызывает массовое освобождение нейромедиатора, но также изменяет механизм слияния пузырьков и утилизации отходов.

При соответствующей флуоресцентного зонда, эта техника может быть использована в различных клеточных системах рассекать механизмы конститутивной и стимулированную секрецию.

Introduction

Химический синаптической передачи между нейронами является основным механизмом связи в нервной системе. Он опирается на высвобождение нейротрансмиттеров через динамический цикл слияния пузырьков и поиска в пресинаптической сайте. Многие из белков, участвующих в динамике везикулы были определены; Однако, их удельный вклад в феномен еще предстоит уточнить 1.

Наше понимание отчасти ограничена тем, что наиболее широко используемые тесты на экзо / эндоцитоза не всегда являются наиболее подходящим. Несколько исследований, связанных с слияния пузырьков и динамика полагаться на электрофизиологических методов. Эта техника обеспечивает оптимальную временное разрешение и отлично подходит для исследования начальной слияние везикул к плазматической мембране, но не в состоянии обнаружить многие из основных молекулярных событий, которые поддерживают пресинаптической функции. Электронная микроскопия, с другой стороны, обеспечивает лучшие morphologicaл описание каждой особой стадии, но в динамическом аспекте случае не может быть захвачен, потому что образцы должны быть установлены для того, чтобы анализировать.

Появление новых методов оптической записи 2,3, в сочетании с прогрессом в разработке флуоресцентного молекулярных зондов 4-6, обеспечивает визуализацию exocytic процессов в живых клетках, тем самым обеспечивая новый уровень информации о синаптической структуры и функции.

Первоначальные исследования эксплуатируемые деятельности зависит от стириловые красители (FM1-43 и связанные с ними органические красители) 7,8. Государство-оф-арт-методы визуализации использовать рН-чувствительных варианты зеленого флуоресцентного белка (GFP) (pHluorin) привязаны к просвете пузырьки белков 9. Эти датчики, как правило, выключается, когда присутствует в пузырьки из-за низкой просвета рН. После слияния с плазматической мембраной, внутренняя пузырьков подвергается нейтральной внеклеточном пространстве, рН резко возрастает, снимает протонов в зависимости от тушения pHluorin и быстро появляется флуоресцентный сигнал. Как изменения в pHluorin быстрее, чем событие слияния, путем мониторинга флуоресценции возрастает, слияния пузырьков с мембраной могут быть измерены и проанализированы. Поскольку поверхность pHluorin с метками молекулы эндоцитарных, сигнал флуоресценции затем возвращается к исходному уровню, поэтому в тот же конструкция может быть использована также для мониторинга пузырек рециркуляции 9.

В то время как пузырек с метками pH-сенсор обеспечивает визуализацию только тех пузырьки, которые действительно сливаются с плазматической мембраной, изображения с высоким пространственным и временным разрешением требуется описать в деталях этапы экзо / эндоцитических процессов. Оптический метод, который обеспечивает необходимую пространственно-временное разрешение полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM), применение флуоресцентной микроскопии 10.

"> Полное внутреннее отражение происходит на границе раздела между стеклом покровным стеклом и образцом. При светлый путь достигает стеклянной крышкой скольжения с углом падения большим, чем критический угол, свет возбуждения не передается в образце, но полностью отражается обратно. В этих условиях, затухающих световой волны формы на границе и распространяется в среде с меньшим оптической плотности (образца). Как интенсивность исчезающего поля убывает экспоненциально с расстоянием от границы (с глубиной проникновения 100 нм) только флуорофоров в непосредственной близости к покровным стеклом могут быть возбуждены в то время как еще дальше от границы нет. В клетках, трансфицированных GFP-конструкций, эта глубина соответствует белков, экспрессированных на плазматической мембране или в везикулярных структур приближается к нему. Как флуорофоры в внутрь клетки не могут быть возбуждены, фон флуоресценции сведено к минимуму, и изображение с очень высоким отношением сигнал / фон крысыIO формируется 11.

Несколько характеристики делают TIRFM методом выбора для контроля везикулы динамику. Идеальный контраст и высокое отношение сигнал-шум-отношение позволяют обнаруживать очень низких сигналов, возникающих из единичных пузырьков. Чип на основе захвата изображения в каждом кадре обеспечивает временное разрешение, необходимое для обнаружения очень динамичные процессы. Наконец, минимальное воздействие клеток к свету в любой другой плоскости образца, резко снижает фототоксичность и позволяет длительное время покадровой записи 12.

Анализ данных остается наиболее сложной и важным аспектом этой техники. Самый простой способ для контроля слияния пузырьков состоит в измерении накопления репортера флуоресцирующих белков на поверхности клетки, с течением времени 13. Как синтеза увеличивается, чистое увеличение сигнала флуоресценции, а также. Тем не менее, этот метод может недооценивать процесс, особенно в больших клетках, и в состоянии покоя условий,потому что эндоцитоза и Фотообесцвечивания процессы компенсировать увеличение интенсивности флуоресценции от пузырьков экзоцитоза. Альтернативным методом является следовать каждый отдельный случай слияния 14. Этот последний метод является очень чувствительным и может раскрыть важные данные о механизмах синтеза. Тем не менее, он требует ручной выбор отдельных событий, потому что полностью автоматизированные процедуры, чтобы следовать пузырьки и зарегистрировать колебания их флуоресцентных сигналов не всегда доступны. Наблюдение динамики пузырька требуется клетки Отбор проб на высокой частоте. Это приводит к большой объем данных, которые практически не могут быть проанализированы вручную.

Предложение данной работы является оптимизация технику отображения TIRFM для мониторинга базальной и стимулированной высвобождения нейромедиаторов в нейробластомы клеточной линии SH-5YSY, и описать, шаг за шагом, процедура разработана в лаборатории для анализа данных, как на уровне целых клеток и одного пузырька.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Axio Observer Z1 Zeiss 491912-9850-000 inverted microscope
Multiline Argon Laser Lasos 77 Lasos 00000-1312-752 multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser
Laser TIRF slider Zeiss 423681-9901-000
100X Objective Zeiss 421190-9900-000 Oil, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 QImaging
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter Sutter Instrument Company
Software
Image ProPlus 6.3 Software Media Cybernetics spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination
Excel Microsoft photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses
GraphPad Prism 4.00 GraphPad Software, Inc. statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, (3), 351-357 (1997).
  3. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2, (11), 989-996 (1999).
  4. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  5. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17, (10), 969-9673 (1999).
  6. Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255, (1342), 61-66 (1994).
  7. Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32, (5), 815-828 (2001).
  8. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1, (6), 2916-2921 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  10. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
  12. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  13. Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28, (1), 325-335 (2008).
  14. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
  15. Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
  16. Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284, (18), 12491-12503 (2009).
  17. Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19, (4), 433-443 (1038).
  18. D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11, (11), 1455-1470 (2010).
  19. Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227, (4), 1740-1751 (2012).
  20. Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
  21. Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75, (3), 991-1003 (2000).
  22. Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443, (3), 199-203 (2008).
  23. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
  24. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591, (7), 1691-1706 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics