TIRFM और पीएच के प्रति संवेदनशील GFP-जांच एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं में neurotransmitter पुटिका गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए: सेल इमेजिंग और डेटा विश्लेषण

Neuroscience

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Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52267, doi:10.3791/52267 (2015).

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Abstract

Synaptic vesicles फ्यूजन और पुनः प्राप्ति के एक गतिशील चक्र के माध्यम से रासायनिक synapses पर न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज। वास्तविक समय में synaptic गतिविधि की निगरानी और एकल पुटिका स्तर पर EXO-endocytosis के विभिन्न चरणों विदारक स्वास्थ्य और रोग में synaptic कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

सीधे अन्तर्ग्रथनी vesicles और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) के लिए लक्षित पीएच के प्रति संवेदनशील जांच पुटिका गतिशीलता का पालन करने के लिए आवश्यक spatio- लौकिक संकल्प प्रदान आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग। कुल आंतरिक प्रतिबिंब द्वारा उत्पन्न क्षणभंगुर क्षेत्र केवल EXO-endocytosis की प्रक्रियाओं जगह ले वास्तव में, जहां, कोशिकाओं का पालन करना है जिस पर गिलास को कवर के ऊपर एक पतली परत (<150 एनएम) में रखा fluorophores उत्तेजित कर सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप उच्च विपरीत छवियों आदर्श रूप से नज़र रखने vesicles और फ्यूजन की घटनाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं।

इस प्रोटोकॉल में, एसएच SY5Y मानव एनeuroblastoma कोशिकाओं क्योंकि उनके फ्लैट सतह की, TIRFM द्वारा एकल पुटिका स्तर पर neurotransmitter रिहाई के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल और छितरी हुई vesicles की उपस्थिति के रूप में प्रस्तावित कर रहे हैं। पक्षपाती कोशिकाओं के रूप में एसएच SY5Y उगाने के लिए और synapto-pHluorin के साथ उन्हें transfecting के लिए तरीकों TIRFM और इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए तकनीक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रदान की जाती हैं। अंत में, का चयन करें, गिनती, और पूरे सेल और एकल पुटिका स्तरों पर संलयन की घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए लक्ष्य के लिए एक रणनीति प्रस्तुत किया है।

इमेजिंग प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए, pHluorin टैग पुटिकाओं की गतिशीलता विश्राम के तहत विश्लेषण कर रहे हैं और शर्तों (पोटेशियम सांद्रता depolarizing) को प्रेरित किया। झिल्ली विध्रुवण संलयन घटनाओं की आवृत्ति बढ़ जाती है और पूरे सेल में दर्ज की गई शुद्ध प्रतिदीप्ति संकेत के एक समानांतर उठाना कारण बनता है। एकल पुटिका विश्लेषण संलयन घटना व्यवहार (बढ़ा शिखर ऊंचाई और चौड़ाई) के संशोधनों का पता चलता है। इन आंकड़ों वें का सुझावपोटेशियम विध्रुवण पर एक विशाल neurotransmitter रिहाई लाती है लेकिन यह भी पुटिका संलयन और रीसाइक्लिंग के तंत्र को संशोधित करता ही नहीं है।

उपयुक्त फ्लोरोसेंट जांच के साथ, इस तकनीक का विधान और उत्तेजित स्राव के तंत्र काटना अलग सेलुलर प्रणाली में नियोजित किया जा सकता है।

Introduction

न्यूरॉन्स के बीच रासायनिक synaptic प्रसारण तंत्रिका तंत्र में संचार का एक प्रमुख तंत्र है। यह प्रीसानेप्टिक स्थल पर पुटिका संलयन और पुनः प्राप्ति के एक गतिशील चक्र के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई पर निर्भर करता है। पुटिका गतिशीलता में शामिल प्रोटीन में से कई की पहचान की गई है; हालांकि, घटना के लिए उनके विशिष्ट योगदान एक स्पष्ट किया जाना बना रहता है।

हमारी समझ आंशिक रूप से EXO / endocytosis के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया assays के हमेशा के लिए सबसे उपयुक्त नहीं हैं कि इस तथ्य से सीमित है। कई पुटिका संलयन से संबंधित अध्ययन और गतिशीलता electrophysiological तकनीक पर भरोसा करते हैं। इस तकनीक को एक इष्टतम अस्थायी समाधान प्रदान करता है और प्लाज्मा झिल्ली vesicles के प्रारंभिक संलयन की जांच के लिए उत्कृष्ट है, लेकिन प्रीसानेप्टिक समारोह का समर्थन करने वाले अंतर्निहित आणविक घटनाओं से कई का पता लगाने में असमर्थ है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, दूसरी तरफ, बेहतरीन morphologica प्रदान करता हैनमूनों का विश्लेषण किया जा क्रम में तय किया जाना चाहिए क्योंकि प्रत्येक विलक्षण कदम है, लेकिन घटना के गतिशील पहलू के एल विवरण, कब्जा नहीं किया जा सकता है।

फ्लोरोसेंट आणविक जांच विकास 4-6 के क्षेत्र में प्रगति के साथ संयोजन में नई ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग तकनीकों 2,3, के आगमन, इस प्रकार के synaptic संरचना और समारोह के बारे में जानकारी के लिए नए स्तर प्रदान करने, जीवित कोशिकाओं में exocytic प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है।

प्रारंभिक अध्ययन शोषण गतिविधि पर निर्भर styryl रंजक (FM1-43 और संबंधित कार्बनिक रंजक) 7,8। राज्य के अत्याधुनिक इमेजिंग तकनीक luminal पुटिकाओं प्रोटीन से 9 तक सीमित ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) (pHluorin) के पीएच के प्रति संवेदनशील वेरिएंट को रोजगार। ये जांच सामान्य रूप से, क्योंकि कम luminal पीएच की पुटिकाओं में जब वर्तमान बंद कर रहे हैं। प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूजन के बाद, पुटिका इंटीरियर तटस्थ बाह्य अंतरिक्ष, पीएच के संपर्क में है अचानक बढ़ जाती है, pHluorin का प्रोटॉन-निर्भर शमन से राहत मिलती है और फ्लोरोसेंट संकेत तेजी से प्रकट होता है। PHluorin में परिवर्तन प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है की निगरानी के द्वारा, फ्यूजन घटना की तुलना में तेजी है, झिल्ली के साथ पुटिका संलयन मापा और विश्लेषण किया जा सकता है। सतह pHluorin टैग अणुओं endocytosed कर रहे हैं, प्रतिदीप्ति संकेत बाद में इसलिए एक ही निर्माण पुटिका 9 रीसाइक्लिंग की निगरानी के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, बेसल स्तर के लिए आए।

पुटिका टैग पीएच-सेंसर ही वास्तव में प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज कि उन पुटिकाओं के दृश्य सुनिश्चित करता है, वहीं उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प इमेजिंग विवरण में EXO / endocytic प्रक्रियाओं में शामिल कदम का वर्णन करने के लिए आवश्यक है। आवश्यक spatio- लौकिक संकल्प प्रदान करता है कि ऑप्टिकल तकनीक कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM), प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 10 के एक आवेदन पत्र है।

"> कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रकाश पथ महत्वपूर्ण कोण से भी बड़ा एक घटना कोण के साथ गिलास को कवर पर्ची तक पहुँच जाता है गिलास को कवर पर्ची और नमूना। के बीच इंटरफेस में होता है, उत्तेजना प्रकाश नमूना में फैलता है, लेकिन नहीं है पूरी तरह से वापस परिलक्षित होता है। इन स्थितियों, इंटरफेस में एक क्षणभंगुर प्रकाश लहर रूपों के तहत और क्षणभंगुर क्षेत्र की तीव्रता का एक प्रवेश गहराई के साथ (इंटरफ़ेस से दूरी के साथ तेजी से नाश होता जाता है। कम ऑप्टिकल घनत्व (नमूना) के साथ मध्यम में प्रसारित आगे दूर सीमा से उन GFP-निर्माणों साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में। नहीं कर रहे हैं, जबकि लगभग 100 एनएम) कवर पर्ची करने के लिए करीब निकटता में केवल fluorophores के लिए उत्साहित किया जा सकता है, इस गहराई प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त प्रोटीन करने के लिए या vesicular संरचनाओं में मेल खाती है सेल इंटीरियर में fluorophores उत्साहित नहीं किया जा सकता है, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम से कम, और एक छवि एक बहुत ही उच्च संकेत / पृष्ठभूमि चूहे के साथ किया जाता है। यह आआईओ 11 बनाई है।

कई विशेषताओं पुटिकाओं गतिशीलता की निगरानी के लिए पसंद की TIRFM तकनीक बनाते हैं। आदर्श विपरीत और उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात एकल पुटिकाओं से पाने के लिए बहुत कम संकेतों का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। प्रत्येक फ्रेम में चिप आधारित छवि अधिग्रहण अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं का पता लगाने के लिए आवश्यक अस्थायी समाधान प्रदान करता है। अंत में, नमूने में किसी भी अन्य विमान में रोशनी करने के लिए कोशिकाओं की न्यूनतम जोखिम जोरदार phototoxicity कम कर देता है और लंबे समय तक चलने समय चूक रिकॉर्डिंग 12 में सक्षम बनाता है।

डेटा विश्लेषण इस तकनीक का सबसे चुनौतीपूर्ण और महत्वपूर्ण पहलू बनी हुई है। पुटिका संलयन की निगरानी के लिए सबसे आसान तरीका यह समय 13 से अधिक, कोशिका की सतह पर संवाददाता फ्लोरोसेंट प्रोटीन का संचय को मापने के लिए है। के रूप में अच्छी तरह से संलयन बढ़ जाती है, शुद्ध प्रतिदीप्ति संकेत बढ़ जाती है। हालांकि, इस पद्धति विशेष रूप से बड़े कोशिकाओं में और विश्राम की स्थिति में, इस प्रक्रिया को नजरअंदाज कर सकते हैं,endocytosis और photobleaching प्रक्रियाओं के कारण पुटिका एक्सोसाइटोसिस के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि ऑफसेट है। एक वैकल्पिक तरीका प्रत्येक एकल संलयन घटना 14 का पालन करने के लिए है। यह बाद विधि बहुत संवेदनशील है और फ्यूजन तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रकट कर सकते हैं। पूरी तरह से स्वचालित प्रक्रियाओं पुटिकाओं पालन करने के लिए और उनके फ्लोरोसेंट संकेतों के उतार-चढ़ाव रजिस्टर करने के लिए हमेशा उपलब्ध नहीं हैं क्योंकि हालांकि, यह एकल घटनाओं का मार्गदर्शन चयन की आवश्यकता है। पुटिका गतिशीलता का अवलोकन उच्च आवृत्ति पर नमूना कोशिकाओं की आवश्यकता है। यह शायद ही मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया जा सकता है कि डेटा की एक बड़ी राशि उत्पन्न करता है।

इस पेपर का प्रस्ताव दोनों, प्रयोगशाला में विकसित की एक प्रक्रिया के डेटा का विश्लेषण करने के लिए एसएच 5YSY neuroblastoma सेल लाइन में बेसल और उत्तेजित neurotransmitter रिहाई की निगरानी के लिए TIRFM इमेजिंग तकनीक का अनुकूलन करने के लिए, और वर्णन करने के लिए, कदम-दर-कदम है पूरे सेल और एकल पुटिका स्तरों पर।

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Protocol

1. सेल संस्कृति और अभिकर्मक

  1. एसएच SY5Y सेल संस्कृति
    नोट: प्रयोगों मानव neuroblastoma SH- SY5Y (ATCC # सीआरएल-2266) 15 का उपयोग किया गया है। एसएच SY5Y कोशिकाओं अस्थायी समूहों और पक्षपाती कोशिकाओं का एक मिश्रण के रूप में विकसित। मजबूती से TIRFM के लिए महत्वपूर्ण है जो गिलास को कवर करने के लिए संलग्न है कि विकसित कोशिकाओं को प्रोटोकॉल (सेल घनत्व, बंटवारे के अनुपात, आदि।) की रिपोर्ट में दिए गए निर्देशों का पालन करें।
    1. शुरू करने से पहले, लामिना का प्रवाह जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत, बाँझ फॉस्फेट बफर नमकीन घोल (पीबीएस) और संस्कृति के माध्यम से उपयुक्त मात्रा बनाते हैं।
      1. 150 मिमी NaCl, 24 मिमी फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4 की सांद्रता के साथ पीबीएस के 50 मिलीलीटर बनाओ। समाधान फ़िल्टर।
      2. उच्च ग्लूकोज, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), एल glutamine के साथ (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) से सेल के माध्यम से 50 मिलीलीटर बनाओ 2 मिमी), औरसोडियम पाइरूवेट (1 मिमी)। समाधान फ़िल्टर।
    2. पूरा मध्यम विकास निकालें और पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए (6 सेमी पेट्री डिश के लिए) 0.05% trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड के 2 मिलीलीटर (EDTA) के साथ कोशिकाओं को सेते 5% सीओ 2 और पिपेट का उपयोग कोशिकाओं को अलग।
    4. DMEM के 2 मिलीलीटर जोड़कर trypsin निष्क्रिय, और 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा।
    5. एक एकल कक्ष निलंबन में कोशिकाओं को फैलाने के लिए नीचे पर्याप्त, सतह पर तैरनेवाला निकालें गोली DMEM के 1 मिलीलीटर जोड़ने और समाधान पिपेट और।
    6. पूरा मध्यम के 3 मिलीग्राम से युक्त एक नया 6 सेमी व्यास पेट्री डिश में 4: उन्हें एक विभाजित। एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 6 सेमी व्यास पेट्री डिश में संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखने। एक सप्ताह में एक बार उप-संस्कृति या वे 80 को कवर किया है - जब सतह क्षेत्र के 90%।
  2. इमेजिंग के लिए एसएच SY5Y सेल चढ़ाना
    1. TIRFM प्रयोगों के लिए, थालीकांच कवर पर कोशिकाओं। रोजगार कांच 0.17 ± 0.005 मिमी मोटाई और एक 1.5255 ± 0.00015 अपवर्तक सूचकांक के साथ शामिल किया गया है। शुरू करने से पहले, पालन के रूप में कांच coverslips तैयार:
      1. साफ कांच 90% इथेनॉल, ओ / एन के साथ शामिल किया गया है।
      2. आसुत जल (आसुत जल के तीन परिवर्तन) में उन्हें अच्छी तरह कुल्ला। सूखी गिलास एक सुखाने ओवन में शामिल किया गया है।
      3. जगह कांच पेट्री डिश में शामिल किया गया और तीन घंटे के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में बाँझ।
    2. दिन अभिकर्मक से पहले, एक 3.5 सेमी पेट्री डिश में प्रत्येक coverslip जगह संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. 1.1.5, पूरा माध्यम से 1 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित और गिनती - चरणों 1.1.3 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं Trypsinize। अच्छी तरह से / 3 x 10 5 कोशिकाओं उपज के लिए प्रत्येक पेट्री डिश में जोड़ने के लिए सेल निलंबन की सही मात्रा की गणना। इस घनत्व इष्टतम सेल के विकास और कुशल अभिकर्मक के लिए आवश्यक है। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेतेएक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर हे / एन में।
  3. Polyethylenimine द्वारा एसएच SY5Ytransfection (पी)
    नोट: synaptic vesicles गतिशीलता कल्पना, synapto-pHluorin युक्त pCB6 वेक्टर इस्तेमाल किया गया है। synapto-pHluorin हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) 16 और निर्माण बड़े पैमाने पर न्यूरॉन्स 9 भीतर synaptic पुटिका संपत्तियों की जांच के लिए नियोजित किया गया है 2. synaptobrevin vesicular झिल्ली प्रोटीन की एक पीएच के प्रति संवेदनशील संस्करण के फ्रेम संलयन में द्वारा उत्पन्न की गई है।
    1. अभिकर्मक शुरू करने से पहले, निम्न समाधानों में से 10 मिलीलीटर बनाते हैं। एक महीने के रूप में अधिक से अधिक के रूप में समाधान रखें।
      1. एक 150 मिमी NaCl समाधान करें। 0.01 एन एचसीएल के साथ 5.5 पीएच को समायोजित करें।
      2. 150 मिमी NaCl समाधान में, 10% polyethylenimine (25 केडीए रैखिक पी) पर एक पी समाधान करें। समाधान के पीएच 8.8 से उगता है। 0.01 एन एचसीएल के साथ 7.8 पीएच को समायोजित करें।
    2. चढ़ाना के बाद 24 घंटा, मध्यम हटाने और के 1.5 मिलीलीटर के साथ ताज़ापूरा मध्यम। एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखें।
    3. लामिना का प्रवाह जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत, एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में 150 मिमी NaCl समाधान के 25 μl और 3.5 सेमी पेट्री डिश प्रति पी समाधान के 100 μl के लिए प्लास्मिड डीएनए के तीन माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें।
    4. भंवर 10 सेकंड के लिए है, तो आरटी पर 30 मिनट के लिए डीएनए / पी मिश्रण सेते हैं।
    5. ध्यान से कोशिकाओं के साथ coverslips युक्त पेट्री डिश के लिए डीएनए / पी मिश्रण जोड़ने और धीरे समान रूप से पेट्री डिश में अभिकर्मक वितरित करने के लिए हिला।
    6. चार घंटे के बाद मध्यम बदलने के लिए और एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन सेते हैं। अभिकर्मक के बाद 48 घंटा - इमेजिंग प्रयोगों 24 प्रदर्शन करते हैं।

कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा 2. सेल इमेजिंग (TIRFM)

  1. इमेजिंग सेट-अप
    1. चित्रा 1 में वर्णित सेट अप के साथ TIRF इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं। यह औंधा एक मोटर चालित शामिलमाइक्रोस्कोप (चित्रा 1, इनसेट ए), लेजर स्रोत (चित्रा 1, इनसेट बी) और TIRF-स्लाइडर (चित्रा 1, इनसेट सी)। एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए 1.45 अल्फा योजना Fluar) 100X तेल, विसर्जन उद्देश्य के माध्यम से TIRFM रोशनी तक पहुंचें।
    2. TIRFM रोशनी के लिए, एक बहु-लाइन (458/488/514 एनएम) 100 मेगावाट आर्गन आयन लेजर रोजगार। एक मोनो मोड फाइबर का उपयोग करना, TIRF स्लाइडर के माध्यम से, किरण पथ में रैखिक ध्रुवीकरण लेजर प्रकाश परिचय। परिलक्षित प्रकाश किरण पथ की चमकदार क्षेत्र डायाफ्राम विमान में TIRF स्लाइडर डालें।
      1. विस्तृत क्षेत्र रोशनी के लिए, एक पारंपरिक पारा छोटी-चाप दीपक एचबीओ श्वेत प्रकाश को माइक्रोस्कोप से कनेक्ट। स्लाइडर में एक ध्रुवीकरण-बनाए रखने डबल चश्मे TIRF रोशनी और सफेद रोशनी के साथ-साथ संयोजन सुनिश्चित करता है।
    3. एक उत्तेजना फिल्टर (बैंड चौड़ाई 488/10 एनएम) के साथ लेजर प्रकाश फिल्टर लेजर पथ में पेश एक फिल्टर पहिया, पर मुहिम शुरू की। रोजगारएक उच्च गति, सॉफ्टवेयर नियंत्रित, शटर लेजर रोशनी के तेजी से नियंत्रण की अनुमति है। PHluorin विश्लेषण के लिए, एक बैंड 525/50 एनएम उत्सर्जन फिल्टर पारित माउंट। छवि ProPlus सॉफ्टवेयर के साथ एक ठंडा फास्ट सीसीडी कैमरे पर डिजिटल छवियों (512 X 512 पिक्सल) पर कब्जा।
  2. TIRF रोशनी हासिल करने (चित्रा 2)
    1. लेजर, कम्प्यूटर, कैमरा, फिल्टर पहिया, और शटर नियंत्रकों पर बारी; तो, लेज़रों को गर्म और स्थिर करने की जरूरत के रूप में प्रयोग शुरू करने से पहले 20 मिनट इंतज़ार करो।
    2. इमेजिंग से पहले, निम्न समाधानों की उपयुक्त मात्रा बनाते हैं।
      1. 1.2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 25 मिमी 4- (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic एसिड (HEPES) (करने के लिए बफर 125 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1.2 मिमी MgSO4, पर क्रेब्स (KRH) समाधान के 50 मिलीलीटर बनाओ 7.4 पीएच), 2 मिमी 2 CaCl, और 6 मिमी ग्लूकोज।
      2. 80 मिमी NaCl, 50 मिमी KCl, 1.2 मिमी MgSO4, 1.2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4 में KCl-KRH समाधान (7.4 पीएच) के 10 मिलीलीटर बनाओ25 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 CaCl, और 6 मिमी ग्लूकोज (7.4 पीएच को बफर)।
    3. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ कांच के कवर निकालें और उपयुक्त इमेजिंग कक्ष में डालें। चैम्बर इकट्ठा और कांच के केंद्र में KRH समाधान के 500 μl जोड़ें।
    4. उद्देश्य के ऊपर तेल जोड़ें। खुर्दबीन के मंच पर इमेजिंग कक्ष प्लेस और गिलास coverslip के तहत उद्देश्य की स्थिति। नमूना अधिक सुरक्षित तैनात हो।
    5. Epifluorescence के मोड में, coverslip के (ऊपरी सतह) पर ध्यान केंद्रित करने और चैम्बर केंद्र में रखा ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का चयन करें। जिसका फ्लोरोसेंट संकेत स्पष्ट रूप से 80 मिसे के नीचे एक जोखिम समय का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है का चयन करें कोशिकाओं।
    6. सॉफ्टवेयर नियंत्रण के तहत, जीना मोड में TIRF रोशनी करने के लिए स्विच।
    7. TIRF विन्यास सेट करने के लिए नमूना कवर (चित्रा 2B) पर, उद्देश्य से बाहर उभर कि किरण की स्थिति की जाँच करें। किरण टी के केंद्र में तैनात है जबवह उद्देश्य लेंस (बाएं 2A चित्रा), एक जगह (बाएं, चित्रा 2B) TIRF नमूना कवर के केंद्र में दिखाई देता है और सेल epifluorescence के मोड में imaged है (कई फोकस विमानों, उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, चित्रा -2, बाएं) ।
    8. महत्वपूर्ण कोण तक पहुँचने के लिए, वाई दिशा में ध्यान केंद्रित स्थान के लिए कदम (आगे या पीछे, चित्रा 2B, केंद्र) TIRF स्लाइडर (चित्रा 1C) पर कोण समायोजन पेंच इस्तेमाल करते हैं। किरण (दाएं 2A चित्रा) महत्वपूर्ण कोण से भी बड़ा एक कोण पर नमूना विमान पर converges, जब मौके गायब हो जाता है और एक सीधी, पतली, ध्यान केंद्रित लाइन (सही चित्रा 2B) नमूना कवर के बीच में स्पष्ट है।
    9. फ़ाइन-ट्यून करने TIRF कोण सेल नमूना (चित्रा -2) का उपयोग करें। इस स्तर पर, एक epifluorescence छवि की तरह अभी भी दिखाई दे रहा है, वीडियो पर प्रतिदीप्ति छवि देखते हैं। धीरे, TIRF चोर जब तक पेंच के लिए कदमप्रत्यर्पण हासिल की है: सेल का केवल एक ऑप्टिकल विमान फोकस (यानी, कवर पर्ची के साथ संपर्क में प्लाज्मा झिल्ली), इस (सही, चित्रा -2) उच्च विपरीत के साथ एक फ्लैट छवि में परिणामों में है।
  3. नमूना इमेजिंग
    1. एकल चैनल समय चूक प्रयोग निर्धारित करें। Photobleaching को कम से कम करने के लिए, कम जोखिम समय और अधिक लाभ का उपयोग कर छवि पर कब्जा। 80 मिसे - उपयुक्त जोखिम बार 40 के बीच हैं। 2 हर्ट्ज आवृत्ति नमूना - 1 पर छवियों मोल। पुटिका कैनेटीक्स उच्च आवृत्ति (10 हर्ट्ज) पर बेहतर सराहना नमूना हो सकता है। अवलोकन के नियमित समय आम तौर पर 2 मिनट है।
    2. TIRFM मोड में KRH समाधान और रिकार्ड कोशिकाओं के 500 μl जोड़ें। इस विश्राम की स्थिति है। समय अनुक्रमिक छवियों को बचाओ।
    3. आराम के एक ही शर्तों (लेसर शक्ति, समय जोखिम, फ्रेम संख्या) के तहत एक ही सेल और रिकॉर्ड पर ध्यान दें। पांच तख्तों के बाद, KCl-KRH समाधान के 500 μl जोड़ने और चैम्बर में KCl रहते हैं।इस उत्तेजित हालत है; समय अनुक्रमिक छवियों को बचाने के।

3. छवि विश्लेषण और डाटा प्रोसेसिंग

नोट: छवियों का विश्लेषण करने के लिए, मैक्रोज़ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का मौजूदा कार्यों के आधार पर, प्रयोगशाला में विकसित किया गया है; इसी तरह मैक्रो को ऑनलाइन (सामग्री और उपकरण की तालिका में दी गई यूआरएल) उपलब्ध हैं।

  1. प्रतिदीप्ति तीव्रता मात्रा का ठहराव
    1. फिल्म के दौरान, छवि के हित (आरओआई) के एक क्षेत्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता मात्रा का ठहराव के लिए एक "अनुक्रम प्रतिदीप्ति तीव्रता" मैक्रो का प्रयोग करें।
    2. समय-अनुक्रमिक छवियों को खोलें। मैक्रो मेनू पर जाएँ और 'अनुक्रम प्रतिदीप्ति तीव्रता' का चयन करें। 'विश्लेषण' विंडो में "आरओआई चुनें" प्रकट होता है।
    3. आरओआई बनाने के लिए मेनू में चयन के उपकरणों में से एक का चयन करें। स्पॉट (पृष्ठभूमि आरओआई) के बिना कोशिका झिल्ली के क्षेत्रों में तीन ROIs रखें। थी रोजगारएस "पृष्ठभूमि आरओआई" photobleaching से मूल्यांकन करने के लिए और फ्यूजन घटना विश्लेषण (चित्रा 3A) के लिए सीमा निर्धारित करने के लिए।
  2. Photobleaching सुधार और सीमा निर्धारण (3B चित्रा)
    1. Photobleaching का मूल्यांकन करने के लिए, प्रतिदीप्ति तीव्रता पंक्तियाँ "पृष्ठभूमि ROIs", (चित्रा 3Ba) खुला। प्रारंभिक तीव्रता मूल्य (F0) (एफ / F0) (चित्रा 3Bb) के लिए प्रत्येक फ्रेम में प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों मानक के अनुसार। मूल्यों औसत।
    2. औसत डेटा पर प्रकाश डाला और चार्ट मेनू विकल्पों का उपयोग कर एक लाइन की साजिश बनाने के लिए।
    3. डेटा विश्लेषण मेनू से, साजिश विश्लेषण संवाद खोलने के लिए "ट्रेंडलाइन" का चयन करें। प्रतिगमन के प्रकार का चयन करें। सेट "घातीय" प्रतिगमन। फिर "चार्ट पर प्रदर्शन के समीकरण" का चयन करें। ग्राफ विंडो में, घातीय समीकरण दिखाई देता है और पैरामीटर मान स्वचालित रूप से (चित्रा 3Bc आवंटित कर रहे हैं
    4. पालन ​​के रूप में प्रत्येक फ्रेम में तीव्रता मूल्यों के घातीय सुधार लागू करें:
      एफ एन (सही) एफ एन / एक्सप्रेस = (-n * एक)
      एफ एन = फ्रेम n पर मापा प्रयोगात्मक प्रतिदीप्ति तीव्रता; एन = तख्ते की संख्या; कारण photobleaching को तीव्रता हानि की दर व्यक्त = विरंजन कारक (निरंतर;   चित्रा 3Bd)।
    5. सीमा निर्धारित करने के लिए, एक सामान्यीकृत और सही "पृष्ठभूमि आरओआई" खुला औसत प्रतिदीप्ति संकेत और इसके मानक विचलन (एसडी) की गणना। 3 एसडी प्लस औसत मूल्य सीमा (चित्रा 3Be) का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा विश्लेषण के लिए इस सीमा का उपयोग करें।
  3. एक semiautomatic प्रक्रिया का उपयोग कर संलयन घटनाओं का चयन
    1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ समय-अनुक्रमिक छवियों को खोलें। सक्रिय छवि अनुक्रम को एक गाऊसी फिल्टर लागू करें।
    2. चयन की अनुमति देता है जो उपकरण "वस्तुओं की गिनती" या एक मैक्रो का उपयोग कर छवियों का विश्लेषणजिसका पिक्सल एक परिभाषित सीमा के भीतर औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता है एक वस्तु की। मैन्युअल रूप से, सीमा समारोह का उपयोग कर सीमा तीव्रता सेट (बार मेनू में जाना, सेट उपाय → दहलीज रुचि के क्षेत्र को उजागर करने के लिए)। एक पर्याप्त दहलीज स्थानीय फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत से अधिक 30% है।
    3. एक मैक्रो निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करने के लिए केवल वस्तुओं का चयन करने के लिए "वस्तुओं फिल्टर" लागू करें:
      1. पहलू के लिए श्रेणियों का विकल्प (न्यूनतम और अधिकतम समावेशी) लागू करें। पहलू प्रमुख धुरी है और इस उद्देश्य के लिए अंडाकार बराबर की नाबालिग अक्ष के बीच अनुपात की रिपोर्ट। पहलू हमेशा से रहा है ≥1। पर्याप्त मूल्यों मिनट = 1, अधिकतम = 3 रहे हैं।
      2. व्यास के लिए श्रेणियों पर लागू करें। व्यास दो डिग्री के अंतराल में दो रूपरेखा अंक में शामिल होने और वस्तु के केन्द्रक से गुजर रहा पर मापा व्यास की औसत लंबाई की रिपोर्ट। पिक्सल में सीमा निर्धारित करें (या माइक्रोन में, एक calibrated प्रणाली का उपयोग करते हैं)।
      3. Prelimin में इष्टतम सीमा को परिभाषित करेंआरे प्रयोगों: मैन्युअल ब्याज की स्पॉट का चयन करें और फिर साजिश प्रोफ़ाइल समारोह का उपयोग कर उनके व्यास उपाय।
    4. "प्रदर्शन वस्तुओं" का चयन करें: चयनित वस्तुओं TIRFM छवि (4B चित्रा) को आरोपित दिखाई देगा।
    5. विश्लेषण में केवल उन एक छोटी (1-3 फ्रेम) बताते हैं कि स्पॉट तुरंत संकेत (क्षणिक स्पॉट) के एक चिह्नित घटाने के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता में क्षणिक वृद्धि हुई है, उनमें शामिल हैं। चयनित पुटिका / स्पॉट (प्रायोगिक ROIs) के चारों ओर लगभग एक मौके व्यास त्रिज्यात एक रॉय बनाने के लिए परिपत्र चयन को रोजगार। मैन्युअल रूप से इस कदम को पूरा करें।
    6. ROIs चयनित साथ, फिल्म के पाठ्यक्रम पर प्रत्येक रॉय की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना।
  4. डेटा विश्लेषण (चित्रा -3 सी-डी)
    1. एक स्प्रेडशीट के लिए प्रत्येक "प्रायोगिक आरओआई" में मापा प्रतिदीप्ति परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम निर्यात; (चित्रा 3Da)। प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ / F0), (चित्रा 3dB) के लिए प्रत्येक फ्रेम में तीव्रता मूल्य मानक के अनुसार।
    2. कदम 3.2.4 (चित्रा 3Dc) की रिपोर्ट में के रूप में प्रत्येक फ्रेम में तीव्रता मूल्यों के घातीय सुधार लागू करें।
    3. फ्यूजन घटनाओं की कुल संख्या (पीक संख्या), प्रत्येक संलयन उत्पन्न होने के समय (पीक चौड़ाई) और फ्लोरोसेंट शिखर (पीक ऊंचाई और एयूसी) के आयाम की गणना के लिए स्प्रेडशीट या गणित संकुल का उपयोग तार्किक कार्यों लागू होते हैं। तार्किक सूत्रों का उपयोग संलयन घटना विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 3Dd और 3De में सूचना दी है।
    4. प्लाज्मा झिल्ली पुटिका संलयन के रूप में सीमा (3SD ± औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता) से अधिक प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि हुई है और एक संलयन घटना के रूप में जिसके परिणामस्वरूप शिखर मान लें।
    5. पिछले और प्रत्येक चोटी के पहले एक्स मूल्य के बीच अंतर के रूप में शिखर चौड़ाई की गणना। 1 / (नमूना आवृत्ति) के लिए इस मूल्य गुणा। अगर यह मान पर विचारपुटिका फिर से अम्लीकरण और रीसाइक्लिंग (चित्रा 3Dd) से पहले प्लाज्मा झिल्ली में पुटिका संलयन और आसंजन का समय है।
    6. दहलीज पर मूल्यों की राशि के रूप में पूरे सेल नीलामी की गणना। कारण सहज (विश्राम) को रिकॉर्ड समय के दौरान शुद्ध फ्लोरोसेंट परिवर्तन या पैदा (उत्तेजित) synaptic गतिविधि के रूप में इस मूल्य पर विचार करें।
    7. प्रत्येक शिखर और सीमा से अधिक से अधिक y मूल्य के बीच अंतर के रूप में शिखर ऊंचाई की गणना। फ्यूजन प्रकार (बनाम एकल एक साथ / अनुक्रमिक फ्यूजन या क्षणिक बनाम पूर्ण फ्यूजन) के इस मूल्य के रूप में संकेत पर विचार करें।

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Representative Results

वर्णित TIRF इमेजिंग और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं सेलुलर सिस्टम में पुटिकाओं गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए तैयार कर रहे हैं। इस तकनीक संलयन घटनाओं और न्यूरोट्रांसमीटर पुटिका गतिशीलता पर 17 अणुओं और दवाओं के संकेत के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। GFP टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का प्रयोग, TIRFM विश्लेषण glial में GFP टैग ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों और उपकला कोशिकाओं 18,19 के विधान की तस्करी को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया गया है।

सूचना दी इमेजिंग प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण रणनीति को मान्य करने के लिए, संलयन घटनाओं बेसल के तहत दर्ज कर रहे हैं और synapto-pHluorin साथ ट्रांसफ़ेक्ट एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं में, (पोटेशियम प्रेरित विध्रुवण) की स्थिति को प्रेरित किया। (क्रमशः वीडियो 1, 2,)। दो अलग-अलग विश्लेषण प्रदर्शन कर रहे हैं: पूरे सेल (चित्रा 4) और एकल पुटिका विश्लेषण (चित्रा 5)।

पूरे सेल विश्लेषण विदेश मंत्रालयसेल में संलयन घटनाओं और उत्तेजना से प्रेरित जिसके परिणामस्वरूप शुद्ध प्रतिदीप्ति परिवर्तन की कुल संख्या उपायों। चित्रा 4 में, synapto-pHluorin ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं विश्राम के तहत दर्ज कर रहे हैं और एक ही प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (समय जोखिम, लेजर बिजली, आदि) का उपयोग कर, शर्तों (KCl उत्तेजना) को प्रेरित किया। चित्रा -4 ए synapto-pHluorin पर बिखरे हुए फ्लोरोसेंट puncta में जम जाता है कि पता चलता है कोशिका झिल्ली। साहित्य में वर्णित है, एक बेहोश फ्लोरोसेंट संकेत भी प्लाज्मा झिल्ली 9 में मौजूद है; यह संकेत imaged किया जा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोगी है। 4B चित्रा में, कागज (धारा 3.3) में वर्णित स्वचालित प्रक्रिया द्वारा चयनित स्पॉट विश्राम शर्तों के तहत चयनित स्थलों में से सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफाइल के चित्रा -4 ए। चित्रा 4C में सूचना दी TIRFM छवि से पता चलता है आरोपित कर रहे हैं। इन प्रोफाइल समान फ्लोरोसेंट पूर्णांक के अलग-अलग चोटियों की उपस्थिति का पता चलता हैकभी कभी झिल्ली के साथ फ्यूज कि पुटिकाओं के लिए रिकॉर्डिंग के दौरान विभिन्न समय पर बाहर आते हैं और शायद अनुरूप कि ensity। चित्रा 4D KCl उत्तेजना के प्रभाव को दर्शाता है। जैसी कि उम्मीद थी, 25 मिमी KCl साथ विध्रुवण एक त्वरित प्रतिक्रिया elicits और कई बहुत उज्ज्वल फ्लोरोसेंट puncta कोशिका झिल्ली पर दिखाई देते हैं (वीडियो) 2। ये puncta प्लाज्मा झिल्ली के नीचे मौजूद synaptic vesicles के 'तत्काल Releasable' पूल के अनुरूप हैं। अलग-अलग स्थानों से पत्राचार में मापा फ्लोरोसेंट परिवर्तन के समय के पाठ्यक्रम विश्लेषण स्रावी प्रोत्साहन (चित्रा 4D और 4F) के आवेदन के बाद अचानक प्रकट होते हैं कि चर प्रतिदीप्ति तीव्रता की चोटियों की उपस्थिति, इंगित करता है। रिकॉर्डिंग के समय के दौरान पूरे सेल विश्लेषण का परिणाम चित्रा 4E-एच में रिपोर्ट कर रहे हैं। KCl उत्तेजना संलयन घटनाओं की संख्या में तेजी से वृद्धि हुई है (विश्राम की स्थिति पर 2.5 गुना वृद्धि) (का कारण बनता हैइस प्रकार बड़े पैमाने पर neurotransmitter रिहाई का संकेत चित्रा 4E-एफ) और जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन (विश्राम की स्थिति पर 9.3 गुना वृद्धि) (चित्रा 4 जी एच),।

एकल-चोटी का विश्लेषण एकल संलयन घटनाओं (चित्रा 5) के लक्षण वर्णन अनुमति देता है। चित्रा 5A अनुक्रमिक से पता चलता है विश्राम की शर्तों के तहत दर्ज एक प्रतिनिधि "प्रायोगिक आरओआई" की छवियों। विशेष रूप से एक synapto-pHluorin TIRF क्षेत्र के अंतर्गत झिल्ली के साथ फ़्यूज़ जो पुटिका में लेबल पर प्रकाश डाला गया। दो फ्रेम के बाद, फ्लोरोसेंट संकेत संभावित पुटिका पुनर्प्राप्ति और फिर से अम्लीकरण का संकेत है, गायब हो जाता है। ब्याज के क्षेत्र की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल (चित्रा 5 ब) TIRF क्षेत्र में हाजिर उपस्थिति के पत्राचार में फ्लोरोसेंट संकेत में वृद्धि के उपाय। इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति मौके लापता होने के बाद बेसल स्तर के लिए रिटर्न (एकल शिखरऔसत चौड़ाई 1.91 ± 0.32 सेकंड; औसत चोटी ऊंचाई 0.042 ± 0.005 सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता)। चित्रा 5C और 5D KCl उत्तेजना के तहत दर्ज एक "प्रयोगात्मक आरओआई" के अनुक्रमिक छवियों और इसी सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल दिखाने के लिए। में और KCl विध्रुवण के बाद TIRF क्षेत्र से बाहर vesicles के आंदोलन में वृद्धि पर ध्यान दें।

40 संलयन घटनाओं चयनित और आराम में विश्लेषण और शर्तों को प्रेरित कर रहे हैं। निम्नलिखित मानकों मापा जाता है: औसत शिखर नीलामी, शिखर चौड़ाई और ऊंचाई। पीक चौड़ाई फिर से अम्लीकरण और रीसाइक्लिंग, चित्रा 5G पहले पुटिका संलयन, लगाव और endocytosis के समय निर्दिष्ट करता है। पीक ऊंचाई पुटिका संलयन, चित्रा 5F द्वारा प्रेरित प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन के उपाय। इन मानकों में परिवर्तन अलग एक्सोसाइटोसिस तंत्र का संकेत कर रहे हैं। एकल-चोटी का विश्लेषण KCl विध्रुवण को संशोधित करने से पता चलता हैप्लाज्मा झिल्ली पुटिका संलयन की विधा। दरअसल, औसत शिखर क्षेत्र बनती टी परीक्षण, चित्रा द्वारा (विश्राम की स्थिति पर 3.8 ± 0.2 गुना वृद्धि हुई है, बनती टी परीक्षण द्वारा पी <0.01, चित्रा 5E), शिखर की ऊंचाई (2.75 ± 0.03 गुना वृद्धि, पी <0.01 में वृद्धि 5F) और बनती टी परीक्षण द्वारा चौड़ाई (2.6 ± 0.5 गुना वृद्धि, पी <0.05। चित्रा 5G) उत्तेजित शर्तों के तहत पता चला रहे हैं। कई स्पष्टीकरण इन परिणामों के लिए परिकल्पना की जा सकती है। एक संभावना KCl विध्रुवण कोशिकाओं के एक विवश क्षेत्र में पुटिकाओं के एक साथ और / या अनुक्रमिक फ्यूजन का कारण बनता है। एक वैकल्पिक व्याख्या मजबूत विध्रुवण क्षणिक संलयन बनाम पूर्ण संलयन के पक्ष में है। बेसल शर्तों के तहत, मौजूदा तंत्र एक क्षणिक संलयन है: एक संलयन ताकना रूपों, पुटिका बढ़ जाती है और फ्लोरोसेंट संकेत प्रतीत होता है में पीएच, लेकिन ताकना तुरंत इस प्रकार तेजी से फिर से अम्लीकरण और रीसाइक्लिंग की इजाजत दी, बंद कर देता है। नीचेउत्तेजित शर्तों, पुटिका पूरी तरह से प्लाज्मा झिल्ली, शिखर ऊंचाई और एक लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती झिल्ली पुटिका घटकों के पीछे हटा, फिर से अम्लीकरण और रीसाइक्लिंग के रूप में चौड़ाई बढ़ाने के साथ फ़्यूज़। इसी प्रकार का एक परिणाम हाल ही में अंत: स्रावी β-कोशिकाओं को 20 में synaptic तरह microvesicle एक्सोसाइटोसिस का विश्लेषण प्राप्त किया गया है।

चित्रा 1
चित्रा 1. TIRF माइक्रोस्कोप की स्थापना की। TIRF माइक्रोस्कोप प्रणाली के योजनाबद्ध देखें और छवि (इनसेट)। axio के प्रेक्षक Z1 के मोटर चालित उलटा माइक्रोस्कोप (ए), एक बहु-लाइन 100 मेगावाट आर्गन आयन लेजर (बी) और एक TIRF-स्लाइडर (सी) शामिल की स्थापना की। लेजर प्रकाश (ग्रीन लाइन) और सफेद प्रकाश (पीली लाइन) दिखाए जाते हैं। प्रकोष्ठों एक 100 × तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग imaged कर रहे हैं। डिजिटल छवियों को एक ठंडा RetigaSRV फास्ट सीसीडी कैमरे पर कब्जा कर रहे हैं। रेफरीध्यान केंद्रित पाठभेद मॉड्यूल, उत्सर्जन (488/10) एनएम और उत्तेजना (बैंड पास 525/50 एनएम) फिल्टर, Collimator (एल 1) और (एल 2) लेंस संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. TIRFM विन्यास हो रही है। (ए) योजनाबद्ध कार्टून उद्देश्य, कवर पर्ची, नमूना और लेजर बीम की स्थिति (नीली रेखा) illustrating। वाम, उत्तेजना बीम कवर पर्ची नमूना इंटरफेस के माध्यम से सीधे यात्रा करता है । नमूना epifluorescence के मोड में के रूप में उत्साहित है। केंद्र, महत्वपूर्ण कोण से एक घटना के कोण कम नमूने के साथ उत्तेजना किरण रूपों, प्रकाश एक चर कोण पर नमूना illuminates। ठीक है, उत्तेजना बीम एक incid रूपोंमहत्वपूर्ण कोण से अधिक से अधिक ईएनटी कोण, प्रकाश पूरा हो गया है वापस उद्देश्य लेंस में परिलक्षित होता है, और एक क्षणभंगुर क्षेत्र नमूने में प्रसारित। नमूना कवर और उत्तेजना बीम (नीला वृत्त) की स्थिति दिखा रहा है (बी) कार्टून, कि TIRF रोशनी (दाएं) की ओर (बाएं) epifluorescence से संक्रमण के दौरान, उद्देश्य से बाहर उभर रहे हैं। (सी) epifluorescence (बाएं) और TIRFM (दाएं) एक लाइव एसएच SY5Y सेल में synapto-pHluorin प्रतिदीप्ति की छवियों। स्केल बार:। 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3. डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण। एक लाइव एसएच एसवाई में synapto-pHluorin प्रतिदीप्ति (ए) TIRFM छवि5y सेल। हरी वर्ग एक प्रतिनिधि "पृष्ठभूमि आरओआई" इंगित करता है। स्केल बार 10 माइक्रोन। (बी) पृष्ठभूमि रॉय के लिए प्रस्तावित कार्यप्रवाह। ऊपर से नीचे तक:।।।। पृष्ठभूमि आरओआई में मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन का एक समय बेशक, प्रारंभिक प्रतिदीप्ति मूल्य (एफ / F0) के लिए प्रतिदीप्ति परिवर्तन की बी सामान्यीकरण; घातीय प्रतिगमन की आवेदन, डी सुधार photobleaching के लिए, ई। दहलीज मूल्यांकन (पारदर्शी ग्रे वर्ग)। एक लाइव एसएच SY5Y सेल में synapto-pHluorin प्रतिदीप्ति (सी) TIRFM छवि। सफेद वर्ग एक प्रतिनिधि "प्रायोगिक आरओआई" इंगित करता है। स्केल बार 10 माइक्रोन। प्रयोगात्मक रॉय के लिए (डी) प्रस्तावित कार्यप्रवाह। ।। ऊपर से नीचे तक:; प्रारंभिक प्रतिदीप्ति मूल्य (एफ / F0) के लिए डेटा सामान्य बनाने, एक प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन के समय के पाठ्यक्रम सी। सुधार;। तार्किक कार्यों के डी आवेदन शिखर संख्या, नीलामी, चौड़ाई और ऊंचाई का पता लगाने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. पूरे सेल विश्लेषण। एक लाइव एसएच SY5Y सेल में synapto-pHluorin प्रतिदीप्ति (ए) TIRFM छवि। प्रकोष्ठों विश्राम के तहत दर्ज की गई और (1 हर्ट्ज पर नमूना) (25 मिमी KCl आवेदन) की स्थिति प्रेरित कर रहे हैं। स्केल बार: 10 माइक्रोन। स्वचालित प्रक्रिया द्वारा की पहचान (बी) के धब्बे TIRFM छवि पर आरोपित (हरे रंग) दिखाए जाते हैं। विश्राम की शर्तों के तहत पूरे सेल में स्वचालित प्रक्रिया द्वारा चयनित स्थलों में से (सी) सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल (एफ / F0)। (डी) Normalizउत्तेजित शर्तों के तहत चयनित स्थलों में से एड प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल (एफ / F0)। निशान से अधिक बार KCl के आवेदन को इंगित करता है। (एह) घटनाओं और (नीला) और उत्तेजित (लाल) की शर्तों के आराम के तहत पूरे सेल में दर्ज प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन की संख्या। (ई) Histograms सेल में दर्ज संलयन घटनाओं की कुल संख्या दिखा। (एफ) संलयन घटनाओं के लौकिक वितरण। (जी) पूरे सेल (कुल नीलामी) में होने वाली pHluorin प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व Histograms। समय के एक समारोह के रूप में संचयी pHluorin प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन दिखा रहा है (एच) घटता। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
(ए) एसएच SY5Y कोशिकाओं विश्राम शर्तों के तहत, एक हर्ट्ज पर imaged हैं। एक synapto-pHluorin दिखा एक रॉय के प्रतिनिधि TIRFM अनुक्रमिक छवियों (हर दो सेकंड) पुटिका लेबल। आरओआई 40 x 35 पिक्सल =। एक में दिखाया गया रॉय के (बी) सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल (एफ / F0)। काला तारक दहलीज लाइन में दिखाया गया है, एक संलयन घटना इंगित करता है। (सी) एक ही सेल प्रेरित शर्तों (25 मिमी KCl) के तहत दर्ज की गई है, एक रॉय के प्रतिनिधि TIRFM अनुक्रमिक छवियों दिखाए जाते हैं। KCl आवेदन पीले तारक ने संकेत दिया है। (डी) सी में दिखाया क्षेत्र की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति प्रोफाइल vesicles के (में) आगमन और लापता होने (से) पर प्रकाश डाला गया। काला तारक संलयन घटनाओं से संकेत मिलता है, सीमा रेखा दिखाया गया है। (जैसे) आराम (नीली पट्टी) के तहत दर्ज की गई और उत्तेजित एकल पुटिका घटनाओं के गुण ( लाल पट्टी) की स्थिति। एन = 40 संलयन घटनाओं। (ई) वाम, शिखर क्षेत्र (नीलामी) हल्के नीले रंग ने संकेत दिया है, ठीक है, औसत शिखर क्षेत्रों की histograms; ** पी <0.01। (एफ) वाम, शिखर ऊंचाई (ज) एक डबल अध्यक्षता में तीर द्वारा संकेत दिया है; केन्द्र, औसत चोटी ऊंचाई की histograms; ** पी <0.01, सही, चोटी ऊंचाई संलयन तंत्र निर्दिष्ट करता है। कार्टून में स्टार synapto-pHluorin इंगित करता है। (जी) वाम, शिखर चौड़ाई एक डबल अध्यक्षता में तीर द्वारा संकेत दिया है; केन्द्र, औसत शिखर चौड़ाई के histograms; * पी <0.05, सही, शिखर चौड़ाई पुटिका एक्सोसाइटोसिस, लगाव और endocytosis के समय निर्दिष्ट करता है। synapto-pHluorin प्रतिदीप्ति दिखाई और इसे बंद कर दिया जाता है। ग्रे है जब सितारा रंग हरा है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ईएनटी "> (1 हर्ट्ज पर नमूना) विश्राम शर्तों के तहत दर्ज की गई हैं synapto-pHluorin व्यक्त वीडियो 1. एसएच SY5Y कोशिकाओं। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Synapto-pHluorin व्यक्त वीडियो 2. एसएच SY5Y कोशिकाओं (1 हर्ट्ज पर नमूना) उत्तेजित शर्तों के तहत दर्ज की गई हैं। KCl के छिड़काव संकेत दिया है। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पत्र में छवि के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और फ्लोरोसेंट सीडीएनए इनकोडिंग वैक्टर और TIRFM का उपयोग कर, स्रावित कोशिकाओं में पुटिकाओं गतिशीलता का विश्लेषण। TIRFM द्वारा सफल इमेजिंग के मुख्य तत्वों में पुटिका रिहाई और रीसाइक्लिंग की आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ऑप्टिकल संकेतक के साथ सेलुलर मॉडल और सेल अभिकर्मक का चयन कर रहे हैं।

TIRFM आदर्श एक गिलास को कवर करने के लिए पक्षपाती बढ़ रही है और झिल्ली और फ्यूजन की घटनाओं के स्थिर दृश्य की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से फ्लैट की कोशिकाओं के लिए अनुकूल है। उनकी तस्करी, फ्यूजन और endocytosis imaged और एकल पुटिका स्तर पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है ताकि vesicles आदर्श सेल में छितरी किया जाना चाहिए। दुर्भाग्य से, न्यूरॉन्स इन मानदंडों को पूरा नहीं करते: वे अक्सर एक दूसरे को पार जो अनियमित आकार, neurites है, और फ्यूजन prevalently छोटे क्षेत्रों (सक्रिय क्षेत्र) में केंद्रित है vesicles। इन क्षेत्रों के लिए न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों में TIRFM द्वारा पुटिका गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए बहुत मुश्किल है।

21,22 सहित विभिन्न एजेंटों की उपस्थिति में एक कार्यात्मक परिपक्व न्यूरोनल फेनोटाइप में भेदभाव किया जा सकता है। कोशिकाओं (विशेष सेल शरीर में) TIRFM मोड में झिल्ली और फ्यूजन की घटनाओं के स्थिर दृश्य की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से फ्लैट हैं और पुटिकाओं अपेक्षाकृत बिखरे हैं। अंत में, कोशिकाओं को आसानी से अलग अभिकर्मक अभिकर्मकों का उपयोग कर प्लाज्मिड एन्कोडिंग GFP लेबल प्रोटीन या पीएच के प्रति संवेदनशील प्रोटीन टैग के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, पी transfect करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैकोशिकाओं। यह अभिकर्मक सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक एजेंटों के आधार का गठन किया और अकेले एक बहुत लागत प्रभावी अभिकर्मक वेक्टर के रूप में कार्य करता है। अभिकर्मक की एक 20% दक्षता एकल कोशिका इमेजिंग के लिए पर्याप्त है जो ऊपर की सूचना दी प्रोटोकॉल का उपयोग होने की उम्मीद है।

अलग अभिकर्मक अभिकर्मकों और प्रक्रियाओं की उपलब्धता एसएच SY5Y में और यहां तक ​​कि प्राथमिक neuronal संस्कृतियों में अभिकर्मक लगभग एक मानक प्रक्रिया में आता है, देखभाल का विश्लेषण और TIRFM डेटा की व्याख्या, जब रिकॉर्डिंग लिया जाना चाहिए। TIRFM जीवित कोशिकाओं में झिल्ली पर या पास होते हैं कि प्रक्रियाओं के बारे में जानकारी के संग्रह की सुविधा है, और में या दायर क्षणभंगुर बाहर चले जाते हैं कि टैग प्रोटीन से व्युत्पन्न फ्लोरोसेंट संकेत में परिवर्तन का पता लगाने के माध्यम से व्यक्तिगत आणविक घटनाओं के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है। हालांकि, कई कारकों जरूरी EXO / endocytic घटनाओं जिसका अर्थ है, बिना इस क्षेत्र में फ्लोरोसेंट संकेतों संशोधित कर सकते हैं, और इस ले जाना चाहिएएन ध्यान में रिकॉर्डिंग और डेटा का विश्लेषण करते हैं। इनमें विशेष रूप से क्षणभंगुर क्षेत्र और फ्लोरोफोरे संशोधनों के तहत ध्यान में विमान के विषय में उन रिकॉर्डिंग के दौरान सेल में morphological परिवर्तन कर रहे हैं।

Morphological परिवर्तन

TIRF तकनीक के उच्च संकल्प कांच इंटरफ़ेस 11 से 100 एनएम का गहराई के साथ, क्षणभंगुर क्षेत्र के भीतर fluorophores के उत्तेजना पर निर्भर करता है। यह एक बहुत ही पतली क्षेत्र है और अगोचर रूपात्मक संशोधनों को ध्यान में सेल विमान को बदलने के लिए उम्मीद कर रहे हैं। यह विशेष रूप से कई प्रक्रियाओं वर्तमान और स्पष्ट ruffling कि प्रदर्शन न्यूरॉन्स और कोशिकाओं के लिए लागू होता है। इन कोशिकाओं में, रिकॉर्डिंग के दौरान कवर पर्ची के साथ संपर्क में झिल्ली क्षेत्र अनियमित है और तेजी से इस प्रकार एक्सोसाइटोसिस का गलत मूल्यांकन के कारण बदल सकते हैं। इस कारण से, जब भी संभव हो, यह जांच के सेलुलर मॉडल का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल moveme को सीमित करने के लिएएनटीएस बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन या पाली एल Lysine के साथ कोट गिलास कवर करने के लिए सहायक हो सकता है। हालांकि, इनमें से एक substrates के सेल व्यवहार और पुटिका गतिशीलता संशोधित कर सकता है कि दिमाग में रखना चाहिए।

रिकॉर्डिंग के दौरान रूपात्मक संशोधनों के अन्य संभावित स्रोतों सेल उत्तेजना, समाधान के अलावा, और तापमान परिवर्तन कर रहे हैं। अक्सर जाहिर TIRF क्षेत्र के अंतर्गत कोशिका की सतह को संशोधित करता है, जो सेल संकोचन का कारण (यानी, KCl विध्रुवण) भारी पुटिकाओं रिहाई के लिए प्रेरित करने के लिए उत्तेजनाओं में सक्षम। यह सही प्रारंभिक प्रयोगों में प्रोत्साहन के प्रकार, एकाग्रता, और आवेदन के समय का चयन करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।

एक विंदुक के साथ स्नान में समाधान का सरल परिचय, स्वतंत्र रूप से रचना की, कतरनी तनाव से सेल आकृति विज्ञान के संशोधन का कारण बन सकता है। इस विरूपण साक्ष्य को हल करने के लिए, मध्यम अधिमानतः शोर को कम करने के लिए संभवत: एक वैक्यूम पंप के साथ जुड़ा हुआ एक छिड़काव प्रणाली का उपयोग करते हुए जोड़ें।

फ्लोरोफोरे

फ्लोरोसेंट संकेतों के बदलाव भी रिकॉर्डिंग के दौरान फ्लोरोफोरे के संशोधन की वजह से हो सकता है। सबसे महत्वपूर्ण 23 photobleaching है। Photobleaching एक फ्लोरोफोरे की फोटॉन प्रेरित अपघटन है। यह आम तौर पर समय के साथ मनाया नमूने के प्रतिदीप्ति और dimming की एक स्थायी नुकसान का कारण बनता है। TIRFM में, केवल क्षणभंगुर क्षेत्र की उत्पत्ति के लिए बंद कर दिया fluorophores photobleached किया जा सकता है और वे इस क्षेत्र में रहते हैं, क्योंकि GFP टैग झिल्ली प्रोटीन photobleached कर रहे हैं। प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तीव्रता का लुप्त होती की रोकथाम मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए बहुत उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, और अनिवार्य है। एक उचित सन्निकटन के साथ, एक निरंतर वातावरण में एक भी अणु के लिए, photobleaching के समय और उत्तेजना स्रोत के लिए जोखिम के चक्र पर निर्भर करता है। कई उदाहरणों में, photobleaching के नियंत्रण रिकॉर्डिंग 23 प्रदर्शन से अपने आकलन और इसके सुधार के लिए आसान बनाता है जो एक साधारण घातीय क्षय समारोह, इस प्रकार है। विभिन्न सुधार फार्मूले / मैक्रो को उपलब्ध ऑनलाइन (सामग्री और उपकरणों की तालिका देखें) कर रहे हैं; प्रोटोकॉल एक साधारण exponenti मेंअल समारोह का इस्तेमाल किया गया है।

Photobleaching काबू पाने के लिए कई रणनीतियों रहे हैं। एक अच्छी रणनीति उच्च photostability साथ fluorophores का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, स्रोत पर photobleaching को रोकने के लिए है। दुर्भाग्य से, अभी, डीएनए इनकोडिंग जांच का विकल्प अभी भी सीमित है। इस मामले में, गतिविधि के नुकसान प्रकाश जोखिम के समय-काल के अनुकूलन, इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान कम से कम किया जा सकता है photobleaching की वजह से, इनपुट प्रकाश के फोटोन ऊर्जा और नमूने की आवृत्ति।

पीएच के प्रति संवेदनशील जांच का उपयोग करते समय, रिकॉर्डिंग के दौरान फ्लोरोफोरे संशोधन का एक और स्रोत माध्यम में पीएच बदलाव है। रिकार्डिंग कक्ष के तरल मात्रा आमतौर पर बहुत कम और नशीली दवाओं के आवेदन पत्र है, सेल गतिविधि और चयापचय विशेष रूप से सेल और coverslip की सतह के बीच छोटे मात्रा में, मध्यम के पीएच को संशोधित कर सकते हैं। यह बदले में, इस प्रकार के तहत अनुमान पुटिका फिर से / अधिक है, जिससे pHluorin फ्लोरोसेंट संकेत परिवर्तनपट्टा। उदाहरण के लिए, मजबूत stimulations साइटोसॉल के एक कैल्शियम निर्भर अम्लीकरण को जन्म दे सकती है और इस प्रकार फ्लोरोसेंट संकेत 24 में एक अतिरंजित वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप, बाह्य अंतरिक्ष में alkalization नजर आता है।

इस समस्या से बचने के लिए, हमेशा Buffered समाधान का उपयोग करें और प्रारंभिक प्रयोगों में स्थापित प्रोटोकॉल द्वारा शुरू संभव पीएच संशोधनों की निगरानी। एक और अधिक सटीक पैदा पुटिका रिहाई का अनुमान है, आंकड़ों का विश्लेषण जब लिए, संलयन घटनाओं बिना कोशिका की सतह के क्षेत्र में प्रतिदीप्ति संकेत की निगरानी, ​​और समायोजन कारक के रूप में इस क्षेत्र के भीतर फ्लोरोसेंट संकेत के संशोधनों का उपयोग करें।

अंत में, पुटिका संलयन और गतिशीलता की निगरानी और विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस तकनीक को प्रोटीन और उनके pathogeni की भूमिका प्रकट करने के लिए, EXO / endocytosis के विभिन्न चरणों के लिए कल्पना और काटना प्रकार की कोशिकाओं (न्यूरॉन्स और अंत: स्रावी कोशिकाओं) से अलग किया जा सकता हैसी म्यूटेंट पुटिका गतिशीलता के नियमन में और विधान और विनियमित एक्सोसाइटोसिस को लक्षित दवाओं की कार्रवाई के तंत्र को उजागर करने के लिए।

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Acknowledgments

लेखकों Eliana डि Cairano (पोस्ट-डॉक्टरल फेलोशिप) और स्टेफेनिया Moretti (पीएच.डी. फैलोशिप) के लिए समर्थन के लिए विश्वविद्यालय Degli Studi di मिलानो स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम सी.पी. के लिए विश्वविद्यालय के अनुसंधान कार्यक्रम पुर द्वारा समर्थित किया गया

PHluorin निर्माण और डॉ Dotti फ्रांसेस्को डेटा विश्लेषण में सहायता के लिए, और तकनीकी सहायता के लिए सिल्विया Marsicano के लिए हम, प्रो जेरेमी एम हेनले, जैव रसायन के स्कूल, ब्रिस्टल, यूनाइटेड किंगडम विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Axio Observer Z1 Zeiss 491912-9850-000 inverted microscope
Multiline Argon Laser Lasos 77 Lasos 00000-1312-752 multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser
Laser TIRF slider Zeiss 423681-9901-000
100X Objective Zeiss 421190-9900-000 Oil, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 QImaging
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter Sutter Instrument Company
Software
Image ProPlus 6.3 Software Media Cybernetics spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination
Excel Microsoft photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses
GraphPad Prism 4.00 GraphPad Software, Inc. statistical analysis

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References

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