TIRFM og pH-følsomme GFP-sonder for å evaluere Neurotransmitter Vesikkel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastom celler: Cell Imaging og dataanalyse

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52267, doi:10.3791/52267 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Synaptiske vesikler slipper nevrotransmittere ved kjemiske synapser gjennom en dynamisk syklus av fusjon og gjenfinning. Overvåking av synaptisk aktivitet i sanntid og dissekere de forskjellige trinnene av exo-endocytose ved enkelt-vesikkel nivå er avgjørende for forståelsen av synaptiske funksjoner i helse og sykdom.

Genetisk kodet pH-følsomme sonder direkte rettet mot synaptiske vesikler og Total Internal Reflection Fluorescensmikroskopi (TIRFM) gir rom-tid-oppløsningen som er nødvendig for å følge vesikkel dynamikk. Det svinnende felt som genereres av total indre refleksjon kan bare eksitere fluoroforer er lagt i et tynt lag (<150 nm) over glassdeksel som holder cellene, hvor prosessene av exo-endocytose finne sted. De resulterende bilder med høy kontrast er ideell for vesikler sporing og kvantitativ analyse av fusjonsbegivenheter.

I denne protokollen, SH-SY5Y menneskelig neuroblastoma celler er foreslått som et verdifullt modell for å studere nevrotransmitter-frigjøring på enkelt-vesikkel nivå ved TIRFM, på grunn av deres flate overflate og nærvær av dispergerte vesikler. De fremgangsmåter for dyrking av SH-SY5Y som adherente celler og for å transfektere dem med synapto-pHluorin er anordnet, samt teknikken for å utføre TIRFM og avbildning. Endelig er en strategi som mål å velge, telle, og analysere fusion hendelser på hel-celle og single-vesikkel nivåer presentert.

Å validere bilde prosedyre og dataanalyse tilnærming, er dynamikken i pHluorin-tagget vesikler analysert under hvile og stimulert (depolariserende kaliumkonsentrasjoner) forhold. Membran depolarisering øker hyppigheten av fusjonsbegivenheter, og bevirker en parallell høyning av netto fluorescens-signalet registreres i hele cellen. Single-vesikkel analyse avslører modifikasjoner av fusion-event atferd (økt maksimal høyde og bredde). Disse dataene antyder thpå kalium depolarization ikke bare induserer en massiv neurotransmitterfrigivning men også endrer mekanismen av vesikkelfusjon og gjenvinning.

Med det passende fluorescerende probe, kan denne teknikken bli anvendt i forskjellige cellesystemer for å dissekere mekanismene for konstitutiv og stimulert sekresjon.

Introduction

Kjemisk synaptisk transmisjon mellom nevroner er en viktig mekanisme for kommunikasjon i nervesystemet. Det er avhengig av utgivelsen av nevrotransmittere gjennom en dynamisk syklus av vesikkelfusjon og henting på den presynaptiske siden. Mange av proteinene som er involvert i vesikkel dynamikk har blitt identifisert; Men deres spesifikke bidrag til fenomenet er fortsatt ikke avklart en.

Vår forståelse er delvis begrenset av det faktum at de mest brukte analyser for ekso / endocytose er ikke alltid den mest hensiktsmessige. Flere studier relatert til vesikkelfusjon og dynamikk stole på elektrofysiologiske teknikker. Denne teknikken gir en optimal tidsmessig oppløsning og er utmerket for å undersøke den innledende fusjon av vesikler til plasmamembranen, men er ikke i stand til å oppdage mange av de underliggende molekylære hendelser som støtter presynaptiske funksjon. Elektronmikroskopi, på den andre siden, gir den fineste morphological beskrivelsen av hver enkelttrinn, men den dynamiske aspektet av arrangementet ikke kan fanges opp, fordi prøvene må være festet for å bli analysert.

Ankomsten av nye optiske opptaksteknikker 2,3, i kombinasjon med fremskritt i fluorescerende molekylære prober utvikling 4-6, muliggjør visualisering av exocytic prosesser i levende celler, og dermed gi nye nivåer av informasjon om den synaptiske struktur og funksjon.

Innledende studier utnyttet aktivitetsavhengige styryl fargestoffer (FM1-43 og relaterte organiske fargestoffer) 7,8. State-of-the-art imaging teknikker ansette pH-følsomme varianter av grønt fluorescerende protein (GFP) (pHluorin) tjoret til luminale blemmer proteiner 9. Disse probene er normalt slått av når den er tilstede i vesiklene på grunn av den lave pH-luminal. Etter fusjon med plasmamembranen, er vesikkel indre utsettes for den nøytrale ekstracellulære rom, pH- brått øker, avlaster proton-avhengige leskende av pHluorin og fluorescerende signal vises raskt. Som endringen i pHluorin er raskere enn fusjons hendelse, ved å overvåke fluorescens øker, kan vesikkel fusjon med membranen måles og analyseres. Fordi overflate pHluorin-merkede molekyler er endocytose, fluorescens-signalet deretter tilbake til basalnivå, og derfor den samme konstruksjon kan anvendes også til å overvåke vesikkel gjenvinning 9.

Mens vesikkel-merket pH-sensoren sørger for visualisering eneste av disse vesikler som virkelig sikring med plasma membran, bildebehandling med høy romlig og tidsmessig oppløsning kreves for å beskrive i detaljer trinnene involvert i exo / endocytiske prosesser. Den optiske teknikk som gir nødvendig rom-tid-oppløsning er total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), et program av fluorescens mikros 10.

"> Forekommer total indre refleksjon ved grenseflaten mellom glassdeksel-slip og prøven. Når lysbanen når glasslokk-slip med en innfallende vinkel som er større enn den kritiske vinkelen, er eksitasjonslys ikke sendes inn i prøven, men er fullstendig reflektert tilbake. Under disse betingelser, et flyktig lys bølgeformer ved grenseflaten, og forplanter seg i mediet med lavere optisk tetthet (prøven). Etter hvert som intensiteten av det flyktige feltet avta eksponensielt med avstanden fra grensesnittet (med en inntrengningsdybde ca. 100 nm) bare fluoroforer i nærmeste nærhet til trekket glid kan være spent, mens de lenger borte fra grensen er ikke. I celler transfektert med GFP-konstruksjoner, tilsvarer denne dybde til proteiner uttrykt på plasmamembranen, eller i vesikulær struktur nærmer seg den. Som fluoroforer i cellens indre ikke kan bli eksitert, blir bakgrunnsfluorescens minimeres, og et bilde med et meget høyt signal / bakgrunns rotteio er dannet 11.

Flere egenskaper gjør TIRFM teknikken av valg for overvåking blemmer dynamikk. Den perfekte kontrast og høyt signal-til-støy-forholdet tillate påvisning av meget lave signaler som stammer fra enkelt vesikler. Chip-basert image oppkjøpet i hver ramme gir den tidsoppløsningen nødvendig for å oppdage svært dynamiske prosesser. Til slutt reduserer minimal eksponering av celler til lys på noen annen planet i prøven sterkt fototoksisitet og gir langvarig intervallopptak 12.

Dataanalyse er fortsatt den mest utfordrende og viktig med denne teknikken. Den enkleste måten å overvåke vesikkel fusjon er å måle akkumuleringen av reporter fluorescerende proteiner på celleoverflaten, over tid 13. Som fusion øker, netto fluorescens signal øker også. Imidlertid kan denne metoden undervurdere prosessen, spesielt i store celler og i hvilebetingelser,fordi endocytose og fotoblekingsprosesser motvirke økningen i fluorescens intensitet på grunn av vesikkel-exocytose. En alternativ metode er å følge hver enkelt fusjons arrangement 14. Denne siste metoden er svært følsom og kan avsløre viktige detaljer om fusion mekanismer. Men det krever manuelt valg av enkelthendelser, fordi helt automatiserte rutiner for å følge vesikler og å registrere svingninger av sine fluoriserende signaler er ikke alltid tilgjengelig. Observasjon av vesikkel dynamikk krever prøvetaking cellene ved høy frekvens. Dette genererer en stor mengde data som neppe kan analyseres manuelt.

Forslaget med denne artikkelen er å optimalisere TIRFM avbildningsteknikk for overvåking av basal og stimulert neurotransmitterfrigivning i SH-5YSY neuroblastom cellelinje, og for å beskrive, trinn-for-trinn, en prosedyre utviklet i laboratoriet for å analysere data, både på hel-celle og single-vesikkel nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Axio Observer Z1 Zeiss 491912-9850-000 inverted microscope
Multiline Argon Laser Lasos 77 Lasos 00000-1312-752 multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser
Laser TIRF slider Zeiss 423681-9901-000
100X Objective Zeiss 421190-9900-000 Oil, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 QImaging
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter Sutter Instrument Company
Software
Image ProPlus 6.3 Software Media Cybernetics spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination
Excel Microsoft photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses
GraphPad Prism 4.00 GraphPad Software, Inc. statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, (3), 351-357 (1997).
  3. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2, (11), 989-996 (1999).
  4. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  5. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17, (10), 969-9673 (1999).
  6. Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255, (1342), 61-66 (1994).
  7. Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32, (5), 815-828 (2001).
  8. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1, (6), 2916-2921 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  10. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
  12. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  13. Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28, (1), 325-335 (2008).
  14. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
  15. Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
  16. Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284, (18), 12491-12503 (2009).
  17. Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19, (4), 433-443 (1038).
  18. D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11, (11), 1455-1470 (2010).
  19. Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227, (4), 1740-1751 (2012).
  20. Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
  21. Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75, (3), 991-1003 (2000).
  22. Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443, (3), 199-203 (2008).
  23. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
  24. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591, (7), 1691-1706 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics