TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52267, doi:10.3791/52267 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sinaptik veziküller füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca kimyasal sinaps nörotransmitterlerin bırakın. Gerçek zamanlı olarak sinaptik aktivite izleme ve tek kese düzeyinde egzo-endositozun farklı adımlar diseksiyon sağlık ve hastalık sinaptik fonksiyonlar anlamak için çok önemlidir.

Doğrudan sinaptik veziküllerin ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) hedeflenen pH duyarlı problar vezikül dinamiklerini takip etmek gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan genetik olarak kodlanmış. toplam iç yansıma tarafından oluşturulan kaybolan alan sadece egzo-endositoz süreçler gerçekleşecek tam olarak nerede, hücreler uygun olan cam kapak üzerinde ince bir tabaka (<150 nm) yerleştirilen fluorophores heyecanlandırmak olabilir. Elde edilen yüksek kontrastlı görüntüler ideal izleme veziküller ve füzyon olayları kantitatif analiz için uygundur.

Bu protokolde, SH-SY5Y insan neuroblastoma hücreleri nedeniyle düz yüzeyin, TIRFM ile tek vezikül seviyesinde nörotransmitter salimim çalışmak için değerli bir model ve dağılmış veziküllerin varlığı olarak önerilmektedir. Yapışkan hücreler gibi SH-SY5Y büyüyen ve synapto-pHluorin ile transfekte edilmesine yönelik yöntemler TIRFM ve görüntüleme gerçekleştirmek için teknik olarak, hem de temin edilmiştir. Son olarak, seçmek saymak ve tam hücre ve tek kese seviyelerinde füzyon olayları analiz etmeyi amaçlayan bir strateji sunulmaktadır.

Görüntüleme işlemi ve veri analizi yaklaşımı doğrulamak için, pHluorin-etiketli kesecikler dinamikleri dinlenme altında analiz edilir ve koşulları (potasyum konsantrasyonları depolarizan) uyarılır. Membran depolarizasyon füzyon olgulannın sıklığını arttırır ve bütün hücre kaydedilen net floresans sinyalinin paralel bir zam neden olur. Tek vezikül analizi füzyon olayı davranışı (yüksek tepe yükseklik ve genişlik) değişiklikleri gösterir. Bu veriler inci öneririzpotasyum depolarizasyon bir büyük nörotransmitter salınımını uyarır, aynı zamanda vezikül füzyon ve geri dönüşüm mekanizmasını değiştiren sadece.

Uygun floresan prob ile, bu teknik yapıcı ve uyarımlı sekresyon mekanizmaları incelemek için farklı hücresel sistemlerde kullanılabilecektir.

Introduction

Nöronlar arasındaki sinaptik iletim Kimyasal sinir sisteminde iletişimin önemli bir mekanizmadır. Bu presinaptik yerinde vezikül füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca nörotransmitterlerin salınımı üzerine dayanır. Vezikül dinamikleri katılan proteinlerin çoğu tespit edilmiştir; Ancak, fenomen kendi özel katkısı 1 netleştirilmelidir.

Bizim anlayış kısmen egzo / endositoz için en yaygın kullanılan testler her zaman en uygun olmadığı gerçeği ile sınırlıdır. Çeşitli vezikül füzyon ile ilgili çalışmalar ve dinamikleri elektrofizyolojik teknikler güveniyor. Bu teknik, optimum zamansal çözünürlük sağlar ve plazma membran veziküller ilk füzyon araştırmak için mükemmel ama presinaptik işlevini destekleyen yatan moleküler olayların birçok algılayamıyor. Elektron mikroskobu, diğer tarafta, en iyi morphologica sağlarNumuneler analiz edilmek üzere tespit edilmelidir, çünkü her tekil adım, ancak olayın dinamik yönü l açıklama yakalanan edilemez.

floresan moleküler sondalar geliştirme 4-6 gelişmeler ile birlikte yeni optik kayıt teknikleri 2,3, gelişi, böylece sinaptik yapısı ve işlevi hakkında bilgi yeni seviyeleri sağlayan, canlı hücrelerde ekzositik süreçlerin görselleştirme sağlar.

İlk çalışmalar sömürülen aktivite bağımlı stiril boyalar (FM1-43 ve ilgili organik boyalar) 7,8. Devlet-sanat görüntüleme teknikleri lümen veziküller proteinler 9 gergin Yeşil Floresan Protein (GFP) (pHluorin) pH-duyarlı varyantlarını kullanır. Bu sondalar, normalde düşük olması nedeniyle lümen pH veziküllerde mevcut olduğunda kapatılır. Plazma membranı ile füzyon sonra, kese iç nötr hücre dışı alanı, pH maruz aniden artar pHluorin proton-bağımlı söndürme rahatlatır ve floresan sinyal hızla görünür. PHluorin değişim floresan artar izleyerek, füzyon olayı daha hızlı olduğu için, membran vezikül füzyon ölçülerek analiz edilebilir. Yüzey pHluorin-etiketli moleküller endocytosed olduğundan, floresans sinyali, daha sonra, bu nedenle, aynı yapı vezikül 9 dönüştürülmesi izlemek için de kullanılabilir, bazal seviyeye döner.

Vezikül etiketli pH sensörü sadece gerçekten plazma zarı ile sigorta bu keseciklerin görselleştirme sağlarken, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntüleme ayrıntıları egzo / endositik süreçlerinde adımları açıklamak için gereklidir. Gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan optik bir tekniktir toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM), floresan mikroskobu 10 bir uygulamadır.

"> Toplam iç yansıma ışık yolu kritik açıdan daha büyük bir olay açısı ile cam kapak-kayma ulaşır cam kapak-slip ve örnek. Arasındaki arayüzde meydana, uyarma ışık numune içine iletilir ama değil Tamamen geri yansıtılır. Bu koşullar altında, ara yüzeyde genliği azalan bir ışık dalga formları altında ve kaybolan alan yoğunluğunun bir penetrasyon derinliği ile (arabiriminden mesafe ile katlanarak çürürken. daha az bir optik yoğunluk (örnek) ile ortam içinde ilerleyen daha uzakta sınırından bu GFP yapılar ile transfekte edilen hücrelerde. değil iken, yaklaşık 100 nm) kapak-slip en yakın olan sadece flüoroforlar uyarılırken, bu derinlik, plazma zarı üzerinde ifade edilen proteinlerin veya veziküler yapılarda tekabül Hücre iç flüoroforlar heyecanlı olamaz gibi, arka plan floresan minimize, ve bir görüntü çok yüksek sinyal / arka plan sıçan olduğunu. yaklaşanio 11 oluşturulur.

Birkaç özellikler veziküller dinamikleri izlenmesi için seçim TIRFM tekniği yapmak. Mükemmel kontrast ve yüksek sinyal-gürültü oranı tek kesecikler kaynaklanan çok düşük sinyallerin algılanmasını sağlar. Her çerçeve çip tabanlı görüntü elde etme derece dinamik süreçleri tespit etmek için gerekli zamansal çözünürlük sağlar. Son olarak, numune başka düzlemde ışık hücrelerin minimal maruz güçlü fototoksisite azaltır ve uzun ömürlü time-lapse kayıt 12 sağlar.

Veri analizi, bu tekniğin en zorlu ve önemli yönü kalır. vezikül füzyon izlemek için en basit yol, zaman 13 üzerine, hücre yüzeyinde raportör flöresan protein birikimini ölçmektir. Yanı sıra füzyon artar, net floresan sinyal arttıkça. Bununla birlikte, bu yöntem özellikle büyük hücreler ve dinlenme koşulları işlemi göz ardı edilebilir,endositoz ve photobleaching süreçleri nedeniyle kese ekzositoz için floresan yoğunluğu artışı telafi çünkü. Alternatif bir yöntem, tek tek her füzyon olayı 14 takip etmektir. Bu ikinci yöntem çok hassastır ve füzyon mekanizmaları hakkında önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Tamamen otomatik prosedürler veziküller takip etmek ve onların floresan sinyallerin dalgalanmasını kayıt her zaman mevcut değildir çünkü Ancak, tek olayların manuel seçimi gerektirir. Vezikül dinamikleri Gözlem yüksek frekansta örnekleme hücreleri gerektirir. Bu pek elle analiz edilebilir veri büyük miktarda üretir.

Bu çalışmanın her iki öneri, laboratuarda geliştirilmiş bir işlem verilerini analiz etmek için SH-5YSY nöroblastom hücre çizgisinde taban ve uyarılmış olan nörotransmitter salimim izlenmesi için TIRFM görüntüleme tekniği optimize etmek ve tanımlamak için, adım adım bir Bütün hücre ve tek vezikül seviyelerde aktivite göstermez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu

  1. SH-SY5Y hücre kültürü
    Not: denemeleri, insan nöroblastom SH- SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15 kullanılarak yapılmıştır. SH-SY5Y hücreleri değişken kümeleri ve diğer yapışıcı hücreler bir karışımı olarak büyür. Sıkıca TIRFM için çok önemlidir cam kapak, bağlı büyümeye hücreleri için protokol (hücre yoğunluğu, yarma oranı, vb.) Rapor talimatları izleyin.
    1. Başlamadan önce, laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, steril fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) ve kültür ortamının elverişli hacmi oluşturmak.
      1. 150 mM NaCI, 24 mM fosfat tampon maddesi, pH 7.4 konsantrasyonları ile PBS, 50 ml olun. Çözüm Filtre.
      2. Yüksek glukoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml), L-glutamin (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) hücre ortamı 50 ml yapmak 2 mM) vesodyum piruvat (1 mM). Çözüm Filtre.
    2. Tam büyüme ortamı çıkarın ve 3 ml PBS ile hücrelerin yıkayın.
    3. 37 ° C'de 5 dakika boyunca (6 cm Petri için)% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit, 2 ml (EDTA) ile inkübe hücreleri,% 5 CO2 ve pipet kullanarak hücreleri ayırmak.
    4. DMEM 2 ml ilave etmek suretiyle deaktive tripsin ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır.
    5. Tek bir hücre süspansiyonu içine hücreleri dağıtmak için aşağı yeterince Süpernatantı pelet DMEM 1 ml ekleyin ve çözüm yukarı pipet ve.
    6. Tam orta 3 ml içeren yeni 6 cm çapında Petri kabındaki 4: Onlara 1 Böl. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de, 6 cm çapında Petri tabaklarında kültür içinde hücreleri koruyun. Haftada bir kez alt-kültür ya da 80 kapalı ne zaman - yüzey alanının% 90.
  2. Görüntüleme için SH-SY5Y hücre kaplama
    1. TIRFM deneyleri için, levhaCam kapakların üzerine hücreler. İstihdam cam 0.17 ± 0.005 mm kalınlığında ve 1,5255 ± 0.00015 kırılma indeksi ile kapsar. Başlamadan önce, aşağıdaki gibi cam lamelleri hazırlamak:
      1. Temiz cam% 90 etanol, O / N kapsar.
      2. Damıtılmış su (damıtılmış su üç değişiklik) içinde iyice yıkayın. Kuru cam bir kurutma fırınında kapsar.
      3. Talep cam Petri kapları içinde kapsamaktadır ve 3 saat boyunca 200 ° C'de önceden ısıtılmış bir fırın içinde sterilize edilir.
    2. Transfeksiyondan bir önceki gün, 3.5 cm Petri için, her lamel kültür ortamının 1 ml ilave edilir ve bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
    3. 1.1.5, komple ortam içinde 1 ml hücre pelletini askıya ve sayısı - adımda 1.1.3 tarif edildiği gibi hücreler tripsinize. De / 3 x 10 5 hücre elde etmek için her bir Petri kabına ekleyin hücre süspansiyonu doğru hacim hesaplanır. Bu yoğunluk optimum hücre büyümesi ve etkili transfeksiyon için gereklidir. 37 ° C'de inkübe edin% 5 CO2 inkübatöründe O / N.
  3. Polietilenimin SH-SY5Ytransfection (PEI)
    Not: sinaptik kesecikler dinamikleri görselleştirmek için, synapto-pHluorin içeren pCB6 vektörü kullanılmıştır. synapto-pHluorin yeşil floresan proteini (GFP), 16 ve yapı da, yaygın olarak nöronlar 9 içinde sinaptik vezikül özelliklerinin incelenmesi için kullanılmıştır edilmiştir 2. sinaptobrevin veziküler membran proteini, bir pH'a duyarlı varyantın çerçeve füzyonu ile oluşturuldu.
    1. Transfeksiyon başlamadan önce, aşağıdaki çözümlerden 10 ml yapmak. 1 ay gibi maksimal olarak çözüm tutun.
      1. 150 mM NaCI çözeltisi olun. 0.01 N HCI ile pH 5.5'e ayarlayın.
      2. 150 mM NaCI çözeltisi içinde% 10 polietilenimin (25 kDa lineer PEI) bir PEI solüsyonu yapın. Çözeltinin pH değeri 8.8'e yükselir. 0.01 N HCI ile 7.8'e pH ayarlayın.
    2. Sonra kaplama 24 saat, orta kaldırmak ve 1.5 ml yenilemetam bir ortam. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler tutun.
    3. Laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, 1.5 ml mikrofüj tüpü içinde, 150 mM NaCI çözeltisi 25 ul ve 3.5 cm'lik bir Petri tabağı başına PEI solüsyonu 100 ul plasmid DNA 3 mikrogram ekleyin.
    4. Vorteks 10 sn için, daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DNA / PEI karışımı inkübe edilir.
    5. Dikkatle hücreleri ile lamelleri içeren Petri kabı DNA / PEI karışımı ekleyin ve hafifçe eşit Petri kabındaki reaktif dağıtmak için sallayın.
    6. 4 saat sonra ortam değiştirme ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler O / N inkübe edin. Transfeksiyondan sonra 48 saat - görüntüleme deneyleri 24 gerçekleştirin.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi 2. Hücre Görüntüleme (TIRFM)

  1. Görüntüleme set-up
    1. Şekil 1'de açıklanan set-up ile TIRF görüntüleme gerçekleştirin. Bu ters bir motorlu içermektedirmikroskop (Şekil 1, ek A), lazer kaynağı (Şekil 1, ek B) ve TIRF-kaymak (Şekil 1, ek C). Bir yüksek sayısal açıklık (NA 1.45 Alpha Planı-Fluar) 100X yağı, daldırma hedefi ile TIRFM aydınlatma ulaşır.
    2. TIRFM aydınlatma için, bir çok çizgi (458/488/514 nm) 100 mW argon-iyon lazeri kullanır. Bir tek modlu optik fiber kullanılarak, TIRF kaydırıcı yoluyla, ışın yoluna doğrusal polarize ışığı lazer tanıtmak. Yansıyan ışık huzmesi yolunun aydınlık alan diyafram düzlemine TIRF sürgüsünü yerleştirin.
      1. Geniş alan aydınlatma için, geleneksel cıva kısa ark lambası HBO beyaz ışığa mikroskop bağlayabilirsiniz. Sürgünün bir kutuplaşma-muhafaza, çift prizma TIRF aydınlatma ve beyaz ışığın eşzamanlı kombinasyonunu sağlar.
    3. Bir uyarım filtre (genişlik 488/10 nm) lazer ışığı filtre lazer yoluna yerleştirilen bir filtre tekerleği üzerine monte edilmiştir. Kullanmakyüksek hız, program kontrollü, kapak, lazer aydınlatma hızlı şekilde kontrol etmek için. PHluorin analizi için, bir grup 525/50 nm emisyon filtresi geçmek monte. Görüntü ProPlus yazılımı ile soğutulmuş Hızlı CCD kamera dijital fotoğraf (512 x 512 piksel) yakalayın.
  2. TIRF aydınlatma sağlanması (Şekil 2)
    1. Lazerler, bilgisayar, kamera, filtre tekerleği, ve deklanşör kontrolörleri açın; Daha sonra, lazerler ısınmak ve stabilize etmek gerekiyor gibi deney başlamadan önce 20 dakika bekleyin.
    2. Görüntüleme önce, aşağıdaki çözümlerden elverişli hacmi oluşturmak.
      1. 1.2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) (tamponlanmış 125 mM NaCI, 5 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, Krebs (KRH) çözeltisi 50 ml yapmak pH 7.4), 2 mM CaCl2 ve 6 mM glükoz.
      2. 80 mM NaCI, 50 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH 2 PO 4'te KCI-KRH çözeltisi (pH 7.4), 10 ml yapmak25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 ve 6 mM glukoz (pH 7.4'e tamponlanmış).
    3. Transfekte hücreler cam kapağını çıkarın ve uygun görüntüleme odasının takın. Odasına monte ve cam merkezinde KRH çözeltisi 500 ul ekleyin.
    4. Amaç üzerinde yağ ekleyin. Mikroskop sahnede görüntüleme odasına yerleştirin ve cam lamel altında hedefi yerleştirin. Numune üzerinde güvenli kapağı yerleştirin.
    5. Epifloresans modunda, lamel (üst yüzey) üzerinde durulacak ve oda merkezinde yer transfekte hücreleri seçin. Olan flüoresan sinyal açıkça 80 msn altında bir pozlama süresi ile kaydedilebilir hücreleri seçin.
    6. Yazılım kontrolü altında, canlı modda TIRF aydınlatma geçiş.
    7. TIRF yapılandırmasını ayarlamak için, numune kapağı (Şekil 2B) hakkında, objektif dışarı çıkar ışınının konumunu kontrol edin. Kiriş t merkezinde konumlandırılmış zamanO objektif lens (sol Şekil 2A), bir nokta (sol, Şekil 2B) TIRF örnek kapağının ortasında görünür ve hücre Epifloresans modunda görüntülü (birkaç odak düzlemleri, yüksek eşiğe Şekil 2C, sol) .
    8. Kritik açı ulaşmak için, Y yönünde odaklı noktaya taşımak (ileri veya geri Şekil 2B, merkezi) TIRF kaymak (Şekil 1C) üzerindeki açı ayar vidası kullanarak. Kiriş (sağ Şekil 2A) kritik açıdan daha büyük bir açıyla örnek uçakta yakınsar zaman, nokta kaybolur ve düz, ince, odaklı çizgi (sağ Şekil 2B) örnek kapak ortasında açıktır.
    9. Ince ayar yapmak için TIRF açısı hücre örneği (Şekil 2C) kullanın. Bu aşamada, bir Epifloresans-benzeri görüntü hala görülebilir, video floresan görüntü izleyin. Yavaşça, TIRF con kadar vidayı hareketkoşul elde edilir: hücrenin, sadece tek bir optik odak düzlemi (yani, kapak astar ile temas halinde, plazma zarı), bu (sağ, Şekil 2C), yüksek kontrastlı bir düz görüntü ile sonuçlanan bulunmaktadır.
  3. Örnek görüntüleme
    1. Tek kanallı time-lapse deney ayarlayın. Photobleaching en aza indirmek için, düşük pozlama süresi ve yüksek kazanç kullanarak görüntüyü yakalamak. 80 msn - Uygun pozlama süreleri 40 arasındadır. 2 Hz örnekleme frekansında - 1 görüntüleri edinin. Vesikül kinetik yüksek frekansta (10 Hz) daha iyi takdir örnekleme olabilir. gözlem düzenli süresi genellikle 2 dakika olduğunu.
    2. TIRFM modunda KRH çözümü ve kayıt hücrelerinin 500 ul ekleyin. Bu dinlenme durumdur. Zaman sıralı görüntüleri kaydedin.
    3. Dinlenme aynı koşullar (lazer gücü, zaman pozlama, çerçeve sayısı) altında aynı hücrede ve kayıt odaklanın. Beş kare sonra, KCl-KRH çözeltisi 500 ul ekleyin ve odasında KCI tutun.Bu uyarılmış bir durumdur; Zaman sıralı görüntüleri kaydetmek.

3. Görüntü Analizi ve Veri İşleme

NOT: görüntüleri analiz etmek, makro görüntü analiz yazılımı mevcut fonksiyonlarına göre, laboratuvarda geliştirilmiştir; benzer makro çevrimiçi (Malzeme ve Ekipmanları Tablo sağlanan URL) bulunmaktadır.

  1. Floresans yoğunluğu ölçümü
    1. Film boyunca, görüntünün ilgi (ROI) bir bölgede floresan yoğunluğu ölçümü için bir "Dizi floresan yoğunluğu" makro kullanın.
    2. Zaman sıralı görüntüleri açın. Makro menüsüne gidin ve 'Sıra floresan yoğunluğu' seçeneğini seçin. 'Analiz' penceresinde "yatırım getirisi seçin" görünür.
    3. Yatırım getirisi oluşturmak için menüden seçim araçlarından birini seçin. Noktalar (arka plan ROI) olmadan hücre zarının bölgelerde 3 ROI'leri yerleştirin. Thi İstihdams "arka plan ROI" photobleaching değerlendirmek ve füzyon olay analizi (Şekil 3A) eşiğini ayarlamak için.
  2. Photobleaching düzeltme ve eşik tayini (Şekil 3B)
    1. Photobleaching değerlendirmek için, floresan yoğunluğu satırları "arka plan ROI", (Şekil 3BA) açın. İlk yoğunluk değerine (F0) (F / F0) (Şekil 3BB) her çerçeve içinde floresan yoğunluğu değerleri Normale. Değerlerinin ortalamasını alın.
    2. Ortalama verileri vurgulayın ve grafik menü seçeneklerini kullanarak bir çizgi grafiği oluşturmak.
    3. Veri analizi menüsünden, arsa analizi iletişim kutusunu açmak için "eğilim çizgisi" seçeneğini seçin. Regresyon türünü seçin. Set "üstel" regresyon. Sonra "grafik ekran denklemi" seçeneğini seçin. Grafik penceresinde, üstel denklem görünür ve parametre değerleri otomatik, (Şekil 3BC atanır
    4. Aşağıdaki gibi her çerçeve içinde yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın:
      Fn (düzeltilmiş) Fn / exp = (-n * a)
      Fn = çerçeve n ölçülen deneysel floresan yoğunluğu; n = kare sayısı; nedeniyle photobleaching için yoğunluk kaybı oranını ifade eden = ağartma faktörü (sabit;   Şekil 3BD).
    5. Eşiğini ayarlamak için, bir normalize ve düzeltilmiş "arka plan yatırım getirisi" açmak ortalama floresan sinyali ve standart sapma (SD) hesaplayın. 3 SD artı ortalama değer eşiği (Şekil 3BE) temsil eder. Veri analizi için bu eşiği kullanın.
  3. Yarı otomatik bir prosedür kullanılarak füzyon etkinlikleri seçimi
    1. Görüntü analiz yazılımı ile zaman-ardışık görüntüleri açın. Aktif görüntü dizisine bir Gauss filtre uygulayın.
    2. Seçim yapmanızı sağlar aracı "nesneleri saymak" veya makro kullanarak görüntüleri analizolan piksel bir tanımlanmış aralık içinde ortalama floresan yoğunluğu sahip bir nesne. Elle, eşik işlevini kullanarak aralığı yoğunluğunu ayarlayın (bar menüsüne gidin, set ölçü → eşik ilgi alanı vurgulamak için). Yeterli eşik yerel floresan arka plan sinyali üzerinde% 30.
    3. Bir makro aşağıdaki kriterleri karşılayan tek nesneleri seçmek için "nesneleri Filtreler" Uygula:
      1. Yönü için aralıkları seçeneğini (min ve max dahil) uygulayın. Aspect ana eksene ve nesneye elips eşdeğer küçük ekseni arasındaki oranı bildirir. Aspect her zaman ≥1. Yeterli değerler dk = 1, max = 3 bulunmaktadır.
      2. Çapı aralıkları uygulayın. Çapı iki derecelik aralıklarla iki anahat noktaları birleştirme ve nesnenin sentroidinden geçerek ölçülen çap ortalama uzunluğu bildirir. Piksel aralığı ayarlayın (veya mikron, bir kalibre sistemi kullanıyorsanız).
      3. Başlangıçtaki optimal aralık tanımlali deneyler: manuel ilgi noktalar seçin ve ardından arsa profil işlevini kullanarak kendi çapını ölçün.
    4. "Görüntüleme nesnelerini" seçiniz: Seçilen nesneleri TIRFM görüntü (Şekil 4B) üst üste görünür.
    5. Analizinde yalnızca kısa (1-3 kare) göstermek noktalar hemen sinyali (geçici noktalar) belirgin bir kayıp tarafından takip floresan yoğunluğunda geçici artış, ekleyin. Seçilen vezikül / noktalar (deneysel ROI) etrafında yaklaşık bir-nokta çapı radyal bir yatırım getirisi oluşturmak için dairesel bir seçim İstihdam. Bu adımı el gerçekleştirin.
    6. ROI'ları seçili, film boyunca her ROI ortalama floresan yoğunluğu hesaplayın.
  4. Veri analizi (Şekil 3C-D)
    1. Bir e-tabloya her "deneysel ROI" ölçülen floresan değişikliklerin zaman seyrini İhracat; (Şekil 3DA). İlk floresan yoğunluğu (F / F0), (Şekil 3dB) her çerçeve içinde yoğunluk değerini Normale.
    2. Adım 3.2.4 (Şekil 3Dc) bildirildiği gibi, her karede yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın.
    3. Füzyon toplam olay sayısı (pik sayısı), her füzyon meydana zamanı (tepe genişliği) ve floresan tepe (pik yüksekliği ve AUC) genlik hesaplamak için elektronik tablo veya matematik paketleri kullanarak mantıksal fonksiyonlar uygulanır. Mantıksal formüller kullanılarak füzyon olayı analizinin bir örneği Şekil 3DD ve 3DE bildirilmiştir.
    4. Plazma zarı vezikül füzyon olarak eşiğini (3SD ± ortalama arka plan floresan yoğunluğu) aşan floresan yoğunluğu artışı ve bir füzyon olayı olarak ortaya çıkan zirve varsayalım.
    5. Son ve her tepe ilk x değeri arasındaki fark olarak pik genişliği hesaplayın. 1 / (örnekleme frekansı) için bu değer çarpın. Bu değer a düşününvezikül yeniden asitlenme ve geri dönüşüm (Şekil 3DD) önce plazma membran vezikül füzyon ve yapışma zamanı.
    6. Eşiğin üzerinde değerler toplamı olarak bütün hücre AUC hesaplayın. Nedeniyle spontan (dinlenme) kayıt süresince net floresan değişikliği veya uyarılmış (uyarılmış) sinaptik aktivite olarak bu değeri düşünün.
    7. Her tepe ve eşik maksimum y değeri arasındaki fark olarak pik yüksekliği hesaplayın. Füzyon türü (genel ort tek eşzamanlı / sıralı füzyon veya geçici vs tam füzyon) bu değeri olarak gösterge düşünün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tarif TIRF görüntüleme ve veri analizi prosedürleri hücresel sistemlerde veziküller dinamikleri üzerinde çalışmak üzere tasarlanmıştır. Bu teknik, füzyon olayları ve nörotransmiter vezikül dinamikleri 17 molekülleri ve uyuşturucu sinyal etkisini belirlemek için de kullanılabilir. GFP etiketli plazma membran proteinleri kullanılarak, TIRFM analizi glial GFP-etiketli glutamat taşıyıcılar ve epitel hücreleri 18,19 kurucu kaçakçılığı karakterize etmek için kullanılmıştır.

Rapor görüntüleme işlemi ve veri analizi stratejisini doğrulamak için, füzyon olayları bazal altında kaydedilir ve synapto-pHluorin ile transfekte SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinde, (potasyum-kaynaklı depolarizasyon) şartları uyarılmış. (Sırasıyla, video 1, 2). Iki farklı analiz gerçekleştirilmiştir: bütün hücre (Şekil 4) ve tek vezikül analizleri (Şekil 5).

Tam hücre analizi meahücreye füzyon olayları ve stimülasyon tarafından uyarılan ortaya çıkan net floresan değişikliklerin toplam sayısını Sures. Şekil 4'te, synapto-pHluorin transfekte edilmiş hücreler, dinlenme altında kaydedilir ve aynı deney protokolü (zaman maruz kalma, lazer gücü, vs) kullanılarak koşulları (KCI stimülasyon) uyarıldı. Şekil 4A synapto-pHluorin dağınık floresan puncta birikir göstermektedir Hücre zarı. Literatürde açıklandığı gibi, hafif bir flüoresan sinyal, aynı zamanda plazma zarı 9 mevcut olduğu; bu sinyal, görüntülenecek hücreleri tanımlamak için yararlıdır. Şekil 4B, kağıt (bölüm 3.3) 'de açıklanan otomatik prosedür tarafından seçilen noktalar istirahat koşullarında seçilen noktalar normalize floresan yoğunluğu profilleri Şekil 4A. Şekil 4C bildirilen TIRFM görüntüye gösterir bindirilmiş. Bu profiller benzer floresan int bireysel zirvelerinden varlığını ortayabazen membran ile sigorta veziküller kayıt sırasında çeşitli zamanlarda çıkıp muhtemelen karşılık densite. Şekil 4D KCl stimülasyon etkilerini gösterir. Beklendiği gibi, 25 mM KCl ile depolarizasyon bir istemine yanıt ortaya çıkaran ve birkaç çok parlak floresan puncta hücre zarı görünür (Video 2). Bu puncta plazma zarı altında bulunan sinaptik veziküllerin 'kolayca serbest bırakılabilir' havuza gelmektedir. tek tek noktalar uygun olarak ölçülmüş olan flüoresans değişikliklerin zaman süreci analizi salgı uyarıcı (Şekil 4D ve 4F) uygulanmasından sonra aniden ortaya çıkan değişken floresan yoğunluğunun tepe varlığını gösterir. Kayıt zamanında bütün hücre analizleri sonuçları Şekil 4E-H bildirilmiştir. KCI stimülasyon füzyon olayları sayısında hızlı bir artış işaretli (istirahat koşulları üzerinde 2.5 kat artış) (nedenBu şekilde büyük nörotransmitter salımını belirten Şekil 4E-F) elde edilen flüoresan yoğunluğu değişir (dinlenme koşulları üzerinde 9.3 kat artış) (Şekil 4G-H) '.

Tek-tepe analizi tek füzyon olayları (Şekil 5) karakterizasyonu izin verir. Şekil 5A sıralı gösterir istirahat koşullarında kaydedilen bir temsilci "deneysel ROI" nin görüntüleri. Özellikle bir synapto-pHluorin TIRF bölgenin altında membran ile sigortalar vezikülü etiketli vurgulamaktadır. İki kare sonra, floresan sinyal muhtemel vezikül alma ve yeniden asitlenme belirten kaybolur. ilgili bölgenin normalleştirilmiş floresan profili (Şekil 5B) TIRF bölgesinde bir nokta görünümü uygun olarak floresan sinyali artışı ölçer. Tersine, floresan nokta kaybolduktan sonra bazal seviyeye döner (tek zirveortalama genişliği 1.91 ± 0.32 sn; ortalama pik yüksekliği 0.042 ± 0.005 normalize floresan yoğunluğu). Şekil 5C ve 5D KCl uyarımı altında kaydedilen bir "deneysel ROI" sıralı görüntüleri ve ilgili normalize floresan yoğunluğu profili göstermektedir. Ve KCl depolarizasyonuna sonra TIRF bölgesi dışında veziküller hareketi artışa dikkat ediniz.

40 füzyon olaylar seçilir ve dinlenme analiz ve koşulları uyarılır. Aşağıdaki parametreler ölçülür: ortalama pik AUC, pik genişlik ve yükseklik. Tepe genişliği yeniden asidifıkasyon ve geri dönüşüm, Şekil 5G önce vezikül füzyon, bağlanma ve endositoz süreyi belirtir. Tepe yükseklik vezikül füzyon, Şekil 5F tarafından uyarılan floresan yoğunluğu değişiklikleri ölçer. Bu parametrelerdeki değişimler çeşitli ekzositozu mekanizmaları göstergesidir. Tek-tepe analizi KCl depolarizasyon değiştirir ortaya koymaktadırplazma zarına vezikül füzyon modu. Nitekim, ortalama pik alanı eşleştirilmiş t-testi, Şekil tarafından (istirahat koşulları üzerinde 3.8 ± 0.2 kat artış, eşleştirilmiş t-testi ile p <0.01, Şekil 5E), pik yüksekliği (2.75 ± 0.03 kat artış, p <0.01 artış 5F) ve eşleştirilmiş t-testi ile genişliği (2.6 ± 0.5 kat artış, p <0.05. Şekil 5G) uyarılmış koşullar altında tespit edilir. Pek çok açıklama, bu sonuç için düşünülebilir. Bir olasılık KCI depolarizasyon hücrelerinin bir kısıtlı bölge veziküllerin aynı anda ve / veya ardışık füzyon neden olmasıdır. Alternatif bir açıklama güçlü depolarizasyon geçici füzyon karşı tam füzyonu yana olmasıdır. Bazal koşullar altında, hakim mekanizması geçici füzyon: Bir füzyon gözenek şekilleri, vezikül artar ve floresan sinyal görünür pH, ancak gözenek hemen dolayısıyla hızlı yeniden asitlenme ve geri dönüşüm sağlayan, kapatır. Altındauyarılmış durumlar, kese tamamen plazma zarı, pik yüksekliği ve daha uzun bir süre gerektirebilir zar kese bileşenlerinin geri alınışında, yeniden asitlenme ve geri dönüşüm gibi genişliği artış ile sigortalar. Benzer bir sonuç, son endokrin β-hücrelerinin 20 sinaptik benzeri microvesicle eksositoz analiz elde edilmiştir.

Şekil 1,
Şekil 1. TIRF mikroskop kurmak. TIRF mikroskop sistemi şematik görünümü ve görüntü (inset). Axio Gözlemci Z1 motorlu ters mikroskop (A), bir çok satırlı 100 mW Argon iyon lazer (B) ve bir TIRF-kaymak (C) içermektedir kurmak. Lazer ışığı (yeşil hat) ve beyaz ışık (sarı hat) gösterilmektedir. Hücreler 100 × immersiyon yağı objektif kullanılarak görüntülü. Dijital görüntüler soğutulmuş RetigaSRV Hızlı CCD kamera üzerinde yakalanır. refodaklama lector modül, emisyon (488/10 nm) ve uyarma (bant geçiren 525/50 nm) filtreler, kolimatör (L1) ve (L2) objektif gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. TIRFM yapılandırmasını alınıyor. (A) şematik karikatür objektif, kapak kayma, örnek ve lazer ışınının konumunu (mavi çizgi) gösteren. Sol, uyarma ışın kapak kayma-numune arayüzü üzerinden doğrudan geçecek . Örnek Epifloresans modunda olduğu gibi heyecanlı. Merkezi, kritik açıdan daha bir olay açı, alt numune ile uyarma ışın şekilleri, ışık değişken açıyla örnek aydınlatır. Sağ, uyarma ışın bir incid oluştururKritik açıdan daha büyük ent açı, ışık tamamlanır geri objektif lensin içine yansıyan, ve bir fani alan numunesinde yayar. Örnek kapağı ve uyarma ışın (mavi daire) konumunu gösteren (B) Karikatür, bu TIRF aydınlatma (sağ) doğru (sol) Epifloresans geçişte, amacın dışında ortaya çıkar. (C), epifloresans (sol) ve TIRFM (sağ) bir canlı SH-SY5Y hücrede synapto-pHluorin floresans ve görüntüler. Ölçek çubuğu:. 10 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Veri işleme ve analiz. Canlı SH-SY içinde synapto-pHluorin floresan (A) TIRFM görüntüsü5Y hücre. Yeşil kare bir temsilci "arka plan yatırım getirisi" gösterir. Ölçek çubuğu 10 mikron. (B) arka plan ROI için önerilen iş akışı. Yukarıdan aşağıya:.... Arka plan ROI ölçülen floresan yoğunluğu değişiklikleri bir zaman ders; ilk floresan değeri (F / F0) floresan değişiklikleri b normalleşme, üstel regresyon c uygulaması d düzeltme photobleaching için, e. eşik değerlendirme (saydam gri kare). Canlı bir SH-SY5Y hücrede synapto-pHluorin floresans (C) TIRFM görüntüsü. Beyaz kare bir temsilci "deneysel yatırım getirisi" gösterir. Ölçek çubuğu 10 mikron. Deneysel ROI için (D) Önerilen iş akışı. .. Üstten alta kaynaktan: b başlangıç ​​floresans değeri (K / F0) veri normalizasyonu, bir floresan yoğunluğu değişikliklerinin zaman süreci, c. düzeltme;. mantıksal fonksiyonların de uygulaması pik sayısı, AUC, genişlik ve yükseklik tespit etmek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Tam hücre analizi. Canlı bir SH-SY5Y hücrede synapto-pHluorin floresans (A) TIRFM görüntüsü. Hücreler dinlenme altında kaydedilmiştir ve (1 Hz örneklenmiş) (25 mM KCI uygulaması) koşullar uyarılır. Ölçek çubuğu: 10 mikron. Otomatik prosedür tarafından tanımlanan (B) noktalar TIRFM resmin üzerine bindirilmiş (yeşil renk) gösterilmektedir. Dinlenme koşulları altında, tüm hücre otomatik prosedürle seçilen noktalar (C) normalleştirilmiş floresan yoğunluğu profilleri (K / F0). (D) Normalizuyarılmış koşullar altında seçilen noktalar ed floresan yoğunluğu profilleri (F / F0). izleri üzerinde bar KCl uygulamasını gösterir. (EH) olaylar ve (mavi) ve uyarılmış (kırmızı) koşulları altında istirahat tüm hücrede kaydedilen floresan yoğunluğu değişiklikleri sayısı. (E) Histogramlar hücrede kaydedilen füzyon olayları toplam sayısını gösteren. (F) füzyon olayları zamansal dağılımı. (G) bütün hücre (Toplam EAA) ortaya çıkan pHluorin flüoresan yoğunluğundaki değişiklik gösteren histogramlar. Zamanın bir fonksiyonu olarak kümülatif pHluorin floresan yoğunluğu değişiklikleri gösteren (H) eğrileri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
(A), SH-SY5Y hücreleri, sadece dinlenme şartları altında, 1 Hz görüntülü. Bir synapto-pHluorin gösteren bir ROI Temsilcisi TIRFM sıralı görüntüler (her 2 sn) vezikülü etiketli. YG 40 x 35 piksel =. Bir gösterilen ROI (B) Normalize floresan profili (F / F0). Siyah yıldız eşik çizgisi gösterilir, bir füzyon olayı gösterir. (C), aynı hücre stimüle koşullar (25 mM KCI) altında kaydedilir, bir ROI temsilcisi TIRFM sıralı görüntüler gösterilir. KCI uygulama sarı yıldız işareti ile gösterilir. (D) C de gösterilen bölge normalleştirilmiş floresan profili veziküller (in) varış ve kaybolması (out) vurgulamaktadır. Siyah yıldız füzyon olayları göstermektedir, eşik çizgisi gösterilir. (EG) istirahat (mavi bar) altında kaydedilmiştir ve uyarılmış tek kese olayların özellikleri ( Kırmızı çubuk) şartları. n = 40 füzyon olayları. (E) Sol, pik alanı (EAA) açık mavi ile gösterilir, sağ, ortalama pik alanlarının histogramlar; ** P <0.01. (F) Sol, pik yüksekliği (h) çift başlı ok ile gösterilen, merkez, ortalama pik yüksekliği histogramlar; ** P <0.01; sağ, pik yükseklik füzyon mekanizması belirtir. Karikatürde yıldız synapto-pHluorin gösterir. (G) Sol, tepe genişliği çift başlı ok ile gösterilen, merkez, ortalama pik genişliği histogramlar; * P <0.05, sağ, tepe genişliği vezikül ekzositoz, bağlanma ve endositoz süreyi belirtir. synapto-pHluorin floresan görünür ve-off açıldığında. gri olduğunda yıldız rengi yeşildir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ent "> (1 Hz örneklenmiş) istirahat koşullarında kaydedilen synapto-pHluorin ifade video 1. SH-SY5Y hücreleri. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Synapto-pHluorin ifade video 2. SH-SY5Y hücreleri (1 Hz örneklenmiş) uyarılmış koşullar altında kaydedilir. KCI perfüzyon gösterilir. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu kağıt görüntüye bir protokol sunar ve floresan cDNA-kodlanmış vektörler ve TIRFM kullanarak, salgılayan hücrelerde veziküller dinamiklerini analiz. TIRFM başarılı görüntüleme anahtar unsurları vezikül serbest bırakılması ve geri dönüşüm genetik olarak kodlanmış optik göstergelerle hücresel modeli ve hücre transfeksiyon seçim vardır.

TIRFM ideal bir cam kapak yapışık büyüyen ve membran ve füzyon etkinlikleri sabit görüntülenmesine olanak vermek üzere yeteri kadar düz hücreler için uygundur. Kaçakçılık, füzyon ve endositoz görüntülenmiş ve tek vezikül düzeyinde ölçülebilir, böylece veziküller ideal hücre içinde dağıtılmış olması gerekmektedir. Ne yazık ki, nöronlar bu kriterlere uymayan: sık sık birbirleri üzerinde çapraz düzensiz şekillere, neurites var, ve füzyon yaygın küçük bölgelere (aktif bölgeler) yoğunlaşmıştır veziküller. Bu bölgeler için nöronların primer kültürlerinde TIRFM ile vezikül dinamikleri üzerinde çalışmak için çok zordur.

21,22 dahil olmak üzere çeşitli maddelerin varlığında, fonksiyonel olarak olgunlaşmış nöronal fenotipine farklılaşmasını edilebilir. Hücreler (özellikle hücre vücutta) TIRFM modunda membranların ve füzyon olayları istikrarlı görselleştirme izin verecek kadar düz ve kesecikler nispeten dağılmış. Son olarak, hücreler kolayca farklı transfeksiyon reaktifleri kullanılarak plazmid kodlayan GFP-etiketli proteinler veya pH'a duyarlı bir protein etiketleri ile transfekte edilebilir. Bu protokol, PEİ transfekte etmek için kullanılmıştırHücreler. Bu reaktif madde, ticari olarak mevcut çoğu transfeksiyon ajanların temelini teşkil eden Tek başına bir çok düşük maliyetli bir transfeksiyon vektörü gibi hareket eder. Bir transfeksiyon% 20 verim, tek bir hücre görüntüleme için yeterli yukarıda belirtilen protokol kullanılarak tahmin edilmektedir.

Farklı transfeksiyon reaktif ve prosedürlerin kullanılabilirliği SH-SY5Y ve hatta birincil nöronal kültürlerinde transfeksiyon neredeyse standart bir prosedür yapar iken, bakım analiz ve TIRFM verileri yorumlama, kayıt sırasında alınmalıdır. TIRFM canlı hücrelerde membran veya yakınındaki meydana süreçlerine ilişkin bilgi toplama kolaylaştırır, ve ya açılan kaybolan dışarı taşımak etiketli proteinlerden elde edilen floresan sinyal değişiklikleri tespit yoluyla bireysel moleküler olayların analizini sağlar. Ancak, çeşitli faktörler mutlaka egzo / endositik olayları ima etmeden, bu bölgede floresan sinyalleri değiştirebilirsiniz, ve bu almak gerekirn dikkate kayıt ve veri analiz ederken. Bunlar arasında özellikle kaybolan alan ve fluorofor değişiklikler kapsamında odak düzlemi ile ilgili olanlar kayıt sırasında hücrede morfolojik değişimler vardır.

Morfolojik Değişiklikler

TIRF tekniği yüksek çözünürlüklü cam arayüzü 11 100 nm derinliğe sahip, yiten alanındaki fluorophores uyarma dayanır. Bu çok ince bir bölge ve algılanamaz morfolojik değişiklikler odak hücre uçağı değiştirmek bekleniyor. Bu özellikle çeşitli süreçler sunmak ve belirgin ruffling sergileyen nöronlar ve hücreler için de geçerlidir. Bu hücrelerde, kayıt sırasında kapak-slip ile temas membran alanı düzensiz ve hızlı böylece ekzositoz ve yanlış değerlendirme neden değiştirebilirsiniz. Bu nedenle, mümkün, bu soruşturmanın hücresel modelini seçmek önemlidir. Hücre MOVEME sınırlamak içinNTS hücre dışı matris proteinleri ya da poli-L-lizin ile kat cam kapaklar için yararlı olabilir. Ancak, kimse bu yüzeyler hücre davranışı ve vezikül dinamiklerini değiştirebilir akılda tutmak gerekir.

Kayıt sırasında morfolojik değişikliklerin mümkün olan diğer kaynaklar, hücre uyarımı, çözeltilerin ilavesi ve sıcaklık değişimleri vardır. Genellikle belli TIRF bölgenin altında hücre yüzeyini değiştiren hücre daralmasına yol (yani, KCl depolarizasyon) büyük veziküller salınımını uyardığı uyaranlar mümkün. Bu doğru ön deneylerde uyarıcı tipi, konsantrasyon ve uygulama süresi belirlemek için oldukça önemlidir.

bir pipet ile banyosuna çözüm basit bir giriş, bağımsız bir şekilde, bileşimin, kesme stresi ile hücre morfolojisi değişikliğe yol açabilir. Bu yapıyı çözmek için, ortam tercihen gürültüyü azaltmak için muhtemelen bir vakum pompası ile bağlı bir perfüzyon sistemi kullanılarak ekleyin.

Fluorofor

Floresan sinyallerin Değişim da kayıt sırasında floroforun değişiklik nedeniyle olabilir. En önemli 23 photobleaching olduğunu. Photobleaching bir floroforun foton kaynaklı ayrışma olduğunu. Genel olarak, zaman içinde gözlemlenen numunenin floresans ve ayarlanması sürekli bir kayba neden olur. TIRFM ise, sadece kaybolan alanın kökeni kapalı flüoroforlar photobleached olabilir ve bu alanda bulunması nedeniyle GFP-etiketli membran proteinleri photobleached edilir. floresan emisyon yoğunluğunun solmasına önlenmesi kantitatif floresan mikroskobu için çok yüksek kaliteli görüntüler elde etmek önemlidir ve zorunludur. Makul bir yaklaşım ile, sabit bir ortamda belirli bir molekül için, ışıkla ağartma zaman ve uyarım kaynağına maruz kalma döngüsünde bağlıdır. Bir çok durumda, ışıkla ağartma kontrol kayıtları 23 gerçekleştirerek de değerlendirme ve düzeltilmesi kolaylaştırır basit bir üslü zayıflamalı fonksiyonunu izler. Farklı düzeltme formülleri / makro online (malzeme ve ekipmanların Tablo bakınız); protokol basit exponenti içindeal fonksiyonu kullanılmıştır.

Photobleaching aşmak için çeşitli stratejiler vardır. İyi bir strateji yüksek fotostabilite ile fluorophores kullanarak, örneğin, kaynağında photobleaching önlemek içindir. Ne yazık ki, şu anda, DNA prob kodlanmış seçimi hala sınırlıdır. Bu durumda, etkinlik kaybı ışık tutulmasından bir zaman dilimini optimize görüntüleme satın alma sırasında minimize edilebilir ışıkla ağartma neden olduğu, giriş ışık foton enerjisi ve numune alma sıklığı.

PH-duyarlı problar kullanırken, kayıt sırasında florofor değişiklik bir başka kaynak ortamı pH değişikliğidir. kayıt odasının sıvı hacmi genellikle çok düşüktür ve ilaç uygulaması, hücre aktivitesi ve metabolizması, özellikle hücre ve lamel yüzeyi arasındaki küçük bir hacim içinde, ortamın pH'ını değiştirebilir. Bu da, böylece altında tahmini vezikül yeniden / üzerinde neden pHluorin floresan sinyali değiştirirkira. Örneğin, güçlü uyarımlar sitoplazmada bir kalsiyum-bağımlı asidifikasyon yol açabilir ve bu nedenle, florasan sinyalinin 24 abartılı bir artışla sonuçlanan hücre dışı alanı alkalizasyon yansıtılmış.

Bu sorunu önlemek için, daima tampon çözümleri kullanmak ve ön deneylerde kurulan protokol tarafından tanıtıldı olası pH değişiklikleri izlemek. Daha doğru bir uyarılmış vezikül sürümü tahmini, veri analizi için, füzyon olayları olmadan hücre yüzeyinde bir bölgede floresan sinyali izlemek, ve ayar faktörü olarak bu bölgedeki floresan sinyal değişiklikleri kullanın.

Sonuç olarak, vezikül füzyon ve dinamiklerinin görüntülenmesi ve analiz edilmesi için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu teknik, proteinlerin ve onların pathogeni rolünü ortaya çıkarmak için, ekso / endositoz çeşitli adımlar görselleştirmek ve incelemek için hücre tipleri (nöronlar ve endokrin hücreleri), farklı olarak kullanılabilirc mutantlar vezikül dinamikleri düzenlenmesinde ve kurucu ve regüle ekzositoz hedefleyen ilaçların etki mekanizmaları ortaya çıkarmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar Eliana Di Cairano (Post-doktora bursu) ve Stefania Moretti (doktora bursu) destek için Universita degli Studi di Milano kabul etmek istiyorum. Bu çalışma CP Üniversitesi Araştırma Programı PUR tarafından desteklenen

PHluorin inşa Dr. Dotti Francesco veri analizi konusunda yardım almak için, ve teknik yardım için Silvia Marsicano için biz, Prof. Jeremy M. Henley, Biyokimya Okulu, Bristol, Birleşik Krallık Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Axio Observer Z1 Zeiss 491912-9850-000 inverted microscope
Multiline Argon Laser Lasos 77 Lasos 00000-1312-752 multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser
Laser TIRF slider Zeiss 423681-9901-000
100X Objective Zeiss 421190-9900-000 Oil, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 QImaging
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter Sutter Instrument Company
Software
Image ProPlus 6.3 Software Media Cybernetics spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination
Excel Microsoft photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses
GraphPad Prism 4.00 GraphPad Software, Inc. statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, (3), 351-357 (1997).
  3. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2, (11), 989-996 (1999).
  4. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  5. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17, (10), 969-9673 (1999).
  6. Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255, (1342), 61-66 (1994).
  7. Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32, (5), 815-828 (2001).
  8. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1, (6), 2916-2921 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  10. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
  12. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  13. Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28, (1), 325-335 (2008).
  14. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
  15. Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
  16. Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284, (18), 12491-12503 (2009).
  17. Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19, (4), 433-443 (1038).
  18. D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11, (11), 1455-1470 (2010).
  19. Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227, (4), 1740-1751 (2012).
  20. Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
  21. Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75, (3), 991-1003 (2000).
  22. Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443, (3), 199-203 (2008).
  23. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
  24. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591, (7), 1691-1706 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics