Beredning av ett transmembranprotein, den spänningskänsliga jonkanaler, KvAP, in Giant enlamellvesiklar för mikroskopi och Patch Clamp Studies

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den beredning av transmembranproteinet, KvAP, till gigantiska enlamellvesiklar (GUVs) demonstreras för två uttorkning-rehydrering metoder - electroformation och gel-assisterad svullnad. I båda metoderna, är små unilamellära vesiklar innehållande proteinet smält samman för att bilda GUVs som sedan kan studeras genom fluorescensmikroskopi och patch-clamp-elektrofysiologi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies. J. Vis. Exp. (95), e52281, doi:10.3791/52281 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Giant enlamellvesiklar (GUVs) är ett populärt biomimetisk system för att studera membran tillhörande fenomen. Emellertid, som vanligen används protokoll för att odla GUVs måste modifieras för att bilda GUVs innehållande funktionella transmembranproteiner. I artikeln beskrivs två uttorkning-rehydrering metoder - electroformation och gel-assisterad svullnad - att bilda GUVs innehåller spänningsstyrda kaliumkanalen, KvAP. I båda metoderna, är en lösning av protein-innehållande små unilamellära vesiklar delvis dehydratiseras för att bilda en stapel av membran, som sedan får svälla i en rehydrering buffert. För electroformation metoden är filmen deponeras på platinaelektroder så att en AC fält kan appliceras under film rehydrering. I motsats härtill använder gelén assisterade svullnad metod en agarosgel substrat för att förbättra film rehydrering. Båda metoderna kan producera GUVs i låga (t.ex. 5 mM) och fysiologiska (t.ex. 100 mm) saltkoncentrationer. De resulte GUVs karakteriseras via fluorescensmikroskopi, och funktionen av rekonstituerade kanaler mäts med insidan ut patch-clamp konfiguration. Medan svallning i närvaro av ett alternerande elektriskt fält (electroformation) ger ett högt utbyte av defektfria GUVs, producerar gelén assisterade svullnad metod en mer homogen proteinfördelning och kräver ingen speciell utrustning.

Introduction

När man studerar de fysikaliska principer som styr levande system, underifrånperspektiv tillåta en experimentalist att styra systemet sammansättning och andra parametrar som inte är lätt manipuleras i cellbaserade system 1. För membranbaserade processer, har Giant enlamellvesiklar (GUVs, diameter ~ 1-100 nm) visat sig vara en mycket användbar biomimetisk systemet 2-7 eftersom de är väl lämpade för mikroskopi studier och mikromanipulation 8-10. Det finns många olika protokoll för att producera GUVs, de flesta delas in i två kategorier - emulsion baserad närmar 11,12 och tekniker som bygger på återfukt en lipidfilm 13-16. I emulsionsbaserade metoder, är de inre och yttre broschyrer av de guv membran sammansatta sekventiellt från lipidmonolager vid gränsytor vatten / olja. Detta tillvägagångssätt är idealisk för inkapsling lösliga proteiner medi GUVs, och för att bilda GUVs med asymmetrisk bipacksedel lipidkomposition. Däremot kan GUVs bildade från emulsioner behålla spår av lösningsmedel som ändrar membran mekaniska egenskaper 17, och tillvägagångssättet är inte särskilt väl lämpad för transmembranprotein beredning.

Film rehydrering metoder bygger på det faktum att torka (uttorkning) orsakar många lipidblandningar att bilda en fler lamellär trave membran. Om denna stapel placeras sedan i kontakt med en vattenhaltig buffert, kommer membranen i stapeln rör sig från varandra som lösningsmedelsflöden mellan dem och vid ytan av stapeln, kan individuella membraner lösgöra att bilda GUVs 13,18 (liksom en veritabel zoo andra lipidiska föremål). Men även för optimala buffert och lipidkompositioner har denna klassiska "spontan svullnad" metoden en relativt låg avkastning på felfria GUVs. En allmänt använd metod för att öka utbytet av felfria GUVs är "electroformation221 ;, i vilken en växelström (AC) fält anbringas under film rehydrering. Medan mekanismen förblir förstås dåligt, "electroformation" kan ge spektakulära guv avkastning (> 90% under gynnsamma omständigheter) för låg saltkoncentration buffertar (<5 mM) 14,19, och kan även arbeta i fysiologiska buffertar (~ 100 mM) använder en högre frekvens (500 Hz kontra 10 Hz) växelfält och platinaelektroder 15. Ett alternativt tillvägagångssätt för att öka utbytet av felfria GUVs är "gel assisterad svullnad", där lipidlösningen deponeras på ett polymersubstrat gel snarare än passiva (t.ex. glas, PTFE) substrat som används i klassisk "spontan svullnad ". När den resulterande lipid / gel film uppblött, kan GUVs snabbt bilda även för fysiologiska buffertar 16,20.

Alla dessa metoder kan producera lipid-enbart GUVs som kan användas för att studera membranassocierade fenomen såsom deninteraktion mellan lösliga proteiner och membran. Men för att inkorporera ett transmembranprotein i GUVs, är betydande ändringar som behövs för att säkerställa att proteinet förblir i ett funktionellt tillstånd under hela rekonstitueringsproceduren. Medan lösningar av lipider i organiska lösningsmedel (t.ex. kloroform, cyklohexan) är idealiska för att framställa lipidfilmer, trans-membranproteiner är typiskt endast stabila när deras hydrofoba transmembrandomänen är inbäddad i ett lipiddubbelskikt, eller omges av en detergent-micell ( t.ex., under proteinrening). Sålunda är utgångsmaterialet för en rekonstituering typiskt nativa membran, renat protein i en rengöringslösning, eller små unilamellära proteininnehållande vesiklar (Proteo-SUVs) och / eller multilamellära vesiklar (Proteo-MLVs) bildade genom avlägsnande diskmedel i närvaro av lipider. De flesta metoder för att införliva dessa membranproteiner i GUVs faller i tre kategorier.

Direkt Insertion: Transmembranprotein upphängd i diskmedel blandas med förformade, lipid-only, milt tvättmedel lösta GUVs och rengöringsmedel avlägsnas sedan använda biobeads 21. Medan konceptuellt enkel, kräver denna metod exakt kontroll av detergentkoncentrationen, som alltför hög en tvättmedelskoncentration kan upplösa GUVs medan alltför låg koncentration kan orsaka proteinet att utvecklas eller aggregat.

GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein i Proteo-SUV kombineras med förformade, lipid-endast GUVs och fusion underlättas med speciella fusogena peptider 22 eller diskmedel 21. Vanligtvis omfattningen av fusion är begränsad vilket leder till GUVs med låg proteintäthet.

Dehydrering / Rehydrering: Ett proteininnehållande lipidfilm bildas genom partiell dehydratisering av en Proteo-SUV (eller Proteo-MLV) -lösning och GUVs odlas sedan som för en ren lipidfilm. Den uppenbara utmaningen är att skydda proteinet under den partiella dehydratipå steg 23, men metoden har framgångsrikt använts för att rekonstruera transmembranproteiner såsom Bacteriorhodopsin, Kalcium-ATPas, Grin och VDAC i GUVs 7,23 - 25.

Denna artikel beskriver dehydratisering / rehydrering protokoll för att göra GUVs innehållande den spänningsstyrda kaliumkanalen, KvAP, från hypertermofila arkéer, Aeropyrum pernix. KvAP har en hög grad av homologi med eukaryot spänningsberoende kaliumkanaler 26 och en känd kristallstruktur 27 , vilket gör det en bra modell för att studera mekanismen för spännings gating. Produktionen av Proteo-stadsjeepar har beskrivits i detalj tidigare och är inte en del av den här guiden 26,28,29. Viktigt do KvAP Proteo-stadsjeepar inte måste produceras för varje GUV beredning, eftersom de kan lagras i små (t.ex. 10 pl) portioner vid -80 ° C under längre tidsperioder (> 1 år). Electroformationeller gel-assisterad svullnad kan sedan användas för att odla GUVs från KvAP Proteo-SUV (eller Proteo-MLV).

De viktigaste stegen för electroformation protokoll illustreras i figur 1. Små droppar av en lösning av SUVs innehållande proteinet avsätts på platinatrådarna (visas i figur 2). Partiell dehydratisering av SUV suspensionen leder till bildning av en lipid-proteinfilm genom fusion av SUV. Under rehydrering, är en AC-fält som appliceras på elektroderna för att bistå lipidskikten att delaminera och bilda GUVs. En 10 Hz fält fungerar bra när man använder "låg salthalt" (<5 mM) rehydrering buffert 28 och GUVs ta flera timmar att växa. Däremot fysiologiska buffertar (innehållande ~ 100 mM salt) fungerar bra med en lägre spänning, 500 Hz AC fältet men kräver en långvarig (~ 12 timmar) svullnad perioden 15. Denna metod är baserad på en tidigare protokollet använder ITO glider 24, men använder en anpassad kammare fortsaining två platinatrådar som visas i figur 2 (se diskussionen om designdetaljer och förslag för enklare, improviserade kammare).

Figur 3 illustrerar gelén assisterade svullnad metoden. Protokollet fungerar bra med buffertar med fysiologiska saltkoncentrationer, är snabb, och producerar GUVs med en mer homogen proteinfördelning. Men (dvs, är GUV membran enhetlig vid optiska längdskalor och inte bifoga några föremål) utbytet av isolerade, synes felfri GUVs är lägre, även om det ger ett tillräckligt antal för patch-clamp och mikromanipuleringsförsök . Denna metod var baserad på ett protokoll med användning av agarosgel för att framställa lipid-enbart GUVs 16 och kräver mindre specialiserad utrustning än electroformation metoden.

Karakterisering av GUVs med fluorescensmikroskopi beskrivs, liksom förfaranden med en vanlig patch-clamp set-up tillmäta KvAP aktivitet i "inside-out" utskurna membran patchar.

Växande proteininnehållande GUVs kan vara svårare än lipid-enbart GUVs. I synnerhet kan den slutliga GUV utbytet beror känsligt på exakt hur SUV lösningen är deponerad och dehydratiseras för att bilda membranet stacken. För någon utan någon tidigare erfarenhet med GUVs, kan det vara till hjälp att först växa lipidfria endast GUVs efter en konventionell protokoll 15,16 i vilken membranet film bildas genom avsättning av lipider ur ett organiskt lösningsmedel. När den konventionella protokollet fungerar bra, kan SUV nedfall och partiell dehydratisering sedan bemästras med hjälp av lipid-bara SUV, som också till stor hjälp när du justerar protokollet för en ny lipidkomposition. När GUVs växer tillförlitligt från lipid-bara SUV, är det då bara ett litet steg för att producera proteininnehållande GUVs från Proteo-stadsjeepar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lösning Förberedelse

  1. Bered 5 ml av "SUV buffert" innehållande 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) eller Tris (pH 7,5), och 2 mM trehalos. Filtrera bufferten med en 0,2 | im sprutfilter och dela i en ml alikvoter som kan lagras vid -20 ° C.
    OBS: Ytterligare information för reagens och instrument ges i listan material.
  2. Förbered 40 ml GUV "Tillväxt Buffer" som kommer att fylla GUV interiören under film rehydrering. För en "låg salthalt" tillväxt, kombinera 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) eller 1 mM TRIS (pH 7,5), och ~ 400 mM sackaros. För en "fysiologisk salt" tillväxt, kombinera 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) eller 5 mM Tris (pH 7,5), och ~ 200 mM sackaros.
  3. Bered 40 ml av "Observation Buffer 'för extern lösning i försökskammaren genom att kombinera 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) eller 5 mM Tris (pH 7,5), och ~ 200 mM glukos.
    OBS: Dessa buffertar är endast examples. Se diskussionen att anpassa buffertarna för andra experiment.
  4. Mät osmolarities av tillväxten och observations buffertar med en osmometer. Lägg granulat av sackaros eller glukos för att matcha dem till inom 1% så att GUVs inte lysera eller kollapsa när de överförs från tillväxtkammaren till observationskammaren.
    OBS: I detta koncentrationsområde, tillsätta 1 mM sackaros (13.7 mg per 40 ml) eller glukos (7,2 mg per 40 ml) ökar osmolaritet av ~ 1 mOsm.
  5. Filtrera de tillväxt- och observations buffertar med ett 0,2 pm filter och förvara dem vid 4 ° C för att förhindra bakterietillväxt.
  6. Lös 50 mg av beta-kasein i 10 ml 20 mM Tris (pH 7,5) buffert för att bilda en 5 mg / ml beta-kasein-lösning som krävs för att passivera ytor experimentella kammare så att GUVs inte fastnar, sprider och skur. När beta-kasein är fullständigt upplöst (upp till flera timmar vid 4 ° C), filter (0,2 | im) den i 0,5 ml alikvoter, vilka kan snabbfrystes och lagradesvid -20 ° C för senare användning (tinade portioner lagrade vid 4 ° C kan normalt användas i upp till en 1 vecka).

2. SUV Framställning

  1. Förbered och frysa portioner av Proteo-stadsjeepar efter tidigare publicerade detaljerade protokoll 28. Använd KvAP fluorescent märkt med Alexa-488 maleimid, rekonstituerades i DPhPC SUVs (10 mg / ml) vid ett protein till lipid-förhållande av 01:10 (vikt-).
    OBS: Wild-typ KvAP innehåller en cystein per monomer ligger nära intracellulär C-terminalen (aminosyra 247).
  2. Fluorescerande, Lipid-bara SUV:
    OBS: Hantera kloroform under en huv bär nitrilhandskar och skyddsglasögon. Undvik att använda någon plast som kloroform kan upplösa dem. Kloroformlösningar kan lagras i bruna glasflaskor med teflonlock och överförs med hjälp av glassprutor. Var noga med att skölja alla glas minst 5 till 10 gånger med kloroform före och efter pipettering lipider.
    1. Bered 100 pl av10 mg / ml DPhPC SUV innehållande 0,5 mol% av den röda fluorescerande lipid, Texas Red-DHPE, genom att blanda 100 ^ DPhPC lösning (10 mg / ml i kloroform) med 8,2 pl Texas Red-DHPE lösning (1 mg / ml i metanol) i ett 1,5 ml bärnstensfärgad glasflaska.
    2. Torka lipiderna ned under en ström av kväve i en kemisk huv under rotation av flaskan. När filmen verkar vara torr, placera lipiderna under ett vakuum i 3 h för att avlägsna eventuellt kvarvarande lösningsmedel.
    3. Lägg 100 pl SUV buffert till lipider, och skaka kraftigt tills ingen lipid förblir fastnat på väggarna i flaskan och lösningen är jämnt, mjölkaktigt.
    4. Sonikera lipidlösningen att bilda SUVs. Justera flaskan position tills ultraljudet orsakar mest rörelse och flöde inuti flaskan, och se till att inte värma lösningen i onödan. Fortsätt ultraljudsbehandling tills lösningen blir genomskinlig, eller när det är möjligt, transparent (2-5 min för tip ultraljudsbehandling, ~ 20 min för badsonikering).
    5. Aliquot SUV (t.ex. 10 pl eller 20 pl) och frysa (-20 ° C) för senare användning.
      OBS: Lipider, speciellt omättade lipider, kan lätt uppdelning. Affär lipidlösningar vid 20 ° C (eller 80 ° C) under argon och används inom 6 månader. Lipid nedbrytningsprodukter kan detekteras med tunnskiktskromatografi.

3. GUV Tillväxt genom Electroformation

  1. Förbered electroformation kammaren.
    1. Om kammaren inte har rengjorts, ta bort fönstren, torka bort allt tätningsmedel och fett, extrahera trådarna, och skölj och skrubba kammaren med en vävnad med vatten och etanol (≥70%) växelvis.
    2. Rub trådarna väl, översvämmas trådarna och kammare i aceton, och sonikera under 5 minuter. Torka allt med en vävnad igen med aceton. Placera kammaren i etanol och sonikeras under 5 min.
    3. Montera kammaren genom att föra in kablarna genom hålen, och rotera och torka trådarna för att se till att de are ren. Sätt den kammare i destillerat vatten, sonikera under 5 minuter och torka kammaren med en ström av kväve eller luft.
  2. Bered 30 pl av 3 mg / ml SUV suspension i SUV-buffert. För att bilda proteininnehållande GUVs, kombinera 8 ul av Proteo-SUVs (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), 2 | il av fluorescerande SUVs (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol-% TexasRed-DHPE) och 20 pl av SUV buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugröret för en slutlig protein lipid (vikt) förhållande av 1 till: 12,5 och 0,1 mol-% TexasRed-DHPE. Blanda lösningen kraftigt.
    1. Alternativt att öva protokollet med lipid-bara SUV, helt enkelt kombinera 10 pl fluorescerande stadsjeepar (10 mg / ml DPhPC och 0,5 mol% TexasRed-DHPE) med 20 pl SUV buffert.
  3. Insättning SUV Solution.
    1. Använd en 2 l pipett eller 5 l glasspruta för att sätta små (<0,2 pl) droppar av SUV lösningen på trådarna. Ungefär behövs ett pl av lösning för att bilda en serie av droppar längs1 cm av tråd. Se till att dropparna är tillräckligt små och fördelade tillräckligt långt ifrån varandra att de inte vidrör eller säkring.
    2. Låt de deponerade stadsjeepar torka i ~ 30 min i fria luften. När alla dropparna har avgjorts, rotera tråden så lipid insättningar är lättare att observera med mikroskopet.
      OBS: Om stadsjeepar inte torka tillräckligt, kan de bara tvätta bort trådarna då tillväxt buffert tillsätts, medan torkning för mycket kan skada proteinet. Eftersom luftfuktighet påverkar graden av torkning, torktiden och / eller luftfuktighet kan justeras för optimala resultat 30. Lipidfilmen på trådarna ska vara synliga under ett mikroskop.
  4. Montera kammaren.
    1. Försegla kammaren Nederst: Använd en spruta för att tillämpa vakuum fett till botten av kammaren runt de tre brunnarna och tryck på en 40 mm x 22 mm täck försiktigt mot den för att försegla kammaren botten så att den fäster utan mellanrum. Täta sidor av kammaren (där trådarna exit) medtätningspasta. Applicera vakuum fett på toppen av kammaren beskriver de tre brunnarna.
    2. Tillsätt långsamt tillväxtbuffert tills varje brunn är fylld till toppen. Undvik snabba rörelser av lösningen i brunnarna eftersom detta kan beröva lipidfilmen utanför elektroderna.
    3. Stäng kammaren genom att trycka den övre luckan slide försiktigt på fettet, noga med att inte rubba den undre täck. Använd en vävnad för att avlägsna eventuella droppar av buffert vid kanterna av den övre täckglas.
      OBS: Detta är ett bra tillfälle att undersöka kammaren under mikroskop för att bekräfta att Lipidfilmen har legat på trådarna.
  5. Anslut signalgeneratorn till ledarna med hjälp av två krokodilklämmor. Ställ frekvensen (10 Hz / 500 Hz sinusvåg för låg / hög saltbuffert) och använda en multimeter för att mäta och justera spänningen över ledningarna till 0,7 / 0,35 V effektivvärde (Vrms) för låg / hög saltbuffert. Täck kammaren med aluminiumfolie för att skydda fluoroforerna från ljus. Lämna than GUVs växa under 2-3 h för låg saltbuffert, och 12 h eller O / N för den höga saltbuffert.
  6. Koppla bort kammaren från generatorn och försiktigt placera den på ett inverterat mikroskop för att utvärdera GUV tillväxt. Använd långsam, stadig rörelser eller fluidumflöde i brunnarna kan förtid lossnar GUVs från trådarna.
    OBS: GUVs på trådkanterna är oftast synliga i fas kontrast (40X långa arbetsavstånd mål), medan GUVs någonstans på den nedre halvan av trådarna kan ses med epifluorescence. Om inga GUVs är synliga, försök med att rotera trådarna för att titta på den övre ytan. GUVs kan lagras vid 4 ° C i en tillväxtkammare under flera dagar.

4. GUV Tillväxt genom Gel-assisterad Svullnad

  1. Bered 10 ml av en 1% agaros-lösning genom att blanda 100 mg agaros med 10 ml rent vatten. Värm tills det kokar genom att placera den i en mikrovågsugn på 480 W för ~ 20 sek. Rör för att se till att agarosen är helt upplöst.
    OBS: Lösningenkan lagras vid 4 ° C och uppvärmt vid behov.
  2. Plasma-ren (luftplasma) en cover-slide i 1 min så att agaroslösningen sprids fint på det. Använd täckglasen inom nästa 15 min som effekten av plasmarengöring avtar snabbt.
  3. Applicera 200 pl av varm agaroslösning till varje 22 x 22 mm 2 sliden så att lösningen väter hela ytan. Vippa sliden vertikalt och vidrör den nedre kanten till en vävnad för att avlägsna överskottsvätska och lämnar bara ett tunt jämnt skikt av agaros på objektglaset.
  4. Placera bilden på en värmeplatta eller ugn vid 60 ° C och låt den torka i minst 30 minuter. Agarosen Filmen är knappt synlig för ögat. Efter glasen svalna till RT, använda dem omedelbart eller lagra dem i upp till en vecka i en sluten behållare vid 4 ° C.
  5. Placera agaros belagda täck i en standard 3,5 cm petriskål.
  6. Förbered SUV lösning såsom i avsnitt 3.2 och tillämpa ~ 15 | il av SUV-lösning (3 mg / ml lipid) i~ 30 mycket små droppar försiktigt på agarosen ytan. Se till att inte snedvrida agarosen lagret för mycket.
  7. Placera objektglaset under en försiktig ström av kväve under ca 10-15 min och följ avdunstningen av bufferten genom ögat som dropparna torka.
  8. Så snart SUVs har torkat, lägg tillväxt buffert för att täcka glidytan. För en liten 3,5 cm petriskål användning ~ 1 ml buffert.
  9. Låt svullnaden att gå vidare för ~ 30 min, och sedan undersöka tillväxten av GUVs i kammaren med ett inverterat mikroskop med fas-kontrast eller Differential interferenskontrast (DIC).
    OBS: epifluorescens observation är svårt på grund av stark bakgrund av fluoroforer i gelén och auto fluorescens av agarosen.

5. Skörd och Observing GUVs

  1. Passivera observationskammare (t.ex. liten petriskål eller glas täck) så att GUVs inte fastnar, sprida och brast på kammarens botten. Täck chamber botten med beta-kasein-lösning, inkubera i 5 minuter, skölj ur kasein lösningen med rent vatten, torka med en ström av luft eller kväve, och slutligen lägga observationsbufferten (t.ex. ~ 5 mm djup för en liten petriskål).
  2. Skörda GUVs. Skär i slutet av en 100 | il pipettspetsar så att öppning är större (~ 2 mm diameter), och aspirerar långsamt som skjuvspänning pipettering kan lätt förstöra GUVs.
    1. För elektro bildade GUVs öppnar tillväxtkammaren genom att försiktigt ta bort det översta täck. Placera pipettspetsen direkt ovanför varje tråd och aspirera ~ 50 pl medan du flyttar pipettspetsen längs tråden att lossa GUVs.
      OBS: Det kan hjälpa att rotera tråden att samla GUVs på den "andra sidan" av tråden.
    2. För "gel-assisted svullnad" GUVs, tryck först på sidan av petriskålen några gånger för att hjälpa de GUVs lossnar från täckytan. Placera pipettspetsen strax ovanför täckglas och aspirera 50 ul, medan Pulling spetsen tillbaka över ytan. Direkt överföra skördade GUVs till en observationskammare, eller förvara i en 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 4 ° C i upp till 1 vecka.
  3. Placera observationskammaren på ett inverterat mikroskop, tillsätt GUVs till observationskammaren, och vänta några minuter för GUVs att reglera på kammarens botten.
  4. Undersökning kammaren med faskontrast eller DIC att snabbt hitta jämna, sfäriska ("defekt fria") "guv kandidater". Undersök varje "GUV kandidat" i epifluorescence att utesluta eventuella innehåller mindre liposomer kapslade inuti. Slutligen, kontrollera att lipid fluorescensintensiteten är enhetlig och kompatibel med ett enda membran (dvs unilamellär).
    OBS: I vissa bilamellar (eller multilamellära) vesiklar, membranen är för nära varandra för att lösas så att de visas unilamellära i fas kontrast eller DIC bilder. Emellertid kan dessa objekt särskiljas från faktisk unilameLlar GUVs av deras lipid fluorescens, vilket är två gånger (eller mer) ljusare.

6. Patch-kläm GUVs

  1. Gör patch pipetter med 1-2 um tip diameter från standard borosilikatglas kapillär glas med hjälp av programmet rekommenderas för pipetten avdragare.
    OBS: Särskilda behandlingar såsom brand polering är inte nödvändigt, och pipetter kan användas i flera dagar efter att de har dragit om de hålls i en sluten låda.
  2. Passivera kammaren genom inkubation med en beta-kasein-lösning (5 mg / ml) för att säkerställa att GUVs inte fastnar, sprida och bristningar på kammarytor. Skölj kasein av efter 5 min.
  3. Sätt i jordelektrod, fylla kammaren med observationsbufferten, överför 10 ìl av GUV fjädring som beskrivs i steg 5,2 och 5,3, och vänta några minuter för GUVs sedimentera på botten.
  4. Fyll en fräsch patch pipett med lösning (observations buffert eller annan iso-osmotisk lösning) ochmontera den på patch-clamp förstärkare huvudsteg.
  5. Sök genom kammaren för att hitta en "felfri" GUV som beskrivs i avsnitt 5.4, och kontrollera att den innehåller fluorescerande protein.
  6. Applicera ett konstant övertryck (> 100 Pa, eller ungefär 1 cm H2O i en manometer) för att hålla plåstret pipetten interiören ren och sätt fläckpipetten in i kammaren. Ta plåstret pipetten i synfältet, tillämpa testpulser för att mäta / kompensera pipetten spänningen offset och motstånd, och undersöka pipetten i lysrörsbelysning för att bekräfta att spetsen är ren.
  7. Bring fläckpipetten mot GUV, och om så är nödvändigt, samtidigt minska den positiva trycket så att utflödet från fläckpipetten gör inte GUV "springa iväg". När fläckpipetten är nära till GUV, applicera ett negativt tryck (upp till 5 cm H2O) för att dra GUV mot fläckpipetten. Övervaka motstånd som "; Tunga "av GUV membran in i plåstret pipetten och gigatätning former.
  8. Om en gigatätning inte bildas, ta bort plåstret pipetten från kammaren och återgå till steg 6.4. Om membranet patch bildade en gigatätning, men GUV sitter kvar på pipetten, skära lappen genom att dra bort från GUV, spricker den GUV mot kammarens botten, eller kort flyttar pipetten ur lösningen.
  9. När insidan ut membran patch har strukits från GUV och gigatätning är stabil, stänga av testpulser och tillämpa ett spänningsprotokoll som den som visas i figur 13.
    OBS: Figur 13 följer standarden elektrokonvention för en inside-out patch där ström som flyter in i patch-elektroden är "positiv", och V = V bad - V pipett. Håll plåstret med en negativ potential (t.ex. V = -100 mV) för ~ 30 sek platser KvAP i vilotillstånd, medan stegen (100 ms till 5 sek) till mer positiva potentialer (t.ex. V = 100 mV) kan sedan köra den till ledande (dvs öppna) aktiva stater.
  10. Efter mätningar på ett membran patch är klar, bryta plåstret med en zap eller tryckpuls och kontrollera att spänningen offset av plåstret elektroden inte har drivit. Ta bort plåstret pipetten från kammaren, och återgå till steg 6.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tillväxten av GUVs kan snabbt utvärderas genom att undersöka tillväxtkammare under mikroskop. För electroformation, de GUVs tenderar att växa i klasar längs platinatrådar, som visas i Figur 4. Under gel-assisterad svullnad, GUVs visas som sfäriska strukturer som snabbt växer och smälter ihop (figur 5).

Felfria GUVs lättare identifieras och utvärderas efter överföring till en observationskammare. Kalibrerings mätningar behövs för att noggrant utvärdera GUV kvalitet, och en systematisk kvantifiering har tidigare 28 publicerats. Emellertid, som en empirisk guide, "bra" GUVs skall isoleras (dvs inte i ett kluster), har en enda, slät, sfärisk yttre membran, innehåller inga objekt (dvs., rör, kapslade vesiklar, etc.) inuti, och har "standard" lipid fluorescens nivå (ljusare objekt är oftast bi- eller multi-lamellär). Figur 6 visar DIC och epifluorescence bilder av en "felfri" GUV efter överföring till en iso-osmotisk glukoslösning. Kontrasten i DIC är på grund av skillnaden i optisk densitet mellan sackaros fylld GUV och glukosinnehållande badlösningen. Brytningsindex kontrasten i KvAP-innehållande GUVs minskar ofta med tiden, även om KvAP sig inte bör vara genomsläpplig för sackaros eller glukos. Den enhetliga proteinfluorescens i GUV membranet bekräftar att KvAP införlivas i GUV (dvs, gjorde det inte kvar i lipidfilmen) och inte har bildat micron skala (eller större) aggregat.

Figurerna 7, 8 och 9 visar konfokala bilder av lipid och proteinfluorescens från GUVs produceras av lägre salt electroformation protokoll, fysiologisk salt electroformation protokoll, och gel-assisted svullnad protokoll. Den fluorescerande lipiden (magenta) och protein(Gröna) signaler har skalats till samma genomsnittliga intensitet, så att GUVs med låg / hög antal proteiner per ytenhet (proteintäthet) har en magenta / grön nyans i overlay bilder (höger kolumn), medan GUVs med en genomsnittlig proteintäthet är vita. Isolerade, defektfria GUVs identifierades och fördelningen GUV storleken visas i Figur 10. Typiskt electroformation producerar fler felfria GUVs än gel-assisterad svullnad, men de GUVs produceras av electroformation är mindre. Figur 11 visar proteintäthetsfördelning härledas från fluorescensen hos GUVs. Electroformation med högsaltbuffert producerar GUVs där proteintätheten varierar mycket från GUV till guv. Protein täthet av enskilda GUVs varierar mycket mindre för electroformation med låg saltbuffert, medan proteintäthet på GUVs produceras av gel-assisterad svullnad är påfallande jämn.

Plåstret-clamp-tekniken är en allmänt-användningd metod för att studera funktionen av spänningskänsliga jonkanaler, såsom KvAP. I "inside-out" inspelningar, är ett rent glas "patch" pipett används för att skära en bit membran från en GUV. En elektrod inuti fläckpipetten används sedan för att tillämpa spänning, och mäta den resulterande strömmen som flyter genom membranet plåstret. Sammansättningen av membran plåstret kan skilja sig betydligt från resten av cellen / GUV 31, men "inside-out" konfiguration är fortfarande mycket användbar för att mäta den enda kanal konduktans, jonisk selektivitet, och spänningsberoende gating. Dessa tre egenskaper är ett utmärkt sätt att fastställa att strömmarna inte beror på artefakter (t.ex. gigatätning frågor) eller föroreningar (t.ex. bakteriella poriner från rening), och det finns funktionella KvAP kanaler i GUVs.

Kanal konduktans lättast mäts i fläckar med endast en eller två aktiva kanaler. I example visas i figur 12, är inga kanalöppningar observerats när membranet hålls vid -100 mV, medan vid 100 mV, individuella kanalöppningar klart kan lösas. Den aktuella histogrammet visar två toppar som motsvarar den slutna och öppna stater, och montera dem med en dubbel Gaussfunktion ger en enda kanal ström på 10,9 ± 0,85 pA, motsvarande en konduktans av 109,2 ± 8,5 pS (i 100 mM KCl). Observera att enda kanal konduktans beror på lösningen (speciellt kalium koncentration) och membransammansättning 32,33.

Liksom många andra K-kanaler, individuell KvAP kanaler uppvisar "tjattrande" skurar av snabba öppningar och stängningar. Som visats tidigare, kan kalium selektivitet testas genom att använda en annan lösning i fläckpipetten (t.ex. plåster pipett lösning 90 mM NaCl, 10 mM KCl) 28.

Spänningsberoende gating ofta studied fläckvis med flera kanaler, så att lättare erhålla en ensemble genomsnitt. Det finns ingen självklar mekanism som gynnar den fysiologiska (intracellulär domän på GUV interiör) och omvänt (intracellulär domän på GUV exteriör) insättning av KvAP i GUVs i "inside-out" membran patchar majoriteten av funktionella kanaler har " fysiologisk "införing 28. Figur 13 visar responsen hos en membran plåster som innehåller multipla (> 10) kanaler till en serie av 5-sekunders depolariserande steg. Mellan varje steg, är plåstret hålls vid -100 mV under 30 sek för att låta kanaler med "fysiologisk" insättning för att återvända till sitt vilotillstånd. När potentialen är tillräckligt negativ (t.ex. V <-60 mV) de flesta av dagens beror på gigatätning läckan, och de tillfälliga öppningar av en eller två kanaler som kan antas ha "omvända" insättning. För steg till mer positiva potentials är allt fler kanaler observeras tills det finns så många att enskilda öppningar och stängningar inte längre kan lösas. Sålunda är det öppna sannolikheten av kanalen tydligt spänningsberoende. Kinetiken för KvAP aktivering och inaktivering skiljer sig avsevärt mellan Black lipidmembraner (BLMs) 26 och GUVs, men detta är förenligt med tidigare rapporter om att Kv kanal gating kan vara känsliga för membransammansättningen och stat 34.

Figur 1
Figur 1. GUV Electroformation Schematisk:. Droppar innehållande SUVs avsätts på en elektrod Partiell dehydratisering av lösning förorsakar SUVs att smälta för att bilda en stapel av membran. Buffert tillsätts sedan och ett AC elektriskt fält appliceras. Som film sväller, individuella membran loss från stapeln för att bilda GUVs. (Denna siffra har mod som du angav från Aimon et al. 28)

Figur 2
Figur 2. GUV Electroformation avdelningen. Kammaren fräses ur ett PTFE-block med tre brunnar (10 mm diameter, 5 mm djup). Två 0,5 mm platina diameter trådar är separerade av 3 mm (kant-till-kantavstånd) och är placerade nära botten av kammaren för att underlätta avbildning av trådarna. Botten och topptäckglas hålls på plats med vakuum fett och tätningspasta förhindrar eventuella läckor från tråd hålen på sidan. AC generatorn är ansluten med krokodilklämmor till trådarna. Kammaren är baserad på en utvecklad av Ernesto Ambroggio och Luis Bagatolli. (Denna siffra har modifierats Aimon et al. 28)

"/>
Figur 3. Gel-assisted Spontan Svullnad Schematisk: Droppar innehållande en SUV-suspension avsätts på en agarosgel Som droppen torkar, SUVs smälta för att bilda en lipidfilm.. När tillväxten buffert tillsätts, rehydrerar filmen och GUVs bildas vid ytan. GUVs växa till en storlek på ~ 10 um genom svullnad och sammansmältning med grann GUVs.

Figur 4
Figur 4. Representant bild av DPhPC GUVs innehåller KvAP växer på platinatråd i en hög saltbuffert. De GUVs likna klasar av druvor längs tråden. Fas Kontrast bild med en 40X LWD mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ays "> Figur 5
Figur 5. DPhPC GUVs innehållande KvAP svullnad på agarosgel. De GUVs är synliga som svaga sfärer med en diameter av ~ 10 | im. De mörka / ljusa fläckar är lipid / agaros aggregat från vilka blåsor sväller. Fas Kontrast bild med 40X LWD mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Bilder av en felfri GUV. (Egg-PC: Ägg-PA 9: 1 mass) innehållande KvAP märkt med Alexa-488 vänster: DIC, höger: Alexa-488 epifluorescens. Excite: 470/50 nm, emission: 545/75 nm. Notera den enhetliga fluorescens från KvAP utan synliga aggregat. 81fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. Konfokala bilder av lipid (magenta) och protein (grön) fluorescens från elektroformade GUVs odlas i en buffert med låg salthalt (Egg-PC: Ägg-PA 9: 1 mass) (A) Den vita pilar märke (troligt). GUVs, medan den röda pilen markerar en potentiellt bi-lamellär vesikel med högre lipid fluorescens. Notera att fluorescensintensiteten är ljusare i mitten av denna bild på grund av den extremt stora synfältet. (B) Zoom visar en liten grupp av GUVs. Vänster (magenta): TexasRed-DHPE excitation: 543 nm laserlinjen, emission: 605/70 nm. Center (grön): KvAP märkt med Alexa-488 excitation: 488 nm laserlinjen, emission: 515/30 nm. Höger: overlay.oad / 52.281 / 52281fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. Konfokala bilder av lipid (magenta) och protein (grön) fluorescens från elektroformade GUVs odlas i fysiologisk saltkoncentration (Egg-PC: Ägg-PA 9: 1 av massan). (A) De GUVs (vita pilar visar sannolikt unilamellär exempel) är glesare än den låga salt protokollet och kan ha extremt olika proteinkoncentrationer (röd pil). (B) Zoom visar en liten grupp av GUVs. Vänster (magenta): TexasRed-DHPE excitation: 543 nm laserlinjen, emission: 605/70 nm mitten (grön): KvAP märkt med Alexa-488 excitation: 488 nm laserlinjen, emission: 515/30 nm. Höger:. Overlay Vänligen cslicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9
Figur 9. Confocal bild av lipid (magenta) och protein (grön) fluorescens av GUVs (DPhPC) bildas av gel assisterad svullnad med en fysiologisk buffert saltkoncentration. GUVs visa en mer homogen proteintäthet än elektroformade GUVs preparerade med fysiologisk buffert. Vänster (magenta): bptr-Cer 0,1% excitation: 543 nm laserlinjen, emission: 605/70 nm. Mellanöstern (grön): KvAP märkt med Alexa-488 excitation: 488 nm laserlinjen, emission: 515/30 nm. Höger:. Sammanslagning av de två kanalerna Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10
Storleksfördelning av felfria Proteo-GUVs (DPhPC) odlas av electroformation i lågsaltbuffert (överst, N = 94) eller gel assisterad agaros svullnad (botten, N = 68).

Figur 11
Figur 11. guv proteintäthet histogram: Proteintätheten (antal proteiner per ytenhet) av GUVs elektro med låg saltbuffert (5 mM KCl, DPhPC) varierar mindre än med fysiologisk saltkoncentration (100 mM KCl, ägg-PC: Ägg -PA 9:. 1 mass) Protein täthet av GUVs (DPhPC) ökat med gel assisterad svullnad i fysiologisk saltbuffert visar minst variation. Protein tätheten proportionell mot KvAP-A488 fluorescensintensitet för dessa koncentrationer 28, och i varje histogram de fluorescensintensiteter normaliseras medelvärdet av fördelningen. (Den mellersta panelen har ändratsfrån Aimon et al. 28)

Figur 12
Figur 12. En kanal aktivitet GUV Membrane Patches (DPhPC 'inside-out "spännings konventionen). Det GUV odlades i 100 mM KCl, 5 mM HEPES pH 7,4 på platinatrådar. Enstaka kanaler öppna efter applicering 100 mV potential på plåstret. Till höger om den infällda är ett histogram som används för att beräkna den enda kanal konduktans. Den röda linjen är en passning till en dubbel Gaussfunktion med maximum vid 4,70 ± 0,27 pA och 15.62 ± 0,58 pA, motsvarande en konduktans av 109,2 ± 8,5 pS. Spåret filtrerades vid 10 kHz med en 4-polig Bessel-filter och registrerades vid 50 kHz.

Figur 13
Figur 13. Spänning-beroenden t grind kanaler i membranet patchen från en GUV bildas på agaros i en hög saltbuffert (DPhPC, "inside-out" spännings konventionen). (A) Svar av patch membranström till ett övergående steg i spänning. Pipett och bad lösningar båda innehöll 100 mM KCl, och membranet hölls under 30 s vid -100 mV mellan successiva spänningssteg. På en noggrann undersökning kan man se att spåret innehåller 1 eller 2 kanaler som verkar för att öppna med negativa spänningar. Inset a) visar en zoom av den fördröjda öppningen och infälld b) den fördröjda stängningen av kanalen. Strömmar filtrerades med en 4-polig Bessel-filter vid 10 kHz och registreras vid 51,3 kHz. Offline spårningen var ned-samplas till 513 Hz. Den negativa kapacitans transienta skärs av vid -150 pA. (B) Genomsnittlig ström (0,25 sek <t <5 sek) kontra steg spänningen. Strömmar på positiva spänningar större eftersom kanalen öppen sannolikheten är spänningsberoende.Iles / ftp_upload / 52.281 / 52281fig13large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biomimetiska modellsystem är ett viktigt verktyg för att studera egenskaper och interaktioner mellan proteiner och membran. Jämfört med andra ombildade system som BLMs eller stöds lipidmembran, GUV baserade system som finns flera möjligheter, inklusive betydande kontroll över membransammansättning, spänning och geometri, samt vara helt oljefri. Att införliva transmembranproteiner, såsom KvAP, i GUVs kräver betydande anpassningar av konventionella protokoll för lipid-endast GUVs. Den electroformation Protokollet presenteras här tidigare karaktäriseras och används för att studera biofysiska principer membran distribution och dynamik protein i krökta membran 2,4,35. Detta arbete visar en ny gel-assisterad svullnad protokoll, lägga till uppsättning metoder för protein beredning i GUVs. Båda protokollen kan producera felfria GUVs innehåller höga tätheter av KvAP och mätningar på insidan-ut patchar bekräftar attSE GUVs innehåller funktionella kalium selektiva, spänningsberoende kanaler.

De två metoderna har olika styrkor och svagheter. När låga saltbetingelser kan användas, erbjuder electroformation en bra kompromiss mellan GUV avkastning och likformig proteindensitet. Electroformation ger fortfarande rimliga utbyten med fysiologiska saltkoncentrationer, men proteintätheten kan variera kraftigt mellan GUVs (se figur 8 och 11). Variationerna densitets verkar vara knuten till den period av electroformation, som låg saltbuffert tillväxt kan också ha betydande variationer densitet om tillväxten fortsätter mycket längre än 2 tim. Däremot GUVs produceras av gel assisterad svullnad har en anmärkningsvärt jämn proteintäthet, även för fysiologiska buffertar. Dock är andelen multilamellära vesiklar större, och agaros auto-fluorescens komplicerar kvantifiering av låg protein densiteter 16. Använda polyvinylalkohol i place agaros har rapporterats att förbättra gel assisterade GUV avkastning när lipider avsattes från kloroform 20, men vi kunde inte producera GUVs använder polyvinylalkohol med SUV-lösningar. Om ett lägre utbyte av felfria GUVs är acceptabelt, har gel-assisterad svullnad en klar fördel för experiment som kräver en jämn proteinfördelning.

Electroformation och gel-assisterad svullnad har också helt andra krav på utrustning. Gelen assisterade svullnad protokollet använder lite specialutrustning utom för plasma renare, vilket inte är nödvändigt eftersom det finns många alternativa metoder för att producera ren, hydrofil glas. I motsats härtill kräver electroformation en anpassad kammare med trådelektroder. Platinatråd är dyrt, men för detta protokoll GUVs växte lättare med platina än titan trådar, och GUVs inte växer på ITO glider när du använder fysiologiska saltkoncentrationer. Diametern på elektroderna (0,5 mm) är ett comprOmiše mellan elektrodytan och pris. Kammaren visas i figur 2 är baserat på en design av Luis Bagatolli 15 och Ernesto Ambroggio, och svarvade ur polytetrafluoretylen (PTFE) för att rengöring med de flesta lösningsmedel. Emellertid bör polyacetal eller polyvinylklorid (PVC) också fungera bra. Förmågan att ta bort platinatrådar för aggressiv rengöring är viktigt, och när första lära protokollet, är det mycket bra att kunna observera GUV tillväxt på plats genom bottenlocket. Den mindre, slutna brunnar förhindrar lösning från skvalpar fram och tillbaka och låta även tester av flera lipidkompositioner parallellt. Dock är inte väsentligt en särskild anpassad kammare när du börjar. Till exempel kan enkla, enkel well kamrarna improviseras genom häftning två trådar ner till botten av en liten petriskål, eller med hjälp av tätnings vax till sandwich dem mellan två glasskivor, eller helt enkelt peta dem genom locket av en liten flaska.

Både electroformation och gel assisterad svullnad protokoll bör producera ett tillräckligt antal felfria GUVs för mikromanipulering och patch-clamp experiment. Men GUV räcker beror känsligt på bildningen av dubbelskiktet stacken när SUV lösningen är delvis uttorkad. Om svårigheter uppstår i växande GUVs (dvs, inga eller få GUVs syns i tillväxtkammaren), kan det vara till stor hjälp för att växa lipid-endast GUVs med hjälp av en lipid / kloroform lösning i stället för stadsjeepar 15,16 (och en låg saltbuffert). Om GUVs inte växer bra från en lipid / kloroform film då något grundläggande är fel (t.ex. felaktiga lipidlösningar eller buffertar, fett eller smuts på elektrod, felaktig spänning eller frekvens, etc.). Men om GUVs växa från lipid / kloroform filmer men inte de SUV filmerna, då kommer sannolikt att vara med partiell dehydratisering frågan.

Den partiella uttorkning steget ärlättast optimerad användning av lipid-bara stadsjeepar eftersom det inte finns någon risk för "denature" lipider från överdriven uttorkning. För electroformation, kan det vara bra att undersöka trådarna efter SUV dropparna har tillåtits torka kolla det är ljust lipid fluorescens vid varje plats där en droppe deponerades. Om lipid fluorescens försvinner efter kammaren är fylld med tillväxtlösning, sedan antingen tillväxtlösningen måste läggas mer noggrant, eller stadsjeepar behöver torka längre så filmen fäster fastare till tråden. Under tillväxt, se till varken sladdar eller lösningen flytta i kammaren (t.ex. när de ställer kammaren på mikroskop) för att undvika stripp GUVs utanför trådarna. När GUVs växer bra, de är oftast lätt att se i fas kontrastrika bilder. Men mindre GUVs ofta tydligare med hjälp lipid fluorescens, som också är till hjälp för att se hur membranstacken har förändrats under tillväxt. Undersök alla ytortrådarna (inuti, utanför, topp och botten) i alla brunnar samt kammargolvet innan du slänger tillväxten, eftersom avkastningen kan variera avsevärt från en plats till en annan.

Hantering och förvaring av GUVs är enkel jämfört med celler, men GUVs är ganska känsliga för osmotisk stress, skjuvkrafter och vidhäftning. Släta, mjuka rörelser är viktiga vid skörd eller överföring GUVs, och det är viktigt att passivera ytor för att förhindra GUVs från att fastna och exploderar. Men för patch clamp experiment kammaren måste sköljas noggrant efter passive så att passivelösningen inte kan belägga patch pipetter och förhindra gigatätning bildning. För passive, är beta-kasein-behandling enkel och effektiv, och jämfört med bovint serumalbumin, som har en lipid transportfunktionen, har mer begränsade interaktioner med lipiddubbelskikt och bör föredras när man arbetar med GUVs 36 beta-kasein. Genom att variera inkubationstiden, är detmöjligt att få GUVs att följa utan att explodera. Dock kommer de GUVs inte hålla sig till täck- så hårt som celler, och därför måste ändå tas under varje förfarande som kan inducera flöde i kammaren (t.ex. buffert perfusion, flytta kammaren).

Patch-clamp inspelning är en klassisk metod för att studera spänningskänsliga jonkanaler som KvAP och detta protokoll kommer från standardtekniker för att erhålla "inside-out" patchar från vidhäftande celler. En standard patch-clamp set-up där plåstret pipetten ned snett (t.ex. 30-60 grader från horisontalplanet) i en liten petriskål bör fungera bra. Däremot kan tydligare bilder av plåstret pipetten och gigatätning region erhållas med hjälp av en kammare i vilken täckglas bildar kammarens topp och botten (~ 1 mm separation) så fläckpipetten kan komma in horisontellt från sidan. Eftersom stora patch pipett tryck inte behövs, kan trycket lämpligen vara com kontrollerade med en spruta och övervakas med någon enkel tryckmätare (t.ex. improviserad vatten manometer). Det kan vara till hjälp för första övnings patch clamp experiment med lipid-endast GUVs odlas med hjälp av en lipid / kloroform-lösning och låg saltbuffert. Eftersom utbytet av defektfria GUVs är mycket hög, kommer det att finnas gott om perfekta GUVs att arbeta med även om många förstörs vid uttagningen och överföring till den experimentella kammaren.

Med lite övning kan utskurna membran patchar med stabila gigatätningar lätt erhållas från DPhPC GUVs och KvAP-DPhPC GUVs. För att uppnå ett bra resultat, hjälper det att noggrant välja rund, men något-fluktuerande, felfria GUVs och kontrollera att plåstret pipetten är ren (söker lipider i fluorescens) innan du försöker att bilda gigatätning. När ett membran "tunga" går in fläckpipetten bildar gigatätning normalt snabbt (<1 sek) utan behov av starkt sug eller specific hållspänning. Medan en dålig tätning kan förbättras som membranet kryper längre in fläckpipetten, ofta tätningen förblir dålig eftersom pipetten interiören var förorenad och det är nödvändigt att börja om med en ny patch pipett och GUV. DPhPC former väldigt stabila membran patchar (tiotals minuter) med en utmärkt tätning beständighet även vid höga spänningar (t.ex. ± 150 mV). SOPC: kolesterol (3: 1 mol) kan också bilda mycket stabila fläckar men kan kräva högre sug att täta, medan Egg-PC patchar verkar lättare sönder.

För längre patch-clamp sessioner kan det vara nödvändigt att justera osmolaritet kammarlösningen. Om osmolaritet är för mycket lägre än GUV tillväxt buffert, GUVs svullnar, spänd och sfärisk och det kanske inte är möjligt att aspirera GUV membranet tillräckligt långt in i plåstret pipetten för att bilda en gigatätning. Detta kan ofta rättas till genom att helt enkelt vänta 10 eller 20 minuter som avdunstning från kammaren ökar external lösning osmolaritet tills GUVs tömma och börja fluktuera. Omvänt, om kammaren lämnas öppen för länge osmolaritet extern lösning kan öka tills GUVs tömma, tubulate och knopp. Detta kan undvikas genom att blockera avdunstning från kammaren (t.ex., med mineralolja) eller periodiskt tillsätta destillerat vatten för att ersätta det vatten som har avdunstat.

Eftersom proteiner kan uteslutas från utskurna membranplåster 31, är antalet aktiva kanaler i en utskuren plåster inte bara relaterad till tätheten av protein i GUV membranet. Fluorescensmätningar antyder koncentrationen av KvAP i plåstret membranet är mycket lägre än den GUV 28 och det kan vara ganska lätt att få lappar innehållande endast ett litet antal kanaler. Men om plåster innehåller alltför många kanaler för enkelkanalsinspelning, de uppenbara stegen med att använda patch pipetter med mindre tips och / eller sänka protein-till-lipid density i SUV mixen är effektiva. I motsats, för att utföra ensemble mätningar på lappar innehållande många kanaler, kan det vara till hjälp att starta med en relativt hög proteindensitet (t.ex. 01:10, protein och lipid i vikt), använd proteinfluorescens att välja GUVs med en hög proteindensitet , använda större patch pipetter (t.ex. 2-3 mikron spetsdiameter) och aspirera snabbt för att försöka bilda förseglingen snabbt. Uppenbarligen skulle "hela-cell" -typ konfiguration (dvs, "hela-GUV ') vara perfekt att karakterisera alla kanaler i en GUV, men tyvärr" hela-GUV "konfiguration innebär flera tekniska frågor 37.

Lösningarna, lipider och proteinkoncentrationer i den här guiden är enbart tillhandahålls som utgångspunkt, och kan ändras för att passa behoven hos en viss experiment efter några överväganden.

Alla lösningar skall innehålla en pH-buffert såsom HEPESeller TRIS att säkerställa proteiner inte utsätts för extrema pH. SUV bufferten bör ha en så låg koncentration av lösta ämnen som proteinet tolererar (t.ex. 5 mM salt eller lägre), som lösta koncentrationen ökar under den partiella dehydratiseringssteget och höga saltkoncentrationer kan denaturera proteinet eller orsaka lipidfilmen att snabbt delaminera under rehydrering steget. Små mängder av sockerarter såsom trehalos (t.ex. 1 mm till 5 mM) tros skydda proteinet under uttorkning 23. Medan trehalos har varit inblandad i anhydrobiosis och tros skydda membran och proteiner mot uttorkning 38, kan sackaros eller glukos fungerar lika bra.

För tillväxtbuffert, är saltkoncentrationen särskilt viktigt eftersom detta kommer att påverka parametrarna för optimal GUV tillväxt (t.ex., electroformation spänning, frekvens och varaktighet). Däremot är den primära begränsningen för observation buffert thatt den bör ha samma osmolaritet som tillväxten bufferten. Införandet av sackaros och / eller glukos i "tillväxtbuffert" och "observationsbuffert" kan vara till hjälp för att säkerställa GUVs sediment till botten av observationskammaren, medan en skillnad i brytningsindex mellan GUV interiör och exteriör hjälper med faskontrast eller DIC mikroskopi. Elektrofysiologer inkluderar ofta kalcium- eller magnesiumjoner till badet och / eller fläckpipetten lösningar för att förbättra gigatätning bildning med cellmembraner, men att dessa inte förefaller vara nödvändig för GUVs. I själva verket kan tvåvärda joner såsom magnesium och kalcium inducera lipid fasseparation och underlätta vidhäftning, så om dessa problem uppstår kan det vara till hjälp att lägga ett mM EDTA.

Uppenbarligen är en viktig attraktion av rekonstituerade system i jämförelse med celler förmågan att kontrollera lipidkomposition. DPhPC GUVs växer bra och bilda stabila utskurna membran patchar, och dessa protokoll har också arbetat eftivt för lipidblandningar innehåller fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylglycerol (PG), fosfatidsyra (PA), fosfatidylserin (PS) och kolesterol. Dock är GUV tillväxten känslig för både lipidkomposition och buffrar 15, och så protokollparametrar (t.ex. mängden lipid deponeras, electroformation spänning / frekvens) kan behöva justeras för lipidblandningar innehåller höga koncentrationer av PE, laddade lipider (PG, PA, PS), eller kolesterol. När du börjar, ägg-PC, DOPC eller DPhPC är ett bra första val, och det är också mycket bra att inkludera en fluorescerande lipid att observera GUV tillväxt och att skilja GUVs från multilamellvesiklar med två eller flera dubbelskikt. Lipidblandningar kan framställas genom att kombinera SUV suspensioner av stamlösningar, eftersom lipiderna blanda under den partiella dehydratiseringssteget (förutsatt att temperaturen är högre än någon enskild fasövergångstemperatur). Använda högre SUV koncentration (t.ex.10 mg / ml) stamlösningar möjliggör en avsevärd flexibilitet, och dessa kan sedan spädas till 3 mg / ml före dehydratisering suspensionen.

Om du försöker att anpassa dessa protokoll till andra transmembranproteiner, är det mycket viktigt att kunna både direkt observera införlivandet av protein i GUVs och provproteinfunktion. Även om inte ett problem med KvAP, finns det alltid en möjlighet att under rehydratisering stega det transmembranproteinet förblir i membranstapeln som leder till bildning av lipid-enbart GUVs. Fluorescerande märkning av proteinet är mycket bekvämt eftersom det ger en snabb och entydigt sätt att observera protein införlivande i GUVs och även kontrollera för aggregering inom GUVs. Det är också mycket viktigt att testa proteinfunktion i GUVs att bekräfta att proteinet inte skadades under rekonstitutionen processen. För jonkanaler som KvAP, kan patch-clamp mätningar fastställa förekomsten av funktionella kanaler iGUVs. Men en fluorescensmärkt, hög affinitet ligand (t.ex. toxin, substrat eller antikroppen) skulle också vara till stor hjälp för att testa tillståndet av proteiner i GUVs.

Sammanfattningsvis här artikeln visar hur man producerar Proteo-GUVs innehåller spänningen gated kalium kanal KvAP och karakterisera dem med fluorescens mikroskopi och elektrofysiologi. Förhoppningsvis kan dessa metoder kan anpassas till nya klasser av membranproteiner och ger en grund för mer komplexa in vitro-system för att studera och bygga upp levande materia från dess grundläggande komponenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids  850356P
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)  Avanti Polar Lipids  840051P
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids  840101P
18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids  850375P
Cholesterol (ovine wool, >98%)  Avanti Polar Lipids  700000P
TRed-DHPE Invirtogen T-1395MP labeled lipid
BPTR-Ceramide Invirtogen D-7540  labeled lipid
Choloroform VWR 22711.290 AnalaR Normapur
Acetone VWR 20066.296 AnalaR Normapur
Ethanol VWR 20821.330 AnalaR Normapur
Kimwipe Kimtech 7552
Hamilton syringes  Hamilton Bonaduz AG diverse
Amber vials and Teflon cups Sigma SU860083 and SU860076
Parafilm VWR 291-1214
Microcentrifuge tube Eppendorf diverse
Agarose Euromex LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
Sucrose Sigma 84097-1kg
Glucose  Sigma G8270-1kg
Trehalose Sigma T9531-25G
KCl Sigma P9333-1kg
Hepes Sigma H3375-100G
TRIS Euromex EU0011-A
Osmometer Wescor Vapro
pH meter Schott instruments Lab850
Sonicator Elmasonic S 180 H
Syringe filter 0.2 µm Sartorius steim Minisart 16532
Function generator TTi TG315
Platinum wires Goodfellow LS413074 99.99+%, d = 0.5 mm
Polytetrafluoroethylene Goodfellow
Dow Corning 'high vacuum grease' VWR 1597418
sealing paste Vitrex medical A/S, Denmark REF 140014 Sigillum Wax
Cover slides 22 x 40 mm No1.5 VWR 631-0136
Cover slides 22 x 22 mm No1.5 VWR  631-0125
Plasma cleaner Harrick PDC-32G airplasma, setting 'high'
Petri dishes Falcon BD REF 353001 3.5 cm x 1 cm
patch clamp amplifier Axon instruments Multiclamp700B
DAQ Card National Instruments PCI-6221
Labview National Instruments version 8.6
Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm Harvard Apparatus GC100-15
Electrode holder Warner Instruments  Q45W-T10P
Micromanipulator Sutter  MP-285
Pipette puller Sutter  P-2000 
Camera ProSilica  GC1380
Zeiss microscope Zeiss Axiovert 135
Objective Zeiss 40X long working distance, Phase contrast
Objective  Zeiss 100X Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (for Alexa-488) Horiba XF100-3
Filterset Cy3 (for TexasRed) Horiba XF101-2
beta-casein Sigma  C6905-1G
Confocal microscope Nikon Eclipse TE 2000-E D-Eclipse C1 confocal head
Objective Nikon Plan Fluor 100X NA 1.3
Matlab Mathworks for image processing and analysis of the current traces

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333, (6047), 1252-1254 (2011).
  2. Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28, (2), 212-218 (2014).
  3. Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, (9), 4141-4146 (2010).
  4. Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, (31), 12605 (2011).
  5. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (14), 5622-5626 (2009).
  6. Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102, (3), 038102 (2009).
  7. Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788, (10), 2291-2300 (2009).
  8. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11, (7), 848-865 (2010).
  9. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, (9), 644-650 (2009).
  10. Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20, (4), 476-482 (2008).
  11. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19, (7), 2870-2879 (2003).
  12. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (12), 4697-4702 (2008).
  13. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73, (1), 49-60 (1969).
  14. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
  15. Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  16. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131, (5), 1810-1819 (2009).
  17. Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104, (6), 1248-1256 (2013).
  18. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35, (3), 637-652 (1981).
  19. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70, (3), 1112-1121 (1996).
  20. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105, (1), 154-164 (2013).
  21. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (18), 7276-7281 (2013).
  22. Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81, (3), 1464-1474 (2001).
  23. Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88, (2), 1134-1142 (2005).
  24. Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94, (8), 088102 (2005).
  25. Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102, (3), 523-531 (2012).
  26. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, (6928), 180-185 (2003).
  27. Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423, (6935), 33-41 (2003).
  28. Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6, (10), e25529 (2011).
  29. Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
  30. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818, (11), 2598-2604 (2012).
  31. Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97, (3), 738-747 (2009).
  32. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. Sinauer Associates, Inc. (2001).
  33. Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98, (5), 762-772 (2010).
  34. Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (49), 19276-19281 (2008).
  35. Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (2014).
  36. Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11, (1), 1-15 (2010).
  37. Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104, (2), 466a (2013).
  38. Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71, (4), 2087-2093 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics