प्रतिदीप्ति डीएनए के लिए सरल तरीका
1Department of Biology, University of Rochester, 2W. M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer, and Scripps Colleges

Published 1/06/2015
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Biology

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Larracuente, A. M., Ferree, P. M. Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes. J. Vis. Exp. (95), e52288, doi:10.3791/52288 (2015).

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Abstract

सीटू संकरण (डीएनए ISH) में डीएनए विशिष्ट गुणसूत्र क्षेत्रों के लिए मानचित्रण दृश्यों के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि है। यह दृष्टिकोण कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण निषेधात्मक चुनौतियों का सामना करना पड़ता है, जहां heterochromatic क्षेत्रों को मानचित्रण अत्यधिक दोहराए दृश्यों में विशेष रूप से प्रभावी है। यहाँ हम अन्य डीएनए ISH प्रोटोकॉल में मानक कदम उठाए हैं कि formamide washes के circumvents कि डीएनए ISH के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन है। हमारी प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से विभिन्न कीट प्रकार के ऊतकों की एक संख्या भर heterochromatic गुणसूत्र क्षेत्रों के भीतर दोहराए डीएनए दृश्यों के निशान जो फ्लोरोसेंट रंजक, ले जाने के लिए है कि कम भी कतरा डीएनए जांच के साथ संकरण के लिए अनुकूलित है। हालांकि, अनुप्रयोगों बड़ा जांच और भी कॉपी (गैर दोहराए) डीएनए दृश्यों के दृश्य के साथ उपयोग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। हम तंत्रिका कोशिकाओं और Nasonia मेलानोगास्टर ड्रोसोफिला से कुचल गुणसूत्रों के लिए कई अलग अलग दोहराए दृश्यों मानचित्रण द्वारा इस विधि का प्रदर्शनvitripennis spermatocytes। हम दोनों छोटे, व्यावसायिक रूप से संश्लेषित जांच के लिए और तुलना के लिए एक बड़ा जांच के लिए संकरण पैटर्न दिखा। यह प्रक्रिया सरल प्रयोगशाला की आपूर्ति और अभिकर्मकों का उपयोग करता है, और डीएनए ISH के प्रदर्शन के साथ कम अनुभव है जो जांचकर्ताओं के लिए आदर्श है।

Introduction

सीटू संकरण (डीएनए ISH) में डीएनए विशिष्ट गुणसूत्र क्षेत्रों के लिए मानचित्रण दृश्यों के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि है। Euchromatin भीतर भी कॉपी क्षेत्रों के लिए जांच की एक विस्तृत विविधता के माध्यम से निक-अनुवाद या लंबी डीएनए उत्पादों 1,2 के अंत लेबलिंग और deoxygenin (डीआईजी) का समावेश सहित दृष्टिकोण, -attached न्यूक्लियोटाइड और उनकी मान्यता के एक मुट्ठी के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है समूह संयुग्मित एंटीबॉडी 1-3। कुछ या एकल प्रतिलिपि संख्या में euchromatic दृश्यों के दृश्य उच्च विशिष्ट गतिविधि या सामूहिक रूप से संकेत बढ़ाने कि कई छोटे, जांच की एक कॉकटेल के साथ ही, बड़ी जांच या तो के उपयोग की आवश्यकता है।

वे सामान्य रूप से दसियों ब्लॉक के रूप में जाना जाता है एक गुणसूत्र क्षेत्रों में क्लस्टर दोहराता के हजारों करने के रूप में मौजूद हैं, क्योंकि इसके विपरीत, ऐसे उपग्रह DNAs रूप heterochromatin में पाया अत्यधिक दोहराए दृश्यों, डीएनए ISH के लिए आसान लक्ष्य कर रहे हैं। Transposable तत्वों को भी हो सकता हैअलग गुणसूत्र loci 2 पर उच्च प्रतिलिपि संख्या में पाया। इन मामलों में, कम विशिष्ट गतिविधि के साथ ही जांच को प्रभावी ढंग से की वजह से कई साइटों पर उनके संकरण करने heterochromatic दृश्यों लेबल कर सकते हैं। दोहराए दृश्यों के लिए जांच व्यावसायिक रूप के रूप में कम oligonucleotides (30-50 बीपी) संश्लेषित और रासायनिक कई अलग फ्लोरोसेंट समूहों में से किसी के साथ संयुग्मित किया जा सकता है। जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके heterochromatin भीतर दोहराए दृश्यों का मिलान होने के कारण अत्यधिक दोहराए उपग्रह ब्लॉक 4-6,7 भीतर इमारत scaffolds में सामना करना पड़ा चुनौतियों के लिए मुश्किल है। वर्तमान में, ISH के उप-गुणसूत्र के स्तर पर इन दृश्यों मानचित्रण का सबसे प्रभावी तरीके के रूप में खड़ा है। इस रणनीति चल रही जीनोम और transcriptome अनुक्रमण पढ़ाई का पर्दाफाश किया जा रहा है कि दोहराए दृश्यों की बड़ी संख्या मानचित्रण के लिए महत्वपूर्ण है।

स्लाइड पर चढ़कर गुणसूत्रों पर मानचित्रण दोहराए दृश्यों की दक्षता और आसानी जीआरई की जाएगीatly डीएनए ISH के लिए एक सरल प्रोटोकॉल के द्वारा बढ़ाया। उदाहरण के लिए, डीएनए ISH के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल इस प्रकार मानचित्रण दृश्यों के लिए आवश्यक समय के लिए काफी हद तक जोड़ने और भी महंगा इस अभिकर्मक के लिए रासायनिक कचरे के बड़ी मात्रा में उत्पादन होता है, formamide समाधान 2,8 में संकरित ऊतकों के कई washes के शामिल है। यहाँ हम formamide washes के लिए की जरूरत में गतिरोध उत्पन्न करने और बुनियादी प्रयोगशाला के उपकरण और अभिकर्मकों इस्तेमाल करता है कि एक संशोधित डीएनए ISH विधि का वर्णन। इस विधि के मूल प्रतिदीप्ति रंगों के साथ संयुग्मित कर रहे हैं कि व्यावसायिक रूप से संश्लेषित oligos का उपयोग करके ड्रोसोफिला लार्वा neuroblasts के heterochromatic क्षेत्रों में अत्यधिक दोहराए डीएनए दृश्यों का तेजी से मानचित्रण के लिए डिजाइन किया गया था। हालांकि, इस विधि को भी अन्य साधन 9,10 के माध्यम से और कई अलग ऊतक और गुणसूत्र प्रकार भर में संश्लेषित बड़ा जांच का उपयोग करके दोहराए दृश्यों मानचित्रण के लिए काम करता है। साथ ही, इस विधि लंबे समय तक या multip का उपयोग करके euchromatic दृश्यों नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैLe, ब्याज की euchromatic अनुक्रम में कम जांच।

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Protocol

1. ऊतक विच्छेदन और फिक्सेशन (60 मिनट)

  1. ड्रोसोफिला दिमाग के लिए, 1x पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) की एक बूंद में 3 आरडी instar लार्वा जगह है। सक्रिय रूप से भीड़ नहीं कर रहे हैं कि शीशियों या बोतलों से रेंग रहे हैं कि बड़े 3 आरडी instar लार्वा चुनें।
    1. मुंह हुक की पकड़ और शरीर (चित्रा 1 ए, बी) की लंबाई नीचे 2/3 हड़पने के लिए एक और चिमटी से नोचना जोड़ी को हड़पने के लिए एक ultrafine चिमटी से नोचना जोड़ी का प्रयोग करें। लार्वा पाचन तंत्र के मस्तिष्क, उदर गैन्ग्लिया, लार ग्रंथियों और भाग बेनकाब करने के लिए मुंह हुक पर धीरे से खींच। मस्तिष्क और उदर गैन्ग्लिया अलग करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें (चित्रा 1 ए, बी) एक प्लास्टिक पेट्री प्लेट पर 1x पीबीटी (बीच के साथ फॉस्फेट बफर खारा) की एक छोटी बूंद में अन्य ऊतकों और जगह से।
  2. Nasonia वृषण dissections के लिए, पुरुष तीन दिन पुरानी pupae (लाल आंखों के साथ पीले निकायों) का चयन करें। नर Nasonia एफ के सापेक्ष छोटे पंख पैड लंबाई हैपोटा संबंधी चरण (चित्रा 1C) के दौरान emales।
    1. एक चिमटी से नोचना जोड़ी है, और अन्य चिमटी से नोचना जोड़ी का उपयोग के साथ वक्ष क्षेत्र के पास पेट के शीर्ष पर प्यूपा पकड़ो, पेट के बहुत बाहर का टिप हड़पने के लिए और आंसू-बूंद के आकार का वृषण बाहर खींच (वे वसा से घिरा हो जाएगा धीरे दूर हिल जा सकता है कि शरीर, चित्रा -1)। एक प्लास्टिक पेट्री प्लेट पर 1x पीबीटी की एक छोटी बूंद में उचित squashing, और जगह नहीं कर पाएगा जो वृषण, से किसी भी बाहरी शरीर के अंगों को अलग करें।
  3. प्रत्येक स्लाइड के लिए, चार या पांच ऊतकों के नमूनों (यानी।, ड्रोसोफिला लार्वा दिमाग या Nasonia वृषण) की कुल काटना।
    नोट: अधिक से अधिक पांच नमूने भीड़ नाभिक और गुणसूत्रों को बढ़ावा मिलेगा।
  4. वैकल्पिक रूप से, mitotic गुणसूत्रों के euchromatic क्षेत्रों में बहन क्रोमेटिडों के कुछ जुदाई को प्राप्त एक hypotonic समाधान के साथ ऊतक के इलाज के लिए: (5-10 के लिए 0.5% सोडियम साइट्रेट की एक बूंद के लिए 1x पीबीटी से दिमाग का स्थानांतरणकोई 10 से अधिक) मिनट।
    नोट: Colchicine (एक mitotic अवरोध) मेटाफ़ेज़ 11 पर mitotic आंकड़े की संख्या बढ़ाने के लिए सहायक हो सकता है। यह नकारात्मक गुणसूत्र संकल्प को प्रभावित कर सकते क्योंकि बहुत बड़े स्वस्थ लार्वा प्रसार और आकृति विज्ञान, उपयोग, और यहां तक ​​कि अवांछनीय हैं हालांकि, अगर इसके प्रयोग अनावश्यक है।
  5. एक साफ Sigmacote इलाज कवर पर्ची की सतह पर लगानेवाला समाधान (45% एसिटिक एसिड में 2.5% paraformaldehyde के) की एक छोटी बूंद (~ 20 μl) रखें।
    नोट: उपयोग की प्रत्येक दिन के लिए लगानेवाला समाधान ताजा बनाओ। 45% एसिटिक एसिड में 1.8-3.7% paraformaldehyde से लेकर लगानेवाला समाधान मछली के लिए सबसे अच्छा परिणाम निकलेगा। इम्युनो-मछली के लिए इस प्रोटोकॉल दिमाग या वृषण के अलावा अन्य ऊतकों का उपयोग करना, या आदत डाल अलग fixatives के साथ प्रयोग करने की आवश्यकता हो सकती (विभिन्न fixatives की सूची के लिए, 12 देखें)।
  6. ध्यान से ultrafine चिमटी, minimi साथ लगानेवाला छोटी बूंद में विदारक बफर (1x पीबीटी) से प्रत्येक ऊतक का नमूना हस्तांतरणलगानेवाला समाधान में बफर विदारक के हस्तांतरण zing। वे समान रूप से लगानेवाला छोटी बूंद के भीतर एक दूसरे से स्थान दिया गया है, ताकि ऊतकों के नमूनों स्थिति। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए लगानेवाला में ऊतकों को सेते हैं।
  7. ध्यान से नीचे ऊतक और कवर पर्ची पर एक पाली lysine लेपित स्लाइड चेहरे जगह है। इस बिंदु पर नीचे प्रेस लेकिन इसके बजाय कवर पर्ची स्लाइड के नीचे पर चिपक जाता है, ताकि दो हल्के से संपर्क करने के लिए अनुमति न दें। कवर पर्ची शीर्ष पर इतना है कि स्लाइड पलटना।
  8. फिल्टर पेपर के एक मुड़ा हुआ टुकड़ा अंदर स्लाइड / ऊतक / कवर पर्ची सैंडविच। एक स्थिर सतह पर, बहुत मजबूती से सीधे नीचे सीधे कवर पर्ची से ऊपर की स्थिति पर अंगूठे, प्रेस का उपयोग। (इस ऊतक के smearing कारण होगा) कवर पर्ची की रपट पार्श्व से बचने के लिए सावधान रहें।
  9. तरल नाइट्रोजन में स्लाइड / ऊतक / कवर पर्ची डूब (चित्रा 1E, एफ में तंत्र देखें), और नाइट्रोजन उबलते बंद हो जाता है जब तक दो स्टैंड (अब चINE)। स्लाइड निकालें और तुरंत (धार के साथ तय ऊतक scratching से बचने के) एक उर्ध्व दिशा में कवर पर्ची के एक कोने flicking द्वारा एक ताजा धार के साथ कवर पर्ची बंद तस्वीर।
    1. सूखी बर्फ का एक ब्लॉक पर स्लाइड / ऊतक / कवर पर्ची प्री-ठंडा, कवर पूर्व खुर से स्लाइड रोकने में मदद मिलेगी तरल नाइट्रोजन में जलमग्न करने के लिए 1-2 मिनट के लिए, ऊपर पर्ची।
  10. तुरंत कमरे के तापमान पर 100% इथेनॉल के साथ भरा एक coplin जार में ऊतक के साथ स्लाइड जगह और (यदि आवश्यक हो तो इस बार लंबे समय तक किया जा सकता है) कम से कम 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
    नोट: शीत 100% इथेनॉल का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  11. , ऊतक के साथ स्लाइड निकालें (फिक्स्ड ऊतक को छूने के बिना) एक Kimwipe के साथ अतिरिक्त इथेनॉल दूर बाती, और 1 घंटे के लिए शुष्क हवा की स्लाइड छोड़ दें।
    1. दो कदम या हफ्तों के लिए संकरण प्रदर्शन से पहले भी महीनों के लिए कम नमी हवा में या एक सुखाना कक्ष में सूखी स्लाइड्स रखने के लिए सीधे आगे बढ़ें।


चित्रा 1: (ए) एक 3 Rd instar ड्रोसोफिला लार्वा (दाएं), मुँह हुक हड़पने के लिए जहां के लिए संकेत दिया पदों के साथ (के साथ चिह्नित *) और दिमाग काटना लार्वा नीचे रास्ते से 2/3; (बाएं) लार्वा सिर के अंदर मस्तिष्क के रिश्तेदार की स्थिति का चित्रण एक ही विकास मंच एक एक लार्वा का एक योजनाबद्ध। (बी) के मस्तिष्क और एक 3 Rd instar ड्रोसोफिला लार्वा (दाएं) और इस का एक योजनाबद्ध से विच्छेदित उदर गैन्ग्लिया ऊतक (बाएं)। पीले शरीर लाल आँख के स्तर पर (सी) तीन दिन पुरानी Nasonia प्यूपा। (डी) जहां प्यूपा हड़पने के लिए यह दर्शाता पदों के साथ (दाएं) एक तीन दिन पुराने Nasonia पुरुष प्यूपा से विच्छेदित एक वृषण जोड़ी पेट के पीछे में (* के साथ चिह्नित) और शरीर पर रास्ते के मध्य में; (बाएं) योजनाबद्ध चित्रण पुरुष और महिला थीपी pupae; पुरुष pupae प्रोफाइल अतीत का विस्तार है कि पंख है जो महिलाओं के विपरीत, saggital प्रोफ़ाइल (काला तीर) अतीत का विस्तार नहीं है कि पंखों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है; वृषण जोड़ी के रिश्तेदार की स्थिति पुरुष प्यूपा में दिखाया गया है। तरल नाइट्रोजन का एक पोत में स्लाइड को विसर्जित करने के लिए इस्तेमाल पेपर क्लिप और (एफ) विधि (ई) तंत्र-एक स्ट्रिंग। एकाधिक क्लिप तार एकाधिक स्लाइड्स के एक साथ विसर्जन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

बगल में संकरण में 2. (1 दिन पर 30 मिनट, लंबे समय के लिए एक घंटा-2.5 घंटा जांच-पर दिन 2)

  1. 1.1x संकरण बफर के 20 μl के लिए हर जांच के 1 μl (100 एनजी) जोड़ें। Pipet जांच / तय ऊतक की सतह पर संकरण बफर (ऊतक छूने से बचने)।
  2. ध्यान से कवर पर्ची ऊतक पर सीधे केंद्रित है, यकीन है कि जांच / संकरण बफर पर सीधे एक कवर पर्ची जगह है। बफर वें की ओर पलायन करना चाहिएकोई हवाई बुलबुले छोड़ रहा है, कवर पर्ची के बाहरी छोर ई।
    नोट: प्रक्रिया के लिए किसी भी समस्या पैदा नहीं करते ऊतक संपर्क नहीं है कि छोटे बुलबुले। ध्यान से स्लाइड पर इसे वापस छोड़ने ध्यान से कवर पर्ची के एक कोने उठाने और बड़े बुलबुले निकालें।
  3. एक ब्लॉक (कवर पर्ची) 95 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म की सतह पर स्लाइड / ऊतक / कवर पर्ची रखें। प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी का एक बड़ा टुकड़ा के साथ कवर। स्लाइड 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते करते हैं।
    नोट: ट्यूबों के लिए छेद के साथ एक ठेठ गर्मी ब्लॉक स्लाइड / ऊतक / कवर पर्ची जगह है जिस पर एक फ्लैट सतह प्रदान करने के लिए अधिक रूप से फ़्लिप किया जा सकता है।
  4. यह छूने के लिए गर्म है, जब तक यह थोड़ा ठंडा है, दे स्लाइड निकालें। इसे ध्यान से नीचे तरल सील करने के लिए कवर पर्ची के चारों ओर फैला parafilm का एक टुकड़ा लपेटो।
  5. एक आर्द्रता कक्ष के अंदर सील स्लाइड प्लेस और 30 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते हैं एक इनक्यूबेटर में चैम्बर जगह है। 4 घंटा रातोंरात करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    1. नीचे रखा घटा Kimwipes या कागज तौलिये के साथ एक एक खाली टिप बॉक्स से नमी कक्ष या lidded Tupperware कंटेनर बनाएँ।
      नोट: एकल असहाय डीएनए oligo जांच 45-47 डिग्री सेल्सियस के एक सैद्धांतिक पिघलने के तापमान (टी एम) प्राप्त करने के लिए 28-33 कुर्सियां ​​होने के लिए डिजाइन किया गया है। ये लंबाई और टी एम पर्वतमाला हम अध्ययन किया है कि कई दोहराए दृश्यों एटी-अमीर हैं और इसलिए बहुत कम जीसी सामग्री तथ्य यह है कि दर्शाते हैं। अब जांच होने की संभावना अधिक है टी एम मूल्यों होगा; इस 30 डिग्री सेल्सियस के मानक संकरण तापमान पर उच्च पृष्ठभूमि संकरण में हो सकता है। इस प्रकार, संकरण तापमान के साथ कुछ समस्या निवारण का सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है। संवर्द्धित, सबसे अच्छा संकरण तापमान, वृद्धि (या कमी) 5 डिग्री सेल्सियस से तापमान को खोजने के लिए।
  6. ध्यान से स्लाइड से Parafilm के हटाने और फिर ध्यान से धीरे-धीरे एक कोने उठाने के द्वारा कवर पर्ची हटा दें। वा15 मिनट 0.1x एसएससी बफर में प्रत्येक धोने के लिए तीन बार स्लाइड श। प्रकाश जोखिम को कम करने के washes के दौरान एल्यूमीनियम पन्नी के साथ coplin जार कवर।
  7. एक लंबे biotinylated जांच का उपयोग नहीं करते हैं, तो 2.8 कदम आगे बढ़ना।
    1. एक लंबे biotinylated जांच का उपयोग करते हैं, तो ऊतक ही छू नहीं सावधान किया जा रहा है, एक Kimwipe के साथ ऊतक के आसपास के क्षेत्र सूखी। ऊतक पर अवरुद्ध समाधान के 100 μl प्लेस और फँसाने बुलबुले से बचने के ख्याल रख रही है, एक coverslip के साथ धीरे को कवर किया। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Parafilm के साथ coverslip और जगह पर स्लाइड लपेटें।
    2. ध्यान coverslip के हटाने और एक Kimwipe के साथ ऊतक के आसपास दाग। Pipet rhodamine-avidin एक पतला के 100 μl: ऊतक पर एसबीटी में 1000 और धीरे से एक coverslip के साथ कवर, देखभाल बुलबुले फँसाने से बचने के लिए। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Parafilm के साथ coverslip और जगह पर स्लाइड लपेटें।
    3. ध्यान coverslip के हटाने और फिर 4x SSCT और में 5 मिनट के लिए स्लाइड प्रत्येक तीन बार धोने0.1x एसएससी में 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार।
      नोट: स्लाइड्स समय की लंबी अवधि के लिए धोया जा सकता है।
  8. स्लाइड निकालें और (ऊतक छूने से बचें) अतिरिक्त बफर दूर करने के लिए एक सूखी Kimwipe के साथ ऊतक के आसपास दाग। 10-15 मिनट के लिए या नमी पूरी तरह से dissipates जब तक एक अंधेरी जगह में स्लाइड ऊतक तरफ ऊपर रखें।
  9. Vectashield बढ़ते मध्यम की pipet 11 μl ('के साथ 4, 6-diamidino-2-phenylindole-DAPI) ऊतक पर। ध्यान से सीधे बढ़ते मध्यम और ऊतक के केंद्र से अधिक नहीं है (Sigmacote के साथ इलाज) एक साफ कवर पर्ची जगह है। बढ़ते मध्यम कवर पर्ची के किनारों की ओर जावक धीरे धीरे विस्थापित होना चाहिए।
    नोट: बढ़ते मध्यम सभी पक्षों पर कवर पर्ची के किनारे तक पहुंचने में विफल रहता है, तो बढ़ते मध्यम के एक अतिरिक्त 1-2 μl जरूरत मात्रा में भरने के लिए कवर पर्ची के किनारे पर एक स्थिति के लिए लागू किया जा सकता है। इस मामले में, पहले स्लाइड सतह से किसी भी अतिरिक्त मध्यम पोंछ के लिए सुनिश्चित होसील।
  10. नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची के किनारों को सील। ऊतक के नमूने से अधिक नेल पॉलिश चित्रकला से बचें।
  11. एक अंधेरी जगह में ईमानदार स्लाइड प्लेस और पूरी तरह हार्ड (आमतौर पर 30 मिनट या अधिक) तक नेल पॉलिश सूखी हैं। इस बिंदु पर, छवि बाद में इमेजिंग के लिए साइन अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक या दुकान।

बफर / समाधान व्यंजनों

10x पीबीएस

  • 80 ग्राम सोडियम क्लोराइड
  • 2.0 जी KCl
  • 14.4 जी ना 2 HPO 4
  • 2.4 जी के.एच. 2 पीओ 4
  • 7.4 पीएच, एच 2 ओ के लिए एक एल

1x पीबीटी

  • 5 मिलीलीटर 10x पीबीएस
  • 45 मिलीलीटर एच 2
  • 0.1% बीच 20

20x एसएससी

  • 175.3 छ NaCl
  • 88.2 जी ना साइट्रेट
  • 800 मिलीलीटर एच 2 ओ में
  • सात पीएच, एच 2 ओ के लिए एक एल

4x SSCT

  • 200 मिलीलीटर 20x एसएससी
  • 799 मिलीलीटर एच 2
  • 0.1% बीच 20

0.1x एसएससी

  • 5 मिलीलीटर 20x एसएससी
  • 995 मिलीलीटर एच 2

संकरण मिश्रण (20 μl, 11 से संशोधित)

  • 10 μl formamide
  • 4 μl 50% dextran सल्फेट
  • 2 μl 20x एसएससी
  • 4 μl एच 2

एसबीटी 8 (10 एमएल)

  • 2 मिलीलीटर 20x एसएससी
  • 0.01 छ गोजातीय सीरम albumin (बीएसए)
  • 10 μl बीच 20
  • 7.9 मिलीलीटर एच 2

अवरुद्ध समाधान 8 (10 एमएल)

  • 0.3 जी बीएसए
  • 10 μl बीच 20
  • 2 मिलीलीटर 20x एसएससी
  • 8 मिलीलीटर एच 2

Paraformaldehyde के साथ लगानेवाला समाधान (1 मिलीलीटर)

  • 2 हे (पहले पानी जोड़ने) 393.75 μl एच
  • 450 μl हिमनदों एसिटिक एसिड
  • 156.25 μl 16% paraformaldehyde

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Representative Results

कई अलग अलग ऊतकों से गुणसूत्रों के लिए, (चित्रा 2B एक पीसीआर उत्पाद के निक अनुवाद के माध्यम से बनाया) इस विधि का प्रदर्शन करने के लिए, हम रासायनिक फ्लोरोसेंट conjugates (चित्रा 2) और एक लंबे समय तक biotinylated जांच के साथ संशोधित किया गया है कि छोटे व्यावसायिक रूप से संश्लेषित oligos का एक सेट संकरित प्रकार (1 टेबल देखें)। लक्ष्य दृश्यों डी से mitotic गुणसूत्रों के pericentromeric (heterochromatic) क्षेत्रों में स्थित उपग्रह दोहराता शामिल पोटा संबंधी एन से लार्वा neuroblasts (2A चित्रा-सी), और meiotic गुणसूत्रों मेलानोगास्टर vitripennis वृषण (चित्रा 2 डी)। इन मामलों में से प्रत्येक में hybridizations उप गुणसूत्र क्षेत्रों में असतत बैंडिंग पैटर्न का पता चला। उल्लेख के लायक एक बात यह है कि डी के लिए जांच मेलानोगास्टर 359 बीपी उपग्रह दोहराने एक्स पर एक बड़ी बहु megabase जोड़ी ब्लॉक, और गुणसूत्र 3 पर एक बहुत छोटे क्षेत्र दोनों को पहचानता(2A चित्रा)। प्रत्युत्तर उपग्रह के खिलाफ एक लंबे समय तक जांच भी अपेक्षाकृत कम दोहराने प्रतिलिपि संख्या (; चित्रा 2B ~ 700 प्रतियां) से मिलकर दोहराने ब्लॉकों का पता लगाता है। इस प्रकार, यह विधि बहुत छोटा उपग्रह ब्लॉक के दृश्य की अनुमति देता है। गुणसूत्र संरचना और गुणसूत्र पहचान में सहायता को प्रकट करने में मदद करने के लिए, यह (1.5 कदम में वर्णित) एक hypotonic समाधान के साथ गुणसूत्रों के इलाज के लिए उपयोगी हो सकता है। आंकड़ा पैनलों 2 बी और -2 सी में ऊतकों में क्रमश: 5 और 10 मिनट के लिए एक hypotonic समाधान के साथ इलाज किया गया। बहन क्रोमेटिडों की जुदाई अब उपचार (चित्रा -2) के साथ अधिक से अधिक है पर ध्यान दें।

चित्रा 2
चित्रा 2: करने के लिए सीटू संकरण में डीएनए (ए) डी से लार्वा Neuroblast गुणसूत्रों मेलानोगास्टर /डी simulans संकर; डी से (बी) और (सी) लार्वा Neuroblast गुणसूत्रों (डी) गहना ततैया Nasonia vitripennis की पोटा संबंधी वृषण ऊतक से meiotic गुणसूत्रों; मेलानोगास्टर hypotonic समाधान (विच्छेदन और फिक्सेशन चरण 1 देखें) के साथ इलाज किया। (ए) में, हरे तीर डी पर AATAT उपग्रह के छोटे क्षेत्रों से संकेत मिलता है हरे रंग की नोक अंक डी पर AATAT जबकि गुणसूत्र वें simulans 4, मेलानोगास्टर एक्स गुणसूत्र। लाल तीर डी पर 359 बीपी उपग्रह के एक छोटे से क्षेत्र पर प्रकाश डाला गया लाल Arrowhead एक्स पर 359 बीपी दृश्यों के निशान जबकि मेलानोगास्टर 3 आरडी गुणसूत्र, (ए) के सभी उपग्रहों कम, fluorescently लेबल oligos के साथ संकरित किया गया। उपग्रह प्रत्युत्तर 120 बीपी (एक biotinylated जांच (बी) में, हरी झंडी AAGAG उपग्रह (संश्लेषित oligo) और रेड सिग्नल से मेल खाती है, के रूप में चिह्नितलाल तीर के साथ)। (सी) एक छोटी fluorescently लेबल oligo (लाल तीर) के साथ एक ही प्रत्युत्तर उपग्रह। (डी) में, लाल तीर एन के प्राकृतिक आबादी में पाया जाने वाला एक गैर जरूरी, अधिसंख्य बी गुणसूत्र है जो विशिष्ट रूप से पैतृक लिंग अनुपात (PSR) गुणसूत्र पर स्थित है जो एक उपग्रह, निशान हरी तीर सामान्य गुणसूत्रों में से एक पर एक उपग्रह को इंगित करता है, जबकि 13 vitripennis; इस संकरण कम, fluorescently लेबल oligos का उपयोग करके किया गया था। सभी जांच पैनल में में 1 टेबल। स्केल बार विस्तृत रहे हैं (ए) 10 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जांच नाम जांच के प्रकार Oligos
AAGAG उपग्रह Oligo (AAGAG) 7 5 '6-परिवार (Fluorescein)
AATAT उपग्रह Oligo (AATAT) 6 5'-Cy3
359-बी पी उपग्रह Oligo TTT टीसीसी एएए TTT सीजीजी टीसीए टीसीए AAT AAT कैट 5'-Alexa555
PSR उपग्रह Oligo टीजीटी एएसी TGG एएए AGG एएए ATG बुनना बुनना टीजीए 5'-Alexa555
Nasonia autosome उपग्रह Oligo AAT TTT GTG AAT TTT GGT जीटीसी टीसीसी एटीसी 5'-Alexa633
प्रत्युत्तर पीसीआर एफ -5 'GGA एएए टीसीए सीसीसी एटीटी टीटीजी एटीसी जीसी बायोटिन-14-dATP
आर-5 'CCG AAT टीसीए AGT एसीसी आगा सी

तालिका 1: चित्रा 2 में इस्तेमाल किया प्रकार जांच।

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Discussion

डीएनए ISH अक्सर गुणसूत्रों के लिए विशिष्ट दृश्यों नक्शा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम उच्च प्रतिलिपि संख्या, heterochromatic दृश्यों के लिए अनुकूलित डीएनए ISH के लिए एक सरल विधि का वर्णन किया है। बल्कि अन्य मौजूदा डीएनए ISH प्रोटोकॉल में एक आवश्यकता है जो एक formamide समाधान में washes के उपयोग की तुलना में, हम डीएनए denature के लिए सीधे एक पूर्व गर्म ब्लॉक पर ऊतक घुड़सवार स्लाइड जगह है। इस विधि formamide की बड़ी मात्रा का उपयोग circumvents। कुरकुरा संकरण संकेतों के उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम ताजा बना निर्धारण समाधान का उपयोग करने के लिए है; विफलता ऐसा करने के लिए (या अधिक से अधिक एक महीने के लिए खुला कर दिया गया है कि paraformaldehyde के साथ नए समाधान बनाने) संकेत संकल्प कम हो सकती है। इस पद्धति का एक सीमा अन्य डीएनए ISH के प्रोटोकॉल के लिए की तरह, संकरण तापमान बंद लक्ष्य दृश्यों के लिए नकली संकरण को खत्म करने के क्रम में अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, कि है।

इस प्रोटोकॉल एक एकल fluorop साथ संयुग्मित के प्रति संवेदनशील कम, ssDNA जांच है(; चित्रा -2 जैसे, ~ 700 आरएसपी दोहराता) अणु प्रति होर भी अपेक्षाकृत कम दोहराने की नकल की संख्या के साथ दोहराता के ब्लॉक पता लगा सकते हैं। कम दोहराता के साथ उपग्रह ब्लॉक करने के संकेतों को एक बेहद संवेदनशील डिजिटल कैमरे का उपयोग करके कम ssDNA जांच के साथ देखे जा सकते हैं। यहाँ नहीं दिखाया गया है, इस विधि को भी euchromatin 10 में गैर दोहराए दृश्यों मानचित्रण के लिए प्रभावी है। लंबे, biotinylated जांच का प्रयोग संकेत आसानी से दोहराया उपचार से परिलक्षित किया जा सकता है के रूप में कम प्रतिलिपि संख्या दृश्यों का पता लगाने में अधिक लचीलापन प्रदान करता है biotinylated विरोधी avidin और rhodamine-avidin 9। एकल प्रतिलिपि दृश्यों की कल्पना करने के लिए, अनुक्रम में फैले कई जांच आवश्यक हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, ब्याज के अनुक्रम युक्त जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (BACS) गैर दोहराए दृश्यों 10 के लिए एक जांच के रूप में उपयोग के लिए निक अनुवाद या यादृच्छिक भड़काना के माध्यम से लेबल किया जा सकता है। एक ठीक पैमाने पर दृश्यों को मैप करने के लिए, जांच एडवेंचर्स को लक्षितटी दोहराता (विभिन्न fluorophores के साथ प्रत्येक) अन्य दोहराता है और गुणसूत्रों पर संरचनात्मक स्थलों के सापेक्ष लक्ष्य दृश्यों की स्थिति प्राप्त करने के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। हम यहाँ दो जांच (2A चित्रा, बी, डी) का उपयोग करते हैं, जांच की संख्या आसानी से उपलब्ध विभिन्न खुर्दबीन प्रतिदीप्ति फिल्टर की संख्या पर निर्भर करता है, तीन 10 या अधिक करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल अन्य करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ऊतकों-हम प्रोटोकॉल लार ग्रंथियों से polytene गुणसूत्र स्क्वैश पर अच्छी तरह से काम करता है कि सत्यापित किया है। इस विधि क्रोमेटिन प्रोटीन की इम्युनो-धुंधला के साथ मिलकर किया है कि यह कल्पना है; हालांकि यह डीएनए ISH के दौरान एंटीबॉडी नुकसान को रोकने के क्रम में डीएनए ISH से पहले paraformaldehyde के साथ फिर से निर्धारण से इम्युनो-धुंधला पहले कदम के रूप में प्रदर्शन किया और पीछा किया जा सिफारिश की है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) Sigma Aldrich
Ultrafine tweezers (5 gauge) Dumont
22 x 22 mm cover slips Fisher Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear
Sigmacote Sigma
Filter paper 75 - 150 mm
Paraffin wax paper
Heat block with thermometer
Dry incubator
Razor blades
Humidity chamber empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes
Coplin jars with slide grooves
Aluminum foil
Pasteur pipettes
1.5 ml microfuge tubes
Nail polish clear or colored
P20 micropipette and plastic tips
Paperclips 20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain
Reagents
16% EM grade paraformaldehyde Electron Microscopy Reagents
Acetic acid Sigma
Liquid nitrogen
100% Ethanol, chemical grade
Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos
Long biotinylated probe Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 e.g., nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen
Rhodamine-Avidin Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 for detection of long biotinylated probe
Hybridization buffer Recipe above
4x SSCT Recipe above saline-sodium citrate + Tween
0.1x SSC Recipe above saline-sodium citrate
Blocking solution Recipe above
SBT Recipe above SSC, bovine serum albumin, Tween
1x PBT Recipe above phosphate-buffered saline + Tween
1x PBS phosphate-buffered saline
Hypotonic solution 0.5% sodium citrate in H2O
Formamide Sigma Aldrich
Vectashield mounting medium with DAPI Vector laboratories

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References

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