Enkel metode for fluorescens DNA
1Department of Biology, University of Rochester, 2W. M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer, and Scripps Colleges

Published 1/06/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Larracuente, A. M., Ferree, P. M. Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes. J. Vis. Exp. (95), e52288, doi:10.3791/52288 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA in situ hybridisering (DNA ISH) er en mye brukt metode for kartlegging sekvenser til spesifikke kromosomregioner. Denne tilnærmingen er spesielt effektiv på kartlegging svært repetitive sekvenser til heterochromatic regioner, hvor beregnings tilnærminger står overfor uoverkommelige utfordringer. Her beskriver vi en strømlinjeformet protokoll for DNA ISH som omgår formamid vasker som er standardmåten i andre DNA ISH protokoller. Vår protokoll er optimalisert for hybridisering med korte enkeltkjedet DNA-prober som bærer fluorescerende fargestoffer, som effektivt markerer repetitive DNA-sekvenser innenfor heterochromatic kromosomale regioner over en rekke forskjellige insekter vevstyper. Imidlertid kan applikasjoner utvides til bruk med større prober og visualisering av enkeltkopi (ikke-repeterende) DNA-sekvenser. Vi viser denne metoden ved å kartlegge flere forskjellige repeterende sekvenser til klemt kromosomer fra Drosophila melanogaster nerveceller og Nasoniavitripennis spermatocytter. Vi viser hybridiserings- mønster for både små, kommersielt syntetiserte prober og for en større probe for sammenligning. Denne fremgangsmåten bruker enkle laboratorierekvisita og reagenser, og er ideell for etterforskere som har liten erfaring med å utføre DNA-ISH.

Introduction

DNA in situ hybridisering (DNA ISH) er en mye brukt metode for kartlegging sekvenser til spesifikke kromosomregioner. Prober til enkeltkopi regioner innen eukromatin kan genereres gjennom en håndfull av tilnærminger inkludert nick-translasjon eller endemerking av lange DNA-produkt 1,2 og inkorporering av deoxygenin (DIG) bundede nukleotider og deres gjenkjennelse gjennom en rekke gruppe konjugert antistoffer 1-3. Visualisering av euchromatic sekvenser i få eller enkeltkopiantall krever bruk av enten enkle, store prober med høy spesifikk aktivitet, eller en blanding av flere, mindre prober som kollektivt forbedre signal.

I kontrast, svært repetitive sekvenser funnet i heterochromatin, for eksempel satellitt DNA, er enklere mål for DNA-ISH fordi de normalt eksistere som titalls til tusenvis av repetisjoner gruppert i enkelt kromosom områder kalt blokker. Transposable elementer kan også blifunnet ved høye kopiantall på distinkt kromosom loci to. I disse tilfeller kan enkle sonder med lav spesifikk aktivitet effektivt merke heterochromatic sekvenser på grunn av deres hybridisering på flere steder. Sonder til repeterende sekvenser kan syntetiseres kommersielt som korte oligonukleotider (30-50 bp) og kjemisk konjugert med noen av flere ulike fluorescerende grupper. Kartlegging repetitive sekvenser innenfor heterochromatin ved hjelp av genom-sekvensering teknologi er vanskelig på grunn av utfordringer i byggestillasene innenfor svært repetitive satellitt blokker 4-6,7. Foreløpig ISH står som den mest effektive måten å kartlegge disse sekvensene på sub-kromosomnivå. Denne strategien er viktig for å kartlegge et stort antall repeterende sekvenser som blir avdekket av pågående genom og transkriptom sekvense studier.

Effektiviteten og enkel kartlegging repetitive sekvenser på glidemonterte kromosomer ville bli greatly forsterket av en forenklet protokoll for DNA ISH. For eksempel eksisterende protokoller for DNA ISH involvere flere vasker av hybridiserte vev i formamid løsning 2,8, og dermed legge vesentlig til ønsket tid for kartlegging sekvenser og også produsere store mengder av kjemisk avfall for kostbar reagens. Her beskriver vi en revidert DNA ISH metode som omgår behovet for formamid vasker og utnytter grunnleggende laboratorieutstyr og reagenser. Denne fremgangsmåten ble opprinnelig utviklet for hurtig kartlegging av svært repetitive DNA-sekvenser i heterochromatic regioner av Drosophila larve neuroblasts ved hjelp av kommersielt syntetiserte oligonukleotider som er konjugert med fluorescerende fargestoffer. Men denne metoden fungerer også for å kartlegge repeterende sekvenser med å bruke større prober syntetisert gjennom andre virkemidler 9,10 og på tvers av flere ulike vev og kromosom typer. I tillegg kan denne metoden brukes til å kartlegge euchromatic sekvensene ved hjelp av lengre eller multiple, korte sonder innenfor euchromatic sekvens av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tissue Dissection og Fiksering (60 min)

  1. For Drosophila hjerner, plasserer 3. stadium larver i en dråpe 1x PBS (fosfatbufferet saltvann). Velg store 3. stadium larver som er aktivt kryp fra ampuller eller flasker som ikke er overbefolket.
    1. Bruk en ultrafine pinsetten par å gripe tak i munnen kroker og en annen pinsetten par å ta 2/3 ned lengden på kroppen (Figur 1A, B). Dra forsiktig i munnen kroker å utsette hjernen, ventral ganglia, spyttkjertler og en del av larvefordøyelseskanalen. Bruk pinsett for å skille hjernen og ventral ganglia (figur 1A, B) fra de andre vev og sted i en dråpe med 1x PBT (fosfatbufferet saltvann med Tween) på en plast Petri plate.
  2. For Nasonia testis- disseksjoner, velger mannlige tre dager gamle puppe (gule legemer med røde øyne). Mann Nasonia har små vinge pad lengder i forhold til females under pupal scenen (figur 1C).
    1. Hold puppe på toppen av magen nær thorax-regionen med en pinsett par, og bruke den andre pinsetten par, ta tak i meget distale tuppen av magen og trekk ut tåre-slipp-formet testiklene (de vil bli omgitt av fett kroppen som kan være forsiktig ristet bort, figur 1D). Løsne eventuelle ytre kroppsdeler fra testiklene, noe som vil hindre riktig pres, og plasser i en dråpe med 1x PBT på en plast Petri plate.
  3. For hvert lysbilde, dissekere totalt fire eller fem vevsprøver (ie., Drosophila larve hjerner eller Nasonia testikler).
    MERK: Mer enn fem prøvene vil føre til overfylte kjerner og kromosomer.
  4. Eventuelt for å oppnå noen separasjon av søsterkromatider i euchromatic regioner av mitotiske kromosomer, behandle vevet med en hypoton løsning: overføre hjerner fra 1x PBT til et fall på 0,5% natriumsitrat for 5-10 (ikke mer enn 10) min.
    MERK: Kolchicin (en mitotisk inhibitor) kan være nyttig for å øke antallet av mitotiske figurer ved metafase 11. Imidlertid er dets bruk ikke nødvendig hvis meget store sunn larver blir anvendt, og til og med uønsket fordi det kan ha en negativ innvirkning på kromosom oppløsning, spredning og morfologi.
  5. Plassere en dråpe (~ 20 mL) av fikseringsmiddel-løsning (2,5% paraformaldehyd i 45% eddiksyre) på overflaten av en ren Sigmacote behandlede dekkglass.
    MERK: Pass på fiksativ løsning frisk for hver dag i bruk. Fiksering løsninger som spenner 1,8 til 3,7% paraformaldehyde i 45% eddiksyre gi de beste resultatene for fisk. Bruk av andre enn hjerne eller testikler vev, eller tilpasse denne protokollen for immun-FISH kan kreve å eksperimentere med forskjellige fiksativ (for en liste over forskjellige fiksativ, se 12).
  6. Nøye overføre hver vevsprøve fra dissekere buffer (1x PBT) i fiksativ dråpe med ultrafine pinsett, Minimizing overføring av dissekere buffer inn i fiksativ løsning. Plasser vevsprøver, slik at de blir jevnt fordelt i avstand fra hverandre inne i fiksativ dråpen. Inkuber vev i fiksativ i 4 min ved romtemperatur.
  7. Nøye plassere en poly-lysin-belagt lysbilde ansiktet ned på vev og dekkglass. Ikke trykk ned på dette punktet, men i stedet la de to å kontakte lett slik at dekkglass holder seg på undersiden av raset. Snu lysbildet slik at dekkglass er på topp.
  8. Sandwich raset / vev / dekkglass inne i en foldet stykke filter papir. På et stabilt underlag, ved hjelp av tommelen, trykker svært godt rett ned på posisjon direkte over dekkglass. Vær forsiktig for å unngå sideveis glidning av dekkglass (dette vil føre til flekker av vevet).
  9. Senke sleiden / vev / dekkglass i flytende nitrogen (se anordningen i figur 1 E, F), og la det stå inntil Nitrogen stopper kokende (lenger er fine). Fjern lysbildet og umiddelbart knekk av dekkglass med en frisk barberblad ved å flikke et hjørne av dekkglass i en oppadgående retning (unngå riper i fast vev med barberblad).
    1. Forkjøling sleiden / vev / dekkglass på en blokk av tørr-is, dekkglass opp til 1-2 min forut for nedsenkning i flytende nitrogen vil forhindre lysbildene fra cracking.
  10. Umiddelbart plassere glide med vevet i en Coplin krukke fylt med 100% etanol ved romtemperatur og lar stå i minst 5 min (denne gang kan være lenger om nødvendig).
    MERK: kald 100% etanol kan også anvendes.
  11. Fjern lysbildet med vev, veken vekk overflødig etanol med en Kimwipe (uten å berøre fast vev), og la lysbildet lufttørke for en time.
    1. Gå direkte til trinn 2 eller holde lysbilder tørre i lav luftfuktighet eller i en uttørking kammer for uker til og måneder før du utfører hybridisering.


Figur 1: (A) En 3. stadium Drosophila larve (til høyre), med posisjoner indisert for hvor du skal ta tak i munnen kroker (merket med *) og 2/3 av veien ned larvene å dissekere hjernen; (Til venstre) viser skjematisk en larve en samme utviklingsstadiet, som viser den relative posisjonen til hjernen i larve hode. (B) Hjernen og ventral ganglia ble dissekert fra en 3 rd instar Drosophila larve (til høyre) og en skjematisk fremstilling av denne vev (til venstre). (C) 3 dager gammel Nasonia puppe på gul body-røde øyne scenen. (D) En testikkel par dissekert fra en 3 dagers gammel Nasonia mannlig puppe (til høyre) med stillinger som indikerer hvor du skal ta tak i puppe ved den bakre av abdomen (angitt med *) og midt på kroppen; (Venstre) skjematisk skildrer mannlige og kvinnelige varp puppe; hann puppe kan være preget av vinger som ikke strekker seg forbi den Saggital profil (sort pil), i motsetning til kvinner, som har vinger som strekker seg forbi profilen; den relative posisjon av testis paret er vist i den mannlige puppe. (E) Apparat-en streng av binderser-og (F) Fremgangsmåten som brukes til å dyppe objektglass i en beholder med flytende nitrogen. Flere paperclip strenger kan brukes for samtidig nedsenking av flere lysbilder.

2. In situ hybridisering (30 min på dag 1; 1 hr-2,5 hr for lange prober-på dag 2)

  1. Tilsett 1 pl (100 ng) av hver probe i 20 pl 1,1x hybridiseringsbuffer. Pipetter probe / hybridiseringsbuffer til overflaten av det faste vev (unngå å berøre vev).
  2. Legg forsiktig en dekkglass direkte på sonde / hybridisering buffer, og pass på at dekkglass er sentrert rett over vev. Bufferen skal migrere til the ytterkant av dekkglass, og etterlater ingen luftbobler.
    MERK: Små bobler som ikke kontakt vev utgjør ikke noen problemer til prosedyren. Fjern store bobler ved å løfte forsiktig et hjørne av dekkglass og nøye slippe den tilbake på lysbildet.
  3. Plasser sleiden / vev / dekkglass på overflaten av en blokk forvarmes til 95 ° C (dekkglass opp). Dekk med et stort stykke aluminiumsfolie for å hindre lys eksponering. La sleiden inkuber ved 95 ° C i 5 min.
    MERK: En typisk varme blokk med hull for rør kan vendes for å gi en flat overflate som du kan plassere raset / vev / dekkglass.
  4. Fjerne raset, la den avkjøles litt før det er varmt å ta på. Vikle nøye et stykke strukket Parafilm rundt dekkglass å forsegle væske under den.
  5. Plasser forseglet inne i en glidefuktighetskammer og plassere kammeret i en inkubator forvarmet til 30 ° C. Inkuber ved 30 ° C i 4 timer til over natten.
    1. Lag en fuktighet kammer fra en tom boksen tips eller lokk Tupperware container med fuktet Kimwipes eller papirhåndklær plassert nederst.
      MERK: enkelttrådet DNA oligo onder har blitt designet for å være 28-33 baser for å oppnå en teoretisk smeltetemperatur (T m) av 45-47 ° C. Disse lengde og T m områder gjenspeiler det faktum at mange repeterende sekvenser som vi har studert er AT-rike og derfor har svært lav GC innhold. Lengre sonder vil sannsynligvis ha høyere T m verdier; dette kan resultere i høyere bakgrunnen hybridisering på standard hybridisering temperatur på 30 ° C. Således kan noe feilsøking med hybridiserings-temperaturer være nødvendig for å oppnå de beste resultatene. For å finne den beste hybridisering temperatur, økning (eller reduksjon) temperaturen med 5 ° C, trinnvis.
  6. Fjern forsiktig Parafilm fra raset og deretter forsiktig fjerne dekkglass ved sakte løfte det ene hjørnet. Wash sleiden tre ganger i 15 min hver vask i 0,1X SSC buffer. Dekk Coplin krukke med aluminiumsfolie under vasker for å minimere lyseksponering.
  7. Hvis du ikke bruker en lang biotinylert probe, fortsett til trinn 2.8.
    1. Hvis du bruker en lang biotinylert sonde, tørk området rundt vev med en Kimwipe, være forsiktig med å berøre vevet selv. Plassere 100 mL av blokkering løsning over vev og dekke forsiktig med et dekkglass, ta vare å unngå overlapping bobler. Pakk den gli over dekkglass med Parafilm og sted ved 37 ° C i 30 min.
    2. Fjern forsiktig dekkglass og blot rundt vevet med en Kimwipe. Pipet 100 ul rodamin-avidin fortynnet 1: 1000 i SBT over vev og dekke forsiktig med et dekkglass, ta vare å unngå overlapping bobler. Pakk den gli over dekkglass med Parafilm og sted ved 37 ° C i 30 min.
    3. Fjerne dekkglass forsiktig og vaske raset tre ganger for 5 min hver i 4x SSCT og deretter3 ganger i 5 minutter hver i 0,1 X SSC.
      MERK: Slides kan vaskes for lengre perioder av gangen.
  8. Fjern lysbildet og blot rundt vevet med en tørr Kimwipe å fjerne overflødig buffer (unngå å berøre vevet). Plasser lysbilde vev siden opp på et mørkt sted i 10-15 min eller til fuktigheten helt forsvinner.
  9. Pipettes 11 ul av Vectashield monteringsmedium (med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-DAPI) på vevet. Forsiktig en ren dekkglass (ikke behandlet med Sigmacote) direkte over midten av monteringsmedium og vev. Monteringsmedium bør migrere langsomt utover mot kantene av dekkglass.
    MERK: Hvis monteringsmedium ikke når kanten av dekkglass på alle sider, så ble ytterligere 1-2 ul av monteringsmedium kan brukes til en stilling ved kanten av dekkglass for å fylle ut den nødvendige volum. I dette tilfellet må du tørke bort overflødig medium fra glideflate førtetting.
  10. Forsegle kantene av dekkglass med neglelakk. Unngå å male neglelakk over vevsprøve.
  11. Plasser lysbilde oppreist på et mørkt sted og la neglelakk tørke til helt hard (vanligvis 30 min eller mer). På dette punktet, bilde vevet eller butikken ved -20 ° C i opptil en uke for senere bildebehandling.

Buffer / løsning Oppskrifter

10x PBS

  • 80 g NaCl
  • 2.0 g KCl
  • 14.4 g Na 2 HPO 4
  • 2,4 g KH 2 PO 4
  • pH-verdien til 7,4, H2O til 1 liter

1x PBT

  • 5 ml 10x PBS
  • 45 ml H 2 O
  • 0,1% Tween 20

20x SSC

  • 175,3 g NaCl
  • 88,2 g Na Citrate
  • i 800 ml H 2 O
  • pH-verdien til 7, H 2 O til 1 L

4x SSCT

  • 200 ml 20x SSC
  • 799 ml H 2
  • 0,1% Tween 20

0.1x SSC

  • 5 ml 20x SSC
  • 995 ml H 2 O

Hybridisering blanding (20 ul; modifisert fra 11)

  • 10 pl formamide
  • 4 mL 50% dekstransulfat
  • 2 ul 20x SSC
  • 4 pl H to O

SBT 8 (10 ml)

  • 2 ml 20x SSC
  • 0,01 g bovint serumalbumin (BSA)
  • 10 ul Tween 20
  • 7,9 ml H 2 O

Blokkeringsløsning 8 (10 ml)

  • 0,3 g BSA
  • 10 ul Tween 20
  • 2 ml 20x SSC
  • 8 ml H 2 O

Fiksativ løsning med paraformaldehyde (1 ml)

  • 393,75 mL H 2 O (tilsett vann først)
  • 450 mikroliter iseddik
  • 156,25 mL 16% paraformaldehyde

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å demonstrere denne metoden, hybridisert vi et sett av små kommersielt syntetiserte oligonukleotider som ble kjemisk modifisert med fluorescerende konjugater (figur 2) og en lengre biotinylert probe (laget ved nick-translasjon av et PCR-produkt; figur 2B), for å kromosomer fra flere forskjellige vev typer (se tabell 1). De målsekvenser inkludert satellitt gjentar lokalisert i pericentromeric (heterochromatic) regioner av mitotiske kromosomer fra D. melanogaster larve neuroblasts (Figur 2A-C), og meiotisk kromosomer fra pupal N. vitripennis testikler (figur 2D). De hybridizations i hvert av disse tilfellene avdekket diskrete båndmønstre på sub-kromosomale regioner. Ett punkt verdt å nevne er at sonden til D. melanogaster 359 bp satellitt gjenta gjenkjenner både et stort multi-megabase par blokk på X, og et mye mindre område på kromosom 3(Figur 2A). En lengre probe mot Responder satellitt oppdager også gjenta blokker som består av relativt lave gjenta kopiantall (~ 700 eksemplarer, figur 2B). Dermed gir denne metoden visualisering av svært små satellitt blokker. For å bidra til å avsløre kromosomstruktur og hjelpemiddel i kromosom identifikasjon, kan det være nyttig å behandle kromosomene med en hypotonisk oppløsning (beskrevet i trinn 1.5). Vev i figur 2B og 2C paneler ble behandlet med en hypoton løsning for 5 og 10 min henholdsvis. Legg merke til separasjon av søsterkromatider er større med lengre behandling (Figur 2C).

Figur 2
Figur 2: DNA in situ hybridisering til (A) larve neuroblast kromosomer fra D. melanogaster /D. simulans hybrider, (B) og (C) larve neuroblast kromosomer fra D. melanogaster behandlet med hypoton oppløsning (se Disseksjon og fiksering trinn 1), (D) meiotisk kromosomer fra pupal testikkel vev av smykke veps Nasonia vitripennis. I (A), grønne piler indikerer små regioner i AATAT satellitt på D. simulans 4 th kromosom, mens de grønne pilspiss punkter å AATAT på D. melanogaster X kromosom. Røde pilen peker på en liten region av 359 bp satellitt på D. melanogaster 3. kromosom, mens den røde pilspissen markerer 359 bp sekvenser på X. Alle satellitter i (A) ble hybridisert med korte, fluorescensmerkede oligoer. I (B), tilsvarer den grønne signal til AAGAG satellitt (syntetiserte oligo) og den røde signal er 120 bp Responder satellitt (en biotinylert probe, merketmed røde piler). (C) Det samme Responder satellitt med en kort fluoresceinmerket oligo (røde piler). I (D), den røde pilen markerer en satellitt som har en unik beliggenhet på Fars Sex Ratio (PSR) kromosom, som er en ikke-essensiell, statist B kromosom funnet i naturlige populasjoner av N. vitripennis 13, mens den grønne pilen indikerer en satellitt på en av de normale kromosomer; denne hybridiseringen ble utført ved hjelp av korte, fluorescensmerkede oligoer. Alle sondene er beskrevet i tabell 1. Scale bar i panelet (A) er 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Probe navn Probetype Oligos
AAGAG satellitt Oligo (AAGAG) 7 5 '6-FAM (fluorescein)
AATAT satellitt Oligo (AATAT) 6 5'-Cy3
359-bp satellitt Oligo TTT TCC AAA TTT CGG TCA TCA AAT AAT CAT 5'-Alexa555
PSR satellitt Oligo TGT AAC TGG AAA AGG AAA ATG TAT TAT TGA 5'-Alexa555
Nasonia autosome satellitt Oligo AAT TTT GTG AAT TTT GGT GTC TCC ATC 5'-Alexa633
Responder PCR F-5 'GGA AAA TCA CCC ATT TTG ATC GC Biotin-14-dATP
R-5 'CCG AAT TCA AGT ACC AGA C

Tabell 1: Probe typer som brukes i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA ISH er ofte brukt for å kartlegge spesifikke sekvenser til kromosomer. Vi har beskrevet en enkel metode for DNA ISH optimalisert for høyt kopiantall, heterochromatic sekvenser. Snarere enn å bruke vasker i formamider løsning, noe som er et krav i andre eksisterende DNA ISH protokoller, vi plassere vev-monterte lysbilder direkte på en forvarmet blokk å denaturere DNA. Denne fremgangsmåte omgår bruken av store mengder av formamid. Ett viktig skritt for å produsere skarpe hybridiseringssignaler er å bruke ferske fiksering løsning; unnlatelse av å gjøre det (eller lage ny løsning med paraformaldehyde som har vært åpen i mer enn én måned) kan redusere signal oppløsning. En begrensning ved denne metoden er at, som for andre DNA ISH protokoller, kan hybridiseringstemperaturen kreve optimalisering for å eliminere falsk hybridisering til off-målsekvenser.

Denne protokollen er sensitive korte, ssDNA sonder konjugert med et enkelt fluorophore per molekyl kan oppdage blokker av repetisjoner med selv relativt lave gjenta kopiantall (f.eks ~ 700 RSP gjentar; Figur 2C). Signaler til satellitt blokker med færre repetisjoner kan visualiseres med korte ssDNA prober ved hjelp av en svært følsom digitalkamera. Selv om det ikke er vist her, er denne metoden også effektive for å kartlegge ikke-repetitive sekvenser i eukromatin 10. Bruke lange, biotinylerte sonder gir mer fleksibilitet i å oppdage lave kopi tallsekvenser som signalet kan lett bli forsterket ved gjentatte behandlinger av biotinylated anti-avidin og rodamin-avidin 9. For å visualisere enkeltkopisekvenser, kan flere sonder som strekker seg over sekvensen være nødvendig. Alternativt kan bakterielle kunstige kromosomer (Bacs) inneholdende sekvensen av interesse bli merket nick-translasjon eller ved tilfeldig priming for bruk som en probe for ikke-repetitive sekvenser 10. Å kartlegge sekvenser på en fin skala, sonder målretting different gjentagelser (hver med forskjellige fluoroforer) kan brukes samtidig for å oppnå posisjonen til målsekvenser i forhold til andre gjentagelser og strukturelle landemerker på kromosomene. Mens vi bruker to prober her (Figur 2A, B, D), kan antallet prober lett økes til tre 10 eller flere, avhengig av antallet av forskjellige fluorescens mikroskop filtre tilgjengelig. Denne protokollen kan utvides til andre vev-vi har bekreftet at protokollen fungerer godt på polytene kromosom saft fra spyttkjertlene. Det kan tenkes at denne metoden være kombinert med immuno-farging av kromatin proteiner; Imidlertid anbefales det at immunofarging utføres som et første trinn, og etterfulgt av re-fiksering med paraformaldehyd før DNA ISH for å hindre antistoff tap under DNA ISH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) Sigma Aldrich
Ultrafine tweezers (5 gauge) Dumont
22 x 22 mm cover slips Fisher Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear
Sigmacote Sigma
Filter paper 75 - 150 mm
Paraffin wax paper
Heat block with thermometer
Dry incubator
Razor blades
Humidity chamber empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes
Coplin jars with slide grooves
Aluminum foil
Pasteur pipettes
1.5 ml microfuge tubes
Nail polish clear or colored
P20 micropipette and plastic tips
Paperclips 20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain
Reagents
16% EM grade paraformaldehyde Electron Microscopy Reagents
Acetic acid Sigma
Liquid nitrogen
100% Ethanol, chemical grade
Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos
Long biotinylated probe Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 e.g., nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen
Rhodamine-Avidin Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 for detection of long biotinylated probe
Hybridization buffer Recipe above
4x SSCT Recipe above saline-sodium citrate + Tween
0.1x SSC Recipe above saline-sodium citrate
Blocking solution Recipe above
SBT Recipe above SSC, bovine serum albumin, Tween
1x PBT Recipe above phosphate-buffered saline + Tween
1x PBS phosphate-buffered saline
Hypotonic solution 0.5% sodium citrate in H2O
Formamide Sigma Aldrich
Vectashield mounting medium with DAPI Vector laboratories

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (9), (2009).
  2. Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
  3. Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (8), 1003-1006 (2011).
  4. Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3, (12), (2002).
  5. Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, (58331), 1625-1628 (2007).
  6. Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13, (1), 36-46 (2012).
  7. He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22, (12), 2507-2519 (2012).
  8. Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (3), (2010).
  9. Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27, (7), 1612-1620 (2010).
  10. Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7, (10), e1000234 (2009).
  11. Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118, (4), 759-773 (1992).
  12. Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
  13. Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117, (1), 85-101 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats