تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (92), e52295, doi:10.3791/52295 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تنظيم تخليق البروتين يمثل نقطة السيطرة الرئيسية في استجابة الخلايا للإجهاد. على وجه الخصوص، وقد أظهرت العناصر التنظيمية RNA سرية للسماح لترجمة انتقائية من mRNAs محددة، والتي عادة لترميز البروتينات اللازمة للاستجابة الإجهاد معينة. وقد تم تحديد هذه من mRNAs، فضلا عن توصيف الآليات التنظيمية المسؤولة عن الترجمة الانتقائية في طليعة البيولوجيا الجزيئية لبعض الوقت. التنميط Polysome هي طريقة حجر الزاوية في هذه الدراسات. هدف التنميط polysome هو الاستيلاء على الترجمة مرنا من قبل شل حركة ريبوسوم بنشاط في ترجمة النصوص المختلفة، وفصل polyribosomes الناجم عن تنبيذ فائق على التدرج السكروز، مما يسمح للتمييز بين النصوص المترجمة للغاية ومنها ترجمت بشكل سيئ. هذه يمكن بعد ذلك تتميز بمزيد من طرق البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية التقليدية. الأهم من ذلك، يجمع صolysome التنميط مع النهج الجينومية إنتاجية عالية يسمح لتحليل واسع النطاق لتنظيم متعدية.

Introduction

تنظيم تخليق البروتين (الترجمة) هو عملية الخلوية الأساسية التي ترتبط ارتباطا وثيقا بقاء الخلوية. بالنظر إلى أن الترجمة تستهلك أكثر من 50٪ من طاقة الخلية، فإنه ليس من المستغرب أن الترجمة ينظم بإحكام وأن الاضطرابات في الترجمة لا تحملها جيدا. على العكس، تتطلب العديد من العمليات الخلوية الشاذة التي الماكينات الترجمة والإخراج الترجمة (أي بروتيوم) لا بد من تعديلها. هذا هو الحال غالبا في مختلف الدول استجابة الإجهاد والمرض، وربما الأفضل يتمثل في السرطان. والميزة الرئيسية للرقابة متعدية هي قدرة الخلايا على إعادة برمجة بسرعة إخراج البروتين ردا على مختلف المثيرات الخارجية والداخلية، وآلية ضبط بالتالي الجميلة التي نصائح التوازن بين بقاء الخلية والموت 1.

جانبين من جوانب الرقابة متعدية مثيرة للاهتمام بشكل خاص. فهم طبيعة MEC التنظيميhanism (ق) وضبط العناصر التي تسمح للترجمة محددة، وتحديد من mRNAs محددة ومنتجاتها البروتينية التي تشارك في الاستجابة الخلوية لالزناد خاص التي أثارت الترجمة الانتقائية في المقام الأول. التنميط Polysome هو الاسلوب الذي يسمح بدراسة فعالة من العمليتين.

الهدف العام من هذه التقنية التنميط polysome هو دراسة وقياس حالة ترجمة من mRNAs محددة في ظل ظروف الخلوية المختلفة. مبدأ هذه التقنية هو الاستيلاء على الترجمة مرنا من قبل '' تجميد 'بنشاط على ريبوسوم ترجمة النصوص المختلفة، وفصل polyribosomes الناجم عن تنبيذ فائق على التدرج السكروز، مما يسمح للتمييز بين النصوص المترجمة للغاية (ملزمة عدة ريبوسوم) و ترجمة سيئة منها (ملزمة من جانب واحد أو اثنين من ريبوسوم). في هذا بروتوكول معين، سيكلوهيكسيميد المضادات الحيوية التي تربط ل60S الوحيدات الريباسي وكتل الافراج عن deacetylated الحمض الريبي النووي النقال من موقع E الريبوسوم ويستخدم لمنع النبات الريبوسوم والمماطلة على ريبوسوم من mRNAs ترجمة. ومع ذلك، منع وكلاء آخرين مثل إيميتين أن الترجمة أيضا كتل استطالة يمكن استخدامها.

على عكس النشاف الغربي و 35 S-ميثيونين تقنيات وضع العلامات لقياس الناتج النهائي لعملية الترجمة، polysome التنميط له ميزة قياس الارتباط مع ريبوسوم من mRNAs ترجمة نشطة، وبالتالي السماح لدراسة أكثر تفصيلا لآليات الترجمة تحت ظروف مختلفة. وبالتالي، فإن تقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة تحديدا وسائط مختلفة الترجمة 4-6 والعوامل البروتينات تشارك في تنظيم الترجمة 7-9، وظروف الإجهاد التي تؤثر على تخليق البروتين 1،10،11 أو آثار الهياكل مرنا مثل IRES أو المنبع إطارات القراءة المفتوحة على البروتين موالفةESIS 12-14. في الوقت الحاضر، polysome تطبيقات التنميط، بل هي أوسع مع استخدام الحمض النووي ميكروأرس 15 أو الجيل المقبل من التسلسل 16،17 لتحليل المرتبطة polysomes-من mRNAs.

Protocol

ملاحظة: ملاحظة على العمل مع RNA: خذ الاحتياطات القياسية للحماية من التدهور RNA من قبل RNases. استخدام قفازات، نصائح حاجز ماصة، خالية من ريبونوكلياز بلستيكور والمواد الكيميائية في جميع الخطوات من البروتوكول. استخدام عالى النقاء أو المياه المعالجة DEPC لجميع الحلول. تطهير الأسطح أي مشتبه بمحلول تعطيل ريبونوكلياز التالية بروتوكول الشركة المصنعة.

1. إعداد الحلول.

  1. إعداد 500 مل من الحل الأساسية (0.3 M كلوريد الصوديوم، 15 ملي MgCl 2 6H 2 O؛ 15 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4). مزيج باستخدام بقضيب حتى حل واضح وتمر من خلال مرشح 0.45 ميكرون. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد 10 و 50٪ حلول السكروز و 60٪ تشيس الحل على النحو التالي:
    1. 10٪ السكروز الحل (ث / ت)، في أنبوب 50 مل الطرد المركزي إضافة 5 ز السكروز وملء 50 مل مع الحل الأساسي. 50٪ السكروز الحل (ث / ت)، في أنبوب 50 مل الطرد المركزي الإعلانيةد 25 ز السكروز وملء 50 مل مع الحل الأساسي.
    2. 60٪ (ث / ت) تشيس الحل، في أنبوب الطرد المركزي 50 مل إضافة 30 ز السكروز وملء 50 مل مع الحل الأساسي. إضافة 100 ميكرولتر من محلول مشبع برموفينول الأزرق (الأزرق برموفينول إضافة إلى المياه حتى لا أكثر سوف تذوب، الطرد المركزي لبيليه مسحوق غير منحل) إلى حل مطاردة 60٪. مزيج باستخدام الدوامة وتحقق حل كامل.
    3. حلول تخزين عند 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
  3. إعداد RNA تحلل العازلة. يعد هذا المخزن المؤقت العذبة في يوم التجربة. إعداد 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي العازلة تحلل لكل عينة. إلى 1 مل من الحل الأساسية إضافة 10 ميكرولتر تريتون X-100 (1٪ [ت / ت] قبل النهائي)، 1 ميكرولتر من 100 ملغ / مل سيكلوهيكسيميد في DMSO (فروج، 0.1 ملغ / مل النهائي) و 3.5 ميكرولتر RNasin (140 U / مل). مزيج باستخدام الدوامة. الحفاظ على الجليد.
    ملاحظة: سيكلوهيكسيميد هو شديدة السمية وتسبب الطفرات. تجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. لتجنب التعامل مع شكل مسحوق كثير من الأحيان، الإعداديةهي كمية أكبر من 100 ملغ / مل الأسهم في DMSO، والحفاظ على قسامة في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. الحفاظ على المخزون تعمل في -20 درجة مئوية.
  4. في يوم من التجربة، وإعداد حلول السكروز + فروج بإضافة فروج (تركيز النهائي من 0.1 ملغ / مل) إلى حجم المطلوب من 10٪ و 50٪ محلول السكروز (~ 7 مل من كل محلول في الانحدار).

2. إعداد السكروز التدرج باستخدام صانع التدرج الآلي

  1. تحويل صانع التدرج '' على '' ومستوى اللوحة التي ستعقد التدرجات (criticalstep!) اضغط على "" تم "" عندما وجهت لوحة.
  2. اختر من القائمة برنامج التدرج ليتم تشغيلها:
    1. اضغط على '' غراد '' القائمة واختر '' قائمة ''.
    2. حدد "SW41".
    3. انتقل خلال القائمة وحدد "'10 - 50٪ التدرج - 11 خطوات" البرنامج "من قبل الصحافةجي في 'تشغيل' زر ''.
  3. وضع أنبوب مخروطي نابذة فائقة السرعة (SW-41 أنبوب، 14 × 89 ملم) في علامة على كتلة واستخدام أنبوب دقيق قدمت علامة لتتبع علامة على الأنبوب على طول الخطوة العليا من علامة كتلة. وضع الأنابيب في الرف المناسب على سطح ثابت.
    ملاحظة: هذا سوف يكون علامة دليل ملء طبقات ل10 و 50٪ في حلول السكروز.
  4. إرفاق قنية اثنين المقدمة لهما 10 مل المحاقن وغسل pipetting صعودا وهبوطا مع الماء المقطر الدافئ تحتوي على ريبونوكلياز الحل تعطيل. تأكد من إزالة كل آثار الماء بعد ذلك.
  5. ملء واحدة من الحقن مع 10٪ سكروز + فروج وإدراج قنية في أسفل الأنبوب نابذة فائقة السرعة. الاستغناء بلطف محلول السكروز 10٪ حتى يذهب الماضي فقط علامة المحرز في أنبوب.
    ملاحظة: تجنب جعل فقاعات. إذا تشكل فقاعات، اضغط بلطف أنبوب لتهجيرهم.
  6. ملء حقنة أخرى مع 50٪ سكروز + فروج، مسح السائل الزائد منمع يمسح برفق وإدراج قنية في أسفل الأنبوب نابذة فائقة السرعة. الاستغناء بلطف الحل السكروز 50٪ حتى تصل بالضبط علامة. بسرعة وسلاسة إزالة قنية.
    ملاحظة: يجب أن يرتفع السكروز 10٪ في أنبوب وتشكيل الغضروف المفصلي في الأعلى. إن لم يكن، إضافة المزيد من 10٪ من محلول السكروز على السطح.
  7. إدراج غطاء المقدمة عن طريق إمالة الأنبوب نابذة فائقة السرعة قليلا وتشريد جميع فقاعات الهواء. إزالة السائل الزائد في خزان غطاء لمع ممص مكروي.
  8. مسح السائل الزائد على طول جدار الأنبوب ومكان على لوحة صانع التدرج.
  9. اضغط على 'تشغيل' زر ''.
    ملاحظة: إمالة لوحة في زاوية محددة، وقفة لمدة 5 ثانية وتناوب لتشكيل سيبدأ الانحدار.
  10. عند اكتمال تشكيل التدرج (حوالي 2 دقيقة، الجهاز سوف زمارة)، وإزالة بلطف نابذة فائقة السرعة (ق)، ووضعت على الرف وبسرعة إزالة الغطاء في الحركة الصعودية لتجنب إزعاج gradie الإقليم الشمالي.
  11. الحفاظ التدرج (ق) على الجليد. عدم الإزعاج! بدلا من ذلك، تبقى التدرجات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  12. بدلا من ذلك، استخدم صانع التدرج اثنين من غرفة لجعل التدرجات على النحو التالي:
    1. أنابيب شطف وصانع التدرج مع حل ريبونوكلياز التعطيل وريبونوكلياز خالية من المياه.
    2. إضافة 5 مل من 50٪ سكروز + فروج إلى الغرفة القريبة من صانع التدرج وضمان أن تتم إزالة أي الهواء بين الغرفتين.
    3. إضافة 5 مل من 10٪ سكروز + فروج للغرفة البعيدة صانع الانحدار.
    4. إضافة 0.5 مل من 50٪ سكروز + فروج إلى قاع مخروطي أنبوب الطرد المركزي (SW-41 أنبوب، 14 × 89 ملم) وضعها في حامل أنبوب.
    5. بدوره على النمام وضعت في غرفة الداني، مفتوحة توقف الديوك والتدرج الودائع بسرعة تعيين "3" (حوالي 1ML / دقيقة).
    6. مكان التدرج (ق) على الجليد. رجاء عدم الإزعاج.
      ملاحظة: التدرجات يمكن أن تظل ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.

3. خلية تحلل وتنبيذ فائق.

    "هامش اليسرى: 40px؛">
  1. وضع SW-41 الدوار والدلاء في 4 درجات مئوية، ووضع أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تم تحسين الإجراء تحلل الخلية لمدة 150 مم ألواح الخلايا HEK293 في التدرج subconfluent (~ 70-80٪ متموجة) و قد تحتاج أحجام تستخدم لتعديلها لخطوط مختلفة من الخلايا.
  2. خلايا لوحة في كثافة الخلية المناسبة في وسائل الإعلام نمو لا يقل عن 24 ساعة قبل أن تحلل.
  3. إعداد قسامة (20 مل لكل 150 ملم لوحة) من وسائط النمو تحتوي على 0.1 ملغ / مل فروج.
  4. احتضان الخلايا في فروج + وسائل الإعلام (20 مل لكل 150 ملم لوحة) لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لاعتقال وتحقيق الاستقرار polysomes.
  5. العمل بسرعة، ووسائل الإعلام نضح من لوحات، لوحات مكان على الجليد وغسل خلايا مرة واحدة مع 10 مل الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS: 137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 1.8 ملي KH 2 PO 4) تستكمل مع فروج (تركيز النهائي من 0.1 ملغ / مل) والحرص على ماصة ببطء أسفل SID(ه) من جدار صحن للحد من رفع أحادي الطبقة الخلية.
  6. نضح PBS وإضافة إضافي 10 مل PBS + فروج إلى كل لوحة، وتتخلص من الخلايا مع رافع الخلية ونقل الحجم الإجمالي من كل من لوحات ل50 مل الطرد المركزي أنبوب على الجليد. الاحتفاظ 1 مل من تعليق الخلية في أنبوب microfuge على الجليد لتحليل البروتين المصب.
  7. الطرد المركزي أنبوب 50 مل من الخلايا في 300 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  8. إزالة كل برنامج تلفزيوني و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الجليد الباردة العازلة تحلل.
  9. نقل تعليق خلية إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل.
  10. ماصة صعودا وهبوطا لليز الخلايا واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة مع vortexing لفي بعض الأحيان.
  11. الطرد المركزي في 2000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتكوير نوى.
  12. نقل طاف لجديد 2 مل أنبوب microcentrifuge.
  13. الطرد المركزي في 17000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتكوير الحطام الخلية.
  14. نقل طاف جديد لأنبوب 2 مل ميكروسنتريفوج واستخدام 2 ميكرولتر لقياسالكثافة البصرية في 260 نانومتر (استخدام تحلل عازلة فارغة ع).
  15. إزالة 50 ميكرولتر (10٪ من المجموع) من كل عينة لتحليل الحمض النووي الريبي مجموع. ملاحظة المحللة يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
  16. تحميل بلطف وحدات A260 متساوية على كل التدرجات السكروز (دقيقة 10 OD، أفضل 25 OD، في الحد الأقصى لحجم 500 ميكرولتر؛ تمييع المحللة مركزة مع تحلل العازلة إضافية إذا لزم الأمر).
  17. ضمان التدرجات ضمن 0.1 غرام من كل قبل تنبيذ فائق الآخرين.
  18. التدرجات الطرد المركزي في 39000 دورة في الدقيقة (260343 x ج) لمدة 1.5 ساعة في 4 درجات مئوية.
  19. خلال spindown حفاظ على الفرامل الدوار وإيقاف تشغيله أثناء التباطؤ عندما يصل إلى 1000 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة تقلل من أي اضطراب من التدرجات التي تسببها التغيرات المفاجئة في التسارع كما رؤساء فرشاة الاتصال الدوار أثناء الكبح.

4. التدرج نظام تجزئة صك مجموعة المتابعة.

  1. انشاء الصك وفارغة لياليpectrophotometer بالماء على النحو التالي:
    1. بدوره على مكونات والسماح للمصباح إلى الاحماء لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    2. ومن المقرر ضمان جزء جامع لطريقة "polysome" (اضغط أيقونة المجلد مرتين؛ عودة السهم مرتين للعودة إلى الشاشة الرئيسية).
    3. ضمان صمام على جمع جزء من المقرر أن تضيع (السهم يشير إلى أيقونة سلة المهملات). وضع 250 مل دورق مخروطي يحتوي على الماء المقطر تحت أنبوب جمع النفايات.
    4. حدد الإعدادات التالية على مسجل الرسم البياني: تعيين حساسية الطلب على "مجموعة مصباح والبصريات '؛ ضبط الضوضاء فلتر التحول إلى '1.5'؛ وضع فاصل ذروة الطلب على "OFF". وضع مخطط لسرعة الاتصال الهاتفي '30 سم / ساعة "(5 سم / 10 دقيقة)؛ تحديد خط الأساس ضبط الطلب (على رأس وحدة معمل) إلى 'MAX فتح'.
      ملاحظة: اختياري: يمكن استخدام برنامج مسجل رقمي بدلا من مسجل الرسم البياني. على الكمبيوتر، انقر على "ابدأ". سوف تفتح نافذة الاستحواذ: تحت العشرينالقائمة خيارات البريد والرسومات وقفة إلغاء تحديد. تحت تحجيم، وضع حدود الرسم البياني ل-10 و 100 (يمكن تغييرها على ذبابة خلال المدى). انقر على زر حفظ لإنشاء ملف جديد وتسجيل المدى.
    5. مكان الحقنة وبرميل في مضخة وتشديد في مكانه (مسامير استخدام المقدمة ومفتاح ألين).
      ملاحظة: لا تبالغ.
    6. ملء الحقنة مع تشيس الحل باستخدام 'REV' القيادة بسرعة السريع. وضع المضخة في وضع مستقيم ومطاردة الهواء عبر الأنابيب باستخدام 'إلى الأمام' 'الأمر'. فقط استخدام RAPID لهذه الوظيفة ويغسل.
    7. تثبيت أنبوب نابذة فائقة السرعة مملوء بالماء ريبونوكلياز خالية.
    8. بيرس أنبوب نابذة فائقة السرعة مع قنية حتى اثنين من علامات سوداء مرئية (يقع في حفرة صرف بين هذه العلامات اثنين) وبدء ضخ حقنة على '' دليل '' في 6.0 مل / دقيقة.
    9. كما يمر الماء من خلال خلية تدفق (عندما جحل HASE يملأ 1/3 من الأنبوب)، سرعة التحول إلى متغير وتعيين إلى 1.0 مل / دقيقة.
    10. بمعدل تدفق 1.0 مل / دقيقة، وتعديل خط الأساس ضبط الطلب على معمل الجهد حتى على الرسم البياني هو عند مستوى الصفر (+/- 0.5 وحدة).
      ملاحظة: لاحظ خروج الماء من أنبوب النفايات في دورق مخروطي.
    11. ضبط الحساسية المطلوبة ل"0.5" أو "1.0" الاتحاد الافريقي.
      ملاحظة: 1.0 AU يعمل على نحو أفضل لOD 10 وحدة في التدرج 10 مل. إذا OD هو أقل من 10 '0.5' حساسية يمكن استخدامها لتعزيز إشارة.
    12. تضغط على الزر السيارات الأساس وضبط خط الأساس لوضع علامة 10٪ على مسجل الرسم البياني من خلال تحويل الطلب مسجل الإزاحة (اختياري في حالة استخدام مسجل رقمي).
    13. مرة واحدة يتم التوصل إلى خط الأساس مستقرة، أدر مفتاح المضخة إلى "OFF"، والاتصال الهاتفي رسم السرعة إلى 60 سم / ساعة في حالة استخدام مسجل الرسم البياني التناظرية أو "OFF" في حالة استخدام مسجل رقمي.
    14. استرداد الحل تشيس عن طريق التحول إلى مضخة "REموقف V '(إذا لزم الأمر واحدة يمكن أن تزيد من معدل تدفق إلى 6.0 مل / دقيقة ... لا تستخدم RAPID) حتى يصل إلى العلامة الأولى على قنية خارقة.
    15. إزالة أنبوب الطرد المركزي ومطاردة أي فقاعات الهواء داخل قنية عن طريق تشغيل قليلا من الحل تشيس من خلال ذلك. يمسح المرحلة ثقب نظيفة.
      ملاحظة: بعض المياه المتبقية قد تتسرب من الخلية التدفق.

5. التدرج تجزئة وجمع العينات.

  1. تثبيت ويخترق أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على التدرج السكروز.
  2. وضع أحد عشر 2 مل أنابيب microcentrifuge في مواقع صينية جزء جامع 1-11 بحيث قبعات لا تبرز صعودا. استبدال '' أنبوب # 1 '' في الوقت الراهن مع '' أنبوب النفايات '' لجمع أي السائل المتبقي في الأنبوب المجمع.
  3. تعيين قرص التحكم مضخة ل"دليل" ومعدل التدفق على ضخ حقنة ل"6.0 مل / دقيقة" اضغط على "تشغيل" أيقونة على جامع الكسر. حالما يصل الذراع الأنبوب الأول، اضغط على "وقفة" زر '' (وهذا سوف وضع ذراعه وفتح صمام صرف جزء).
  4. بدء تشغيل المضخة باستخدام 'إلى الأمام' 'الأمر' ورصد مخطط مسجل القلم. عندما يبدأ ينحرف صعودا (تشير إلى أن عينة يمر من خلال خلية تدفق معمل)، يستعاض بسرعة '' أنبوب النفايات '' مع '' أنبوب # 1 '.
  5. عندما يتم جمع أول قطرة، والتحول بسرعة إلى الأوامر "بعد بدء / إيقاف '،' 'متغير (1.0 مل / دقيقة)' ثم اضغط على 'اللعب' 'رمز.
    ملاحظة: يتم التحكم في مضخة الآن من قبل واجهة جزء جامع وسيتم جمع الكسور 1 مل كل دقيقة.
  6. من هذه النقطة فصاعدا، سوف تظهر قراءات A260 على واجهة مسجل رقمي (أو recorde الرسم البياني التناظريةص). تأكد من أن '' سجل '' الضغط على زر في البرنامج!
  7. بعد دخول تشيس الحل الأزرق أنبوب جمع أو أنبوب آخر (عادة أنبوب 11)، اضغط على أيقونة 'وقف'.
    ملاحظة: صمام صرفها يجب التحول إلى صمام النفايات.
  8. الحفاظ الكسور على الجليد حتى يتم مجزأة كل التدرجات. في نهاية الكسور اليوم يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية قبل البروتين أو RNA العزلة. إذا كان مطلوبا من البروتين والحمض النووي الريبي التحليل، وتقسيم كل جزء إلى نصفين (500 ميكرولتر لكل من البروتين وتحليل RNA).

6. غسل

ملاحظة: (هذه خطوة اختيارية التي يتعين القيام بها إلا إذا تدرجات متعددة هي التي يتعين جمعها).

  1. غمر أنبوب النفايات في دورق مخروطي يحتوي على ~ 50 مل من الماء عالى النقاء وعكس المضخة باستخدام معدل التدفق 6 مل / دقيقة.
  2. وقف ضخ عندما تصل إلى الحل تشيس أول علامة سن قنية خارقة.
  3. إزالة أنبوب الطرد المركزي، مطاردة أي الهواء من قنية وتنظيف مرحلة خارقة.
    ملاحظة: بعض المياه المتبقية قد تتسرب من الخلية التدفق.
  4. كرر الإجراء التجزئة بدءا من الخطوة 5.1.

7. تنظيف النهائي.

  1. فصل أنابيب مضخة من أسفل ثاقبة وضخ الحل تشيس إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل باستخدام الإعداد التدفق السريع. تخزين الحل تشيس في 4 درجات مئوية كما يمكن إعادة استخدامها.
  2. توصيل أنبوب مضخة لنظام أنابيب 3 الطريق وإغلاق صمام يؤدي إلى الحقنة. توصيل أنبوب واحد لحقنة 50 مل مملوءة بالماء المقطر وأنبوب آخر إلى قاعدة ثاقبة.
  3. تثبيت أنبوب نابذة فائقة السرعة تستخدم لتقطيع خطوة وتمرير ما لا يقل عن 50 مل من الماء المقطر من خلال أنبوب مقياس الطيف الضوئي وجمع (التحول إلى جمع القائمة على واجهة بالضغط على 'ستارر / وقفة '' رمز).
  4. إزالة أنبوب، حقنة (استخدام مفتاح ألين لإزالة مسامير) وجميع مكونات أخرى قابلة للإزالة ويغسل جيدا باستخدام ماء الصنبور الدافئ ثم شطف مع الماء عالى النقاء.
    ملاحظة: عناية خاصة عند غسل المكبس، برميل، وثقب أنابيب قنية.
    ملاحظة: التعامل مع الزجاج حقنة برميل مع الرعاية! تخزين جميع المكونات بعيدا عن الغبار.
  5. مسح أسفل خلية تدفق بمنديل مبلل ناعمة مع الماء المقطر. مسح أسفل الدرج جزء جامع وأية مناطق أخرى حيث قد تم امتد السكروز.

8. عزل الحمض النووي الريبي من السكروز الكسور.

  1. إعداد 50 ميكرولتر من محلول بروتين كاف لكل 1 مل من نسبة السكروز (37.5 ميكرولتر 10٪ SDS، 7.5 ميكرولتر 0.5M EDTA، 1 ميكرولتر Glycoblue، 4 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين K).
  2. في 2 مل أنبوب أسفل شقة، واحتضان 1 مل جزء السكروز مع 50 ميكرولتر من محلول بروتين كاف في 55 ° Cلمدة 1 ساعة (في حال استخدام الكسور 500 ميكرولتر ضبط حجم محلول بروتين كاف وفقا لذلك).
  3. إضافة حجم مساو من الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي (125: 24: 1، ويفضل أن يكون الحمضية (الرقم الهيدروجيني 4.5) للحد من التلوث DNA) إلى كسور السكروز.
    ملاحظة: إضافة مبلغ إضافي 200 ميكرولتر من كلوروفورم إلى كسور 7-10 لأنها أثقل ويمكن الحصول على مقلوب مراحل.
    ملاحظة: الفينول / الكلوروفورم يمكن أن يسبب حروق على الاتصال والاستنشاق. ارتداء معطف المختبر، نظارات السلامة، واستخدام fumehood.
  4. دوامة ~ 30 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة ~ 80-90٪ من المرحلة المائية (لا تلمس البيني التي يمكن أن تحتوي على الحمض النووي الجيني) ومكان في أنبوب جديد.
  6. إضافة حجم مساو من كلوروفورم وكرر الخطوة 8.4.
  7. إزالة المرحلة المائية والحرص على تجنب البيني.
  8. إضافة 01:10 حجم M 3 خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2 (بدلا من 5 خلات الأمونيوم M يمكن استخدامها).
  9. إضافة 1.5 حجم المبرد، أبسولوالشركة المصرية للاتصالات الإيثانول ودوامة لمدة 15 ثانية.
  10. تترسب بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية (أو 1 ساعة عند -80 درجة مئوية إذا كان في عجلة من أمرهم).
    ملاحظة: هذه العينات يمكن أن تترك في -20 ° C لمدة أطول إذا لزم الأمر.
  11. الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  12. غسل بيليه مع 1 مل من المبرد الخالي من ريبونوكلياز الايثانول 70٪.
  13. الهواء الجاف بيليه و resuspend في 20 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه.
  14. قياس الحمض النووي الريبي مجموع من قبل الطيفي لضمان العائد والطهارة (على أساس A260 / 280 نسبة) كاف والمضي قدما لمعيار تحليل RT-14 QPCR باستخدام كميات متساوية من كل جزء والاشعال PCR محددة إلى مرنا (ق) من الفائدة.

9. عزل البروتينات من السكروز الكسور.

  1. بالإضافة إلى RNA، البروتينات يمكن عزل وتحديد الكسور في polysome الفردية كذلك. استخدام واحدة من العديد من البروتوكولات ممتازة متاحة للبروتين العزلة، على سبيل المثال 18.

Representative Results

وصفناها في الآونة الأخيرة دورا جديدا للورم القامع PDCD4 كمانع الترجمة الانتقائي للمن mRNAs ترميز مثبطات أفكارك XIAP وبي سي-XL-12 IRES إيواء. كان التنميط Polysome تقنية رئيسية لإثبات تورط محدد من PDCD4 في الترجمة IRES بوساطة. خلايا HEK293 تم عابر في استنزاف مستويات الذاتية من PDCD4 (الشكل 1A) ثم تعرض لpolysome تحليل الشخصية. لاحظنا أن مستويات الحد من PDCD4 لم تنل الترجمة الخلوية العالمية، والحكم عليها من خلال عدم وجود تغيرات في الشخصية polysome عند مقارنة siCTRL وsiPDCD4 الخلايا المعالجة (الشكل 1B). وبالمثل، كان polysome توزيع غير IRES-البديل من XIAP 19 دون تغيير بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة (الشكل 1C). في المقابل، polysome توزيع اثنين من mRNAs IRES-إيواء، XIAP وبي سي-XL، تم تغيير بشكل كبير. في غياب PDCD4 يتم إزاحة توزيع هذه من mRNAs اثنين الى ribopolysomes ثقيلة (الشكل 1D، E). لأن هذا لا يرافقه تغيرات في مستويات ثابتة للدولة من XIAP وبي سي-XL مرنا (الشكل 1F) وتوضح هذه النتائج المعززة ترجمة XIAP وبي سي-XL في الخلايا مع انخفاض مستويات PDCD4، وهو ما أكده أكثر من قبل الغرب النشاف (الشكل 1G).

الشكل 1
الرقم 1: يحدد ملامح Polysome PDCD4 كما مثبط انتقائي لXIAP وبي سي-XL الترجمة (A) تم علاج الخلايا مع HEK293 PDCD4 سيرنا أو التحكم (CTRL)، عدم استهداف سيرنا، هي lysed وتعرض لتحليل لطخة غربية مع المضادة للPDCD4 وأضداد نوكليولين للتحقق من مدى PDCD4 تدق إلى أسفل. (ب) وقد طرقت PDCD4 أسفل كما في (A) وتعرض لست] الخلية إلى polysome التنميط. ويظهر الملف polysome تمثيلي في لوحة أعلى. توزيع XIAP غير IRES (C)، بي سي-XL (D)، وXIAP IRES (E) من mRNAs النسبية إلى أن من GAPDH وكما هو مبين في المئة من إجمالي مرنا (٪ مرنا) في كل جزء. (F) ثابت تم قياس مستويات مرنا -state بواسطة RT-QPCR في PDCD4 سيرنا أو التحكم (CTRL) سيرنا الخلايا المعالجة. (G) ولست] من (A) تعرضوا أيضا إلى تحليل لطخة الغربية مع مكافحة XIAP، ومكافحة بي سي-XL، و أضداد نوكليولين. (ملحوظة: البيانات الواردة في الشكل (1) نشرت في الأصل في 12) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

التنميط Polysomal هي تقنية قوية تسمح لتقدير الدولة لترجمة النصوص محددة تحت ظروف معالجة مختلفة. إنها تقنية بسيطة جدا من حيث المبدأ إلا أنه يتطلب عدة خطوات التنفيذ، وبعضها بالغ الأهمية لإنتاج لمحات polysome جيدة. الخطوات الرئيسية هي: 1) استخدام المواد الكيميائية ريبونوكلياز خالية وبلستيكور، 2) إعداد التدرجات السكروز جيدة (في تجربتنا 10-50٪ التدرجات السكروز عمل أفضل لحل بكفاءة 40 / 60S مفارز من mRNAs ومع ريبوسوم منضمة)، و 3 ) باستخدام الخلايا التي تنمو باطراد وليس أكثر من 80٪ متموجة من أجل الاستيلاء على أعلى معدلات الترجمة. ينبغي اتخاذ هذه الخطوة الأخيرة في الاعتبار عند القيام العلاج بالخلايا طويلة، مثل ضربة قاضية الجينات أو overexpression، بحيث أن كمية الخلايا لوحة ستكون وظيفة لمدى سيتم متموجة الخلايا عند نقطة النهاية.

في نتائج حاضراهنا، كان تيد polysome تحليل الشخصية أداة هامة لتقييم دور PDCD4 في تنظيم ترجمة من mRNAs XIAP وبي سي-XL 12 بإيواء IRES. حقيقة أننا لم نلاحظ أي تغيير في الملامح العامة على polysome PDCD4 تدق إلى أسفل (الشكل 1B) يسمح لنا أن نستنتج أن PDCD4 لم يضعف الترجمة الخلوية العالمية في ظل ظروف التجربة. كنا بجوار تحليل RT-QPCR لتحديد توزيع XIAP وبي سي-XL من mRNAs في الخلايا تعامل مع PDCD4 أو الرناوات siRNAs السيطرة. QPCR هو الأسلوب المفضل لتحليل الشخصية polysome، خلافا لمعيار RT-PCR أو النشاف الشمالي، لأنه يسمح لكمية بدلا من التحليل شبه الكمي للتوزيع مرنا وللكشف عن التحولات الطفيفة في كفاءة متعدية بين العلاجات. باستخدام هذه التقنية، تمكنا من إظهار أن توزيع XIAP وبي سي-XL من mRNAs (كنسبة مئوية من إجمالي مرنا الهدف عبر غراممتجه نحو المنبه) وقد تحولت بشكل كبير إلى polyribosomes الثقيلة (من mRNAs مع عدد كبير من الريبوسومات المرتبطة بها) بعد PDCD4 تدق إلى أسفل (الشكل 1D، E)، مما يشير إلى زيادة في ترجمة هذه من mRNAs. وقد أكد هذا أيضا زيادة في XIAP وبي سي-XL مستويات البروتين ولكن ليس في مستويات RNA الحالة المستقرة لها (الشكل 1F، G). الأهم من ذلك، كان توزيع polysome من البديل غير IRES من XIAP دون تغيير بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة (الشكل 1C). بدلا من ذلك، يمكن تقديم كفاءة متعدية كنسبة من المحتوى مرنا في polysomes (الكسور عادة ما بين 5 و 10) مقابل monosomes (عادة كسور 2 إلى 4) 14.

استخدام الضوابط في جميع أنحاء بروتوكول مهم في التحقق من صحة أي polysome التنميط النتيجة، كما لا يمكن بمفردها أن يعزى قمم لوحظ من قراءات الامتصاصية في 254 نانومتر إلى RNA الريباسي (المنظفاتS، مثل تريتون X-100 تمتص بقوة في هذه المنطقة من الطيف وربما يحجب 40 / 60S قمم في قمة التدرج). التدرجات فارغة دون المحللة و / أو مع العازلة المحللة تحتاج إلى أن تدار لتحديد المساهمة النسبية للمخازن إلى الامتصاصية في 254 نانومتر. مصطنع الهياكل ترتيب أعلى يمكن أيضا أن تؤدي إلى تفسيرات خاطئة للpolysomes حيث توجد في الواقع لا شيء (على سبيل المثال "شبه polysomes" 20). امتصاص المغنيسيوم (التي تستخدم في جميع أنحاء الداخلي لتحقيق الاستقرار ريبوسوم 80S) مع EDTA ثنائي التكافؤ الموجبة خالب وأضاف أن ولست] إلى المخزن المؤقت التدرج (20 ملم لمدة 15 دقيقة) سوف يسبب فصل الريبوسوم إلى مكوناته الصغيرة (40S) والكبيرة (60S ) مفارز. وبالتالي، إذا قمم الامتصاصية سجلت في 260 نانومتر هي في الواقع polysomes، سوف تنهار العلاج EDTA بحيث لا تتجاوز واحد وسيراعى بالقرب من أعلى التدرج الذي يتوافق مع تحرير مرنا وحدات الريباسي في الملف (لا تظهر البيانات). متماكنمع الانهيار الناجم عن EDTA من الوضع، كل أهداف محددة تحليلها من قبل QPCR الآن يجب أن توجد في الجزء العلوي من التدرج.

عدد ريبوسوم المرتبطة مرنا ليست دائما مؤشرا على مدى كفاءة مرنا بشكل خاص أن يتم ترجمتها. في الواقع، هناك سياقات محددة فيها الترجمة النشطة في polysomes يصبح توقفت 21،22 والتي ينبغي أن يكون القارئ على علم. تحديد ما إذا كان أو لم يكن النصوص وتشارك بنشاط مع الترجمة الآلية يمكن أن تقوم به أ) معالجة العينة مع بوروميسين، والتي خلافا EDTA، يسبب "الاعادة" من ريبوسوم التي translocating بنشاط عبر مرنا، أو ب) معالجة عينة مع homoharringtonine الذي يحول النبات فقط الريبوسوم الأول في كودون البداية، مما تسبب في "جولة الإعادة" أي ريبوسوم translocating المصب مرة أخرى.

استخدام النصوص السيطرة لتحليل QPCR أمر بالغ الأهمية أيضا. وSELECنشوئها من النصوص التي لا تتأثر بالظروف معاملة مختلفة مثل بعض الجينات التدبير المنزلي (GAPDH، أكتين، تويولين، نوكليولين)، من mRNAs الريباسي (18S، RPL13A) أو في هذه الحالة البديل غير IRES للXIAP IRES، المهم في التحقق اذا تأثير العلاج على الترجمة هو محدد أو تعميمها. هذه النصوص تحكم يمكن استخدامها لتطبيع توزيع من mRNAs تحليلها كما حدث هنا (تم تطبيع XIAP وبي سي-XL من mRNAs إلى GAPDH مرنا ويعبر عنه كنسبة مئوية من إجمالي المحتوى مرنا يمثلها مجموع المحتوى مرنا في كل جزء ) أو بدلا من ذلك، الهدف والسيطرة من mRNAs يمكن التعبير عن القيم المطلقة وتظهر بشكل منفصل. تحليل QPCR من المدخلات لست] (عادة 10٪ من الحجم الكلي) هو خطوة أخرى من شأنها أن تحكم لتوزيع من mRNAs محددة. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون مرنا من المحتوى لنص معين في المحللة مدخلات تعادل مجموع المحتوى مرنا في جميع الكسور 10 تحليلها. أخيرا، وهي خطوة اختيارية للتحكم عن الفينول: خطوة استخراج الكلوروفورم هي ارتفاع كل جزء polysome مع مرنا في المختبر كتب مراسل (مثل اتفاقية مناهضة التعذيب، الكلورامفينيكول ترانسفيراز الاسيتيل) التي سيتم قياسها لاحقا QPCR ويمكن حتى أن تستخدم للتطبيع البيانات 14.

كما هو الحال مع أي تقنية، يقدم التنميط polysome بعض القيود. الحقيقة التي عادة ما لا يقل عن 10 الكسور (قد يتطلب تحولات أكثر دهاء في كفاءة الترجمة 20 أو أكثر) تحتاج إلى جمعها من أجل الحصول على توزيعات polysome طيبة يجعل هذه الخطوة تحد، بمعنى أنه فقط كحد أقصى من 4 عينات يمكن أن يكون تحليلها في وقت لتكون قادرة على التعامل بشكل مريح استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل 40 عينة من QPCR والضوابط 4 المدخلات في وقت واحد. حجم العينة يمكن أن تضيف بسهولة مع عدد من النصوص لتحليلها وعدد QPCR يكرر القيام به، وهذا يمكن أن يكون مكلفا. آخر الحد من polysomal مقرها QPCR-التنميط وnalysis هو أنه لا يمكن أن يتم إلا على النهج القائم على مرشح (حيث يتم تحليل النصوص إلى معروفة مسبقا) والتي لا يمكن تطبيقها لتحليل الجينوم على نطاق الترجمة. ومع ذلك، في بداية القرن 21، بدأ المحققون في استجواب RNA polysomal بهم على المستوى الجيني باستخدام الحمض النووي ميكروأرس 15، ومؤخرا مع الجيل المقبل من التسلسل 16،17. في هذا النهج القوي، يتم إجراء التنميط polysomal كما هو موضح في هذا البروتوكول إلا أنه بدلا من إجراء تحليل QPCR الكسور الفردية، monosomes الكسور (عادة جزء 2-4) وpolysomes الكسور (عادة كسور) يتم تجميع معا والاختلافات في الترجمة العالمية حلل بواسطة ميكروأري DNA أو RNA كامل الجينوم التسلسل. وبالتالي مع هذا النهج، فمن الممكن لتقييم كل من mRNAs التي التوزيع التحولات من polysomes لmonosomes (النقص في الترجمة) أو العكس (زيادة في الترجمة) على علاج معينمنة. ويمكن بعد ذلك أن يتم التحقق من صحة النوعي والكمي لتوزيع polysomes مرنا محدد من QPCR. لاستخدام أكثر قوة من مبدأ التنميط polysomal هو التنميط الريبوسوم. وأفادت التقارير أيضا تمديد إنتاجية عالية من هذه التقنية في الآونة الأخيرة التي تسمح للرصد في وقت واحد من مئات polysome الكسور 23. وهذا يوفر ميزة واضحة عند تحقق الكفاءة متعدية مجموعات متحولة أو في شاشات رني على نطاق واسع. التنميط الريبوسوم هو الاسلوب الذي يستفيد من الجيل القادم لتسلسل الخريطة شظايا الحمض النووي الريبي التي تحميها ريبوسوم (آثار أقدام الريبوسوم) تشارك في تخليق البروتين 24،25. في هذه التقنية، يمكن أن تحول دون النبات الريبوسوم مع سيكلوهيكسيميد (عكسها) أو إيميتين (لا رجعة فيه)، يليه تحلل الخلايا وريبونوكلياز الهضم لانتاج عدد سكانها آثار أقدام الريبوسوم. يتم إثراء ريبوسوم، يتم عزل الحمض النووي الريبي مجموع، وتتم إزالة تلوث الريباسي وRNA الريباسي الميتوكوندريا.آثار أقدام RNA حوالي 26-28 النيوكليوتيدات هي معزولة، عكس كتب، وتحويلها إلى مكتبة [كدنا] والتسلسل 26. عكس polysome التنميط القياسية، وهذا النهج ليس فقط يحدد من mRNAs محددة تنظم translationally ولكن أيضا يعطي معلومات مرنا محددة في قرار كودون مثل الاحتلال الدقيق وكثافة ريبوسوم على طول النص المحدد. وهذا هو على وجه الخصوص من اهتمام لمن mRNAs مع وسائل محددة مثل الترجمة من mRNAs IRES-إيواء، لأنها يمكن أن تعطي المزيد من المعلومات حول مكان على نسخة الريبوسوم التوظيف يحدث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient Master 108 automated gradient maker BIOCOMP 107-201M
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker LABCONCO 4517000
Beckman Ultracentrifuge  Beckman Coulter Model # L-100-XP
Density gradient fractionator TELEDYNE ISCO 69-3873-246 Composed of: tube piercing system,  peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector
WinDaq data acquisition software DATAQ INSTRUMENTS WINDAQ/LITE http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) Beckman Coulter 331372
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) DiaMed PRE1900-N
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) SafeSeal 12000
Sucrose (nucleases-free) Calbiochem 573113 MW = 342.3 g/mol
Cycloheximide SIGMA C7698 MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.
Sodium chloride (nucleases-free) OmniPur 7710 MW = 58.44 g/mol
MgCl2.6H2O (nucleases-free) OmniPur 5980 MW = 203.3 g/mol
Tris Base (nucleases-free) J.T. Baker 4109-01 MW = 121.14 g/mol
Triton X-100 OmniPur 9400 Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2515
RNaseZap Rnase inactivation solution Ambion, Life Technologies AM9780
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) Invitrogen, Life Technologies AM9516
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Ambion, Life Technologies AM9722 Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246, (1), 174-181 (1971).
  3. Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8, (4), 479-487 (1975).
  4. Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25, (19), 2057-2068 (2011).
  5. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40, (2), 541-552 (2012).
  6. McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6, (1), 9-17 (2014).
  7. Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26, (4), 1355-1372 (2006).
  8. Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115, (6), 739-750 (2003).
  9. Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17, (4), 719-729 (2010).
  10. Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100, (1), 27-38 (2008).
  11. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486, (7401), 126-129 (2012).
  12. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32, (10), 1818-1829 (2012).
  13. Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9, (3), (2013).
  14. Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33, (2), 307-318 (2013).
  15. Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (19), 10632-10636 (1999).
  16. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14, (11), (2013).
  17. Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (24), 9818-9823 (2013).
  18. Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6, (9), 1465-1472 (1997).
  19. Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38, (14), 4665-4674 (2010).
  20. Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447, (7146), 875-878 (2007).
  21. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146, (2), 247-261 (2011).
  22. Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (40), 16205-16210 (2013).
  23. Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32, (10), (2004).
  24. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, (5924), 218-223 (2009).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15, (3), 205-213 (2014).
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7, (8), 1534-1550 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics