Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

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Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (92), e52295, doi:10.3791/52295 (2014).

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Abstract

Regulation der Proteinsynthese stellt einen wichtigen Kontrollpunkt in der zellulären Antwort auf Stress. Insbesondere wurden diskreten RNA Regulationselemente gezeigt, die selektive Translation bestimmter mRNAs, die für Proteine ​​codieren typischerweise für eine bestimmte Stressantwort erforderlich zu ermöglichen. Identifizierung dieser mRNAs als auch die Charakterisierung von regulatorischen Mechanismen für die selektive Translation verantwortlich ist, an der Spitze der molekularen Biologie seit einiger Zeit. Polysom ​​Profilierung ist ein Eckpfeiler Verfahren in diesen Studien. Das Ziel Polysom ​​Profilierung ist es, mRNA-Translation durch Immobilisierung aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte erfassen und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte und schlecht übersetzt Einsen. Diese können dann durch traditionelle biochemische und molekularbiologische Methoden charakterisiert werden. Wichtig ist, dass die Kombination von polysome Profilierung mit hohem Durchsatz genomische Ansätze erlaubt eine groß angelegte Analyse der Translationsregulation.

Introduction

Regulation der Proteinsynthese (Translation) ist ein Schlüssel zellulären Prozess, der eng mit zellulären Überleben verknüpft ist. Da Übersetzung verbraucht mehr als 50% der Energie Zelle, ist es nicht verwunderlich, dass Übersetzung ist streng reguliert, und dass Störungen in der Übersetzung nicht gut vertragen. Umgekehrt sind viele aberrante zelluläre Prozesse erfordern, dass Translationsmaschinerie und Übersetzungs Ausgang (dh Proteom) müssen geändert werden. Dies ist häufig in verschiedenen Stressantwort und Krankheitszuständen der Fall, und ist wahrscheinlich am besten in der Krebsbeispielhaft dargestellt. Ein wesentlicher Vorteil der Translationskontrolle ist die Fähigkeit von Zellen, sich schnell neu zu programmieren, die das Protein Ausgabe in Reaktion auf verschiedene externe und interne Trigger, wodurch eine Feinabstimmung Mechanismus, neigt das Gleichgewicht zwischen Zellüberleben und Tod 1.

Zwei Aspekte der Translationskontrolle sind besonders interessant; Verständnis der Natur des Regelungs mechanism (s) und Kontrollelemente, die für bestimmte Übersetzung zu ermöglichen, und die Identifizierung von spezifischen mRNAs und deren Proteinprodukte, die in der zellulären Reaktion auf den Trigger, insbesondere selektive Translation in erster Linie ausgelöst teilzunehmen. Polysomen-Profilierung ist eine Technik, die effektive Untersuchung beider Prozesse ermöglicht.

Das übergeordnete Ziel des Polysom ​​Profiling-Technik ist, um zu studieren und zu quantifizieren Übersetzung Zustand spezifischer mRNAs unter verschiedenen zellulären Bedingungen. Das Prinzip der Technik ist es, die mRNA-Translation durch '' Einfrieren '' aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte (von mehreren Ribosomen gebunden) erfassen und schlecht übersetzt Einsen (mit einem oder zwei Ribosomen gebunden). In diesem speziellen Protokoll, das Antibiotikum Cycloheximid, die das bindet60S ribosomalen Untereinheit und blockiert die Freisetzung von deacetyliertes tRNA aus dem Ribosom E Park 2, wird verwendet, um Ribosomentranslokation hemmen und Stall Ribosomen an der Übersetzung mRNAs. Aber auch andere Blockierungsmittel, wie Emetin, die auch Blöcke Translationselongation 3, können verwendet werden.

Im Gegensatz zu dem Western Blotting und 35 S-Methionin-Markierungstechniken, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses zu messen, Polysomen-Profilierung hat den Vorteil der Messung Ribosomen Verbindung mit aktiv-translatierte mRNAs, wodurch für eine genauere Untersuchung der Übersetzungsmechanismen unter verschiedenen Bedingungen. Daher kann die Technik leicht an spezifisch untersuchen verschiedene Modi der Übersetzung 4-6 werden die Übersetzungsregelung 7-9, Stressbedingungen beeinflussen die Proteinsynthese 1,10,11 oder die Auswirkungen von mRNA-Strukturen wie IRES oder stromaufwärts beteiligten Proteine ​​Faktoren offene Leserahmen auf die Protein synthESIS 12-14. Heutzutage sind Polysom ​​Profilierung Anwendungen noch breiteres mit dem Einsatz von DNA-Microarrays 15 oder Next-Generation-Sequencing 16,17 zu analysieren Polysomen-assoziierte mRNAs.

Protocol

Hinweis: Ein Hinweis auf die Arbeit mit RNA: Nehmen Sie Standard-Sicherheitsvorkehrungen, um gegen RNA-Abbaus durch RNasen zu schützen. Verwenden Sie Handschuhe, Barrierepipettenspitzen, RNase-freie Kunststoffgeschirr und Chemikalien in allen Schritten des Protokolls. Verwenden Reinstwasser oder DEPC-behandeltem Wasser für alle Lösungen. Dekontaminieren alle vermuteten Oberflächen mit RNase-Inaktivierung Lösung nach Herstellerprotokoll.

1. Herstellung der Lösungen.

  1. Vorbereitung 500 ml Grundlösung (0,3 M NaCl;. 15 mM MgCl 2 6H 2 O; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Mischen Sie mit einem Rührstab, bis die Lösung klar ist und durch ein 0,45 um Filter. Lagerung bei Raumtemperatur.
  2. Bereiten 10 und 50% Saccharoselösungen und 60% Chase Lösung wie folgt:
    1. Für 10% Saccharose-Lösung (w / v) in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen 5 g Saccharose und füllen auf 50 ml mit Basislösung. 50% ige Saccharoselösung (w / v), in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen add 25 g Saccharose und füllen auf 50 ml mit Basislösung.
    2. Für 60% (w / v) Chase-Lösung, in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen werden 30 g Saccharose und füllen auf 50 ml mit Basislösung. 100 l gesättigte Bromphenolblau-Lösung (fügen Bromphenolblau zu Wasser, bis nicht mehr auflösen; Zentrifuge, um die ungelösten Pulverpellet) an die 60% Verfolgungsjagd Lösung. Mischen Sie mit einem Vortex und überprüfen vollständige Auflösung.
    3. Shop-Lösungen bei 4 ° C, bis sie benötigt.
  3. Bereiten RNA Lysepuffer. Bereiten Sie diesen Puffer frisch am Tag des Experiments. Vorbereitung 500 ul RNA Lysepuffer für jede Probe. Zu 1 ml Grundlösung werden 10 ul Triton X-100 (1% [v / v] endgültig), 1 ul 100 mg / ml Cycloheximid in DMSO (CHX, 0,1 mg / ml final) und 3,5 ul RNasin (140 U / ml). Mischen Sie mit einem Vortex. Halten Sie auf dem Eis.
    HINWEIS: Cycloheximid ist hochgiftig und können Mutationen verursachen. Hautkontakt und Einatmen vermeiden. Um die Handhabung des Pulverform zu oft zu vermeiden, prepsind eine größere Menge von 100 mg / ml Stamm in DMSO, aliquoten und halten bei -80 ° C zur Langzeitlagerung. Arbeiten Sie Lager bei -20 ° C.
  4. Der Tag des Experiments vorbereitet Sucrose + CHX-Lösungen durch Zugabe von CHX (Endkonzentration 0,1 mg / ml) auf das gewünschte Volumen von 10% und 50% Saccharose-Lösung (~ 7 ml jeder Lösung pro Gradient).

2. Herstellung von Saccharosegradienten Verwendung eines automatisierten Gradient Maker

  1. Drehen Sie den Gradienten maker '' auf '' und das Niveau der Platte, die die Steigungen halten wird (criticalstep!) Klicken Sie auf '' Fertig '', wenn die Platte wird eingeebnet.
  2. Wählen Sie im Menü des Gradienten-Programm ausgeführt werden soll:
    1. Drücken Sie '' GRAD '' Menü und wählen Sie '' LIST ''.
    2. Wählen Sie "SW41".
    3. Blättern Sie durch die Liste und wählen Sie das ''10 - 50% Steigung - 11 Stufen' 'Programm durch drückening die Schaltfläche '' 'RUN'.
  3. Legen Sie eine konische Ultrazentrifugenröhrchen (SW-41 Röhre, 14 x 89 mm) in die Marker-Block und den Gebrauch der bereitgestellten feine Röhre Marker, um eine Markierung auf dem Rohr entlang der oberen Stufe des Markerblock zu verfolgen. Die Röhrchen in einem passenden Gestell auf einem stabilen Oberfläche.
    HINWEIS: Diese Kennzeichnung wird die Füllung Führung für die Schichtung der 10 und 50% Saccharose-Lösungen sein.
  4. Befestigen Sie die beiden mitgelieferten Kanüle in zwei 10 ml Spritzen und Waschen durch Auf- und Abpipettieren mit warmem destilliertem Wasser, das RNase-Inaktivierung Lösung. Achten Sie darauf, um alle Spuren von Wasser danach entfernen.
  5. Füllen Sie eine der Spritzen mit 10% Saccharose + CHX und legen Sie die Kanüle an der Unterseite des Ultrazentrifugenröhrchen. Sanft verzichten 10% Saccharose-Lösung, bis sie kurz hinter der Markierung auf dem Rohr geht.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen. Wenn sich Blasen bilden, klopfen Sie leicht Röhre, um sie zu verdrängen.
  6. Füllen Sie die anderen Spritze mit 50% Saccharose + CHX, wischen überschüssige Flüssigkeit ausmit einem Wischen und schieben Sie die Kanüle an der Unterseite des Ultrazentrifugenröhrchen. Sanft verzichten die 50% Saccharose-Lösung, bis es genau die Markierung erreicht. Schnell und reibungslos entfernen Sie die Kanüle.
    HINWEIS: Die 10% Saccharose sollte im Rohr steigen und bilden einen Meniskus an der Spitze. Falls nicht, fügen Sie mehr 10% Saccharose-Lösung an der Oberfläche.
  7. Legen Sie die mitgelieferte Schutzkappe durch Kippen des Ultrazentrifugenröhrchen leicht und verdrängen alle Luftblasen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit in der Kappe Reservoir mit einem Mikropipette.
  8. Wischen Sie überschüssige Flüssigkeit entlang der Rohrwand und auf den Gradienten maker Platte.
  9. Drücken Sie die Taste "" 'RUN'.
    HINWEIS: Die Platte wird im vorgeschriebenen Winkel kippen, Pause für 5 sec und die Drehungen zu bilden die Steigung beginnt.
  10. Wenn Gradientenbildung abgeschlossen ist (ca. 2 min, wird die Maschine piept), entfernen Sie vorsichtig die Ultrazentrifuge (n), findet am Rack und schnell entfernen Kappe in einer Aufwärtsbewegung zu vermeiden, die Gradie störennt.
  11. Halten Gradienten (n) auf Eis. Bitte nicht stören! Alternativ halten Gradienten über Nacht bei 4 ° C.
  12. Alternativ können Sie einen Zweikammer-Gradienten maker Gradienten machen wie folgt:
    1. Rinse Schläuche und Gradient Maker mit RNase-Inaktivierung Lösung und RNase-freies Wasser.
    2. 5 ml 50% Saccharose + CHX zu proximalen Kammer des Gradienten maker und sicherzustellen, dass keine Luft zwischen den beiden Kammern entfernt wird.
    3. 5 ml 10% Saccharose + CHX zu distalen Kammer des Gradienten maker.
    4. 0,5 ml von 50% Sucrose + CHX nach unten aus einem konischen Zentrifugenröhrchen (SW 41-Rohr, 14 x 89 mm) und in Rohrhalter.
    5. Schalten Sie Rührer in proximalen Kammer platziert, offene Hähne und Einlagen Gradienten bei der Geschwindigkeit auf "3" (ca. 1 ml / min) eingestellt.
    6. Platz Gradienten (n) auf Eis. Bitte nicht stören.
      HINWEIS: Gradienten über Nacht bei 4 ° C aufbewahrt werden.

3. Zell-Lyse und Ultrazentrifugation.

    Zeigen SW-41 Rotor und Schaufeln bei 4 ° C und stellen Sie Zentrifuge auf 4 ° C.
    HINWEIS: Die Zelllyse Verfahren wird für zwei subkonfluenten 150 mm (~ 70-80% konfluent) Platten aus HEK293 Zellen pro Gradienten optimiert und die verwendeten Mengen müssen möglicherweise für verschiedene Zelllinien eingestellt werden.
  1. Plattenzellen auf der entsprechenden Zelldichte in dem Wachstumsmedium mindestens 24 Stunden vor der Lyse.
  2. Bereiten Sie ein Aliquot (20 ml pro 150 mm Platte) von Wachstumsmedien, die 0,1 mg / ml CHX.
  3. Zellen in CHX + Medien inkubieren (20 ml pro 150 mm-Platte) für 3 min bei 37 ° C / 5% CO 2 zu verhaften und zu stabilisieren Polysomen.
  4. Schnell arbeiten, absaugen Medien aus Platten, statt Platten auf Eis und waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml eiskaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) ergänzt mit CHX (Endkonzentration von 0,1 mg / ml) vorsichtig, um langsam den sid pipettierene der Schalenwand, um das Anheben der Zellmonolayer zu minimieren.
  5. Saugen PBS und fügen Sie eine zusätzliche 10 ml PBS + CHX zu jeder Platte, kratzen Zellen mit einem Zellheber und übertragen das Gesamtvolumen von beiden Platten zu einem 50 ml Zentrifugenröhrchen auf Eis. Behalten 1 ml der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis nachgeschalteten Proteinanalyse.
  6. Zentrifugenröhre 50 ml der Zellen bei 300 × g bei 4 ° C für 10 min.
  7. Entfernen Sie das gesamte PBS und Pellet in 500 ul eiskaltem RNA Lysepuffer.
  8. Übertragen Zellsuspension in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  9. Pipette auf und ab zu lysieren Zellen und Inkubation auf Eis für 10 Minuten unter gelegentlichem Vortexen.
  10. Zentrifugation bei 2.000 × g bei 4 ° C für 5 min pelletiert Kernen.
  11. Überstand in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß.
  12. Zentrifuge bei 17.000 × g bei 4 ° C für 5 min, um die Zelltrümmer zu pelletieren.
  13. Überstand in ein neues 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen und benutzen 2 ul zu messenoptische Dichte bei 260 nm (Verwendung Lysepuffer wie leer).
  14. Entfernen 50 ul (10% der Gesamtmenge) von jeder Probe für die Analyse von Gesamt-RNA. HINWEIS Lysate können bei -80 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden.
  15. Gleich A260 Einheiten vorsichtig laden auf jeden Saccharosegradienten (10 OD min, optimale 25 OD, in einem maximalen Volumen von 500 ul;. Verdünnte konzentrierte Lysat mit zusätzlichen Lysepuffer, wenn nötig).
  16. Stellen Sie sicher, Steigungen sind innerhalb von 0,1 g voneinander vor Ultrazentrifugation.
  17. Zentrifuge Gradienten bei 39.000 rpm (260.343 × g) für 1,5 h bei 4 ° C.
  18. Während Spindown halten Rotorbremse auf und schalten Sie ihn aus während der Verzögerung, wenn es 1000 rpm erreicht.
    HINWEIS: Dieser Schritt jede Störung der Gradienten durch abrupte Änderungen der Beschleunigung verursacht, wie die Bürstenköpfe an den Rotor beim Bremsen minimiert.

4. Gradient Fraktionierungssystem Instrument Set-up.

  1. Set-up das Instrument und leere die spectrophotometer mit Wasser wie folgt:
    1. Schalten Sie die Komponenten und die Lampe, warm-up für mindestens 15 min.
    2. Stellen Sie sicher, Fraktionssammler zum "Polysom ​​'Verfahren eingestellt ist (zweimal drücken Ordnersymbol; Rück Pfeil zweimal, um Startbildschirm zurückzukehren).
    3. Stellen Sie sicher, das Ventil an der Fraktionssammler wird auf (Pfeil nach Papierkorbsymbol) zu verschwenden. Platzieren Sie einen 250 ml Erlenmeyerkolben mit destilliertem Wasser unter dem Abfallsammelröhrchen.
    4. Wählen Sie die folgenden Einstellungen auf dem Schreiber: Set Sensitivity -Rad 'SET Lampe und die Optik'; eingestellt Rauschfilter-Schalter auf '1.5'; gesetzt Spitzentrennwähler auf "AUS"; gesetzt Tabelle Kurzwahl '30 cm / h '(5 cm / 10 min); Set Baseline einstellen Wahl (oben auf dem Spektralphotometer Einheit) auf 'MAX AUF'.
      HINWEIS: Optional: Eine Digitalrekorder-Software kann anstelle der Schreiber verwendet werden. Auf dem Computer, klicken Sie auf "Start". Eine Übernahme-Fenster wird geöffnet: unter the-Optionen-Menü die Markierung Pause Grafiken. Unter Skalierung festgelegten Grenzen des Diagramms auf -10 und 100 (kann geändert on-the-fly während der Lauf werden). Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern, um eine neue Datei zu erstellen und notieren Sie die Sicht.
    5. Legen Sie die Spritze und Fass in der Pumpe und ziehen in Stelle (Verwendung mitgelieferten Schrauben und Sechskantschlüssel).
      HINWEIS: Nicht zu fest anziehen.
    6. Füllen Sie die Spritze mit Chase-Lösung unter Verwendung der '' REV '' Befehl mit rasanter Geschwindigkeit. Stellen Sie die Pumpe in aufrechter Position und jagen Luft durch den Schlauch mit dem '' forward '' Befehl. Verwenden Sie nur RAPID für diese Funktion und Waschungen.
    7. Installieren Sie ein Ultrazentrifugenröhrchen mit RNase-freiem Wasser gefüllt.
    8. Pierce die Ultrazentrifugenröhrchen mit der Kanüle, bis die zwei schwarzen Flecken sichtbar sind (die Abgabeloch ist zwischen diesen beiden Markierungen befinden) und starten Spritzenpumpe auf '' Manual '' bei 6,0 ml / min.
    9. Da das Wasser durch die Durchflusszelle (wenn chase Lösung füllt 1/3 der Röhre), Schalter Geschwindigkeit variabel und auf 1,0 ml / min eingestellt.
    10. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml / min, können die Grundlinienwahl einstellen zu dem Spektrophotometer, bis die Spannung auf dem Diagramm ist auf Null (+/- 0,5 Einheiten).
      Hinweis: Beachten Sie Wasseraustritt aus dem Abfallrohr in den Erlenmeyerkolben.
    11. Stellen Sie die gewünschte Empfindlichkeit zu "0.5" oder "1.0" AU.
      HINWEIS: 1,0 AU besten für 10 OD-Einheiten in einem 10 ml-Gradienten. Wenn OD kleiner als 10 ', 0.5' Empfindlichkeit kann verwendet werden, um Signal verbessern.
    12. Drücken Sie die Auto-Baseline-Taste und stellen Sie die Ausgangseinstellung auf die 10% -Marke auf dem Schreiber durch Drehen der Recorder Offset Wahl (optional bei Verwendung von Digitalrecorder).
    13. Sobald eine stabile Basislinie erreicht ist, drehen Sie den Pumpenschalter auf "OFF" und die Vorschubgeschwindigkeit Wahl bis 60 cm / h bei Verwendung von analogen Schreiber oder 'AUS' bei Verwendung von Digitalrekorder.
    14. Wiederherstellen der Chase-Lösung durch Einschalten Pumpe an "REPosition V '(falls nötig kann man Flussrate wieder auf 6,0 ml / min zu erhöhen ... DO NOT USE RAPID), bis er die erste Markierung auf der Stichkanüle erreicht.
    15. Entfernen Zentrifugenröhrchen und jagen alle Luftblasen innerhalb der Kanüle, indem Sie ein wenig von der Chase-Lösung durch. Wischen Sie das Piercing Bühne sauber.
      HINWEIS: Einige Restwasser kann aus der Durchflusszelle austreten.

5. Gradientenfraktionierung und Entnahme von Proben.

  1. Installieren und durchbohren die Zentrifugenröhrchen, das die Saccharose-Gradienten.
  2. Zeigen elf 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen in den Fraktionssammler Fach Positionen 1-11, dass die Kappen nicht nach oben herausragen. Ersetzen '' Rohr # 1 '' für jetzt mit einem '' Abfallrohr '', jede Flüssigkeit in der Sammelschlauch links zu sammeln.
  3. Stellen Sie die Pumpe Steuerschalter auf 'Manual' und die Strömungsgeschwindigkeit auf der Spritzenpumpe zu "6,0 ml / min" Drücken Sie das Symbol "Play" auf der Fraktionssammler. Sobald der Arm das erste Rohr erreicht, drücken Sie die Taste "" "Pause" (dies wird die Armhaltung und öffnen Sie die Bruch-Zapfventil).
  4. Starten Sie die Pumpe mit dem '' forward '' Befehl und Überwachung Schreiber Stift. Wenn es beginnt Ablenkung nach oben (was anzeigt, dass Probe wird durch die Durchflusszelle des Spektrometers vorbei), schnell zu ersetzen '' Abfallrohr '' mit '' Rohr # 1 ''.
  5. Wenn der erste Tropfen wird gesammelt, schnell wechseln Befehle an 'Remote Start / Stop', '' Variable (1,0 ml / min) '' und drücken Sie '' Play '' Symbol.
    HINWEIS: Die Pumpe wird jetzt von dem Fraktionssammler-Schnittstelle gesteuert und 1 ml-Fraktionen werden alle min gesammelt werden.
  6. Von diesem Punkt an wird A260 Ablesungen auf dem digitalen Rekorder-Schnittstelle (oder dem analogen Diagramm angezeigt recorder). Achten Sie darauf, die '' Record '' Taste auf der Software betätigt wird!
  7. Nachdem der blaue Chase Lösung tritt in die Sammelrohr oder das letzte Rohr (in der Regel Rohr 11), drücken Sie "Stop" Symbol.
    HINWEIS: Das Zapfventil sollte dem Ablaufventil wechseln.
  8. Halten Fraktionen auf Eis, bis alle Farbverläufe wurden fraktioniert. Am Ende des Tages Fraktionen bei -80 ° C vor der Protein- oder RNA-Isolierung aufbewahrt werden. Wenn Protein und RNA-Analyse erforderlich ist, aufgeteilt jede Fraktion in die Hälfte (je 500 & mgr; l für Protein- und RNA-Analyse).

6. Waschen

HINWEIS: (Dies ist ein optionaler Schritt, um nur durchgeführt werden, wenn mehrere Gradienten gesammelt werden sollen).

  1. Tauchen Sie den Abflussschlauch in den Erlenmeyerkolben mit ~ 50 ml Reinstwasser und umgekehrt die Pumpe mit einem 6 ml / min Volumenstrom.
  2. Stoppen Sie die Pumpe, wenn der Chase-Lösung erreicht den ersten Markierung on das Piercing Kanüle.
  3. Entfernen Sie die Zentrifugenröhrchen, jagen keine Luft aus der Kanüle und reinigen das Piercing Bühne.
    HINWEIS: Einige Restwasser kann aus der Durchflusszelle austreten.
  4. Wiederholen Sie die Fraktionierung Vorgang ab Schritt 5.1.

7. Schlussabgleich.

  1. Trennen Sie den Pumpenschlauch aus dem Boden der Piercer und pumpen das Chase-Lösung in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit der Schnelldurchflusseinstellung. Bewahren Sie die Chase-Lösung bei 4 ° C, wie sie wiederverwendet werden können.
  2. Verbinden Pumpenschlauch zu einem 3-Wege-Schlauchsystem und Schließen des Ventils führt zu der Spritze. Verbinden eines Rohres mit einem 50-ml-Spritze mit destilliertem Wasser und das andere Rohr an der Basis des Dorns gefüllt.
  3. Installieren Sie den Ultrazentrifugenröhrchen für den Stanzschritt verwendet und geben mindestens 50 ml destilliertem Wasser durch das Spektralphotometer und Sammelröhrchen (Schalter auf Menü Sammlung auf der Schnittstelle durch Klicken auf die '' Start / Pause Symbol '').
  4. Entfernen Rohr, Spritze (Verwendung Inbusschlüssel Schrauben entfernen) und alle anderen Wechselkomponenten und mit warmem Leitungswasser gründlich waschen und dann mit hochreinem Wasser spülen.
    HINWEIS: Besondere Vorsicht beim Waschen des Kolbens, Fass, Schläuche und Piercing Kanüle.
    HINWEIS: Gehen Sie mit dem Glasspritzenzylinder mit Sorgfalt! Lagern Sie alle Komponenten vor Staub.
  5. Wischen Boden der Durchflusszelle mit einem weichen Tuch mit destilliertem Wasser befeuchtet. Wischen Sie die Fraktionssammler Fach und alle anderen Bereiche, in denen die Saccharose wurde möglicherweise verschüttet wurde.

8. Isolierung von RNA aus Sucrose Fraktionen.

  1. Vorbereitung 50 & mgr; l Proteinase K-Lösung pro 1 ml Saccharose-Fraktion (37,5 & mgr; l 10% SDS, 7,5 ul 0,5 M EDTA, 1 ul Glycoblue, 4 ul 20 mg / ml Proteinase K).
  2. In 2 ml Röhre mit flachem Boden, Inkubation 1 ml Saccharose-Fraktion mit 50 ul Proteinase K-Lösung bei 55 ° C1 h (bei Verwendung von 500 ul Fraktionen entsprechend anpassen Volumen Proteinase K-Lösung).
  3. Ein gleiches Volumen an Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol den Saccharosefraktionen (125: 24 1, vorzugsweise sauer (pH 4,5), um DNA-Kontamination zu minimieren).
    HINWEIS: Mit einem zusätzlichen 200 ul Chloroform Fraktionen 7-10, weil sie schwerer sind und Phasen invertiert werden könnten.
    HINWEIS: Phenol / Chloroform bei Berührung Verbrennungen und Einatmen. Tragen Laborkittel, Schutzbrille und verwenden Sie einen Abzug,.
  4. Wirbel ~ 30 sec und Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Entfernen ~ 80-90% der wässrigen Phase (nicht berühren Interphase, welche genomische DNA enthalten könnten) und in neue Röhre.
  6. Hinzufügen eines gleichen Volumen Chloroform und wiederholen Sie Schritt 8.4.
  7. Entfernen wässrige Phase vorsichtig zu Interphase zu vermeiden.
  8. Hinzufügen 1.10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 (alternativ 5 M Ammoniumacetat verwendet werden kann).
  9. In 1,5 Volumina gekühlt, absolute Ethanol und Vortex für 15 Sekunden.
  10. Auszufällen über Nacht bei -20 ° C (oder 1 Stunde bei -80 ° C, wenn in Eile).
    HINWEIS: Die Proben können bei -20 gelassen werden ° C für länger, falls erforderlich.
  11. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 30 min bei 4 ° C.
  12. Mit 1 ml gekühltem RNase-freien 70% Ethanol waschen des Pellets.
  13. Luft trocknen das Pellet resuspendieren in 20 ul RNase-freies Wasser.
  14. Quantifizieren von Gesamt-RNA durch Spektrophotometrie um eine angemessene Ausbeute und Reinheit (bezogen auf A260 / 280-Verhältnis) zu gewährleisten und zur Standard RT-qPCR-Analyse 14 unter Verwendung gleicher Volumina von jeder Fraktion und PCR-Primer, die spezifisch an die mRNA (s) von Interesse.

9. Isolierung von Proteinen aus Sucrose Fraktionen.

  1. Neben RNA können Proteine ​​isoliert und in Einzel Polysom ​​Fraktionen identifiziert als gut. Verwenden Sie eine der vielen ausgezeichneten Protokolle zur Proteinisolierung erhältlich, zB 18.

Representative Results

Wir haben kürzlich eine neue Rolle für das Tumorsuppressor Pdcd4 als selektiver Inhibitor der Übersetzung IRES-tragenden mRNAs Apoptoseinhibitoren XIAP und Bcl-xL 12. Polysom ​​Profilierung war eine Schlüsseltechnik, um die spezifische Beteiligung von Pdcd4 in IRES-vermittelte Übersetzung zu demonstrieren. HEK293-Zellen wurden transient transfiziert endogenen Pdcd4 (1A) führen und dann einer Profilanalyse Polysomen. Wir haben beobachtet, dass die Reduzierung des Niveaus Pdcd4 nicht globalen zellularen Übersetzung beeinträchtigt, wie durch das Fehlen von Änderungen der Polysomen-Profil im Vergleich siCTRL und siPDCD4 behandelten Zellen (1B) beurteilt. Ebenso Polysomen Verteilung nicht-IRES Variante XIAP 19 unverändert zwischen behandelten und unbehandelten Zellen (1C). Dagegen Polysomen Verteilung der beiden IRES-tragenden mRNAs, XIAP und Bcl-xL, signifikant verändert. In der Abwesenheit von PDCD4 die Verteilung dieser beiden mRNAs in schweren ribopolysomes (1D, E) verschoben. Da dies nicht durch Veränderungen in der Steady-State-Niveaus von XIAP und Bcl-xL mRNA (1F) diesen Ergebnissen begleitet weisen eine verbesserte Übersetzung von XIAP und Bcl-xL in Zellen mit vermindertem Pdcd4 Ebenen, die durch Western Blot (Abbildung bestätigt wurde 1G).

Figur 1
Fig. 1: Polysomen Profilierung identifiziert Pdcd4 als selektiver Inhibitor von XIAP und Bcl-xL-Übersetzung (A) HEK293-Zellen wurden mit Pdcd4 siRNA oder Kontrolle (CTRL) behandelt, nicht-Targeting siRNA, lysiert und mit Anti-Pdcd4 Western-Blot-Analyse unterzogen, und Anti-Nucleolin Antikörper, um das Ausmaß des Pdcd4 knock-down zu überprüfen. (B) Pdcd4 wurde verkleinert, wie in (A) klopfte undZelllysate wurden einer Profilierung Polysom. Repräsentative Polysom ​​Profil wird im oberen Bereich angezeigt; Verteilung des XIAP IRES nicht (C) wird Bcl-xL (D) und XIAP IRES (E) mRNAs relativ zu der GAPDH als Prozentsatz der Gesamt-mRNA (% mRNA) in jeder Fraktion gezeigt. (F) stetig -state mRNA-Spiegel wurden mittels RT-qPCR in Pdcd4 siRNA oder Kontrolle (CTRL) siRNA behandelten Zellen gemessen. (G) Die Lysate aus (A) wurden auch Western-Blot-Analyse mit anti-XIAP, anti-Bcl-xL und ausgesetzt Anti-Nucleolin Antikörper. (NB. Die dargelegten Daten in Abbildung 1 wurden ursprünglich in 12 veröffentlicht) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Polysomaler Profilierung ist eine leistungsfähige Technik, die zur Quantifizierung der Zustand der Übersetzung der spezifischen Transkripte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen ermöglicht. Es ist eine sehr einfache Technik im Prinzip doch mehrere Schritte der Ausführung, von denen einige kritische zur Herstellung guter Polysomen-Profile erfordert. Diese wichtigen Schritte sind: 1) mit RNase-frei Chemikalien und Kunststoffgeschirr, 2) Vorbereitung gute Saccharosegradienten (nach unserer Erfahrung ein 10-50% Saccharosegradienten funktionieren am besten, für die effiziente Lösung von 40 / 60S-Untereinheiten und mRNAs mit gebundenen Ribosomen) und 3 ) unter Verwendung von Zellen, die exponentiell wachsen und nicht mehr als 80% konfluent, um zu erfassen die höchsten Raten der Übersetzung. Dieser letztere Schritt ist zu berücksichtigen, wenn dabei lange Zellbehandlungen, wie beispielsweise Knock-down oder Überexpression genommen werden, so dass die Menge der Zellen an der Platte wird eine Funktion, wie viel sich die Zellen am Endpunkt konfluent sein.

In den Ergebnissen presented hier Polysomen-Profil-Analyse war ein wichtiges Werkzeug für die Bewertung Pdcd4 Rolle in der Translationsregulation der IRES-tragenden mRNAs XIAP und Bcl-xL 12. Die Tatsache, dass wir keine Änderung der allgemeinen Polysom ​​Profile auf Pdcd4 knock-down (1B) nicht beachten konnten wir feststellen, dass Pdcd4 nicht globalen zellulären Übersetzung unter den Bedingungen des Experiments beeinträchtigen. Als nächstes verwendet RT-qPCR-Analyse, um die Verteilung des XIAP und Bcl-xL-mRNAs in Zellen, die mit Pdcd4 oder Kontroll siRNAs behandelt bestimmen. qPCR ist ein Verfahren der Wahl für die Analyse von Polysomen-Profile, im Gegensatz zu Standard-RT-PCR oder Northern-Blot, weil es für eine quantitative anstatt semi-quantitative Analyse der mRNA Verteilung und zum Nachweis von feinen Verschiebungen in Translationseffizienz zwischen den Behandlungen. Mit dieser Technik konnten wir zeigen, dass die Verteilung der XIAP und Bcl-xL-mRNAs (ausgedrückt als Prozent des gesamten Ziel-mRNA durch die gradient) signifikant in schwere Polyribosome (mRNAs mit einer großen Anzahl von Ribosomen mit ihnen verbunden sind), nachdem Pdcd4 knock-down (1D, E) verschoben wird, was auf eine Erhöhung der Übersetzung dieser mRNAs. Dies wurde weiter durch eine Erhöhung der XIAP und Bcl-xL-Protein-Spiegel, aber nicht in ihrer stationären RNA-Niveaus (1F, G) bestätigt. Wichtiger ist, die Polysomen Verteilung des nicht-IRES-Variante von XIAP war unverändert zwischen behandelten und unbehandelten Zellen (1C). Alternativ kann die Translationseffizienz als das Verhältnis der mRNA-Gehalt in Polysomen (üblicherweise die Fraktionen 5 bis 10) gegenüber monosomes vorgestellt (üblicherweise die Fraktionen 2 bis 4) 14.

Die Verwendung von Steuerelementen im gesamten Protokoll ist bei der Validierung keine Polysom ​​Profilierungsergebnis wichtig, da von Absorptionswerte bei 254 nm beobachtet Spitzen können nicht auf eigene Faust, um die ribosomale RNA (Reinigungsmittel zurückzuführens, beispielsweise Triton X-100 stark absorbieren in diesem Bereich des Spektrums und kann 40 / 60S Spitzen an der Spitze des Gradienten verdecken). Lassen Gradienten ohne Lysat und / oder mit Lysatpuffer müssen ausgeführt werden, um den relativen Beitrag der Puffer zu der Absorption bei 254 nm zu bestimmen. Artefakt Strukturen höherer Ordnung können auch zu Fehlinterpretationen von Polysomen, wo es in der Tat keine (zB "pseudo-Polysomen" 20) führen. Maskierungs Magnesium (während des gesamten Verfahrens zur Stabilisierung von 80S Ribosomen) mit der zweiwertige Kationenchelator EDTA zugegeben, um Lysate und dem Gradienten-Puffer (20 mM für 15 min) wird die Trennung des Ribosoms in seine Komponenten kleinen (40S) führen und große (60S ) Untereinheiten. Wenn somit Absorptionspeaks bei 260 nm aufgezeichnet sind zwar Polysomen, EDTA-Behandlung das Profil, so dass ein einziges Maximum wird in der Nähe der Oberseite des Gradienten, die zu mRNA und die ribosomale Einheiten frei entspricht beachten kollabieren (Daten nicht gezeigt). Übereinstimmendmit EDTA-induzierten Zerfall des Profils, sollten alle der besonderen Ziele durch qPCR analysiert jetzt an der Oberseite des Gradienten gefunden werden.

Die Anzahl der Ribosomen mit einer mRNA assoziiert ist nicht immer ein Indikator dafür, wie effizient diese bestimmte mRNA übersetzt wird. Tatsächlich gibt es bestimmte Kontexte, in denen aktive Übersetzung auf Polysomen wird ins Stocken geraten 21,22, die der Leser bewusst sein sollten. Bestimmen, ob oder nicht Transkripte werden aktiv mit der Translationsmaschinerie in Eingriff kann durch eine geführt werden) Behandeln der Probe mit Puromycin, die im Gegensatz EDTA, bewirkt 'run-off "von Ribosomen, die aktiv in einem mRNA translozieren sind, oder b) Behandeln der Probe mit Homoharringtonin die Translokation nur der ersten Ribosom am Startcodon hemmt, was wiederum zu "Run-off" aller nachgelagerten Translokationseinheit Ribosomen.

Die Verwendung von Steuer Transkripten qPCR-Analyse ist ebenfalls kritisch. Das Selection von Transkripten, die nicht durch unterschiedliche Behandlungsbedingungen wie einige Housekeeping-Gene (GAPDH, Actin, Tubulin, Nucleolin), ribosomale mRNAs (18S, Rpl13a) oder in diesem Fall der Nicht-IRES Variante des XIAP IRES betroffen sind, ist in wichtigen Überprüfung, ob die Behandlung die Wirkung auf Übersetzung ist spezifisch oder generalisiert. Diese Steuer Transkripten verwendet werden, um die Verteilung der mRNAs analysiert, wie es hier gemacht normalisieren (XIAP und Bcl-xL-mRNAs wurden auf GAPDH-mRNA normalisiert und als Prozentsatz der Gesamt-mRNA-Gehalt durch die Summe der mRNA-Gehalt in jeder Fraktion vertreten ) oder alternativ können Ziel- und Steuerungs mRNAs als Absolutwerte angegeben und gesondert auszuweisen. qPCR-Analyse der Eingangs Lysaten (in der Regel 10% des Gesamtvolumens) ist ein weiterer Schritt, der für die Verteilung von spezifischen mRNAs steuern wird. Idealerweise sollte der mRNA-Gehalt einer spezifischen Transkripts in der Eingangs Lysat vergleichbar mit der Summe der mRNA-Gehalt in den Fraktionen 10 analysiert werden. Schließlich, Ein optionaler Schritt, um für die Phenol steuern: Chloroform Extraktionsschritt besteht darin, jeden Polysom ​​Fraktion mit einem in vitro transkribiert Reporter mRNA Spike (wie CAT, Chloramphenicolacetyltransferase), die anschließend von qPCR quantifiziert werden wird und kann sogar verwendet werden, um die Normalisierung Daten 14.

Wie bei jeder Technik stellt die Polysomen Profilierung einige Einschränkungen. Die Tatsache, dass in der Regel ein Minimum von 10 Fraktionen (subtilere Veränderungen der Translationseffizienz erfordern 20 oder mehr) benötigen, um schöne Polysom ​​Distributionen gesammelt macht dieser Schritt Begrenzung, in dem Sinne, dass nur maximal 4 Proben kann zu einem Zeitpunkt analysiert, um in der Lage, bequem hand RNA-Extraktion und qPCR-Analyse von 40 Proben und 4 Input-Kontrollen auf einmal sein. Die Stichprobengröße kann leicht bis mit, wie viele Transkripte analysiert werden und wie viele qPCR repliziert zu tun, und das kann teuer werden. Eine weitere Einschränkung eines qPCR-basierte polysomaler Profilierung einnalysis ist, dass sie nur auf einen Kandidaten-basierten Ansatz (wobei die Transkripte zu analysierende im Voraus bekannt sind) und kann nicht für genomweiten Analyse von Übersetzungs angewendet werden erfolgen. Doch zu Beginn des 21. Jahrhunderts begannen die Ermittler ihre polysomaler RNA an genomischer Ebene mit Hilfe von DNA-Microarrays zu verhören 15 und in jüngerer Zeit mit der nächsten Generation Sequenzierung 16,17. In diesem leistungsfähigen Ansatz wird polysomaler Profilierung durchgeführt, wie in diesem Protokoll beschrieben ist, außer, dass anstatt der Durchführung qPCR Analyse der einzelnen Fraktionen, monosomes Fraktionen (in der Regel Bruch 2-4) und Polysomen Fraktionen (meist Fraktionen) werden vereinigt und Variationen in der globalen Übersetzung analysiert durch DNA-Microarray oder des gesamten Genoms RNA Sequenzierung. Daher bei diesem Ansatz ist es möglich zu beurteilen, alle mRNAs, deren Verteilung verschiebt sich von Polysomen zu monosomes (Abnahme der Übersetzung) oder umgekehrt (Erhöhung der Übersetzung) auf ausdrückliches treatment. Validierung und Quantifizierung spezifischer mRNA Polysomen Verteilung kann dann durch qPCR erfolgen. Eine noch leistungsfähigere Nutzung der polysomaler Profilierung Prinzip ist Ribosom Profilierung. Weitere Hochdurch Erweiterung dieser Technik wurde kürzlich berichtet, dass zur gleichzeitigen Überwachung von Hunderten von Polysomen Fraktionen 23 ermöglicht. Dies stellt einen klaren Vorteil beim Antasten Translationseffizienzen von Mutantensammlungen oder in einer groß angelegten RNAi-Screens. Ribosom Profiling ist eine Technik, die ausnutzt Next Generation Sequencing, um RNA-Fragmente von Ribosomen (Ribosomen Fußabdrücke) geschützt in der Proteinsynthese 24,25 engagiert abzubilden. Bei dieser Technik kann Ribosomentranslokation mit Cycloheximid (reversibel) oder Emetin (irreversible), gefolgt von Zell-Lyse und RNase-Verdau, um eine Population von Ribosomen Fußabdrücke ergeben gehemmt werden. Ribosomen sind angereichert, die Gesamt-RNA isoliert und verunreinigen ribosomale und mitochondriale ribosomale RNA wird entfernt.RNA Fußabdrücke von ca. 26-28 Nukleotiden werden isoliert, revers transkribiert, in eine cDNA-Bibliothek umgewandelt und sequenziert 26. Im Gegensatz zu Standard Polysom ​​Profiling, dieser Ansatz nicht nur identifiziert spezifische mRNAs, die translational reguliert werden, sondern auch liefert mRNA-spezifische Informationen bei Codon Auflösung wie die genaue Besetzung und Dichte der Ribosomen entlang einer spezifischen Transkript. Dies ist besonders interessant für mRNAs mit bestimmten Arten der Übersetzung wie IRES-beherbergen mRNAs, wie es mehr Informationen darüber, wo auf dem Transkript Ribosom-Rekrutierung auftritt geben könnte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient Master 108 automated gradient maker BIOCOMP 107-201M
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker LABCONCO 4517000
Beckman Ultracentrifuge  Beckman Coulter Model # L-100-XP
Density gradient fractionator TELEDYNE ISCO 69-3873-246 Composed of: tube piercing system,  peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector
WinDaq data acquisition software DATAQ INSTRUMENTS WINDAQ/LITE http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) Beckman Coulter 331372
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) DiaMed PRE1900-N
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) SafeSeal 12000
Sucrose (nucleases-free) Calbiochem 573113 MW = 342.3 g/mol
Cycloheximide SIGMA C7698 MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.
Sodium chloride (nucleases-free) OmniPur 7710 MW = 58.44 g/mol
MgCl2.6H2O (nucleases-free) OmniPur 5980 MW = 203.3 g/mol
Tris Base (nucleases-free) J.T. Baker 4109-01 MW = 121.14 g/mol
Triton X-100 OmniPur 9400 Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2515
RNaseZap Rnase inactivation solution Ambion, Life Technologies AM9780
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) Invitrogen, Life Technologies AM9516
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Ambion, Life Technologies AM9722 Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion

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References

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