포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University
Immunology and Infection

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Sontag, R. L., Mihai, C., Orr, G., Savchenko, A., Skarina, T., Cui, H., Cort, J. R., Adkins, J. N., Brown, R. N. Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (95), e52296, doi:10.3791/52296 (2015).

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Abstract

살아있는 세포의 맥락에서 단백질 상호 작용의 연구는 현지화, 역학, 그리고 상호 작용 파트너에 대한 중요한 정보를 생성 할 수 있습니다. 이 정보는 호스트 병원체 상호 작용의 컨텍스트에서 특히 유용하다. 많은 병원체 단백질은 세포 내 환경 내에서 숙주의 면역 시스템 및 생존의 회피를 가능 같은 방법의 다양한 숙주 세포 내에서 기능한다. 이러한 병원체 단백질 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해, 여러 가지 접근 방법이 일반적으로 포함하여, 사용됩니다 생체 내 감염에 형질 전환 또는 형질 도입을 통해 태그 또는 돌연변이 단백질 또는 병원체 유전자의 도입을 발현하는 균주. 이러한 방식은 각각 이점과 단점을 갖는다. 우리는 직접 세포에 외래 단백질을 소개 할 수있는 방법을 모색하고 있습니다. 일반적으로 일렉트로 세포 내로 핵산을 도입하기 위해 사용되지만, 생물 리 학적 근거가 정확히 동일하지만 드물게 단백질에 적용되지 않았다.표준 electroporator는 포유 동물 세포에 친 화성 태그가 세균 이펙터를 소개하는 데 사용되었다. 상피 및 마우스 대식 세포는 전통적인 분리 방법에 의해 배양하고, 관심 외인성 세균 병원체의 단백질 (예를 들어 살모넬라 Typhimurium의 GtgE) 0.4 cm 갭 전기 천공 큐벳에 넣었다. 전기 (0.3 kV의) 짧은 (4 시간) 회복 기간 후, 세포 내 단백질은 형광 친 화성 태그를 통해 단백질을 라벨 및 공 초점 현미경으로 공간과 시간 분포를 조사하여 확인 하였다. 일렉트로 단백질은 세포 내부의 세포 내 작용 및 올바른 거래 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 할 수있는 것으로 나타났다. 외래 단백질이 세포의 표면 상에 축적되는 경향이 있지만, 일렉트로 샘플 단독 배양 세포 내 이펙터 농도에 대하여 크게 증가했다. 이 프로토콜은 AP에서 할 수 간단하고 빠른만큼타겟팅 및 병원성 세포 내 단백질의 기능을 포함하는 숙주 세포에서 단백질의 병원체 높은 처리량 특성을 허용 arallel 패션.

Introduction

많은 그람 음성균 직접 숙주 세포를 1-5로 (이펙터라고 함) 병원성 관련 단백질을 주입하도록 전문화 분비 시스템을 사용한다. 숙주의 면역 억제, 세포 골격 변화, 세포 내 신호 전달 및 매매, 전사 변화 수정 및 호스트 테아 변경 6-9 : 이러한 이펙터 포함한 생물학적 기능의 넓은 범위를 갖는다. 일부 이펙터 기능하지만 호스트 대상 외 다수의 생화학 적 조치 (들)이 결정될 수 남아 알려져있다. 야생형 및 재조합 박테리아 감염을 비교하는 세포 독성 이펙터 메커니즘을 연구하는 유효한 방법이지만, 상기 숙주 세포에 도입 개별 이펙터 종종 유리하다. 따라서, 숙주 세포의 컨텍스트에서 세균 효과기 단백질을 도입하고 특성화 간단한 방법이 매우 바람직하다.

실험 분석 위스콘신 단순화하나의 이펙터가 중요 번째 다른 이펙터는 반대 또는 중복 기능을 가질 수 있기 때문이다. 이 단순화를 달성하기 위해, 연구진은 이전에 긁어은 12, 13로드, 바이러스 성 전달 (10), 미세 주입법 (11) 등 다양한 방법에 의해 세포로 거대 분자를 도입, 화학적으로 유도 미세 주입 (14), 독점 단백질 "형질 전환"시약 (15), 인산 칼슘 침전와 세포 융합 (16), 및 전기 17-20. 도입 된 분자는 세포 내 표적 (21, 22)에 대한 단백질, 세포 투과성 염료 및 항체 DNA, RNA, RNAi의 종을 포함하여 핵산 이르기까지 다양합니다. 일부 방법은 도입 될 수있는 고분자의 종류를 포함한 한계가 있고, 특히 하류 분석 높아 세포 독성 작용의 손상 기전, 효능이 낮고 또는 도입 효율이 제한 될 수있다. 형질, ofte또한 대 식세포 및 일차 전지와 같은 몇 가지 중요한 숙주 세포 유형, 형질 향해 특히 내성을 겪고 제한, 포유 동물 세포에서 세균의 유전자를 발현하는 방법을 위해 사용되는 N. 이 외에도, 또한 외래 DNA의 도입시 생성 된 박테리아 단백질의 수준을 조절하는 것이 곤란하다.

많은 작품은 일반적인 실험실 기술로 모두 세균 및 포유 동물 세포에 핵산의 전기를 설립했다; 그러나, 생리 학적 조건하에 단백질을 세포 내로 전달하기위한 최선의 방법에 대한 지속적인 연구가있다. 단백질 형질 전환에 보고서는 유망하지만, 고가의 시약 및 최적화를 필요로한다. 최소한의 비용으로 셀 대상의 다양한에 잠재적으로 독성 세균 이펙터를 소개하는 욕망은 생체 내에서 단백질을 연구하는 방법으로 전기를 고려하는 우리를 이끌었다.

단백질 전기 23-25는 만족입니다또한 전기 형질 전환 또는 전자 주입 (26)로 알려진 electropermeabilization를 통해 살아있는 세포로 단백질을 소개 HOD. 이 방법은 세포막에 구멍을 만드는 고강도 전기 펄스를 사용한다. 이 가역적 모공은 일반적으로 세포 내 공간에서 제외됩니다 거대 분자가 세포를 입력 할 수 있습니다. 외부 전계를 제거하여, 상기 멤브레인은 셀이 통과 구멍 (27, 28)의 분자를 보유 할 수 있도록, 다시 봉인 할 수있다.

표준 electroporator 일관 마우스 대 식세포 유사 세포 및 인간 상피 세포에 모두 세균 이펙터를 도입이 연구에 사용 하였다. 이 방법은 세포 생존 능력의 뚜렷한 감소와 신속하고 효율적이며 저렴하다. 도입 된 단백질은 면역 형광 현미경을 통해 시각 또는 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 이뿐만 아니라, 비 독성 표준으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하여 입증되었다두 살모넬라 이펙터 단백질과 SspH1 GtgE. 우리는 진핵 숙주 세포에서 세균 독성 단백질의 기능 연구의 레퍼토리에 추가 도구로 단백질 전기를 제안한다.

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Protocol

1. 사전에 준비

  1. 37 ° C에 따뜻한 멸균 인산 완충 식염수 (PBS).
  2. 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 이글 배지 (DMEM) 및 최소 필수 매체 (MEM)의 따뜻한 둘 베코 변형, 100 IU / ml의 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신을 37 ° C이다. 참고 :이 각각 RAW와 헬라 세포 정상적인 성장 미디어 (NGM)를 나타냅니다.

세포의 2. 준비

  1. NGM에 70-90%의 포화 상태에 RAW 264.7 세포를 성장.
    1. 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 세포를 유지한다.
  2. NGM에 70-90%의 포화 상태에 헬라 세포를 성장.
    1. 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 세포를 유지한다.
  3. 수집하기 전에, 멸균 PBS로 한 번 세포 단층을 씻는다.
  4. 멸균 원뿔 튜브에 미리 합류 세포를 수집합니다.
    1. 부드럽게 RAW 세포를 긁어PBS에서 고무 경찰관으로, 반복 피펫으로 세포 집계를 분산한다.
    2. 육안 검사는 문화면에서 해리가 표시 될 때까지 0.25 % 트립신 솔루션 헬라 세포를 분리합니다. 예를 들어, T-75 플라스크에 대해 2 내지 3 ml의 사용. 트립신 솔루션이 전체 성장 표면을 커버하기 위해 그에 따라 볼륨을 조정합니다.
      1. NGM 10 % FBS를 함유하는과 해리 반응을 켄칭.
      2. 세포 집합체를 분산시키기 반복 피펫 팅으로, 트립신 NGM의 적어도 두 배 볼륨을 사용.
  5. 가볍게 4 분 900 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛.
  6. 멸균 PBS를 사용하여 트립신 / 종결 용액과 동일한 볼륨에 재현 탁.
  7. 입자 또는 혈구 계수기를 사용하여 세포를 카운트.
  8. 가볍게 4 분 900 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛.
  9. 5.5 × 106 6.0 × 106 개의 세포 / ㎖의 PBS를위한 충분한 부피 재현 탁. 참고 : 예를 들어, 하나의 T-75 플라스크 approxim을 얻을 것입니다러면 7.5 × 10 6 세포 (29).
  10. 전기까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.

일렉트로 3. 준비

  1. 얼음 사전 냉각 전기 큐벳 (0.4 cm 간격).
  2. 전기 장치의 전원을 켜고 0.3 kV의에 전압을 설정합니다.
    참고 : 용량 및 저항 (제조업체가 10 μF 600 Ω로 설정) 우리의 electroporator에 설정 조정하지 않았다.
  3. NGM과 복구 판을 작성하고 37 ℃에서 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 평형

4. Electroporation에

  1. 사전 냉장 큐벳에 세포 현탁액 400 μl를 놓고 베트 (/ ㎖ 50 μg의) 선택된 단백질 20 μg의를 추가합니다.
  2. 톡 베트는 부드럽게 ~ 10 배 세포를 손상시키지 않고 혼합합니다. 참고 : 베트는 잘 혼합 여러 번 반전 될 수 있지만, 최대 피펫하지 않고 아래로 또는 소용돌이 세포의 손상을 방지 할 수 있습니다.
  3. 1.5-1.7 밀리 0.3 kV의에서 Electroporate 샘플. 참고 :이 연구에 대한 전형적인했다.
  4. 즉시 전기 플릭 베트 후 부드럽게 ~ 10 배는 잘 혼합합니다.

세포의 5. 도금

  1. 준비가 될 때까지 얼음에 electroporation하여 세포 보관 큐벳 복구 플레이트에 배치합니다.
  2. 대부분의 다운 스트림 분석을 위해, 외부 이펙터 단백질을 제거하기 위해 미리 예열 NGM으로 세포가 1 배 씻는다.
    1. 분석을 위해 세포를 제거하고 NGM의 3-5 ml의 일시 중지합니다.
    2. 4 분 동안 900 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛.
    3. 원하는 판 크기 (예 : 35mm 접시 2 ml)에 대한 NGM의 적절한 볼륨을 Resuspend.
  3. 다운 스트림 분석을위한 세포의 적당량을 제거합니다.
    1. 예 1 : 현미경 분석을위한 유리 바닥 요리에 판.
    2. 예 2 : 판 INT친 화성 - 정제를 같은 단백질 분석 용 O 세포 배양 플라스틱.
  4. 세포는 적어도 4 시간 동안 37 ° C에서 95 % 가습 된 공기 / 5 % CO 2 분위기하에 평형화 플레이트에서 복구 할.

6. 현미경 분석

6.1) 고정 / 면역 형광 염색법

  1. 워시 세포는 4 시간의 회복 기간 후 멸균 PBS로 1 배.
  2. 실온에서 2 분 동안 100 % 메탄올에 세포를 고정. 완전히 세포 (예를 들어, 2 ml의 35mm의 요리)를 충당하기 위해 충분한 메탄올을 사용합니다.
  3. 멸균 PBS로 세척 배.
  4. 15 분 동안 PBS에서 0.4 % 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면. 예를 들어, 35mm 직경 플레이트 된 1 mL의 사용.
    1. 에피토프 및 표적 단백질의 위치에 따라 트리톤 X-100 투과성으로 강도의 길이를 조정합니다. 참고 : 최상의 결과를 그러나 위의 조건은 대부분의 C에 적합해야한다, 경험적으로 각 대상에 대해 결정해야합니다ytosolic 목표.
  5. RT에서 1 시간 동안 PBS 중 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단. 예를 들어, 35mm 직경 플레이트 된 1 mL의 사용.
  6. PBS로 세척 배.
  7. 도 4에서 밤새 항체 용액에 결합 차 항체 (PBS 중 0.1 % 트리톤 X-100, 1 % BSA)을 부화   부드러운 락과 C를 °. 예를 들어, 35mm 직경 플레이트를 0.5ml를 사용한다.
    1. 항체 희석에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 주 : 200 희석 : PKN1 항체 1에 사용 된 반면, 1000 희석 : 예를 들어, 스트렙 타비 딘 - 결합 펩티드 태그 (SBP-Tag)을 1 항체를 사용 하였다.
  8. PBS로 세척 4 배.
  9. 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 동안 항체 결합 액에 적합한 형광 접합 된 이차 항체와 함께 배양한다.
    1. 예를 들어, 실온에서 1 시간 동안 또는 알렉사 488 알렉사 647을 사용한다.
      1. 개미에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오ibody 희석. (예를 들어 약 1 : 1,000 본 연구).
    2. 예를 들어, 필요에 따라 다른 얼룩을 추가, 5 μM 밀 배아 agglutinnin (WGA) 실온에서 1 시간 동안, 제조업체의 권고에 따라 알렉사 647 또는 DAPI에 결합.
  10. 이미지에 대한 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호 PBS 4 ° C에서 저장 씻을 5 배.

6.2) 공 초점 현미경 및 이미지 분석

  1. 63X 기름 침지 목표를 사용하여 반전 공 초점 현미경 이미지 샘플.
    1. 492-542 nm의 방출 사이의 대역폭과 아르곤 레이저의 488nm의 라인을 이용하여, 화상을 녹색 채널.
    2. 640-718 nm의 방출 사이의 대역폭을 가진 633 nm의 다이오드 레이저를 사용하여 적색 이미지 채널.
    3. 407-453 nm의 방출 사이의 대역폭을 가진 405 nm의 다이오드 레이저를 사용하여 청색 이미지 채널.
    4. Z-스택 세포 볼륨의 전체를 커버 여러 채널을 확인합니다.
  2. 해당 이미지 처리 소프트웨어로 이미지를 처리​​.

7. 선호도 정화

  1. 4 시간의 회복 기간 후 4 ° C PBS로 두 번 일렉트로 세포를 씻으십시오.
  2. 와를 Lyse ~ 용해 완충액 얼음 (PBS에서 프로테아제 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제와 1 % 트리톤 X-100)의 1.0 ml의. 제조업체의 지침에 따라 억제제를 사용합니다. 참고 : 예를 들어, 모두 본 연구에 사용 된 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (100X)에 공급하고 있지만, 다른 제제는 동일하게 잘 작동한다.
  3. 즉시 고무 경찰관과 세포를 긁어 원뿔 튜브에 수집합니다.
  4. 활발한로 소용돌이 초음파 처리를 Lyse. 참고 : 다른 용해 방법은 똑같이 잘 작동 할 수 있지만 효율이 경험적으로 분석 요구 사항의 적합성 여부를 결정해야합니다.
    1. 간헐적 와동와 3 × 30 초 초음파 처리.
  5. 4 ° C에서 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 수집세포 파편과 불용성 집계; 뜨는을 저장합니다.
  6. 엔드 오버 엔드 회전 4 ° C에서 하룻밤 스트렙 타비 딘 아가로 오스 수지 현탁액 50 μL와 일렉트로 세포 용 해물 같은 부피 (~ 1.0 ml)에 결합합니다. 참고 :이 수지는 스트렙 타비 딘 결합 펩타이드 친 화성 태그를 통해 일렉트릭 단백질 (및 관련 단지)를 캡처합니다.
  7. 2 분 동안 2,500 XG에 원심 분리기 및 상층 액을 제거한다.
  8. 40 침대 볼륨 (~ 1 ml)을 PBS로 두 번 세척 할 것.
  9. 30 μl의 4 배 LDS 로딩 버퍼 (141 mM 트리스베이스, 2 % LDS, 10 % 글리세롤, 0.51 mM의 EDTA, 0.22 mM의의 Serva 블루 G, 빨간 0.175 mM의 페놀, 산도 8.5), 20 μL DIH 2 O, 1 μL의 추가 일정량 허용 0.5 M 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)는 비드 2340.
  10. 10 분 동안 95 ° C에서 열 및 얼음에 멋진.
  11. 스핀 5 분 4 ° C에서> 10,000 XG.
  12. 상층 액을 수집합니다.
  13. 적절한 항체를 참고하여 웨스턴 블롯을 수행 그는다시, 안티 PKN1 차 항체가 사용됩니다.

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Representative Results

개념의 초기 증거로서, 정제 된 녹색 형광 단백질을 이용하여 성공적으로 전기 포유 동물 세포에 도입 하였다. GFP, 대략 27 kD의 분자량 단백질은 일반적으로 세포 독성이없는 중요한 분자 생물학 도구로 (일반적으로 플라스미드 DNA로부터 발현) 포유 동물 세포 내로 도입된다. 헬라 세포 (그림 1A)를 배양 또는 형광 GFP 신호를 확인하기 위해 면역 형광 공 초점 현미경을 25 ㎍ / ㎖의 GFP와 (그림 1B)를 전기 천공 하였다. GFP는 세포 세포질 내부 것을 입증하기 위해, 또한, 세포 핵을 나타낼 밀 배아 응집소 (WGA) 세포질 경계 (적색)의 윤곽뿐만 아니라 핵산 얼룩, DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 어떤 세포 내 단백질 GFP 함께 배양 세포에서 관찰되지 않았다하면서 세포 내 GFP 신호는 전기 천공시에만 관찰되었다. 비슷한 결과는 RAW264.7 마​​우스로 관찰되었다대 식세포 유사 세포 (도 1C1D). WGA 우선적 인큐베이션 길이에 기초 점상 오염을 나타낼 수있다 따라서 세포막 잔기에 결합 렉틴 유의. 그림 2A 그림 1A보다 더 긴 시간 동안 배양 하였다 그림 1A그림 2A를 비교.

전기 천공 다음 태깅 된 정제 살모넬라 이펙터 GtgE로 확장 하였다. GtgE, 알려진 독성 인자 (30), 우리 그룹에 의해 발견됐다가 숙주 세포 (31)으로 분비되는, 최근 시스테인 프로테아제 (32) 것으로 나타났다. HeLa 세포는 배양 또는 50 ㎍ / ㎖의 GtgE로 전기 천공 하였다. 면역 형광 분석을 위해, 세포를 GtgE에 스트렙 타비 딘 - 결합 친 화성 펩타이드 태그에 대한 항체로 염색 하였다. 또한, 세포 WGA 및 DAPI 염색 하였다. Figu (배양 헬라 세포에서) 2A 재, 녹색 형광 초점의 부족으로 시각화 어떠한 세포 내 GtgE가 없습니다. 대조적으로, 전기 천공 HeLa 세포 (도 2B)은 상당한 형광을 나타내는 세포 내 신호 효과기 단백질 인해 전기 프로세스에 입력 셀을 표시했다. RAW 세포 배양 (그림 2C) 동안 세포 표면에 단백질을 축적하는 약간 증가 경향을 보였으 나, 세포 내 신호는 전기 (그림 2D)에 보였다.

공 초점 현미경을 통해 세포 이하 지역화 시각화 검출 한계를 결정하는 것은 잠재적으로 독성 세균 이펙터 세포 과부하 방지하면서 충분한 단백질, 세포를 입력 확인하는 것이 중요했다. 그림 3에서 GtgE 2.5, 25 RAW 대식 세포와 같은 세포에 electroporation, 50 ㎍ / ml의했다. 세포를 고정 GtgE에 태그​​에 대한 항체로 염색 하였다. O할수 있답니다 병소의 극소수는 25 ㎍ / ㎖, (도 3B)에서 명백 병소의 증가 된 숫자, 2.5 ㎍ / ml의 GtgE (도 3A)에서 관찰 되었으나, 뚜렷한 초점의 최대 개수는 최대 단백질 았으며 농도 테스트, 50 ㎍ / ㎖ (그림 3C). 유사 염색 패턴이 세포 내 단백질이 용이하게 공 초점 현미경 검사에 의해 검증 될 수있는 이러한 단백질 농도를 나타내는 샘플 간의 관찰되었다. 50 ㎍ / ml의 단백질 농도 상기 SO는 세포의 표면에 흡착 될 수있는 표적 단백질에 대한 성향 않았다 인해 증가 된 단백질의 농도로 시험되지 않았다. 막 관련 단백질의 이러한 집계를 방지하기 위해, 웨스턴 블롯 (그림 6, 오른쪽 차선)에 시각화하는 단백질 상호 작용 충분한 호스트를 얻기 위해 두 개의 전기 큐벳을 풀 필요하게되었다.

더 INT 함을 입증하기roduced 단백질 단순히 세포의 표면에 흡착되지 않은 연속 광학 섹션마다 0.35-0.43 마이크로 미터 (Z-스택) 공 초점 현미경을 사용하여 초점면에 묘화 하였다. RAW 세포는 50 ㎍ / ml의 일렉트로 GtgE으로하고 (도 4,B) 상기 한 바와 같이 염색 하였다. Z-스택 GtgE 세포 내 참 것으로 나타났다과 초점은 셀 (그림 4B,면 36의 26)의 상단에 하단 (그림 4A,면 36의 6)에서 연장. 유사한 결과가 모든 electroporation하여 단백질을 얻었다. 효과기 단백질 또는 전기 않고 다른 제어 세포 집단의 극한 프로필 형광 공 초점 형광 현미경으로 관찰하고, 무시할만한 것으로 밝혀졌다.

부가 적으로, 전기 천공이 단백질은 세포 내 이입 경로를 통해 분해 대상으로하고 있는지를 조사 하였다. 세포는 라스 관련 단백질 5A (Rab5)에 대한 염색,초기 엔도 좀 (그림 4C), 또는 리소좀 관련 막 단백질 1 (램프 1), 후기 엔도 좀과 리소좀 (그림 4D)에 대한 마커 마커. 일렉트릭 단백질이 세포 마커 사이의 공동 현지화 (일렉트릭 단백질이 엔도 좀 / 리소좀 내부했다 예) 사이에 가까운 물리적 상호 작용을 나타냅니다. 공 초점 현미경 일렉트릭 단백질 (GFP 또는 GtgE)는 램프 1 또는 Rab5와 공동 지역화하지 않은 것으로 나타났다. 그것은 직접 세포로 endocytosed 또는 치료 4 시간 이내에 세포 내로 경로를 대상으로하지 않은 단백질을 소개하는이 추론했다.

외래 단백질의 도입은 여러 시간 또는 며칠에 걸쳐 세포의 효과를 가질 수있어, 그 도입 된 단백질의 지속성을 조사하는 것이 유익하다. 일렉트로 단백질이 전기 후 저하없이 지속 할 시간을 결정합니다. 을 바탕으로 오세포의 부착 및 N 시각화, 4 시간은 일렉트로 세포 대략 최소 복구 시간 인 것으로 측정되었다 확산. 일시적으로 단백질 지속성을 관찰하려면 시간 코스 실험은 세포 4, 24, 또는 전기 후 96 시간 염색, 실시 하였다. 세포 형태가 복구를 제안 할 때 4 시간 (그림 5A) 한 후, 세포 내 단백질의 상당한 양이 있었다. 24 시간 (그림 5B) 후, 세포 내부에 상당한 일렉트로 단백질은 여전히 있었다. 전기 후 시간이 고정 및 염색 (그림 5C) 초기 치료 후 단백질 지속성 일을 보여주는 감소 명백한 풍부이기는하지만 관찰 초점이 있었다 전에 96 시간까지 연장 된 경우에도.

두 가지 중요한주의 사항이 실험 과정에서 관찰되었다. RAW 세포를 세포 표면에 외래 단백질 irre 축적 HeLa 세포보다 더 큰 경향을 나타내배양 spective (그림 6A) 또는 전기 (그림 6B). 그럼에도 불구하고, 모든 샘플을 전기 천공 내부 단백질 (도 1, 2, 5B)을 증가 하였다. 또한, 막 - 관련 단백질은 시간이 지남에 따라 사라졌다. 두 번째주의해야 할 점은, 작은 구성된 표현형을 보이는 세포의 작은 인구이었다 모두 제어 외인성 단백질의 높은 양의로드 셀을 반올림 (배양) 및 치료 (일렉트로) 세포 (그림 6 C와 D는, 배양 샘플 참조). 이러한 세포의 핵은 DAPI 염색에 기초 염색질 응축을 나타내었고, 세포 사멸을 시사하는 세포의 전체 부피를 채웠다. 그것은 (수확 / 치료에 세포주기의 정상적인 부분으로 인해 발생 또는) 사멸 세포가 버퍼로부터의 단백질을 흡수하는 경향이 있다는 것이 가능하다.

일렉트로 단백질이 기능했고, 이리와! 빨리 현지화 수 있음을 보여주기 위해ctly 살모넬라 이펙터 단백질 SspH1 및 공지 호스트 표적 단백질 키나아제 N1 (PKN1) (33) 사이에 도시 된 숙주 세포 공동 지역화 및 단백질 - 단백질 상호 작용 안쪽. 전기 후, SspH1과 PKN1 사이의 물리적 상호 작용은 웨스턴 블롯 (그림 7A) 다음에 친 화성을 ​​기반으로 면역 침전에 의해 확인되었다. 공동 지역화는 형광 물질이 공간 (34)을 중첩 할만큼 가까운 나타냅니다 공 초점 현미경에 의해 관찰되었다. 50 ㎍ / ㎖의 SspH1와 전기 후, 헬라 세포 (그림 7B)를 고정하고 SspH1 (녹색)과 PKN1 (빨간색)에 대한 스테인드. 낮은 레이저 파워 별개의 초점 (노란색)에서 SspH1을 나타내는 핵에서 관찰 및 PKN1 상호 작용하기에 충분 물리적 가까웠다했다. 이러한 상호 작용은 문헌에 설립되었습니다; 그러나이 연구는 핵 공동 현지화를 보여 처음이다.

= "항상"> 그림 1
그림 1 : GFP의 일렉트로 - 헬라 또는 RAW 264.7 세포 세포 안티 GFP 항체 (녹색), DAPI, 핵 특정 프로브와 함께 배양 또는 정제 된 녹색 형광 단백질 (GFP)의 25 ㎍ / ㎖로 전기 천공 및 염색 (블루. ) 및 WGA (적색) 세포질의 경계를 묘사합니다. 인큐베이션 (A) HeLa 세포에서는 GFP 내재화의 부족을 나타내는 녹색 형광의 유무를 나타낸다. (B) electroporation하여 GFP의 대표 현미경 사진을 보여준다. GFP는 세포 들어갔다 나타내는 세포 병소의 모양을 참고. (C)(D)는 정제 된 녹색 형광 단백질의 25 ㎍ / mL를 RAW 배양 세포 (C)의 대표적인 이미지 또는 전기 천공 (D)이다.

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그림 2. 살모넬라 이펙터 GtgE의 일렉트로 - 살모넬라 이펙터, GtgE, 그리고 항 - 이펙터 태그 항체 (녹색)로 염색 태그 HeLa 세포 세포를 친 화성의 50 ㎍ / ㎖로 (A) 또는 전기 천공 (B) 배양하고, DAPI, 핵 마스크 (청색), 및 WGA (적색) 세포질의 경계를 묘사합니다. (A)에서는. HeLa 세포가 GtgE 내재화의 부족을 나타내는 녹색 형광의 유무를 표시 인큐베이션 (B) 세포 electroporation하여 효과기 단백질을 보여주는, 일렉트로 GtgE의 대표 현미경 사진을 보여준다. (C)를과 (D)의 대표 이미지들이다 어느 살모넬라 GtgE 50 μg의 / ㎖와 동일한 방식으로, 각각 배양 또는 세포 RAW 전기 천공 하였다. 라이트 블루는 WGA에서 붉은 형광의 조합, 또는 오버레이이고,이차 항체에서 녹색 형광.

그림 3
도 3 : 일렉트로 단백질 적정 - RAW 식세포 유사 세포 세포를 2.5 ㎍ / ㎖ (A), 25 ㎍ / ㎖ (B), 또는 50 ㎍ / ㎖ (C) 살모넬라 이펙터 GtgE와 전기 천공 및 대한 회복시켰다. 4 시간. 세포를 고정 및 SBP-항 - 태그 항체 (녹색) 및 핵 마스크 DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 이는 단백질의 높은 초기 양이 사용되었을 때보다 좋은 결과가 얻어졌다하더라도, 축소 복사 촛점 비아 2.5 ㎍ / ml의 세포 내에서 GtgE 나타내는 형광 초점을 시각화 할 수있다. (쉽게 과도한 막 연관된 응집체없이 초점 현미경으로 관찰하여, 세포 내 단백질을 포함 함)는 만족스러운 결과 N GtgE 따라서 50 ㎍ / ㎖의에 수득 하였다오 큰 농도는 시험 하였다.

그림 4
그림 4 :. 일렉트릭 단백질이 내부 인 경우 단백질의 국제화와 엔도 좀 마커와 공동 현지화의 부족 공 초점 현미경으로 얻은 연속 광학 조각 (Z-스택) 시각화합니다. RAW 세포는 50 ㎍ / ㎖의 GtgE로 전기 천공 하였다. (A)는 6 (36)의 광학 슬라이스를 나타내고, 접시의 바닥 위의 Z-스택 (2.1 마이크로 미터). (B)은 볼하지만 슬라이스 (26)에서 동일한 필드를 도시 36. 세포 병소가 진정으로 세포 내 단백질과 세포의 표면 상에 응집하지 것을 나타내는 셀에 걸쳐 연장된다. 밝은 파란색 빨간색 WGA, 녹색 차 항체, 파랑 DAPI의 조합입니다. 엔도 솜 / 리소좀, Rab5, (C) 또는 리소좀 마커 램프 1의 마커와 공동 현지화 분석

그림 5
그림 5 : 전기 후 단백질 지속 시간에 electroporation하여 GtgE의 지속성을 보여주는 공 초점 현미경 사진.. 50 ㎍ / ml의 GtgE는 HeLa 세포에 전기 천공 하였다. 이어서, 세포를 고정하고 항 - SBP-태그 항체 (녹색) 및 핵 마스크 DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 4 시간 (A)은 세포가 복구 할 수 있도록하는 최소 시간 인 것으로 측정되었다 예상대로 최대 세포 내 단백질을 나타낸다. 세포 내 및 CEL 모두에서 24 시간 (B), 96 시간 (C), 녹 초점, 후하여 세포 표면은 쇼 이펙터 지속성 단백질이 저하 일 초기 치료 후이 불가능하다는 것을 나타냄. 이 이미지의 밝은 파란색 색상은 블루 DAPI와 녹색 항체 염색의 오버레이입니다.

그림 6
도 6 :. 세포 표면 단백질 응집 및 일렉트로 표현형 RAW 식세포 유사 세포는 어느 레드 (50 ㎍ / ㎖의 GtgE로 (A) 또는 전기 천공 (B) 인큐베이션 및 항 SBP-태그 항체 (녹색), WGA 염색 하였다 ) 및 DAPI (파란색). RAW 264.7 모두와 정도가 더 적기는 HeLa 세포, 세포의 표면 상 이펙터 응집 경향; 모든 electroporation하여 세포 내부의 단백질을 증가 것으로 나타났다 (헬라는 도시하지 않음). 노란색 표적 단백질의 WGA에서 빨간색의 오버레이과 녹색입니다. 바바리 RAW (C)와 헬라 (D) 세포g GtgE 배양 한 후 변경된 표현형 (그림 참조). 몇몇 실험은 차동 DAPI 염색과 세포질 손실 작은 셀들로 이루어진 표현형을 나타내었다. 밝은 파란색 빨간색 WGA, 녹색 차 항체, 파랑 DAPI에서 오버레이입니다. 초점 현미경은 핵에 축적 표적 단백질을 표시하는 데 사용 하였다. 외래 단백질을 함유 한 세포의이 표현형 배양 및 전기 모두 후 등장하기 때문에, 하나는 세포 자살을 암시 수 있도록이 표현형을 가정 할 수있다.

그림 7
도 7 :. 일렉트로 살모넬라 SspH1와 호스트 단백질 상호 작용 - 웨스턴 블롯 (A) 다음에 변형 된 친화도 정제를 수행하기 전에 4 시간 동안 회복하도록 허용 세포를 SspH1 함께 나열 농도에서 전기 천공 한 HeLa 세포에 대한 농축 및공지 진핵 파트너 상호 작용을 검출 : 세린 / 트레오닌 단백질 키나아제 N1 (PKN1)를. 하나 베트의 신호가 배경으로 혼합, 아직 PKN1 여전히 노 미끼 제어에서 볼 바인딩의 부족보다 강화되었을 때 맨 오른쪽 차선 (배 EP)이, 2 풀링 큐벳을 포함합니다. 웨스턴 블롯은 기본 헬라 해물 실행 SspH1 정제 및 전 친화 정화 샘플 PKN1에 대한 단일 클론 항체 검사 대상인했다. 표적 탐지는 차 항체의 이소 타입에 대해 반응성 냉이 퍼 옥시 다제 접합 이차 항체로 수득 하였다. 헬라 세포 50 ㎍ / ㎖의 SspH1와 전기 후 공 초점 현미경을 통해 PKN1 (적색)과 SspH1 (녹색) 사이의 공동 현지화 (노란색)를 표시합니다 (B). 이 광 중복 이펙터와 호스트 단백질이 물리적으로 상호 작용하는만큼 가까이 있음을 나타냅니다. 상호 작용이 처음 핵에 도시되었다는 사실은, 추가적인 지원을 제공한다는단백질은 호스트에 의해 정확하게 인신 하였다.

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Discussion

병원성 박테리아로부터 분비 이펙터 숙주 세포 환경 내에서 작동하도록 진화하고, 따라서 호스트 내에서 (in situ)을 연구하기 위해 유용하다. 숙주 세포에 특정 관심 이펙터의 도입은 관련 병원체 호스트 상호 작용이 다른 세균 단백질의 간섭없이 독립적으로 연구 할 수 있습니다. 목표는 형질 감염 또는 형질 도입시켜과 관련된 몇 가지 문제를 피하고, 진핵 생물 숙주 세포 내로 박테리아 효과기 단백질을 도입하기위한 수단으로 전기 천공을 탐구 하였다. 녹색 형광 단백질이 대조군으로 사용하고, 살모넬라 효과기 단백질을 시험 하였다. 이 때문에 상피 세포뿐만 아니라 면역 세포를 대상 호스트 세균성 병원체의 관심, 인간 상피 형 세포주 (HeLa 세포)와 마우스 대 식세포 유사 세포 (RAW 264.7)를 사용 하였다. 전기 세포 viabili에서 뚜렷한 감소와 숙주 세포에 외래 단백질을 제공 할 수 있습니다타이, 그리고 전달 단백질 최대 4 일 동안 세포에서 검출되었다.

일렉트로 단백질의 효과를 분리하기 위해, 순수한 단백질이 요구된다. 본 연구에서는 단백질은 E. 표현했다 N 말단 히스티딘 및 스트렙 타비 딘 결합 펩티드 태그 대장균 균주 BL21. 단백질 농도 (일반적 사이 5-25 ㎎ / ㎖) 및 순도에 대해 분석 NI-NTA 수지로 정제하고 전기 천공까지 -80 ℃에서 저장 하였다. 그들은 고순도 잘 특성화 될 경향 시판중인 단백질은 또한 일렉트로 허용 될 수있다.

이 프로토콜의 핵심 단계는 완전히 세척하여 세포 배양 배지를 제거하고 무 단백질 세포 버퍼에 현탁 포함했다. 이것은 관찰 된 다운 스트림 표현형 관심 외래 단백질에 아닌 배지에 존재하는 단백질에 기인 것을 보장한다. 셀 밀도는 더 나은 때의 전기 효율을 관찰최적의 세포 수는 셀 크기와 종류에 따라 달라질 수 있지만, (예를 들어, 6 × 10 6 대 1 × 10 6 세포) 이상. 실험의 또 다른 중요한 단계는 세포 시간 복구와 요리에 재 부착 할 수 있도록했다; 부착 성 세포는이 연구에 사용 하였다 때문에 필요 하였다. 그것이 의도 된 연구의 특성에 따라, 적절한 세포 트래 피킹, 단백질 - 단백질 상호 작용, 또는 단백질에 대한 효소 활성 시간을 부여 할 필요가있을 수 있지만, 회복 기간은, 현탁 세포 덜 중요 할 것이다. 전달 단백질이 96 시간까지에 대한 세포 내에서 관찰 되었기 때문에, 시각화 또는 셀룰러 분석을 현미경으로 이전 잠복기에 조정의 여지가있다.

이 프로토콜의 몇 가지 변수들은 다른 종류의 세포, 단백질 표적, 또는 하류 분석 방식을 위해 최적화 될 수있다. 단백질의 양은 원하는 세포 농도가 미세한 전기 천공 될 수있다. FO단백질 현지화의 R 시각화, 적은 1과 μg의 사용할 수 있습니다. 기능 연구, 단백질의 높은 초기 금액은 필요할 수 있습니다. 또한, 전기 천공 후 세포 복구에 시간이 단락되거나 연장 될 수있다. 불안정한 단백질 또는 표적 빠른 하류 공정은 짧은 배양 시간을 필요로한다. 또 도금 셀의 양은 여기에 제안 넘어 조정될 수있다. 도입 된 단백질이 현미경에 의해 모니터링, 또는 전기 천공 단백질은 웨스턴 블롯과 같은 애플리케이션을 위해 회수 될 경우보다 밀도가 도금 될 경우 세포들은 띄엄 도금 될 수있다.

전기 천공은 살아있는 세포로 단백질을 도입하기위한 단순하고 간단한 방법이지만, 기술 몇 가지 제한이있다. 이 방법은 마이크로 그램 양의 고순도 단백질을 필요로한다. 적은 1과 μg의는 일렉트로와 공 초점 현미경으로 시각화하지만, 단백질의 높은 초기 금액은 BETT을 나타내었다시각적 인 결과 어. 단백질 기능 일렉트로 결국 농도에서 평가되지 않은 반면, 크거나 50 ㎍ / ml의 단백질 농도를 웨스턴 블롯에 적합한 신호에 필요 하였다. 또한, 전기 큐벳의 크기 제약으로 인해, 최대 스케일링 세포의 여러 큐벳의 처리를 필요로 할 수있다. 그러나, 세포가 준비되면 전기 과정이 단순한 초 정도 걸립니다 점을 감안, 병렬 처리는 조금 더 시간과 노력이 필요합니다.

도입 된 단백질은 웨스턴 블롯, 현미경에 의해 가시화, 또는 친 화성 정제를 위하여 사용될 경우, 단백질은 친 화성 정제 또는 검출 가능한 항체 태그 (35)를 가져야한다. 그러나, 알려지지 않은 이유로, 문헌 또는 기타 생화학 적 방법 (데이터 미도시)로부터의 상호 작용은 일부 공지 된 일렉트로 포 레이션 후 효과적으로 요약 될 수 없었다. 이 호스트가 F 일부 electroporation하여 단백질을 인식 할 수있다빨리 oreign 및 프로 테아 좀 저하 그들을 표시합니다.

전기는 단백질 전달을위한 기존의 방법에 비해 몇 가지 장점을 보유하고있다. 마이크로 인젝션에 비해 전기 훨씬 빠르고 간단하며, 다수의 셀이 시험 조건에 거의 100 %의 생존율로 한 번에 처리 할 수​​있다. 전기는 시중에서 판매하는 약으로 단백질 형질 전환보다 저렴합니다. DNA 형질 감염은 종종 숙주 세포에 세균 이펙터 단백질을 연구하는 데 사용됩니다; 그러나,이 단백질이 박테리아의 호스트에 의해 비 이상적으로 합성되도록한다. 한편, 박테리아 단백질의 전기 이펙터 단백질은 박테리아에 의해 발현되는 감염성 과정의 더 나은 표현을 허용 포유류 단백질 발현 기계류에 대한 의존도를 제거한다.

여러 응용 프로그램은 세균 호스트 INTERA의 연구 방법으로 단백질 전기를 사용할 수 있습니다ctions. 첫째, 자주 형질하기 어려운 일차 전지는 단백질 전달을위한 전기에 더 순종 할 수있다. 이것은 더 생물학적으로 중요한 세포 유형에서의 작동 자 기능의 연구를 허용한다. 전기는 또한 다중 단백질 및 / 또는 치료 옵션을 제공합니다. 예를 들어, 다수의 단백질이 동시에 도입 될 수 있거나, 또는 약물 및 다른 작은 분자는 단백질과 함께 전달 될 수있다. 세포 내 판별 단백질 일렉트로 그러한 친 화성 정제, 공지 된 표적, 전 세포 발현 분석에 대해 웨스턴 블롯 및 현미경과 같은 단백질의 기능과 상호 작용 분석법, 결합 될 수 도입 된 단백질의 효과의 기능적 이해를 얻기위한 가장 중요한 도입 된 단백질의 현지화. 따라서,이 방법은 다른 세포 및 분자 생물학 기술과 함께 세균성 병원체 생물학을 해명하기위한 도구로서 큰 잠재력을 가지고있다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution Cellgro 25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2088
100% Methanol Any N/A Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter Beckman Coulter Model Z1
Cell Culture Incubator Any N/A Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C 
Cell Culture Plastic Any N/A Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) Cellgro 10-013 Warm to 37 °C 
Electroporator Bio-Rad E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-016-CV
Fluorescent confocal microscope  Ziess Model  LSM 710 
Glass Bottom Dishes for Microscopy Wilco Wells HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail Pierce 78430 Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line ATCC ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer Invitrogen NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)  Cellgro 10-010 Warm to 37 °C 
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent Any N/A
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line ATCC TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest Any N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore Any N/A
Phosphate Buffered Saline Any N/A Chill to 4 °C 
Sterile Phosphate Buffered Saline Any N/A Warm to 37 °C 
Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin Agarose Resin Suspension  Pierce 20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) Any N/A
TCEP Sigma-Aldrich 646547 Corrosive, Toxic
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8585 Irritant, Toxic

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References

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