Электропорация функциональных бактериальных эффекторов в клетках млекопитающих

1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sontag, R. L., Mihai, C., Orr, G., Savchenko, A., Skarina, T., Cui, H., Cort, J. R., Adkins, J. N., Brown, R. N. Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (95), e52296, doi:10.3791/52296 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Изучение белковых взаимодействий в контексте живых клеток может генерировать критическую информацию о локализации, динамики и взаимодействующих партнеров. Эта информация особенно ценна в контексте хозяин-патоген взаимодействий. Многие белки патогена функционировать в клетках-хозяевах в различных образом, такого как, позволяя уклонения от иммунной системы хозяина и выживание в пределах внутриклеточного среды. Для изучения этих патогенов-белковых взаимодействий клетки-хозяина, несколько подходов обычно используются, в том числе: в естественных условиях заражения штаммом, выражающей с тегами или мутантный белок, или введение генов возбудителя через трансфекции или трансдукции. Каждый из этих подходов имеет свои преимущества и недостатки. Мы стремились средство непосредственно ввести экзогенные белки в клетки. Электропорации обычно используется, чтобы ввести нуклеиновых кислот в клетки, но был значительно реже применяется к белкам, хотя биофизических основанием является точно такой же.Стандартный Электропоратор был использован для введения сродством с метками бактериальных эффекторы в клетки млекопитающих. Человеческие эпителиальные и мыши макрофагов Клетки культивировали традиционными методами, удаленные, и помещают в 0,4 см зазор электропорации кюветы с бактериальным патогеном экзогенного белка, представляющего интерес (например, Salmonella Typhimurium GtgE). После электропорации (0,3 кВ) и короткие (4 ч) периода восстановления, внутриклеточный белок был проверен флуоресцентно маркировки белка с помощью своей аффинной метки и изучения пространственное и временное распределение с помощью конфокальной микроскопии. Электропорации белок также показали, чтобы быть функциональным в клетке и способный правильной субклеточном торговли и белок-белкового взаимодействия. В то время как экзогенные белки, как правило, накапливаются на поверхности клеток, электропорации образцы имели значительное увеличение внутриклеточной концентрации эффектор по отношению к инкубации в покое. Протокол является простым и достаточно быстро, чтобы быть сделано в арarallel моды, что позволяет с высокой пропускной характеристике патогенов белков в клетках-хозяевах, включая субклеточном адресности и функции вирулентности белками.

Introduction

Многие грамотрицательные бактерии используют специализированные системы секреции вводить вирулентности связанных белков (так называемые эффекторами) непосредственно в клетках-хозяевах 1-5. Эти эффекторы имеют широкий спектр биологических функций, включая: подавление иммунитета хозяина, изменения цитоскелета, изменение внутриклеточного транспорта и сигнализации, транскрипции изменений, и хозяин протеасомных изменений 6-9. Функции некоторых эффекторов известны, однако хозяева цели и биохимическое действие (ы) и многие другие еще предстоит определить. При сравнении дикого типа и рекомбинантных бактериальных инфекций является действительным подход к изучению внутриклеточных эффекторных механизмов вирулентности, часто выгодно вводить индивидуальный эффектор в клетку-хозяина. Таким образом, простые способы введения и характеризующие бактериальных белков эффекторные в контексте клетках-хозяевах является весьма желательным.

Упрощение анализа экспериментальных Wiй сингл эффектор имеет решающее значение, как и другие эффекторы могут иметь противоположные или избыточных функций. Для достижения этой облегчение, исследователи введенный ранее макромолекул в клетки различных методов, в том числе вирусной трансдукции 10, микроинъекции 11, загрузка путем соскоба 12,13, слияние клеток с химически индуцированного микроинъекции 14, фирменная белок "трансфекции" реагентов 15, фосфат кальция осадков 16 и 17-20 электропорации. Введенные в диапазоне от молекулы нуклеиновых кислот, включая виды ДНК, РНК, и RNAi в белках, клеточных непроницаемый красителей, и антитела для внутриклеточных мишеней 21,22. Некоторые методы имеют ограничения в том числе типа макромолекулы, которые могут быть введены, и конкретные вниз по течению анализ может быть ограничено из-за высокой клеточной токсичности, повреждений механизмами действия, низкой эффективности или эффективности внедрения. Трансфекцию, ofteн-используемый метод для выражения бактериальных генов в клетках млекопитающих, также страдает тем ограничением, что некоторые соответствующие виды клеток-хозяев, таких как макрофаги и первичных клеток, особенно устойчивы к трансфекции. Помимо этого, трудно контролировать уровни бактериального белка, полученного при введении чужеродной ДНК.

Большая работа была создана электропорации нуклеиновых кислот в обоих клетках бактерий и млекопитающих, как общая техника, лаборатории; Однако, проводятся исследования в лучших методов для доставки белков в клетки в физиологических условиях. Отчеты о белковой трансфекции являются перспективными, но требуют дорогостоящих реактивов и оптимизации. Желание ввести потенциально токсичные эффекторы бактериальных в самых разнообразных клеточных мишеней с минимальными затратами привели нас к рассмотрению электропорации в качестве способа для изучения этих белков в естественных условиях.

Белок электропорации 23-25 ​​является встретилHOD ввести белки в живых клетках с помощью electropermeabilization, также известный как электро-трансфекции или электро-инъекции 26. Эта методика использует высокой интенсивности электрических импульсов для создания пор в клеточных мембранах. Эти обратимые поры позволяют макромолекулы, которые обычно исключаются из внутриклеточного пространства проникнуть в клетку. После удаления внешнего электрического поля, мембрана может запечатать, позволяя клетке, чтобы сохранить молекул, которые прошли через поры 27,28.

Стандартный Электропоратор был использован в данном исследовании последовательно ввести бактериальных эффекторы в обоих мыши макрофагами, как клетки и эпителиальные клетки человека. Способ быстрой, эффективной и недорогой, без заметного снижения жизнеспособности клеток. Введенные белки могут быть визуализированы с помощью иммунофлюоресценции микроскопии или используется для функциональных анализов. Это было продемонстрировано использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве нетоксичного стандарта, а такжедва Salmonella эффекторные белки, SspH1 и GtgE. Мы предлагаем белка электропорации в качестве дополнительного инструмента в репертуаре для изучения бактериальных белков вирулентности и их функций в эукариотических клетках-хозяевах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. подготовить заранее

  1. Теплый стерильный фосфатный буферный солевой раствор (PBS) до 37 ° С.
  2. Модификация Теплый Дульбекко из среде Игла (DMEM) и минимальной поддерживающей среде (MEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина до 37 ° С. Примечание: Они представляют нормального роста массовой информации (NGM) для сырья и HeLa клеток соответственно.

2. Подготовка клеток

  1. Растут RAW 264.7 клетки 70-90% слияния в НГО.
    1. Поддержание клеток при 37 ° С в увлажненной 95% воздуха / 5% CO 2 атмосфере.
  2. Расти HeLa клеток 70-90% слияния в НГО.
    1. Поддержание клеток при 37 ° С в увлажненной 95% воздуха / 5% CO 2 атмосфере.
  3. Перед коллекции, мыть клеточный монослой один раз стерильной PBS.
  4. Сбор предварительной сливной клетки в стерильные конические пробирки.
    1. Аккуратно очистить RAW клеткис резиновым полицейского в PBS, с повторным пипетированием для разгона клеточные скопления.
    2. Снять HeLa клеток с 0,25% раствором трипсина, пока визуальное обследование не показывает диссоциации с поверхности культуры. Например, можно использовать от 2 до 3 мл на Т-75 колбу. Регулировка громкости соответственно для обеспечения раствор трипсина охватывает всю поверхность роста.
      1. Гасят реакции диссоциации с НГМ, содержащей 10% FBS.
      2. Используйте по крайней мере в два раза объем НГО трипсином, при повторном пипетки, чтобы разогнать клетки агрегаты.
  5. Слегка осаждения клеток центрифугированием при 900 х г в течение 4 мин.
  6. Ресуспендируют в том же объеме, как трипсин / охлаждения раствора с использованием стерильного PBS.
  7. Граф клеток с использованием гемоцитометра или счетчика частиц.
  8. Слегка осаждения клеток центрифугированием при 900 х г в течение 4 мин.
  9. Ресуспендируют в надлежащем объеме PBS в течение 5,5 × 10 6 до 6,0 × 10 6 клеток / мл. Примечание: Например, один Т-75 колбу даст approximленно 7,5 х 10 6 клеток 29.
  10. Держите клеточной суспензии на льду до электропорации.

3. Подготовка к Электропорация

  1. Pre-охлаждающие электропорации кюветы (0,4 см GAP) на льду.
  2. Включите электропорации аппарата и установить напряжение до 0,3 кВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: емкости и сопротивления не было регулируемых параметров на нашем электропоратора (по умолчанию установлено 10 мкФ и 600 Ω производителем).
  3. Заполните восстановления пластин с НГО и уравновешивают в увлажненной 95% воздуха / 5% СО 2 атмосферы при 37 ° С

4. Электропорация

  1. Поместите 400 мкл клеточной суспензии в предварительно охлажденной кювете и добавить 20 мкг белка, выбранного в кювете (50 мкг / мл).
  2. Флик кювета мягко ~ 10 раз перемешать, не повреждая клетки. Примечание: кювета может быть несколько раз перевернуть, чтобы хорошо перемешать, но не пипетки вверх и вниз или вихрь, чтобы избежать повреждения клеток.
  3. Электропорации образец на 0,3 кВ для 1,5-1,7 мс. Примечание: Это было типично для данного исследования.
  4. Сразу после электропорации Флик кювете осторожно ~ 10 раз тщательно перемешать.

5. Покрытие из клеток

  1. Магазин кювета с электропорации клеток на льду до готовности положите в восстановительных пластин.
  2. Для большинства последующих анализов, мыть клетки 1x с подогретого НГО, чтобы удалить посторонние белок эффекторной.
    1. Удалить ячейки для анализа и приостановить в 3-5 мл NGM.
    2. Гранул клетки центрифугированием при 900 х г в течение 4 мин.
    3. Ресуспендируют в адекватном объеме НГО для нужного размера пластины (например, 2 мл для 35-мм блюдо).
  3. Удалить соответствующее количество клеток для последующего анализа.
    1. Пример 1: тарелка в стеклянным дном посуды для анализа микроскопии.
    2. Пример 2: пластина INTO культуры клеток из пластика для анализа белков, таких как сродства очисток.
  4. Разрешить клетки для восстановления в уравновешенную пластин в увлажненной атмосфере 95% воздуха / 5% CO 2 атмосфере при 37 ° С в течение по меньшей мере 4 ч.

6. микроскопия Анализ

6.1) Фиксация / Иммунофлуоресценции Окрашивание

  1. Вымойте клетки 1x стерильной PBS после 4 ч восстановительного периода.
  2. Исправить клеток в 100% метаноле в течение 2 мин при комнатной температуре. Используйте достаточно метанола чтобы полностью покрыть клетки (например, 2 мл в течение 35 мм блюдо).
  3. Вымойте 3x стерильной PBS.
  4. Проницаемыми клеток с 0,4% Тритон Х-100 в PBS в течение 15 мин. Например, можно использовать 1 мл в течение 35 мм Диаметр пластины в.
    1. Регулировка длины проницаемости и прочности Triton X-100 в соответствии с эпитопом и местоположении целевого белка. Примечание: Наилучшие результаты должны быть определены эмпирически для каждой цели, однако вышеуказанные условия должны быть адекватны для большинства сytosolic целей.
  5. Блок 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Например, можно использовать 1 мл в течение 35 мм Диаметр пластины в.
  6. Промыть 3 раза ЗФР.
  7. Инкубируйте первичного антитела в антитело связывания раствора (0,1% Тритон Х-100 и 1% BSA в PBS) в течение ночи при 4   ° C при осторожном качания. Например, можно использовать 0,5 мл для 35 мм Диаметр пластины в.
    1. Следуйте рекомендациям изготовителя для разведения антител. Примечание: Например, стрептавидин-связывающий пептид, метка (тэг САД) антитела были использованы в отношении 1: 1000 разведении, в то время как антитела PKN1 был использован в количестве от 1: 200 разбавлении.
  8. Промыть 4x с PBS.
  9. Инкубируют при соответствующей флуоресцентно конъюгированного второго антитела в антитело связывания раствора в течение 1 ч при комнатной температуре, в защищенном от света.
    1. Например, можно использовать Alexa 488 или Alexa 647 в течение 1 ч при комнатной температуре.
      1. Следуйте рекомендациям производителя по муравьяibody разбавления. (Например, приблизительно от 1: 1000 в данном исследовании).
    2. Добавить другие загрязнения при необходимости, например, 5 мкМ зародышей пшеницы agglutinnin (WGA), конъюгированный с Alexa 647 или DAPI в соответствии с рекомендациями производителя, в течение 1 ч при комнатной температуре.
  10. Промыть 5x с PBS и хранить при 4 ° С, не защищены от света до готовности к изображению.

6.2) конфокальной микроскопии и анализа изображений

  1. Образцы изображение на перевернутой конфокальной микроскопии с использованием 63x нефти погружения цели.
    1. Изображение зеленый канал при помощи 488nm линии аргонового лазера, с излучением полосы пропускания между 492-542 нм.
    2. Изображение красного канала с помощью диодного лазера 633 нм, с выделением полосы пропускания между 640-718 нм.
    3. Изображение синий канал, используя лазерный диод 405 нм, с выделением полосы пропускания между 407-453 нм.
    4. Убедитесь, что для канала множественного Z-стеки покрытия полноту сотовой объеме.
  2. Изображения процесса с соответствующим программным обеспечением для обработки изображений.

7. Affinity Очистка

  1. Промыть электропорации клетки в два раза с 4 ° C PBS, после 4 ч восстановительного периода.
  2. Lyse с ~ 1,0 мл буфера для лизиса (1% Тритон Х-100 с коктейлем ингибиторов протеаз и ингибитора фосфатазы в PBS) на льду. Используйте ингибиторы соответствии с инструкциями производителя. Примечание: Например, оба фосфатазы и ингибиторы протеазы, использованные в данном исследовании, были поставлены на 100х, но и другие препараты должны работать одинаково хорошо.
  3. Оперативно очистить клетки с резиновым полицейского и собирать в конических труб.
  4. Lyse энергичным встряхиванием и ультразвуком. Примечание: Другие способы лизиса может работать одинаково хорошо, но эффективность нужно будет определена эмпирически относительно пригодности требований анализа.
    1. Разрушать ультразвуком 3 х 30 сек с прерывистым вортексе.
  5. Центрифуга при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для сбораклеточные обломки и нерастворимые агрегаты; сохранить супернатант.
  6. Зерноуборочный равные объемы (~ 1,0 мл) электропорации клеточного лизата с 50 мкл стрептавидин агарозном смолы суспензии при 4 ° С в течение ночи с конца поверх торцевой вращения. Примечание: Эта смола захватывает электропорации белок (и связанных с ними комплексов) через его стрептавидин-связывающий пептид аффинной метки.
  7. Центрифуга при 2500 х г в течение 2 мин и отбросить супернатант.
  8. Мыть два раза с 40 объемами слоя (~ 1 мл) PBS.
  9. Добавить 30 мкл 4х буфера для нанесения LDS (141 мМ Трис-основание, 2% СПД, 10% глицерина, 0,51 мМ ЭДТА, 0,22 мМ СЕРВА синий G, 0,175 мМ фенола красного, рН 8,5), 20 мкл DIH 2 O и 1 мкл 0,5 М трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР), что позволяет в течение некоторого объема оставаться в шариков.
  10. Нагревают при 95 ° С в течение 10 мин и охладили на льду.
  11. Спин> 10000 мкг при 4 ° С в течение 5 мин.
  12. Соберите супернатант.
  13. Выполните вестерн-блот, используя соответствующие антитела Примечание: ОнRe, анти-PKN1 первичное антитело используется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В качестве первого доказательства концепции, очищенный зеленый флуоресцентный белок был успешно введены в клетки млекопитающих с использованием электропорации. GFP, приблизительное 27 кДа белок, молекулярная масса обычно вводится в клетках млекопитающих (как правило, выражается с плазмидной ДНК), в качестве молекулярной биологии инструмента без значительной клеточной токсичности. HeLa клетки инкубировали (фиг.1А) или электропорации (фиг.1В) с 25 мкг / мл GFP, а затем иммунофлюоресценции конфокальной микроскопии для проверки флуоресцентного сигнала GFP. Чтобы продемонстрировать, что GFP был внутри сотовой цитозоле клетки окрашивали и агглютинина зародышей пшеницы (WGA), чтобы очертить границы цитозольного (красный), а также пятна нуклеиновой кислоты, DAPI (синий), чтобы указать, ядро. Внутриклеточный сигнал GFP наблюдалось только при электропорации, а не внутриклеточный белок не наблюдалось в клетках, инкубированных с GFP. Аналогичные результаты были получены с RAW264.7 мышимакрофагов, как клетки (фиг 1C и 1D). Следует отметить, что WGA является лектин, который преимущественно связывается с остатками в плазматической мембране и, следовательно, может проявлять точечный окрашивание на основе длины инкубации. Сравнение фиг.1А и фиг.2А, где фиг.2А инкубировали в течение более длительного периода времени, чем на фиг.1А.

Электропорация был продлен до тегами, очищенной Salmonella эффектора, GtgE. GtgE, известным фактором вирулентности 30, был обнаружен нашей группы, секретируется в клетки-хозяева 31, а в последнее время было показано, что цистеин протеазы 32. HeLa клетки инкубировали или электропорации с 50 мкг / мл GtgE. Для иммунофлуоресцентного анализа клетки окрашивали антителом против стрептавидин-связывающих пептидной метки сродства по GtgE. Клетки также окрашивали WGA и DAPI. В инкубировали клетки HeLa (FIGURe 2А), нет внутриклеточного GtgE как визуализировали с отсутствием зеленого флуоресцентного очагов. В отличие от этого, электропорации клетки HeLa (фиг.2В) показывают значительное флуоресцентный сигнал, указывающий внутриклеточного эффектор белок был введен в клетки из-за процесса электропорации. RAW клетки показали немного повышенная склонность к накоплению белка на клеточной поверхности во время инкубации (рис 2С), но внутриклеточный сигнал был замечен только после электропорации (рис 2D).

Определение пределов обнаружения для визуализации субклеточных локализации с помощью конфокальной микроскопии было важно обеспечить достаточное количество белка в камеру вошел, избегая при этом перегрузки ячейки с потенциально токсичных бактерий эффекторов. На фиг.3 GtgE подвергали электропорации в RAW макрофагов, как клетки на 2,5, 25 и 50 мкг / мл. Затем клетки фиксировали и окрашивали антителом против метки на GtgE. Оолько очень небольшое число очагов, которые наблюдались на 2,5 мкг / мл GtgE (рис 3а) с увеличение числа очагов очевидным на 25 мкг / мл, (рис 3B), но наибольшее число различных очагов были замечены при максимальной белка тестируемой концентрации, 50 мкг / мл (фиг.3С). Аналогичные тенденции окрашивания наблюдались между образцами, указывающими на этих концентраций белка внутриклеточного белка может быть легко проверено с помощью конфокальной микроскопии. Концентрации белка выше 50 мкг / мл не были проверены, потому что, как концентрация белка увеличивается, так же склонность к белку-мишени, чтобы стать адсорбируются на поверхности клеток. Чтобы избежать этих агрегатов мембраны белок, ассоциированный с, стало необходимым объединить два электропорации кюветы получить достаточно хозяина белок, взаимодействующий с визуализировать на вестерн-блоттинга (рис 6, далеко правой полосе).

Для дальнейшей демонстрации, что Introduced белок не просто адсорбирован на поверхности клетки, последовательные оптические срезы отображаемого в фокальных плоскостях каждые 0,35 до 0,43 мкм (Z-стеки) с помощью конфокальной микроскопии. RAW клетки подвергали электропорации с 50 мкг / мл GtgE и окрашивали, как описано выше (фиг.4, A и B). Z-стеки показали, что GtgE действительно внутриклеточного и очаги проходить от нижней (фиг.4А, самолет 6 из 36) в верхней части ячейки (фиг.4В, самолет 26 36). Аналогичные результаты были получены для всех электропорации белков. Внутренняя флуоресцентная профиль популяций клеток управления с и без эффекторной белка или электропорации исследовали с помощью флуоресцентного конфокальной микроскопии, и было обнаружено, что им можно пренебречь.

Кроме того, электропорации белок был рассмотрен, чтобы увидеть, если она была направлена ​​на деградацию с помощью эндоцитических путей. Клетки окрашивают в течение Рас-белок, связанный с 5А (Rab5),маркер для ранних эндосом (Рис 4в), так лизосомы, связанные мембранный белок 1 (LAMP1), маркера для поздних эндосом и лизосом (рис 4D). Co-локализация между электропорации белка и этих клеточных маркеров будет указывать на близкое физическое взаимодействие между ними (т.е. электропорации белка внутри эндосомах / лизосом). Конфокальной микроскопии показал, что электропорации белок (GFP или GtgE) не ко-локализуются с LAMP1 или Rab5. Был сделан вывод, что из этого вводится белок не был непосредственно эндоцитарных в клетки или ориентированы на эндоцитозного пути в течение четырех часов обработки.

Экзогенный протеин введение может иметь клеточные эффекты более в течение нескольких часов или дней, и, таким образом, часто полезно рассмотреть сохранение введенных белков. Чтобы определить, как долго электропорации белок будет сохраняться без ухудшения после электропорации. На основании выводап визуализация привязанности и распространения клеток, 4 ч был определен приблизительный минимальное время восстановления для электропорации клеток. Для временно наблюдать сохранение белка Эксперимент времени проводили Конечно, окрашивания клеток 4, 24 или 96 ч после электропорации. После 4 ч (рис 5А), когда морфология клеток предложил восстановление, было значительное количество внутриклеточного белка. После 24 ч (фиг.5В), по-прежнему значительное электропорации белок в клетках. Даже тогда, когда время после электропорации был продлен до 96 часов, прежде чем фиксации и окрашивания (5С) находились наблюдаемые очаги хотя и в меньших кажущееся изобилие, демонстрируя сохраняемости белок дней после первоначального обращения.

Два важных предостережений было отмечено в ходе этих экспериментов. RAW клетки проявляли большую склонность, чем HeLa клеток накапливать экзогенные белки на поверхности клетки IRREзависимо от инкубации (6А) или электропорации (6В). Несмотря на это, все образцы электропорации увеличилось внутренний белок (фиг.1, 2, 5, б). Кроме того, мембрана-ассоциированный белок исчез в течение долгого времени. Второй предостережение был небольшой популяции клеток, обладающих фенотипом, состоящий из меньше, закругленные клетки, нагруженные больших количеств экзогенных белков в обеих управления (инкубируют) и обработанные (электропорации) клетки (фиг.6 С и D, образцы инкубации показаны). Ядра этих клеток показали конденсированного хроматина, основанную на окрашивание DAPI и наполнил всю полноту сотовой объема, наводящий апоптоза. Поэтому возможно, что апоптотических клеток (возникающие в обычной части клеточного цикла или из-за сбора / обработки) имеют склонность к поглощению белок из буфера.

Чтобы продемонстрировать, что электропорации белки были функциональными и может локализовать Correctly внутри клетки-хозяина, совместной локализации и белок-белкового взаимодействия между эффекторной белка Salmonella SspH1 и его цели известны хоста, протеинкиназы N1 (PKN1) 33 был показан. После электропорации, физическое взаимодействие между SspH1 и PKN1 была проверена на основе иммунопреципитации с последующим аффинной вестерн-блоттинга (7А). Co-локализация наблюдалась также с помощью конфокальной микроскопии, который показывает флуорофоры достаточно близки пространственно перекрываться 34. После электропорации с 50 мкг / мл SspH1, HeLa-клетки (7В) фиксировали и окрашивали для SspH1 (зеленый) и PKN1 (красный). При низких мощности лазера отдельной очагов (желтый) наблюдались в ядре с указанием SspH1 и PKN1 были физически достаточно близко, чтобы взаимодействовать. Это взаимодействие было установлено в литературе; Однако это исследование является первым, чтобы показать совместной локализации в ядре.

= "Всегда"> Рисунок 1
Рисунок 1: Электропорация GFP - HeLa или сырые 264,7 клетки Клетки инкубировали или электропорации с 25 мкг / мл очищенной зеленого флуоресцентного белка (GFP) и окрашивали анти-GFP антитела (зеленый), DAPI, ядерная зондом, специфичным (синий. ), а WGA (красный), чтобы очертить цитозольную границу. Инкубировали (А) HeLa клетки показывают отсутствие зеленой флуоресценции, указывающий на отсутствие интернализации GFP. (В) показан репрезентативный микрофотография электропорации GFP. Обратите внимание на внешний вид внутриклеточного очагов индикации GFP был введен в клетки. (С) и (D) представлены типичные изображения RAW клеток, инкубированных (С), или электропорации (D) с 25 мкг / мл очищенного зеленого флуоресцентного белка.

ES / ftp_upload / 52296 / 52296fig2highres.jpg "/>
Рисунок 2:. Электропорация Salmonella эффектор GtgE - HeLa клеток Клетки инкубировали () или электропорации (B) с 50 мкг / мл сродством с тегами Salmonella эффектор, GtgE и окрашивали с тегом антитела против эффекторных (зеленый), DAPI, ядерная маска (синий) и WGA (красный), чтобы очертить цитозольную границу. В (А), инкубировали клетки HeLa показывают отсутствие зеленой флуоресценции, указывающий на отсутствие интернализации GtgE. (В) показан репрезентативный микрофотография электропорации GtgE, показывающий внутриклеточный белок электропорации эффекторной. (C) и (D) представлены типичные изображения RAW клетки, которые были либо инкубировали или электропорации, соответственно, таким же образом, с 50 мкг / мл Salmonella GtgE. Светло-голубой комбинации или наложение, из красной флуоресценции от WGA изеленая флуоресценция с вторичным антителом.

Рисунок 3
Рисунок 3: Титрование электропорации белка - RAW макрофагов, как клетки Клетки электропорации с 2,5 мкг / мл (А), 25 мкг / мл (В), или 50 мкг / мл (C) Salmonella эффекторной GtgE и оставляли для восстановления на. 4 ч. Клетки фиксировали и окрашивали анти-SBP-метки антител (зеленый) и ядер маски, DAPI (синий). Можно представить себе флуоресцентный очаги, указывающего внутриклеточного GtgE на 2,5 мкг / мл через конфокальной микроскопии, хотя лучшие результаты были получены, когда были использованы выше, исходное количество белка. Удовлетворительные результаты (в том числе внутриклеточного белка легко наблюдать с помощью конфокальной микроскопии без чрезмерного мембранных связанных агрегатов) были получены при 50 мкг / мл для GtgE и, таким образом, пО более высокие концентрации были протестированы.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Белок интернализация и отсутствие совместной локализации с эндосом маркеров Последовательные оптические срезы (Z-стеки), полученные с помощью конфокальной микроскопии для визуализации, если электропорации белок внутренние. RAW клетки подвергали электропорации с 50 мкг / мл GtgE. (А) показывает оптический срез 6 из 36, Z-стек (2,1 мкм) выше нижней части блюда. (Б) показывает то же поле зрения, но на срезе 26 36. Внутриклеточные очаги расширить по всей клетке, указывающей, что белок является действительно внутриклеточные и не объединяются на поверхности клетки. Светло-голубой сочетание красного WGA, зеленый вторичного антитела и синего DAPI. Совместной локализации анализа с маркерами эндосом / лизосом, Rab5, (C) или лизосомы маркера, LAMP1

Рисунок 5
Рисунок 5: Белки настойчивость после электропорации конфокальной микроскопа, показывающую сохранение электропорации GtgE с течением времени.. 50 мкг / мл GtgE подвергали электропорации в клетки HeLa. Затем клетки фиксировали и окрашивали анти-SBP-метки антител (зеленый) и ядер маски, DAPI (синий). 4 ч () был определен как минимальное количество времени, чтобы позволить клеткам восстановиться и, как и ожидалось показывает максимальную внутриклеточного белка. После 24 ч (В) и 96 ч (С), зеленого очагов, как внутриклеточного и на челlular поверхность, показать эффектор сохранение индикации, что белок не разрушается дней после первоначальной обработки. Светло-голубой цвет в этом изображении накладка голубой DAPI и окрашивания зеленой антител.

Рисунок 6
Рисунок 6:. Агрегация белков клеточной поверхности и фенотип электропорации RAW макрофагов, как клетки либо инкубируют () или электропорации (B) с 50 мкг / мл GtgE и окрашивали антителами анти-SBP-метки (зеленый), WGA (Red ), а также с DAPI (синий). Как RAW 264.7 и в меньшей степени клетки HeLa, тенденцию к агрегации эффектор на поверхности клетки; Все электропорации клетки показали, что увеличению внутреннего белка (HeLa не показан). Желтый наложение красный от WGA и зеленый с белком-мишенью. RAW (С) и (D HeLa) клеток Showinг измененный фенотип после инкубации с GtgE (показано). Несколько экспериментов показали, фенотип, состоящий из мелких клеток с дифференциальной DAPI окрашивания и потере цитоплазмы. Светло-голубой наложения из красного WGA, зеленый вторичного антитела и синего DAPI. Конфокальной микроскопии был использован для отображения целевой белок накапливается в ядре. Так этот фенотип экзогенных белков-Ладена клеток появились после того как и инкубации и электропорации, можно предположить, это фенотип наводящий апоптоза.

Рисунок 7
Рис. 7: Принимающие белковых взаимодействий с электропорации Salmonella SspH1 - HeLa клеток Клетки электропорации в перечисленных концентрациях с SspH1, разрешенных для восстановления в течение 4 часов перед выполнением модифицированный аффинной очистки с последующим вестерн-блоттинга (А) для обогащения иобнаружить известную эукариотической взаимодействующих партнера: серин / треонин протеинкиназы N1 (PKN1). Обратите внимание, что далеко правой полосе (2x EP) включает в себя 2 в пуле кювет, а сигнал от одного кювете смешивают в фоновом режиме, пока PKN1 еще обогащенный выше, отсутствие привязки видели в контроле не приманки. Вестерн-блот был запущен с нативным HeLa лизата, очищают SspH1, и образцы аффинной очистки перед их зондировали моноклональными антителами к PKN1. Обнаружение целей был получен с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела с реактивностью против изотипа первичного антитела. HeLa клетки (B) показывает совместной локализации (желтый) между PKN1 (красный) и SspH1 (зеленый) с помощью конфокальной микроскопии после электропорации с 50 мкг / мл SspH1. Этот оптический перекрытие означает, что эффектор и хозяин белок достаточно близко, чтобы физически взаимодействовать. Тот факт, что взаимодействие было показано в ядре в первый раз, обеспечивает дополнительную поддержку, чтоБелок торговли правильно хостом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Секретируемые эффекторы от патогенных бактерий развивались функционировать в среде клетки-хозяина, и, таким образом, было бы полезно, чтобы изучить их на месте в узле. Введение конкретных эффекторов интерес в клетки-хозяева позволяет соответствующим патогеном-хозяева взаимодействия должны быть изучены в изоляции, без вмешательства со стороны других бактериальных белков. Цель в том, чтобы исследовать электропорации в качестве средства для внедрения бактериальных эффекторных белков в эукариотических клетках-хозяевах, тем самым избежать некоторых проблем, связанных с трансфекции или трансдукции. Зеленый флуоресцентный белок был использован в качестве контроля, и сальмонелла эффекторные белки были испытаны. Из-за интереса в бактериальных патогенов, которые целевого хоста эпителиальные клетки, а также клетки иммунной системы, были использованы эпителиальных как человеческая линия клеток (HeLa) и мышь макрофагами, как клетки (RAW 264.7). Электропорация может доставить экзогенных белков в клетках-хозяевах без заметного снижения в ячейке viabiliти, и поставленные белки были обнаружены в клетках до четырех дней.

Для выделения эффектов электропорации белка, чистый белок необходим. В этом исследовании, были высказаны белки в E. Штамм BL21 с N-концевой полигистидиновой и стрептавидина-пептидных меток. Белки были очищены с Ni-NTA смолы, анализировали на концентрации (обычно между 5-25 мг / мл) и чистоты и хранили при -80 ° С до электропорации. Коммерчески полученные белки также будет приемлемым для электропорации, как они, как правило, высокой чистоты и хорошо охарактеризованы.

Основные шаги в этом протоколе, включенных полного удаления клеточную культуральную среду с помощью промывки и суспендировани клеток в небелкового буфера. Это гарантирует, что любые наблюдаемые фенотипы вниз по течению обусловлены экзогенного белка, представляющего интерес, и не белков, присутствующих в культуральной среде. Повышение эффективности электропорации наблюдалось, когда плотность клетоквыше (например, 6 × 10 6 против 1 × 10 6 клеток), но лучше количество клеток будет меняться в зависимости от размера ячейки и типа. Еще одним важным шагом в эксперименте было, чтобы клетки время для восстановления и повторного подключения к блюдам; это было необходимо, потому что прилипшие клетки использовали в этом исследовании. Восстановительный период должен быть менее важным для суспензии клеток, хотя это может быть необходимо, чтобы дать протеины время для правильного внутриклеточного транспорта, белок-белковых взаимодействий, или ферментативной активности, в зависимости от природы предполагаемого исследования. С поставленной белки были обнаружены внутри клеток до 96 ч, есть много возможностей для корректировки инкубационного периода до микроскопии визуализации или клеточная.

Некоторые переменные в этом протоколе могут быть оптимизированы для различных типов клеток, белковых мишеней, или схем вниз по течению анализа. Количество белка для электропорации может быть доработаны для требуемого внутриклеточной концентрации. ФоR визуализация локализации белков, как мало, как 1 мкг может быть использован. Для функциональных исследований, более высокие стартовые количество белков могут быть необходимы. Кроме того, количество времени для восстановления после электропорации клеток может быть замкнут или расширяется. Лабильные белковые мишени или быстрые последующих процессов потребует меньше времени инкубации. Кроме того, количество посеянных клеток можно регулировать за предложений здесь. Клетки могут быть покрыты более редко, если вводится белок должен контролироваться с помощью микроскопа, или покрыты более плотно, если электропорации белок будет возмещена для таких приложений, как западных пятна.

В то время как электропорация является простым и понятным способ введения белков в живых клетках, есть некоторые ограничения метода. Метод требует высокой чистоты белков в микрограммовых количествах. Как мало, как 1 мкг электропорации и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии, но более высокие стартовые количество белка дал Беттэ визуальные результаты. В то время как функции белка не была оценена при всех концентрациях после электропорации, концентрации белка, равной или большей, чем 50 мкг / мл были необходимы для адекватного сигнала для вестерн-блоттинга. Кроме того, из-за размера ограничений электропорации кюветы, расширения может потребовать обработку нескольких кюветах клеток. Однако, учитывая, что процесс электропорации занимает считанные секунды, как только клетки готовы, параллельная обработка требуется немного больше времени и усилий.

Если введено белок должен быть визуализированы с помощью вестерн-блот, микроскопии, или использовать для аффинной очистки, белок должен иметь метку 35 для аффинной очистки или доступным антителом для детекции. Тем не менее, по неизвестным причинам, некоторые взаимодействия, известные из литературы или других биохимических методов (данные не показаны), не могли быть обобщены после электропорации. Вполне возможно, что хозяин распознает некоторые электропорации белков в качестве Foreign и быстро помечает их деградации протеасом.

Электропорация имеет несколько преимуществ по сравнению с другими существующими методами доставки белка. По сравнению с микроинъекции, электропорации намного быстрее и проще, и большое количество клеток можно лечить сразу с почти 100 процентов жизнеспособности для тестируемых условиях. Электропорация также дешевле, чем белка трансфекции коммерчески доступных реагентов. Трансфекции ДНК, часто используется для изучения бактериальных белков эффекторные в клетках-хозяевах; Однако, это приводит к тому, бактериальные белки, чтобы быть синтезированы без идеале хостом. С другой стороны, электропорации бактериальных белков удаляет зависимость от млекопитающих экспрессии белков техники, что позволяет лучше представлении инфекционного процесса, где эффекторные белки экспрессируются бактериями.

Некоторые приложения могут использовать белковые электропорации как метода в изучении бактериально-хозяина Интераctions. Во-первых, первичные клетки, которые часто трудно трансфекции может быть более пригодными для электропорации для доставки белков. Это позволит для изучения эффекторной функции в более биологически соответствующих типов клеток. Электропорации также дает возможность мультиплексирования белков и / или лечения. Например, несколько белки могут быть введены одновременно или лекарственные средства и другие малые молекулы могут быть доставлены вместе с белками. Наиболее важно для получения функциональной понимания влияния введенных белков, белок электропорации может использоваться в сочетании с анализами на функцию белка и взаимодействия, таких как аффинной очистки, вестерн-блоттинга от известных целей, анализ целых клеток экспрессии, и микроскопии для определения субклеточные локализация введенного белка. Таким образом, этот метод имеет большой потенциал в качестве инструмента для выяснения бактериальный возбудитель биологии наряду с другими клеточными и молекулярными методами биологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution Cellgro 25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2088
100% Methanol Any N/A Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter Beckman Coulter Model Z1
Cell Culture Incubator Any N/A Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C 
Cell Culture Plastic Any N/A Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) Cellgro 10-013 Warm to 37 °C 
Electroporator Bio-Rad E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-016-CV
Fluorescent confocal microscope  Ziess Model  LSM 710 
Glass Bottom Dishes for Microscopy Wilco Wells HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail Pierce 78430 Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line ATCC ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer Invitrogen NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)  Cellgro 10-010 Warm to 37 °C 
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent Any N/A
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line ATCC TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest Any N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore Any N/A
Phosphate Buffered Saline Any N/A Chill to 4 °C 
Sterile Phosphate Buffered Saline Any N/A Warm to 37 °C 
Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin Agarose Resin Suspension  Pierce 20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) Any N/A
TCEP Sigma-Aldrich 646547 Corrosive, Toxic
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8585 Irritant, Toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
  2. Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
  3. Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
  4. Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
  5. He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
  6. Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
  7. Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
  8. Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
  9. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
  10. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
  11. Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
  12. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
  13. Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68, (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
  14. Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
  15. Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
  16. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
  17. Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
  18. Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
  19. Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
  20. Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
  21. Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
  22. Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
  23. Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
  24. Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
  25. Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
  26. Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
  27. Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
  28. Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
  29. McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
  30. Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
  31. Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
  32. Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
  33. Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
  34. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4, (Unit 4.19), (2011).
  35. Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9, (Unit 9.9), (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics