电功能性细菌效应器到哺乳动物细胞

1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University
Immunology and Infection

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Sontag, R. L., Mihai, C., Orr, G., Savchenko, A., Skarina, T., Cui, H., et al. Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (95), e52296, doi:10.3791/52296 (2015).

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Abstract

蛋白质相互作用的活细胞中的上下文中的研究可以产生大约本地化,动力学和相互作用伙伴的关键信息。这些信息是在宿主 - 病原体相互作用的背景下尤为可贵。许多病原体的蛋白质的宿主细胞内的多种方式,如功能,从而使宿主的免疫系统和存活的逃避细胞内环境中。研究这些病原体蛋白宿主-细胞相互作用,几种方法是常用的,其中包括: 在体内感染用表达一个标记或突变蛋白,或引入病原体的基因通过转染或转导的菌株。每一种方法都有优点和缺点。我们试图直接引入外源蛋白进入细胞的一种手段。电穿孔通常用于将核酸引入细胞中,但已被更很少应用于蛋白质虽然生物物理基础是完全一样的。一个标准的电穿孔被用于引入亲和标签效应细菌到哺乳动物细胞。人类上皮细胞和小鼠巨噬细胞用传统方法进行培养,分离,并置于0.4厘米的空隙电试管与感兴趣的外源细菌病原体蛋白( 例如鼠伤寒沙门氏菌 GtgE)。电穿孔(0.3千伏)和短(4小时)的恢复期后,细胞内蛋白质是由通过其亲和标记物的荧光标记的蛋白,并检查空间和时间分布通过共聚焦显微镜证实。电穿孔的蛋白质也被证明是功能性细胞内,并能正确的亚细胞贩卖和蛋白质 - 蛋白质相互作用的。而该外源蛋白倾向于积聚在细胞的表面上,将电穿孔样品具有大量增加的细胞内效应器浓度相对单独孵育。该协议是简单,速度不够快,在做AParallel时尚,允许病原体蛋白在宿主细胞中的高通量特征包括亚细胞靶向和毒性蛋白的功能。

Introduction

许多革兰氏阴性菌采用专门的分泌系统注入毒性相关蛋白(称为效应器)直接导入宿主细胞1-5。这些效应物具有广泛的生物学功能,包括:抑制宿主免疫的,细胞骨架的变化,细胞内运输和信号传导,转录变化的修饰,和宿主蛋白酶的改变6-9。某些效应的功能是已知的,但是在主机的目标和其他许多人的生化作用(多个)仍有待确定。而比较野生型和重组体细菌感染是研究细胞内效应器毒力机制的有效的方法,它通常是有利的引入个体效应入​​宿主细胞。因此,简单的方法,用于在宿主细胞中的上下文中引入和表征细菌效应蛋白是高度期望的。

简化了实验分析的Wi第一个效应是至关重要的其它效应可能有相反的或多余的功能。要做到这一点简化,研究人员先前推出的大分子物质进入细胞的许多不同的方法,包括病毒转导10,显微注射11,刮装载12,13,细胞融合与化学诱导注射14,专有蛋白“转”试剂15,磷酸钙沉淀16,和电穿孔17-20。所引入的分子范围从核酸包括DNA,RNA和RNA干扰物种的蛋白质,细胞不透染料和抗体的细胞内目标21,22。一些方法都有局限性,包括大分子的可以引入的类型,以及特定下游分析可由于高的细胞毒性,作用破坏机制,低功效,或导入效率的限制。转染,一个ofte正使用的表达方法在哺乳动物细胞中的细菌的基因,也受到限制,一些有关的宿主细胞类型,例如巨噬细胞和原代细胞,是朝着转染特别耐。除此之外,它难以控制导入外源DNA后产生的细菌蛋白的水平。

许多工作已建立的核酸引入细菌和哺乳动物细胞作为通用实验室技术电穿孔;然而,人们一直在研究转化为在生理条件下提供的蛋白质进入细胞的最佳方法。对蛋白质的转染报告是有希望的,但需要昂贵的试剂和优化。引入潜在的有毒细菌效应成各种各样的以最小的成本细胞靶的愿望促使我们考虑电穿孔作为用于体内研究这些蛋白质的方法

蛋白质电23-25 ​​是一个满足HOD引入蛋白质成经由electropermeabilization活细胞,也被称为电-转染或电注入26。这种技术使用高强度的电脉冲以在细胞膜孔。这些可逆孔隙允许通常由细胞内的空间中排除大分子进入细胞。在去除外部电场,膜可以重新密封,使细胞能留存穿过孔27,28的分子。

一个标准的电穿孔被用于本研究中一致地引入细菌效应入两个小鼠巨噬细胞样细胞和人上皮细胞。该方法是快速的,有效的,廉价的,在细胞生存力没有明显的下降。引入的蛋白可通过免疫荧光显微镜进行可视化,或用于功能测定法。这已被证明使用绿色荧光蛋白(GFP),为无毒的标准,以及2 沙门氏菌效应蛋白,SspH1和GtgE。我们建议蛋白电作为剧目的细菌毒力的蛋白质及其功能的真核宿主细胞研究的一个额外的工具。

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Protocol

1.提前准备

  1. 温暖的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS),以37℃。
  2. 温暖的Dulbecco改性的Eagle培养基(DMEM)和极限必需培养基(MEM),补充有10%胎牛血清(FBS),100国际单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素至37℃。注:分别为这些代表正常生长介质(NGM)为RAW和HeLa细胞。

2.准备细胞

  1. 生长的RAW 264.7细胞中的NGM 70-90%汇合。
    1. 保持在湿润的95%空气/ 5%CO 2的气氛中的细胞在37℃。
  2. 生长的HeLa细胞中的NGM 70-90%汇合。
    1. 保持在湿润的95%空气/ 5%CO 2的气氛中的细胞在37℃。
  3. 收集前,用无菌PBS洗涤细胞单层一次。
  4. 收集在无菌锥形管中预汇合的细胞。
    1. 轻轻刮去RAW细胞用橡皮警察在PBS,反复吹打分散细胞聚集。
    2. 分离HeLa细胞与0.25%胰蛋白酶溶液,直到视力检查显示了从培养表面解离。例如,使用2〜3毫升为T-75烧瓶中。相应地调整音量,保证胰蛋白酶溶液覆盖整个生长表面。
      1. 淬火用含有10%FBS的NGM离解反应。
      2. 使用NGM的至少两倍的量,以胰蛋白酶,反复移液以分散细胞聚集。
  5. 轻轻离心沉淀细胞,在900×g离心4分钟。
  6. 重悬在相同体积用无菌PBS胰蛋白酶/骤冷溶液。
  7. 计数使用血球或粒子计数器细胞。
  8. 轻轻离心沉淀细胞,在900×g离心4分钟。
  9. 重悬在PBS中的适当体积为5.5×10 6〜6.0×10 6个细胞/ ml。注:例如,一个T-75瓶将产生逼近的ately 7.5×10 6个细胞29。
  10. 保持细胞悬液在冰上直到电。

3.准备电穿孔

  1. 预冷电试管(0.7厘米的缝隙)冰上。
  2. 打开电设备和设置电压0.3千伏。
    注:电容和电阻并不在我们的电穿孔(由制造商设定在10μF和600Ω)可调设置。
  3. 填回收板的NGM,并在37℃下平衡的湿润的95%空气/ 5%CO 2的气氛中

4.电穿孔

  1. 放置400微升细胞悬浮液中预先冷却的反应杯,并添加20微克选择蛋白与样本池(50微克/毫升)。
  2. 弗里克试管轻轻〜10次混合而不损伤细胞。注意:反应杯也可以倒置几次以调匀,但不要吸管上下或涡流,以避免损坏电池。
  3. 在0.3千伏为1.5-1.7毫秒电​​穿孔的样品。注意:这是典型的用于本研究。
  4. 紧接着电轻弹试管轻轻〜10次调匀。

5.电镀细胞

  1. 商店试管在冰上,直到准备电穿孔细胞放置在复苏板块。
  2. 对于大多数下游分析,洗涤细胞1×预热的NGM去除多余的效应蛋白。
    1. 去除细胞进行分析,并暂停在3-5毫升NGM的。
    2. 通过离心沉淀细胞,在900×g离心4分钟。
    3. 悬浮在NGM足够的音量所需的板尺寸( 2毫升35毫米盘)。
  3. 对于下游分析去除细胞的适当的量。
    1. 例1:板到玻璃底菜显微镜分析。
    2. 例2:板INTØ细胞培养塑料蛋白质分析等亲和纯化。
  4. 允许细胞在平衡板在加湿的95%空气/ 5%CO 2的气氛中以回收在37℃下至少4小时。

6.显微镜分析

6.1)固定/免疫染色

  1. 洗涤细胞后4小时恢复期1×用无菌PBS。
  2. 固定的细胞在100%甲醇中,在室温下2分钟。使用足够的甲醇,以完全覆盖细胞( 2毫升35毫米盘)。
  3. 洗3次,用无菌PBS洗涤。
  4. 通透细胞用0.4%的Triton X-100的PBS 15分钟。例如,使用方法1毫升35毫米直径板。
    1. 根据表位与目标蛋白的位置调整通透的Triton X-100和实力的长度。注意:最好的结果将需要凭经验为每个目标确定的,但是在上述条件应足以大多数Cytosolic目标。
  5. 用5%的牛血清白蛋白(BSA)的PBS阻断1小时,在室温。例如,使用方法1毫升35毫米直径板。
  6. 洗涤3次,用PBS。
  7. 孵育在抗体结合解第一抗体(在PBS中0.1%的Triton X-100和1%BSA)中过夜,在4   °下与温和的摇摆。例如,使用0.5毫升为35毫米直径板。
    1. 按照制造商的建议抗体稀释。注意:例如,链霉亲和结合肽标签(SBP-标签)抗体被用于以1:1000稀释,而PKN1抗体被用于以1:200的稀释。
  8. 洗涤4X,用PBS。
  9. 孵育在抗体结合解适当荧光标记的二抗1小时,在室温下,避光。
    1. 例如,使用的Alexa 488或Alexa 647进行1小时,在室温下进行。
      1. 按照制造商的建议蚂蚁ibody稀释。 ( 例如,约1:1000本研究)。
    2. 添加其它污渍根据需要,例如,5微米的小麦胚芽agglutinnin(WGA)缀合的Alexa 647或DAPI根据制造商的建议,进行1小时,在室温下进行。
  10. 洗涤5次,用PBS,并在4℃储存,避光,直到准备图像。

6.2)共聚焦显微镜和图像分析

  1. 在使用63X油浸物镜倒置共聚焦显微镜图像样本。
    1. 图像的绿色通道使用氩激光的488nm处线,具有492-542纳米之间的带宽发射。
    2. 图像的红色通道用一个633纳米二极管激光器,具有640-718纳米之间的带宽发射。
    3. 图像蓝色通道使用一个405nm的二极管激光器,具有407-453纳米之间的带宽发射。
    4. 确保多通道的z堆叠覆盖细胞体积的全部。
  2. 处理图像与适当的图像处理软件。

7.亲和纯化

  1. 后4小时恢复期间用4℃的PBS洗两次电穿孔的细胞。
  2. 裂解用〜加入1.0ml裂解缓冲液(1%的Triton X-100与蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂的PBS)在冰上。根据制造商的说明,使用抑制剂。注意:例如,无论是在本研究中使用的磷酸酶和蛋白酶抑制剂在100倍供给的,但其他的制剂应该工作得同样好。
  3. 及时刮掉细胞橡胶警察并收集到锥形管。
  4. 裂解剧烈涡旋和超声。注:其它裂解方法可工作得同样为好,但将需要效率来凭经验确定作为对测定规定的适用性。
    1. 超声处理3×30秒,间歇漩涡。
  5. 离心机以10,000×g离心10分钟,在4℃以收集细胞碎片和不溶性聚集体;保存上清液。
  6. 结合电穿孔细胞裂解物等体积(〜1.0ml)中,用50微升链霉亲和琼脂糖树脂悬浮液在4℃下过夜终过端旋转。注意:此树脂捕获经由其链霉结合肽的亲和标签的电穿孔蛋白(和相关的复合物)。
  7. 离心在2500 xg离心2分钟,弃上清。
  8. 用40柱床体积(约1毫升)的PBS洗涤两次。
  9. 添加30微升4×LDS加样缓冲液(141毫摩尔Tris碱,2%的LDS,10%甘油,0.51毫摩尔EDTA,0.22毫SERVA蓝G,0.175毫酚红,pH值8.5),20微升DIH 2 O和1微升0.5M的三(2-羧乙基)膦(TCEP),允许一些量留在珠。
  10. 热,在95℃下进行10分钟,并在冰上冷却。
  11. 自旋> 10,000 xg离心在4℃下5分钟。
  12. 收集上清。
  13. 使用合适的抗体注意进行免疫印迹:他重,抗PKN1初级抗体被使用。

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Representative Results

作为概念的初步证明,纯化的绿色荧光蛋白被成功地引入到使用电穿孔哺乳动物细胞。绿色荧光蛋白,近似27 kD的分子量蛋白质通常引入哺乳动物细胞(通常为质粒DNA表​​达),为无显著细胞毒性的分子生物学工具。 HeLa细胞孵育( 图1A)或电穿孔( 图1B)与25微克/毫升的GFP,随后通过免疫荧光共聚焦显微镜检查荧光GFP信号。以证明GFP是蜂窝胞质溶胶内,将细胞也沾上麦胚凝集素(WGA)划定胞质边界(红色),以及一个核酸染色,DAPI(蓝色),以指示所述核。胞内GFP信号观察仅在电穿孔,而没有细胞内蛋白质中观察到的细胞培养用GFP。类似的结果,观察RAW264.7小鼠巨噬细胞样细胞( 图1C1D)。需要注意的是WGA是一种凝集素,其优先结合残基在质膜,因此可以根据培养的长度呈现出点状染色。比较图1A图2A中 ,其中图2A温育持续时间比图1A更长。

那么电延长到一个标记,纯化沙门氏菌效应,GtgE。 GtgE,已知毒力因子30,发现了我们的组被分泌到宿主细胞31,以及最近被证明是一种半胱氨酸蛋白酶32。 HeLa细胞培养或电穿孔,用50微克/毫升GtgE。对于免疫荧光分析,将细胞染色,对上GtgE的链霉亲和结合肽的亲和标签的抗体。上的细胞也沾上WGA和DAPI。在培养HeLa细胞(Figu重新2A),有作为可视化由缺乏绿色荧光灶的无细胞内GtgE。与此相反,电穿孔的HeLa细胞( 图2B)示出显著荧光的细胞内信号指示效应蛋白已进入细胞由于电穿孔过程。的RAW细胞表现出稍微增加的倾向孵育( 图2C)期间积累的蛋白质的细胞表面上的,但细胞内信号被视为仅根据电穿孔( 图2D)。

确定检测限用于经由共焦显微镜可视化亚细胞定位是很重要的,以确保有足够的蛋白质进入细胞,同时避免过载使细胞与潜在有毒细菌效应。在图3中 ,GtgE电转入RAW巨噬细胞样细胞在2.5,25,和50微克/毫升。然后将细胞固定并用抗上GtgE标记的抗体。 ØNLY观察到极少数灶在2.5微克/毫升GtgE( 图3A),与病灶明显增加数为25微克/毫升( 图3B),但不同的病灶数目最多,看到在最大的蛋白质浓度测试,50微克/毫升( 图3C)。类似染色模式表明这些蛋白质的浓度的细胞内蛋白可以通过共聚焦显微镜很容易地验证样品之间观察到。蛋白质浓度高于50μg/ ml的未测试因为作为蛋白质增加的浓度,所以没有倾向靶蛋白成为吸附至细胞表面。以避免相关膜蛋白的这些聚集体,它成为必须集合2电试管以获得足够的宿主相互作用蛋白可视化上的蛋白印迹分析( 图6,最右边泳道)。

为了进一步证明整型roduced蛋白不是简单地吸附在细胞的表面上,连续的光学切片每0.35至0.43微米(Z-栈)使用共焦显微镜进行成像在焦平面。的RAW细胞用50微克/毫升GtgE和上述( 图4,AB),为描述的染色。的Z堆叠表明GtgE确实细胞内和细胞的焦点从底部( 图4A,平面6的36)延伸到细胞( 图4B,平面36 26)的顶部。获得类似的结果对于所有电穿孔蛋白。控制细胞群具有和不具有效应蛋白或电的固有荧光信息进行了检查,荧光共焦显微镜,并且被认为是可忽略不计。

此外,将电蛋白进行了检查,看它是否是通过内吞途径靶向降解。细胞染色为Ras相关蛋白5A(Rab5的),一个标记早期内涵体( 图4C),或溶酶体相关膜蛋白1(灯管1),标 ​​记为晚期内涵体和溶酶体( 图4D)。电穿孔蛋白与这些细胞标记之间的共定位将表明他们之间的密切物理相互作用( 电穿孔蛋白是核内体/溶酶体内)。共聚焦显微镜表明,电穿孔蛋白(GFP或GtgE)没有共同本地化与LAMP1或Rab5的。它是从本地介绍了蛋白质没有直接内吞进入细胞或四个小时的处理内靶向胞吞途径的推断。

外源蛋白的介绍可以有超过数小时或数天的过程中细胞的影响,并且因此它往往是有益的,研究导入蛋白的持久性。要确定多长时间的电蛋白将电后持续不下降。基于Ø附着和细胞的n个可视铺展,4小时测定为近似最小恢复时间为电穿孔的细胞。在时间上观察蛋白的持久性的时程实验中进行,细胞染色4,24,或电穿孔后96小时。 4小时( 图5A)后,当细胞的形态暗示恢复,有细胞内蛋白质的显着量。 24小时后( 图5B),仍然在细胞内大量电穿孔蛋白。即使当电穿孔后的时间延长至96小时,固定和染色( 图5C)有可观察到的病灶尽管在降低的表观丰度,这表明蛋白的持久性天初始治疗后前。

这些实验的过程中,两个重要的注意事项进行说明。的RAW细胞表现出比HeLa细胞更倾向于积聚外源蛋白质在细胞表面irre孵育spective( 图6A)或电穿孔( 图6B)。尽管如此,所有的电穿孔的样品已经增加内部蛋白质( 图1,图2,图5B)。此外,该膜结合蛋白消失时间的推移。第二种警告是一个小群细胞表现出的表型包括较小的,圆形细胞装载有两个控制中的高量的外源蛋白质的(孵育)和处理(电穿孔)的细胞( 图6 C和D,如图孵育样本)。这些细胞的细胞核显示基于DAPI染色质凝集,并充满了细胞体积的全部,暗示细胞凋亡。因此,可能的是凋亡细胞(产生作为细胞周期的正常部分或由于收获/治疗)有一个倾向从缓冲器吸收蛋白质。

为了证明电穿孔蛋白是功能性,并能定位CORREctly内的宿主细胞中, 沙门氏菌效应蛋白SspH1和其已知的宿主靶,蛋白激酶N1(PKN1)33被示出之间的共定位和蛋白质-蛋白质相互作用。电穿孔后,SspH1和PKN1之间的物理相互作用是通过基于亲和力的免疫沉淀,随后通过Western印迹( 图7A)进行验证。共定位也通过共聚焦显微镜,其指示所述荧光团足够靠近空间上重叠34观察。电穿孔用50微克/毫升SspH1后,HeLa细胞( 图7B)固定并染色SspH1(绿色)和PKN1(红色)。在低激光功率不同的焦点(黄色),观察在细胞核中指示SspH1和PKN1在物理上足够接近交互。这种相互作用已经建立在文献中;然而本研究首次显示共定位在细胞核中。

=“总是”> 图1
图1:的GFP电穿孔-的HeLa或RAW 264.7细胞培养细胞或电穿孔用纯化的绿色荧光蛋白(GFP)的25微克/毫升,并用抗GFP抗体(绿),DAPI,一个核特异性探针(蓝色 )和WGA(红色)来描绘的胞质边界。孵育(A)中的HeLa细胞显示缺乏绿色荧光指示缺少的GFP内化的。(B)示出电穿孔的GFP的代表性显微照片。注意细胞内病灶指示GFP已经进入了细胞的外观。(C)(D)是培养的RAW细胞(C)的与纯化的绿色荧光蛋白的25微克/毫升的代表图像,或电穿孔(D)中

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图2: 沙门氏菌效应GtgE的电穿孔- HeLa细胞培养细胞(A)或电穿孔(B)中的亲和力的50微克/毫升标记沙门氏菌效应,GtgE,并用抗效应标签抗体(绿色), DAPI,核掩模(蓝色)和WGA(红色)来描绘的胞质边界。在(A)中 ,温育的HeLa细胞显示缺乏绿色荧光指示缺乏GtgE内在化的。(B)示出电穿孔GtgE的代表性显微照片,显示出细胞内的电穿孔效应蛋白(C)(D)是具有代表性的图像的RAW细胞中任一温育或电穿孔,分别以相同的方式与沙门氏菌 GtgE的50微克/毫升。浅蓝色从WGA的结合,或覆盖,红色荧光,绿色荧光从二次抗体。

图3
图3:电穿孔蛋白滴定- RAW巨噬细胞样细胞细胞用2.5微克/毫升(A)中 ,25微克/毫升(B)中 ,或50微克/毫升(C)的沙门氏菌效应GtgE并使其恢复为 4小时。将细胞固定并用抗SBP标签抗体(绿色)和细胞核掩模,DAPI(蓝色)。因此能够可视荧光灶,指示细胞内GtgE在通过共焦显微术2.5微克/毫升,虽然当使用蛋白质的更高的起点量更好的结果。令人满意的结果(包括细胞内蛋白质通过共聚焦显微镜容易观察而没有过度的膜相关联的聚集体)在50微克/毫升获得GtgE从而nØ更大的浓度进行了测试。

图4
图4:蛋白质内化和缺乏共定位与内涵体标志物通过共聚焦显微镜获得的连续的光学片(Z-堆栈)来可视化,如果电穿孔蛋白内部。的RAW细胞用50微克/毫升GtgE。(A)示出的光学片6 36的,在z栈(2.1微米)的培养皿的底部的上方。(B)示出的图,但在片26的相同场36.胞内病灶延伸整个细胞,表明该蛋白质是真正的细胞内而不是聚集在细胞的表面上。浅蓝色是红色的WGA,绿色二次抗体,以及蓝色的DAPI的组合。随着核内体/溶酶体,Rab5的,(C)或溶酶体标记,LAMP1标记共定位实验

图5
图5:电穿孔后蛋白的持久性的共焦显微照片,示出电穿孔GtgE随时间的持久性 50微克/毫升GtgE电转入HeLa细胞。然后将细胞固定并用抗SBP标签抗体(绿色)和细胞核掩模,DAPI(蓝色)。 4小时(A)被确定为时间,让细胞恢复的最低金额和预期显示最大的细胞内蛋白质。 24小时后(B)和96小时(C)中 ,绿色病灶,细胞内和细胞上的CEL细胞性表面,显示的效应的持久性指示该蛋白质不是初始治疗后退化天。淡蓝色的颜色在这个形象是蓝色的DAPI,绿色抗体染色的叠加。

图6
图6:细胞表面蛋白的聚集和电穿孔表型的RAW巨噬细胞样细胞或者孵育(A)或电穿孔(B)中 ,用50微克/毫升GtgE并用抗SBP标签抗体(绿色),WGA(红),并用DAPI(蓝色)。两者的RAW 264.7,并在较小程度HeLa细胞,倾向于聚集效应的细胞的表面上;所有电穿孔的细胞显示出增加的内部蛋白(HeLa细胞未示出)。黄色是红色的WGA覆盖和绿色的靶蛋白。 RAW(C)和HeLa细胞(D)的细胞舒克(示出)孵育GtgE后改变的表型。几个实验表明的表型包括较小的细胞与差动DAPI染色和细胞质损失。淡蓝色是红WGA,绿二抗,蓝色DAPI覆盖。共聚焦显微镜用于显示目标蛋白积累在细胞核中。由于这种表型外源性蛋白载货细胞的出现既孵化和电穿孔后,人们可以推测这种表型是暗示凋亡。

图7
图7:主机蛋白质相互作用与电穿孔的沙门氏菌 SspH1 - HeLa细胞的细胞进行电穿孔,在所列出的浓度与SspH1,允许恢复4小时进行改性的亲和纯化,随后通过Western印迹(A)的前富集和检测已知的真核细胞相互作用的合作伙伴:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N1(PKN1)。注意,最右边车道(2×EP)包括2池比色皿,从一个反应杯内的信号混入的背景下,但PKN1仍然高于缺乏结合见于无诱饵控制富集。西方印迹与本地海拉裂解运行,纯化SspH1和前亲和纯化样品被探测与单克隆抗体PKN1。通过与反应性针对第一抗体的同种型辣根过氧化物酶缀合的第二抗体,获得目标检测。 HeLa细胞(B)中示出PKN1(红色)和SspH1(绿色)之间的共定位(黄色)经由通过电穿孔后共聚焦显微镜用50微克/毫升SspH1。该光的重叠表明效应和宿主蛋白是足够接近的物理交互。该相互作用在细胞核中首次示出的事实,提供了额外的支持该蛋白质是由主机正确贩卖。

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Discussion

从致病细菌分泌的效应已经发展到在宿主细胞内环境的作用,因此它是有帮助的主机内研究它们在原位 。引入感兴趣的特定效应物到宿主细胞中允许相关病原体 - 宿主相互作用进行研究孤立,而不与其他细菌蛋白质的干扰。的目标是探讨电穿孔以引入细菌效应蛋白进入真核宿主细胞,从而避免了与转染或转导相关的挑战的一种手段。绿色荧光蛋白作为对照和沙门氏菌效应蛋白进行了测试。因为在细菌病原体靶宿主上皮细胞以及免疫细胞的兴趣,人上皮样细胞系(HeLa细胞)和小鼠巨噬细胞样细胞(RAW 264.7)被使用。电穿孔可以提供外源蛋白质进入宿主细胞,在细胞viabili没有明显的降低TY,和交付的蛋白是可检测的细胞中长达四天。

以隔离电穿孔蛋白的效果,纯蛋白质是必需的。在这项研究中,将蛋白表达在大肠杆菌大肠杆菌菌株BL21具有N末端 ​​多组氨酸和链霉结合肽标签。蛋白质纯化用的Ni-NTA树脂,测定浓度(一般为5-25毫克/毫升)和纯度,并储存于-80℃直至电穿孔。商业化生产的蛋白质也将是可接受的电穿孔,因为它们往往是高纯度和良好表征的。

在这个协议中的关键步骤,通过包括的洗涤完全去除细胞培养基和悬浮细胞在无蛋白缓冲液中。这保证了观察到的任何下游的表型是由于感兴趣的外源蛋白,而不是存在于培养基中的蛋白质。电穿孔的更好的效率,观察时的细胞密度为更高( 例如,6×10 6与1×10 6个细胞),但最好的细胞数目将随细胞的大小和类型。在实验中另一个关键步骤是让细胞的时间来恢复和重新连接到菜肴;这是必要的,因为粘附的细胞在本研究中使用。甲恢复期应为悬浮细胞不太重要,但它可能是必要的,得到的蛋白质的时间进行适当的细胞内运输,蛋白质 - 蛋白质相互作用,或酶的活性,根据期望的研究的性质。由于交付的蛋白质在细胞内观察到长达96小时,有很大的调整空间,以于显微镜可视化或细胞试验之前的潜伏期。

在这个协议中的几个变量可以针对不同类型的细胞,蛋白质靶,或下游分析方案进行优化。被电穿孔的蛋白质的量可以是微调所需的细胞内浓度。 FO蛋白质定位ř可视化,小至1微克都可以使用。为功能性研究中,可以根据需要的蛋白质更高的起动量。此外,时间后​​电穿孔细胞恢复的量可以短或延长。不稳定蛋白靶或快下游过程将需要一个较短的温育时间。此外,细胞铺板的量可以超出建议这里调整。如果所引入的蛋白质,是通过显微镜进行监控,或镀更密集,如果将电蛋白是要回收的应用,如蛋白质印迹细胞可以镀更稀疏。

而电穿孔是用于将蛋白进入活细胞的简单和直接的方法,也有一些限制的技术。该方法需要在微克量的高纯度蛋白质。小至1微克电穿孔和可视化用共焦显微镜,但蛋白质的更高起始量得到BETT呃的视觉效果。同时蛋白功能没有评估在电穿孔后的所有浓度下,被要求的适当信号以免疫印迹蛋白质浓度等于或大于5​​0微克/毫升。另外,由于电穿孔比色皿的大小的限制,扩大可能需要细胞的多个反应杯的处理。然而,考虑到一旦细胞中制备的电穿孔过程需要几秒钟,并行处理需要一些额外的时间和精力。

如果所引入的蛋白质是由免疫印迹,显微镜可视化,或用于亲和纯化,蛋白质应具有对亲和纯化或检测的可用抗体标记35。然而,对于未知的原因,一些从文献或其它生化方法(数据未示出)的相互作用已知没有能电穿孔后进行概括。这可能是因为主机识别一些电穿孔蛋白为foreign并迅速将其标记为蛋白酶体降解。

电拥有多项优势的蛋白质输送等现有方法。相比显微注射,电穿孔是更快,更简单,并有大量的细胞可以一次被处理与用于测试的条件几乎100%生存力。电穿孔也比蛋白的转染用市售试剂便宜。的DNA转染通常用于研究在宿主细胞中的细菌效应蛋白;然而,这将导致细菌蛋白由宿主合成的非理想。另一方面,细菌蛋白的电消除了对哺乳动物蛋白质表达机械的依赖,允许在感染过程,其中效应蛋白是由细菌表达的更好的表示。

多个应用程序可以在细菌宿主INTERA的研究使用蛋白电作为一种方法ctions。首先,主细胞,往往难以染可能更适合于电穿孔蛋白递送。这将允许对效应器功能的多种生物相关的细胞类型的研究。电穿孔也给复用的蛋白质和/或治疗方法的选择。例如,多个蛋白可以同时引入,或药物和其它小分子可交付一起蛋白​​质。最重要的是获得的引入蛋白质,蛋白质电穿孔可以加上测定蛋白质的功能和相互作用,如亲和纯化,对公知的目标,全细胞表达分析蛋白质印迹,和显微镜的效果的功能的理解,以确定亚本地化的介绍蛋白质。因此,这种方法具有很大的潜力,为阐明细菌病原生物与其他细胞和分子生物学技术的工具。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution Cellgro 25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2088
100% Methanol Any N/A Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter Beckman Coulter Model Z1
Cell Culture Incubator Any N/A Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C 
Cell Culture Plastic Any N/A Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) Cellgro 10-013 Warm to 37 °C 
Electroporator Bio-Rad E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-016-CV
Fluorescent confocal microscope  Ziess Model  LSM 710 
Glass Bottom Dishes for Microscopy Wilco Wells HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail Pierce 78430 Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line ATCC ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer Invitrogen NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)  Cellgro 10-010 Warm to 37 °C 
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent Any N/A
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line ATCC TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest Any N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore Any N/A
Phosphate Buffered Saline Any N/A Chill to 4 °C 
Sterile Phosphate Buffered Saline Any N/A Warm to 37 °C 
Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin Agarose Resin Suspension  Pierce 20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) Any N/A
TCEP Sigma-Aldrich 646547 Corrosive, Toxic
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8585 Irritant, Toxic

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