العزلة وتخليد خطوط الخلايا المشتقة من المريض من خزعة العضلات لمرض النمذجة

1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Robin, J. D., Wright, W. E., Zou, Y., Cossette, S. A., Lawlor, M. W., Gussoni, E. Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling. J. Vis. Exp. (95), e52307, doi:10.3791/52307 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

يجب مراجعة بروتوكولات لجمع الأنسجة البشرية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية IRB: ملاحظة. وقد تمت الموافقة على مجموعة من التخلص منها، الأنسجة البشرية التي تم تحديدها من قبل دي مستشفى بوسطن للأطفال ومستشفى بريجهام للنساء في اللجان IRB. وقد طبقت الطرق الموضحة أدناه لعزل خلايا المنشأ العضلي من دي تحديدها، التخلص من الأنسجة. الأساليب المذكورة تنطبق على الأنسجة التي تم جمعها من المواد المرضى وافق.

1. عزل خلية

  1. تفكك خزعة العضلات وتنقية خلايا المنشأ العضلي
    1. قبل تزن لوحة زراعة الأنسجة 10 سم في السلامة الأحيائية هود زراعة الأنسجة، ومن ثم إعادة تزن-لوحة تحتوي على خزعة العضلات لحساب كمية الأنسجة ليتم فصلها.
    2. باستخدام المشارط معقمة، الأنسجة العضلية اللحم المفروم ناعما وإضافة بضع قطرات من معقم 1X HBSS لمنع الأنسجة من الجفاف.
    3. إضافة 3.5 مل كل من ديspase الثاني وكولاجيناز D في كل غرام من الأنسجة العضلية ليتم هضمها. ماصة الأنسجة المفروم وحل الانزيم من خلال العقيمة 25 مل ماصة عدة مرات. احتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 15 دقيقة وهضم الأنسجة حتى الطين يمر بسهولة على الرغم من معقمة 5 مل ماصة.
      وعادة ما يتحقق الأنسجة التفكك عن طريق الهضم الأنزيمي داخل 45-90 دقيقة: ملاحظة. يرجى الرجوع إلى قسم "ممثل النتائج" للحصول على تفاصيل إضافية.
    4. إضافة 2 مجلدات من متوسط ​​النمو معقم للأنسجة فصلها، ومرشح من خلال مصفاة 100 ميكرون الخليوي أكثر من 50 مل الخلايا المخروطية أنبوب وبيليه لمدة 10 دقيقة في 329 x ج (~ 1،100 دورة في الدقيقة)، درجة حرارة الغرفة. يرجى الرجوع إلى الجدول المواد اللازمة لتكوين وسائل الإعلام.
    5. resuspend الكرية في 1 حجم معقم متوسطة النمو وإضافة 7 مجلدات الأحمر حل الخلية تحلل الدم. تصفية حل من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر، ثم بيليه رانه الخلايا لمدة 10 دقيقة في 329 x ج، درجة حرارة الغرفة.
    6. عدد الخلايا في عدادة الكريات و resuspend الخلايا في 1X HBSS 0.5٪ BSA بتركيز 1 × 10 6 خلية / 100 ميكرولتر. جانبا 250،000 الخلايا في أنبوب واحد التي سيتم استخدامها بوصفها سلبية (غير ملوثين) مراقبة ~. تعيين أحادية اللون أنابيب السيطرة الملون جانبا إضافية ليوديد propidium وCD56، وهي مطلوبة من أجل النابضة السليم للخلايا إيجابية CD56 بواسطة FACS الفرز. يرجى الرجوع إلى الخلية أدلة الفرز أو التشاور مع تدرج FACS فرز خبراء منشأة الأساسية لضمان الضوابط المناسبة.
    7. وصمة عار على الخلايا ليتم فرزها مع 5μl / 10 6 خلايا لمكافحة CD56 الأجسام المضادة. احتضان جميع العينات (بما في ذلك الضوابط) على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    8. عينات غسيل في 10 مل 1X HBSS وخلايا بيليه لمدة 10 دقيقة في 329 x ج (~ 1،100 دورة في الدقيقة) في أجهزة الطرد المركزي المبردة، 4 ° C درجة الحرارة.
    9. إضافة يوديد propidium بتركيز نهائي من 1μg / مل للعينة أن يكون سورتيد لاستبعاد الخلايا الميتة. تنقية خلايا إيجابية CD56 المنشأ العضلي من الخلايا غير المنشأ العضلي باستخدام مضان تنشيط خلية فارز.
  2. تفكك خزعة الجلد
    ملاحظة: الجلد الخلايا الليفية يمكن عزلها من لكمة الجلد من المرضى عندما الخزعات العضلية غير متوفرة. الخلايا الليفية الجلدية ويمكن استخدام مادة بيولوجية للعديد من الدراسات، بما في ذلك التنبيغ مع MyoD على توليد خلايا المنشأ العضلي. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الليفية الجلدية يمكن استخدامها لتوليد خلايا الجذع، والتي يمكن أن تكون متباينة في مختلف أنواع الخلايا لمزيد من الدراسة.
    1. نقل خزعة الجلد إلى المختبر في وسط النقل. وبمجرد استلام العينة، نفذ ثقافة الأولية في أقرب وقت ممكن. إذا لا يمكن تأسيس ثقافة الأولية في نفس اليوم، وتخزين العينة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    2. نقل خزعة الجلد لالعقيمة 35 ملم طبق بتري في غطاء تدفق الصفحي.
    3. شطف خزعة الجلد في طبق بتري مع معقم 1س PBS لإزالة الدم والحطام. إزالة الأنسجة الدهنية مع مشرط معقم.
    4. إضافة 2 مل من محلول كولاجيناز واللحم المفروم مع النسيج مشرط، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة، اعتمادا على حجم الأنسجة.
    5. نقل الأنسجة هضمها إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وشطف طبق بتري مع 2 مل من ثقافة الخلايا الليفية المتوسطة مرتين، وجمع المتوسطة في نفس الأنبوب.
    6. بيليه الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 3 مل من الخلايا الليفية المتوسطة لإزالة كولاجيناز، ثم خلايا بيليه مرة أخرى. يرجى الرجوع إلى الجدول المواد اللازمة لتكوين وسائل الإعلام.
    8. كرر الخطوة 1.2.7 مرة أخرى.
    9. اعادة تعليق بيليه في الخلايا الليفية المتوسطة وصفيحة 5 مل في الصعود إلى T25 نسيج الثقافة العقيمة القارورة. احتضان القارورة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    10. تقييم ثقافة لمرفق الخلايا الليفية والنمو خلال الايام المقبلة 1-3. <ر /> ملاحظة: بعض قطع الأنسجة الصغيرة قد تعلق أيضا على لوحة والخلايا الليفية تهاجر من هذه القطع الأنسجة.
    11. الحفاظ على الثقافة في ظل نفس الظروف حتى تزرع الخلايا الليفية إلى ما يقرب من 80٪ التقاء.
    12. جمع الخلايا الليفية من قبل trypsinization ونقل على قوارير ثقافة جديدة للتوسع إضافي. أداء trypsinization بغسل الثقافات 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم ++ ++. إضافة التربسين-EDTA (الجدول انظر المواد) إلى الخلايا (2ML / T25 القارورة) لمدة 2 دقيقة عند 37 ° C.
    13. انقسام خلايا منفصلة في قوارير إضافية. وإذا كان بعض قطع الأنسجة لا تزال تعلق على قوارير T25 الأصلية، إضافة 5 مل ثقافة جديدة متوسطة إلى هذه القارورة وسوف المزيد من الخلايا الليفية تهاجر خارج باستمرار.
      ملاحظة: ثقافة الخلايا الليفية موسعة يمكن تجميد منصبه كرئيس P1 وتخزينها في النيتروجين السائل للتجارب المستقبلية.

2. تخليد خلايا عضلي

  1. خلايا تغذية 30 دقيقة قبل ترنسفكأيشن مع 5 مل من وسائل الإعلام الجديدة تستكمل مع 10 ملي الكافيين.
  2. التجانس خليط من 2 ميكروغرام من DNA البلازميد من الإعدادية ميدي (CDK4 أو hTERT بلازميد) وpolyjet ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
  3. يضاف خليط بلازميد / polyjet إلى خلايا PE بين عشية وضحاها.
  4. خلايا تغذية مع المتوسطة الطازجة (DMEM والمتوسطة 199 في نسبة 4: 1، على أن تستكمل مع 10٪ مصل العجل). في وقت لاحق اثنتي عشرة ساعة، وجمع طاف التي تحتوي على الفيروس وتصفية من خلال حجم مرشح 0.45 ميكرون المسام.
  5. استخدام 1 مل من طاف جمعها على إصابة بين عشية وضحاها خط PA317 خلية التعبئة والتغليف amphotropic 5 و الحصول على خط الخلية المنتجة للفيروس مستقر بعد اختيار إما 0.5 ملغ / مل النيوميسين (G418) لCDK4 أو 0.5 ملغ / مل هيغروميسين لhTERT.
  6. إعداد العمل supernatants الفيروسية من خلال زراعة الخلايا التعبئة والتغليف مستقرة لالقريب confluency، ثم حصاد طاف كل صباح، مساء وصباح لمدة ثلاثة مواسم الحصاد.
  7. تصفية supernatants الفيروسية وإما استخدام مباشرة أو تقسيمها إلى 1 مل مأخوذة وتخزينها في -80 ° C لاستخدامها لاحقا. لاحظ أن طاف الفيروسي يفقد 50٪ كفاءة العدوى مع بعضها تجميد ذوبان الجليد. تذكر لتبييض غسل قبل رميه كل ما لمست الجسيمات الفيروسية.
    ملاحظة: مستقر PA317 الفيروسات خط انتاج الخلايا يمكن تجميد والحفاظ على -150 درجة مئوية لمدة التخزين الدائم (تجميد المتوسطة هو 10٪ DMSO و 90٪ مصل).
  8. لوحة-FACS تنقية خلايا المنشأ العضلي (موضح في الخطوات 1،1-1،9) في مناطق ذات كثافة من 5 × 10 4 خلايا / جيد في 6 لوحات جيدة المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين. ضمان المرفقة الخلايا إلى لوحة قبل المضي قدما في عدوى فيروسية.
  9. إضافة 400 ميكرولتر تصفيتها، وأنتجت reshly طاف الفيروسية أو مأخوذة المجمدة إلى كل لوحة ستة جيدا بين عشية وضحاها (الحفاظ على 2 الآبار والضوابط).
  10. تغيير المتوسطة عن طريق تغذية الخلايا مع 2.5 مل / جيد من وسائل الاعلام الطازج العضلات (4: 1 Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) والمتوسطة 199 تستكمل مع 15٪ مصل بقري جنيني، 0.02 M HEPES العازلة؛ 1.4 ملغم / لتر فيتامين B12، 0.03 ملغ / L ZnSO4، 0.055 ملغ / L ديكساميثازون 2.5 ميكروغرام / لتر عامل نمو الخلايا الكبدية و 10 ميكروغرام / لتر عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية). تجاهل وسائل الإعلام والماصات التي تحتوي على جسيمات فيروسية في وعاء التبييض. ترك الخلايا في نفس متوسطة لمدة 3 أيام للتعافي من الإصابة، ثم علاج لاختيار إما باستخدام 400 ميكروغرام / مل النيوميسين (عدوى CDK4) أو 300 ميكروغرام / مل هيغروميسين (عدوى hTERT).
  11. الحفاظ على الخلايا تحت اختيار المخدرات حتى الخلايا في الطبق يموت التحكم (1-2 أسابيع).
  12. خلايا مرور قبل أن تصبح متكدسة (60-80٪ confluency، واستخدام 0.05٪ التربسين EDTA)، حتى خلال selectiعلى الفترة. خلايا Replate في 10CM متعددة الأطباق مع المتوسطة بالخلايا العضلية الجذعية الطازجة (كما هو موضح في 2.11) تستكمل مع الدواء الاختيار. الحفاظ على الخلايا المحددة خلد باعتباره السكان غير متجانسة أو استنساخ للحصول على الخلفية الوراثية متجانسة تماما (نفس الإدراج من التحوير في كل خلية).
  13. أداء اختيار نسيلي باستخدام الخطوات التالية:
    1. البذور الخلايا في كثافة منخفضة (مثل 300 و 500 الخلايا في 10 سم أطباق) والمحافظة عليها لمدة أسبوعين تقريبا، حتى يتم تشكيل مستعمرات صغيرة (10-20 الخلايا).
    2. إزالة معظم المتوسطة في هذه المرحلة، ولم يتبق سوى طبقة رقيقة لمنع الخلايا من الجفاف.
    3. ضع حلقة الاستنساخ (مع نهاية واحدة مغموسة في سيليكون الشحوم فراغ) على كل استنساخ المطلوب وإضافة بضع قطرات من التربسين / EDTA.
    4. حصاد الخلايا بمجرد أن تصبح تقريب بواسطة الشفط بعناية الخلايا باستخدام طرف 1 مل أو الماصة باستور وتحويلها إلى أصغر جيش التحرير الشعبى الصينى multiwell متاحالشركة المصرية للاتصالات (96 أو 48، 24 أو 12 لوحات جيدا).
    5. توسيع استنساخ حسب الحاجة لمنع confluency المحلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويوضح الشكل (1) بعض الخطوات الرئيسية المشاركة في التفكك النسيج الأساسي: يتم وزن المبلغ المحدد من الأنسجة في طبق بتري معقمة زراعة الأنسجة (الشكل 1A، B). ثم يتم مفروم ناعما النسيج باستخدام المشارط معقمة، حتى يتم الحصول على الطين الأنسجة (الشكل 1C، D). وبعد إضافة إنزيمات الهضم، وعادة ما تحقق العضلات الأولية الأنسجة التفكك عن طريق الهضم الأنزيمي داخل 45-90 دقيقة. تطور الهضم الأنسجة عادة ما يتم رصد كل 15-20 دقيقة لمنع overdigestion وموت الخلايا. عملية الهضم الأنزيمي يمكن أن يكون pipetted بلطف ومختلطة عدة مرات كل 15-20 دقيقة. في نهاية الخطوة الهضم، وتصفية الخلايا من خلال 100 ميكرون (الشكل 1E، F) ثم مرشح 40 ميكرون. اعتمادا على كمية من بدء الأنسجة العضلية وعما إذا كان يتم الحصول على عينة من أقل ما يقال أو بشدة العضلات المتأثرة، وسل الأساسي نأتسوف يكون ليرة سورية غير المتجانسة. ويبين الشكل 1G مثالا للخلايا وحيدات النوى في تعليق بعد الهضم الفور، في حين يبين الشكل 1H مثال على الخلايا الأولية فصل 3-6 ساعة التالية الهضم والطلاء في أطباق زراعة الأنسجة. وعادة ما تكون مختلطة خلايا المنشأ العضلي مع الخلايا الليفية والخلايا مكون الشحم. قد تكون الخلايا المناعية أيضا في الحالات التي يرتبط التهاب يعانون من مرض المريض. ولذلك، فصل المحتملين من أنواع مختلفة من الخلايا قد يكون مرغوبا فيه. لعزل خلايا المنشأ العضلي المحتملين الإنسان، CD56 أو N-CAM وقد استخدم على نطاق واسع كعلامة موثوقة 6-9. هذه التنقية قد يكون مفيدا بعد وقت قصير من العزلة لإثراء الأسلاف عضلي وقبل عملية تخليد الخلية. بدلا من ذلك، تخليد من الخلايا الأولية لا يمكن أن يؤديها في البداية، ويمكن تحديد خلايا المنشأ العضلي ثم خلد على أساس التعبير عن CD56 بواسطة FACS. وعلى التخطيطيالخطوات المطلوبة قبل FACS الفرز ومثال على الملف الشخصي FACS هو موضح في الشكل (2). باختصار، يتم عد الخلايا الأولية ومعلق في تركيز عال كما هو مبين، ثم يتم إضافة الأجسام المضادة الأولية (أي مكافحة CD56) إلى الخلايا وحضنت لمدة 30 دقيقة على الجليد. بعد غسل، ويتم تحليل الخلايا من خلال خلية فارز مضان تنشيط وتنقية يختلف (الشكل 2)، والعائد التقريبي للخلايا إيجابية CD56 من عينة لعينة، تتراوح 40-70٪ من مجموع الخلايا وحيدات النوى. يختلف العائد على حسب عمر الفرد، وما إذا كان يتم استخراج خلايا المنشأ العضلي من العضلات تتأثر أو المريضة. العضلات تتأثر عادة ما يكون له نسبة عالية من خلايا المنشأ العضلي، في حين العضلات التصنع في كثير من الأحيان أقل النسب المئوية للخلايا إيجابية CD56. ومطلي الخلايا المنقى في كامل متوسطة النمو عضلي (انظر الجدول مواد). خلايا يمكن passaged قبل trypsinization عندما REAC ح 60-70٪ التقاء. خلايا CD56 التعبير هي المنشأ العضلي وقادرة على تشكيل myotubes في المختبر 10،11. وتخليد خلايا المنشأ العضلي يتطلب ترنسفكأيشن متتابعة من اثنين من الجينات 12،13 (كما schematized في الشكل 3). يستخدم السيكلين يعتمد كيناز 4 (CDK4) للتغلب على الإجهاد من زراعة الأنسجة بسبب عدم كفاية الظروف والثقافة، والتيلوميراز البشري عكس الناسخ (hTERT) يمنع التيلومير تقصير بسبب ظاهرة النسخ المتماثل نهاية 12. كل من البلازميدات قبل الفيروسية هي في pBAbe العمود الفقري النواقل. يحتوي بناء الماوس CDK4 [كدنا المقاومة الجينات بالنيوميسين ويحتوي hTERT [كدنا بناء الجينات المقاومة هيغروميسين. وهذا الأخير يحتوي أيضا على فيروس الهربس البسيط ثيميدين كيناز (TK) كاسيت والمواقع loxP وضعت في كلا طرفي كاسيت hTERT / TK. وهذا يسمح للاستئصال وحدة التعبير كامل من قبل لجنة المساواة العرقية recombinase 14 و مكافحة التحديد باستخدام gancyclovir.

وتعد الطبقة = "jove_content"> لتخليد، والعمل supernatants الفيروسية من خلال زراعة الخلايا التعبئة والتغليف مستقرة لالقريب confluency، ثم يتم حصاد طاف في الصباح والمساء، وصباح لمدة ثلاثة مواسم الحصاد. وتصفية supernatants الفيروسية وإما تستخدم مباشرة أو تقسيمها إلى 1 مل مأخوذة وتخزينها في -80 ° C لاستخدامها لاحقا. supernatants الفيروسية يمكن أن يفقد 50٪ من كفاءة عدوى مع بعضها تجميد ذوبان الجليد.

حديثا خلايا خلدت لا يمكن الحفاظ عليه باعتباره السكان حيث يتم دمج الفيروسات في مواقع مختلفة، أو المستنسخة، للحصول على خلفية متماثل الزيجوت تماما الوراثية (الإدراج واحد في الجينوم الخلية وذريته). في معظم الحالات، وعزل الحيوانات المستنسخة من السكان رئيسي واحد سوف يؤدي إلى اختلافات طفيفة بين الحيوانات المستنسخة اعتمادا على ادراج الكاسيت في الجينوم الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، سوف زراعة الأنسجة واسعة يفضل اختيار الخلايا مع ميزة النمو بدلا من تلك التي تفرق. أنا ويتم تحلول من الحيوانات المستنسخة واحدة ببساطة عن طريق بذر الخلايا في كثافة منخفضة (على سبيل المثال: 300 و 500 الخلايا في 10 سم أطباق) وزراعة لنحو أسبوعين حتى يتم تشكيل مستعمرات صغيرة (10-20 الخلايا). ثم يتم إزالة معظم المتوسطة، ولم يتبق سوى طبقة رقيقة لمنع الخلايا من الجفاف. وtrypsinized استنساخ باستخدام حلقات الاستنساخ وثم توسعت حسب الحاجة. ويمكن اختبار موسع استنساخ خلدت للتعبير عن علامات خلية المنشأ العضلي المشتركة، مثل CD56 بواسطة FACS، desmin وMyoD التعبير المناعي، أو myotube مركزيا تشكيل على التمايز. Myotubes هي الأكثر وضوحا عندما يتم وضعها خلايا المنشأ العضلي متموجة (90٪ confluency) في التمايز المتوسطة (DMEM والمتوسطة 199 في نسبة 4: 1، على أن تستكمل مع 2٪ مصل الحصان) بعد 3-5 أيام (الشكل 4). وشوهدت عدم وجود فروق في myotube مركزيا تشكيل وmyotube مركزيا في انكماش القدرة بين الخلايا السيطرة غير مخلد والخلايا خلد (فيديو 1 و 2).

> التحقق من الخطوات تخليد يمكن أن يعاير من قبل العديد من المنهجيات، بما في ذلك منحنيات نمو الخلايا، وقياس طول التيلومير وتقييم النشاط التيلوميراز (الشكل 5). وترد أمثلة لمنحنيات النمو في الشكل 5A، حيث لوحظ تقصير التيلومير كما تم توسيع خلايا لعدد موسع من الممرات. على العكس من ذلك، يرتبط تخليد ناجحة مع زيادة النشاط التيلوميراز (الشكل 5)

الشكل (1)
الشكل 1:.. التوضيحية من الخطوات الهامة لتفكك الأنسجة العضلية الأولية الإنسان (A) وزنها من لوحة الثقافة فارغة، قبل وضعها الأنسجة و (ب) بعد وضع النسيج وتستخدم (C) مشارط معقمة لتخطر على الأنسجة، وحتى (D) في الأنسجة فإنهيتم تقليل الذات إلى الطين. تضاف كولاجيناز وdispase ويتم هضم الأنسجة ل45-90 دقيقة، ثم يتم تصفية الهضم من خلال مرشح شبكة من النايلون لتجاهل الحطام (E، F). (G، H) أمثلة على خلايا فصلها حديثا مطلي مباشرة بعد التفكك (G ) أو 3 ساعة بعد التفكك، عندما تبدأ الخلايا الأولية لتسوية (H).

الشكل 2
الشكل 2: سير العمل إجراءات المشاركة في تلطيخ بالخلايا العضلية الجذعية البشرية قبل تنقية عبر مضان تنشيط خلية فارز وأبرز الخطوات الحاسمة لتلطيخ الخلايا البشرية قبل التحليل FACS. وترد أيضا أمثلة من المؤامرات FACS. يتم استخدام السيطرة السلبية (اللوحة اليسرى) لإنشاء بوابة الفرز. في لوحات الصحيحة، هي بوابات الخلايا إيجابية التعبير عن CD56 وبيرسينتاويظهر جنرال الكتريك للخلايا إيجابية. هذه الاستراتيجية يمكن أن تستخدم لتنقية خلايا المنشأ العضلي إما قبل أو بعد تخليد الإجراء تخليد.

الشكل (3)
الشكل 3: رسم تخطيطي للإنتاج الفيروس لتخليد بالخلايا العضلية الجذعية. العمل من إنتاج الفيروس الارتجاعي تستخدم لتخليد myoblasts. وبناء البلازميد التي تحتوي إما CDK4 أو floxed hTERT-TK الكاسيت في العمود الفقري pBabe (يسار) وtransfected في ecotropic فينيكس (PE) خط الخلية التعبئة والتغليف بين عشية وضحاها (8-12 ساعة) يستخدم polyjet. ثم يتم نقل طاف بعد الترشيح على amphotropic خط الخلية التعبئة والتغليف فينيكس (PA317). طاف من هذه الخلايا يمكن إما أن تستخدم مباشرة أو يمكن اختيار الخلايا مع إما النيوميسين أو هيغروميسين لتوليد خط الخلية مستقرة لاستخدامها في المستقبل. مأخوذة من FILTويمكن تخزين طاف الدو في -80 ° C لاستخدامها لاحقا (مع فقدان الكفاءة 50٪). يستخدم التبييض لتنظيف كل الاستهلاكية المستخدمة في جميع نقاط من الإجراء.

الشكل (4)
الشكل 4: رسم تخطيطي للعكسها بالخلايا العضلية الجذعية تخليد سير العمل الإجراء تخليد (أعلى): و transfected الخلايا الأولية لأول مرة مع CDK4. بعد نيومايسين الاختيار، و transfected في myoblasts مع كاسيت hTERT floxed تحتوي على اثنين من علامات الاختيار؛ HSV-TK وهيغروميسين. إذا رغبت في وقت لاحق، الكاسيت hTERT يمكن "floxed" للخروج بالإعراب عن لجنة المساواة العرقية recombinase واختيار لاستئصال مع gancyclovir. وهذا يسمح لل"إعادة mortalization" من myoblasts وإعادة بدء من التيلومير تقصير. إذا كانت التيلوميرات هي 20 كيلو بايت طويلة، وهذا لا يزال يسمح مئات الأضعاف، ويتجنب ر انه مضاعفات الإفراط في التعبير عن hTERT. وأخيرا، استنساخ إسوي من السكان خلد يمكن أن تكون معزولة. ويمكن أن تظهر myogenicity من الخلايا خلد حديثا باستخدام علامات محددة لخلايا العضلات مثل desmin (اللوحة اليسرى السفلى، والخلايا في النمو المتوسطة ملطخة مكافحة desmin، استنساخ D33، الأخضر). هذا هو استنساخ عضلي بحيث ينظر إلى خلايا متباينة حتى لو تم الحفاظ على خلايا في ظروف انتشار الأسلحة النووية. عندما يتم التمييز الخلايا في التمايز المتوسطة (مع 2٪ مصل الحصان والمتوسطة والألواح اليمنى) يصبح myotube مركزيا تشكيل واسعة جدا. تقريبا جميع خلايا ملطخة الأجسام المضادة MF20 إلى الجنينية الميوسين السلسلة الثقيلة (الخضراء) وmyotubes هو خلية متعددة النوى التي كتبها دابي تلطيخ (الأزرق وجميع الصور). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليه / ftp_upload / 52307 / 52307fig5highres.jpg "/>
الشكل 5: التحقق من الإجراء تخليد. (A) منحنيات النمو من الحيوانات المستنسخة إسوي من بالخلايا العضلية الجذعية الأولية، السكان الخالد (بالخلايا العضلية الجذعية hTERT-CDK4) واستنساخ إعادة mortalized (بالخلايا العضلية الجذعية floxed hTERT-CDK4) وترد كأمثلة. لم تكن هناك اختلافات في معدلات النمو التي يمكن اكتشافها قبل الخلايا تصل إلى الشيخوخة. تم رصد التيلومير تقصير بوصفها وظيفة من الأضعاف السكان وطول التيلومير كان يقاس TRF. (B) myoblasts TRF المعروضة هي أمثلة على نقاط زمنية مبكرة والتضاعف في myoblasts (5 نقاط الوقت من PD 13-75)، وإعادة mortalized بعد الختان hTERT (3 نقاط الوقت من PD 62-152) وmyoblasts خلد (PD 75 و 200). (C) عدوى hTERT الناجح يترجم إلى زيادة في نشاط التيلوميراز. تم تقييم النشاط التيلوميراز التي كتبها ddTRAP (ddTRAP قراءات، اليمنى. الكمي للمقايسة، يسار) 15 في الخلايا قبل وبعد إيرباصعدوى RT. hTERT الختان إلغاء النشاط التيلوميراز إلى عتبة الأصلية ينظر في myoblasts. وتظهر النتائج على هيئة مجموع المنتجات التيلوميراز ولدت في ما يعادل الخلية (تصحيح الخلفية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرجاء الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو.
الرجاء الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

تم إنشاء مقطع فيديو 1 و 2. Myotubes من الخلايا قبل وبعد عملية تخليد. كانت تزرع الخلايا لنقطة التقاء في وسائل الإعلام النمو وتحولت إلى وسائل الإعلام التمايز لمدة 10 يوما. في كل من أشرطة الفيديو، وتقلصات وظيفية من واحد أو أكثر myotubes يتم كشفها. تسجيل من الوخز العفويويتم ذلك باستخدام عدسة 20X. لوحظ عدم وجود فروق بين الخلايا خلد وغير مخلد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا كما مصدرا مفيدا

العزلة وثقافة السكان الخلية عضلي مفيد للغاية عند إنشاء الظواهر المرض أو في نماذج المختبر من المرض. الإجراء العزلة خلية عضلي الموصوفة هنا يسمح للعزل myoblasts والخلايا الليفية من العينات العضلات والهيكل العظمي، والتي يمكن بعد ذلك نشر، متباينة، أو مباشرة تحليلها. يمكن تقييم هيكل بالخلايا العضلية الجذعية وظيفة من خلال الفحص المجهري، وتقييم بقاء الخلية، وتقييم الانصهار خلية، أو من خلال الدراسات الجزيئية من RNA أو البروتين التعبير. بالإضافة إلى ذلك، myoblasts يمكن التفريق في myotubes التي تشترك العديد من الميزات من myofibers غير ناضجة، والذي يسمح للتقييم المباشر من وظيفة بالخلايا العضلية الجذعية في سياق تنمية العضلات والانتعاش في أعقاب تلف الأنسجة. وفي حين أن جميع هذه الظواهر تميل إلى أن تكون استنساخه إلى حد ما في الممرات الأولى من خلايا المنشأ العضلي، وسلوك العديد من متر الأساسيخطوط الخلايا yogenic يمكن تغيير على مدى العديد من المقاطع. ونتيجة لذلك، فإنه في بعض الأحيان من المرغوب فيه أن يخلد خط الخلية عضلي معين (كما هو موضح هنا)، الذي يمكن أن يسهل سهولة إنشاء ثقافة وتوليد نتائج استنساخه على مدى فترة أطول من الزمن.

اختيار بالسكان خلية معينة

يصف هذا البروتوكول عزل خلايا المنشأ العضلي من أنسجة العضلات والهيكل العظمي باستخدام FACS كمشروع تنقية. وتشمل الاستراتيجية المقترحة من خلايا اختيار باستخدام يوديد propidium (مؤشرا على الخلايا الميتة) وCD56 (علامة من خلايا المنشأ العضلي) للتمييز الحية، وخلايا المنشأ العضلي من الخلايا الميتة، والحطام، والخلايا غير المنشأ العضلي. سوف خلايا الواردة في السكان إيجابي CD56 تشمل الأسلاف عضلي قادرة على تشكيل myotubes، في حين أن السكان CD56 السلبية سوف تشمل الخلايا غير المنشأ العضلي بما في ذلك الخلايا الليفية والخلايا ربما مكون الشحم. كل من هذه الكسور يمكنيكون مثقف مستقل لإنتاج مزارع الخلايا من myoblasts أو الخلايا الليفية، وإمكانية إنشاء مزارع الخلايا الليفية موازية يمكن أن تكون مفيدة للخلية أو المصرفية DNA تمارين مستقلة أو شروط السيطرة كما إضافية لفحوصات التي يتم تنفيذها على الثقافات خلية المنشأ العضلي. هناك العديد من الخيارات الأخرى لاختيار ثقافات محددة خلية أرومي ويفية من الأنسجة العضلية هضم، في الحالات التي FACS الفرز غير مرغوب فيه أو غير متوفر، والتي تم وصفها في أي مكان آخر 16،17. واحد طريقة بديلة لفصل خلايا ليفية أرومي وينطوي على استخدام خصائص التصاق التفاضلية بين هذه الأنواع الخلية اثنين لإثراء مقاطع متتالية من الخلايا لنوع خلية معينة. كما الليفية تلتزم البلاستيك أكثر من ذلك بكثير بسهولة من myoblasts، والسماح للتعليق خلية لاحتضان على البلاستيك لحوالي 1 ساعة عند إنشاء أو الركض الخلايا والطلاء ثم طاف على طبق مختلفة ودورة الفتشوبLT في إزالة العديد من الخلايا الليفية من تعليق خلية 18.

فائدة الخلايا الليفية مقابل Myoblasts

وعادة ما تستخدم الخزعات العضلية من المرضى لتنقية الخلايا العضلية الأولية، ومع ذلك myoblasts المريضة قد لا تتكاثر على نحو فعال، ويمكن أن تخضع سوى عدد قليل من الانقسامات في المختبر، مما يتطلب تخليد الخلايا للوصول إلى عدد كبير من الانقسامات اللازمة. وبالنظر إلى أن كلا من الخلايا الليفية وmyoblasts يمكن عزله عن خزعات العضلات، يجب حفظ كل من الكسور خلية من عينات المرضى، لأنها يمكن أن كلا من المفيد وتقديم الكثير من براعة لتطبيقات المصب. على سبيل المثال، الخلايا الليفية يمكن استخدامها لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs)، والذي عقد الكثير من الأمل لتوليد أعداد الخلايا غير محدودة وإمكانية أن يتسبب على التمايز إلى الأنساب خلية متعددة. هذه الميزات هي مرغوب فيه للغاية للخلايا التي تم الحصول عليها من المريضالصورة مع الأمراض النادرة، التي يحتمل أن يتم تصحيحه في المختبر أو استخدامها في العروض الدواء التجريبي في البحث عن المركبات العلاجية. ويمكن أيضا myoblasts خلد استخدامها في فحص القائم على المخدرات. ويمكن أيضا الخلايا الليفية تحويلها بشكل فعال نحو مصير عضلي عن طريق العدوى بفيروس معربا عن MyoD 19-21. هذه الطريقة قد تم اختباره على نحو فعال باستخدام الخلايا الليفية المستخرجة من المرضى الذين يعانون من أمراض العضلات وأكدت أن الخلايا الليفية، معربا عن MyoD يمكن أن تشكل myotubes التي تعبر عن البروتينات في العضلات ناضجة بشكل فعال. وهكذا، كل أنواع الخلايا يمكن استخدامها بشكل فعال في العديد من التطبيقات المصب وتوفر المواد لا تقدر بثمن للدراسات التشخيصية والعلاجية.

تأثير تخليد

تخليد الخلايا مضاعفا العادية يسمح احد لإعداد خط الخلية البشرية مستقر يمكن وصفها بشكل كامل ودراستها من قبل العديد من المختبرات المختلفة. الثقافات الأولية من مستقلةيمكن أن تختلف العزلة والقدرة التكاثري الشاملة يمكن أن يكون متغير عند تقديم الضرر في عملية التفكك أو عن طريق overdigestion، والذي من شأنه أن يشوه السلوك الثقافة. تخليد الخلايا باستخدام التعبير عن الوحيدات الحفاز تيلوميراز (hTERT) لديه ميزة للحفاظ على النمط الظاهري الخلوية مستقر وتبقى الخلايا مضاعفا. وكانت هناك تقارير في الفئران التي التيلوميراز يمكن أن تعدل مسار WNT 22. لم نلحظ هذه الظاهرة في الخلايا البشرية. ومع ذلك، لتجنب مثل هذه المضاعفات المحتملة، وقد يحيط الكاسيت hTERT مع مواقع السلمون المدخن، بحيث يمكن إزالتها بعد أن تم ممدود التيلوميرات. التيلوميرات طويلة تمنح مئات من انقسامات اضافية، وعادة ما تكفي لتنفيذ معظم التجارب.

بسبب التوسع خلية المستمر يوفر دائما ميزة انتقائية للنمو السريع، ويمكن أن تصبح النمط الظاهري الخلوية في بعض الأحيان منحازة بسبب فرط من تقسيم بسرعة أكبرالخلايا، بدلا من أفضل الخلايا التفريق. في حين أن هذا لم يثبت حتى الآن وجود مشكلة كبيرة باستخدام الطريقة الموصوفة، ويمكن معالجتها من قبل ذوبان الخلايا التي تم تجميدها في وقت مبكر من تاريخ ثقافتهم أو عن طريق اختيار نسيلي للخلايا واظهار النمط الظاهري المطلوب.

وأخيرا، في حين أن التوسع في خلايا المنشأ العضلي لعدد غير محدود بالقرب من مزاياه لفحص المخدرات والنمذجة المرض ممكن، يكون التقنيات الحالية أيضا مساوئ الجوهرية التي تحول دون استخدام هذه الخلايا كما المركبات العلاجية في العلاج المعتمدة على الخلايا أو أدوات التشخيص الأولية كما. كل من واسعة النطاق في الثقافة وتخليد الخطوات المختبر تغيير النمط الظاهري للخلايا العضلات مقارنة إلى حالتها الأصلية. الأهم من ذلك، يتم توسيع هذه الخلايا في بيئة مختلفة تماما عن الوسط الطبيعي من الخلايا الأقمار الصناعية الأولي ضمن مكانها المناسب. ولذلك، تتطلب خلايا خلدت اختبار سلامة المكثف وربما development تقنيات جديدة إذا أريد لها أن تكون تقديمه ثانية في عضلة المريض البشري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood Baker Company, Inc. Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model  Beckman Coulter Model Allegra 6R If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope Nikon Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source Forma Scientific  Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) Becton Dickinson Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II Roche Applied Science #04942078001 Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D  Roche Applied Science #088882001 Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free GIBCO Life Technologies #14185-052
Bovine serum albumin, fraction V Sigma #05470 Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum GIBCO Life Technologies 11965-092 Contains L- glutamine
RBC lysis solution Qiagen 158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml Sigma P4170 Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry Biolegend 318310 APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE Cell Biolabs RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174 Cell Biolabs RV-102
Pig skin gelatin Sigma G1890-500g Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet  Signagen SL100688
G418 Fisher 345812
Hygromycin EMD Biosciences 400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT not commercially available Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit Qiagen 12143
Medium 199 Life Technologies  Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies  DMEM (11965-092) Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor. Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)  #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).  Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining Developmental Hybridoma Bank MF20 Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining Thermo Scientific MS-376-S0 Clone D33
Horse serum Invitrogen 26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies 11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin Fetal bovine serum: Thermo Scientific SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized Worthington 4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free Lonza 17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes GeneMate/Bioexpress C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels Aspen Surgical 372610
Hemocytometer Hausser Scientific 1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes Bellco glass 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml) Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm) BD Falcon 353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size) BD Falcon 352340 (40µm); 352360 (100µm)
 Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters Millipore SLHV013SL
Cloning rings Corning #3166-8 To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines 
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes Greiner bio-one 628160
Sterile scalpels DeRoyal D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks Techno Plastic Product, TPP 90026 sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
  2. Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
  3. Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
  4. Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
  5. Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
  6. Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
  7. Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
  8. Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
  9. Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
  10. Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
  11. Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454 (2011).
  12. Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
  13. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34 (2011).
  14. Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
  15. Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104 (2014).
  16. Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
  17. Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
  18. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
  19. Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
  20. Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
  21. Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
  22. Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics