रोग मॉडलिंग के लिए पेशी बायोप्सी से मरीज व्युत्पन्न सेल लाइनों के अलगाव और अमरता

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Robin, J. D., Wright, W. E., Zou, Y., Cossette, S. A., Lawlor, M. W., Gussoni, E. Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling. J. Vis. Exp. (95), e52307, doi:10.3791/52307 (2015).

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Abstract

Protocol

नोट: मानव ऊतक के संग्रह के लिए प्रोटोकॉल की समीक्षा की और संस्थागत आईआरबी समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए। त्याग, डे-पहचान मानव ऊतक का संग्रह बोस्टन बच्चों के अस्पताल और ब्रिघम और महिला अस्पताल आईआरबी समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया है। नीचे वर्णित विधियों de-पहचान से myogenic कोशिकाओं के अलगाव के लिए लागू किया गया है, ऊतक खारिज कर दिया। वर्णित विधियों सहमति रोगी सामग्री से एकत्र ऊतकों को लागू कर रहे हैं।

1. सेल अलगाव

  1. पेशी बायोप्सी और myogenic कोशिकाओं की शुद्धि की हदबंदी
    1. ऊतक की राशि की गणना करने के लिए पेशी बायोप्सी युक्त थाली-तौलना रहे हैं तो अलग होने के लिए एक टिशू कल्चर जैव सुरक्षा हुड में एक 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट पूर्व तौलना, और।
    2. सूक्ष्मता बाँझ नलियां, कीमा मांसपेशियों के ऊतकों का उपयोग करना और बाहर सुखाने से ऊतक को रोकने के लिए बाँझ 1x HBSS के कुछ बूँदें जोड़ें।
    3. 3.5 मिलीग्राम डि में से प्रत्येक में जोड़ेंspase द्वितीय और मांसपेशियों के ऊतकों के ग्राम प्रति collagenase डी पच जाए। एक बाँझ 25 मिलीलीटर विंदुक के माध्यम से एक बार कुछ कीमा बनाया हुआ ऊतक और एंजाइम समाधान पिपेट। 15 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं और गारा आसानी से एक बाँझ 5 एमएल पिपेट हालांकि गुजरता है जब तक ऊतक को पचाने।
      नोट: ऊतक हदबंदी आमतौर पर 45-90 मिनट के भीतर enzymatic पाचन द्वारा हासिल की है। अतिरिक्त जानकारी के लिए 'प्रतिनिधि परिणाम' अनुभाग को देखें।
    4. 329 XG (~ 1100 आरपीएम), कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और गोली कोशिकाओं पर एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से अलग ऊतक, फिल्टर करने के लिए बाँझ मध्यम विकास के दो संस्करणों में जोड़ें। मीडिया रचना के लिए सामग्री तालिका देखें।
    5. बाँझ मध्यम विकास की एक मात्रा में गोली Resuspend और 7 संस्करणों लाल रक्त कोशिका lysis समाधान जोड़ें। एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से समाधान फ़िल्टर, तो टी गोली329 XG पर 10 मिनट, कमरे के तापमान के लिए वह कोशिकाओं।
    6. एक hemocytometer में कोशिकाओं की गिनती और 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / 100 μl की एकाग्रता में 1x HBSS के 0.5% BSA में कोशिकाओं resuspend। अलग निर्धारित ~ एक नकारात्मक (बेदाग) नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा कि एक एकल ट्यूब में 250,000 कोशिकाओं। FACS छँटाई द्वारा CD56 सकारात्मक कोशिकाओं के समुचित gating के लिए आवश्यक हैं जो propidium आयोडाइड के लिए और CD56 के लिए अलग अतिरिक्त एकल रंग दाग नियंत्रण ट्यूब, सेट करें। छँटाई मैनुअल सेल या उचित नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए कोर सुविधा विशेषज्ञों छँटाई FACS के शामिल किए गए हैं के साथ परामर्श करने के लिए देखें।
    7. कोशिकाओं दाग विरोधी CD56 एंटीबॉडी के 5μl / 10 6 कोशिकाओं के साथ हल किया जाना। 30 मिनट के लिए बर्फ पर (नियंत्रण सहित) सभी नमूनों को सेते हैं।
    8. 10 एमएल 1x HBSS में धो नमूने और गोली कोशिकाओं एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 329 XG (~ 1100 आरपीएम), 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 10 मिनट के लिए।
    9. Sor होने के लिए नमूने के 1μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में propidium आयोडाइड जोड़ेंमृत कोशिकाओं के बहिष्कार के लिए टेड। प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर का उपयोग करते हुए गैर myogenic कोशिकाओं से myogenic CD56 सकारात्मक कोशिकाओं को शुद्ध।
  2. त्वचा बायोप्सी की हदबंदी
    नोट: पेशी बायोप्सी उपलब्ध नहीं हैं जब त्वचीय fibroblasts के रोगियों से एक त्वचा पंच से अलग किया जा सकता है। त्वचीय fibroblasts के myogenic कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए MyoD साथ पारगमन सहित कई अध्ययनों के लिए biomaterial के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, त्वचीय fibroblasts के आगे के अध्ययन के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है जो आईपीएस कोशिकाओं, उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. परिवहन माध्यम में प्रयोगशाला के लिए त्वचा बायोप्सी परिवहन। नमूना प्राप्त हो जाने के बाद जितनी जल्दी हो सके प्राथमिक संस्कृति प्रदर्शन करते हैं। प्राथमिक संस्कृति एक ही दिन पर स्थापित नहीं किया जा सकता है, तो रात भर कमरे के तापमान पर नमूना दुकान।
    2. लामिना का प्रवाह हुड में एक बाँझ 35 मिमी पेट्री डिश के लिए त्वचा बायोप्सी स्थानांतरण।
    3. बाँझ एक साथ एक पेट्री डिश में त्वचा बायोप्सी कुल्लाएक्स पीबीएस रक्त और मलबे को हटाने के लिए। एक बाँझ स्केलपेल के साथ वसा ऊतकों निकालें।
    4. 2 मिलीलीटर collagenase समाधान जोड़ें और स्केलपेल के साथ ऊतक कीमा, ऊतक के आकार पर निर्भर करता है, एक घंटा 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को पचा ऊतक स्थानांतरण दो बार तंतुप्रसू संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश कुल्ला, और एक ही ट्यूब में मध्यम इकट्ठा।
    6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर गोली कोशिकाओं।
    7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फिर उसके बाद, गोली कोशिकाओं कोलैजिनेज दूर करने के लिए तंतुप्रसू मध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ गोली धोने। मीडिया रचना के लिए सामग्री तालिका देखें।
    8. कदम 1.2.7 एक बार और दोहराएँ।
    9. एक T25 बाँझ टिशू कल्चर कुप्पी पर 5 मिलीलीटर तंतुप्रसू मध्यम और थाली की कोशिकाओं में गोली फिर से निलंबित। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं।
    10. अगले 1-3 दिनों से अधिक तंतुप्रसू लगाव और विकास के लिए संस्कृति का मूल्यांकन। <br /> नोट: कुछ छोटे ऊतक टुकड़े भी थाली करने के लिए संलग्न कर सकते हैं और fibroblasts इन ऊतक टुकड़े से बाहर आ जाते हैं।
    11. Fibroblasts के लगभग 80% संगम के लिए बड़े हो रहे हैं जब तक एक ही परिस्थितियों में संस्कृति को बनाए रखने।
    12. Trypsinization द्वारा fibroblasts लीजिए और अतिरिक्त विस्तार के लिए ताजा संस्कृति बोतल पर स्थानांतरण। सीए ++ और मिलीग्राम ++ से मुक्त संस्कृतियों 1x पीबीएस में 3 बार धोने से trypsinization प्रदर्शन करते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं (2ml / T25 कुप्पी) को trypsin EDTA (देख सामग्री तालिका) जोड़ें।
    13. अतिरिक्त बोतल में अलग कोशिकाओं को विभाजित। कुछ ऊतक टुकड़े मूल T25 बोतल में जुड़े रहते हैं, तो इस कुप्पी के लिए 5 मिलीलीटर ताजा संस्कृति के माध्यम से जोड़ने के लिए और अधिक fibroblasts के लगातार बाहर की ओर पलायन होगा।
      नोट: विस्तारित तंतुप्रसू संस्कृति P1 के रूप में नीचे जमे हुए और भविष्य के प्रयोगों के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहित किया जा सकता है।

Myogenic कोशिकाओं के 2. अमरता

  1. 10 मिमी कैफीन के साथ पूरक ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ अभिकर्मक के लिए 30 मिनट पूर्व फ़ीड कोशिकाओं।
  2. एक मिडी प्रस्तुत करने का (CDK4 या hTERT प्लाज्मिड) और polyjet से प्लास्मिड डीएनए के दो माइक्रोग्राम प्रति का एक मिश्रण homogenize और निर्माता की सिफारिश के अनुसार, 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  3. रातोंरात पीई कोशिकाओं को प्लाज्मिड / polyjet मिश्रण जोड़ें।
  4. ताजा माध्यम के साथ फ़ीड कोशिकाओं (DMEM और 4 के अनुपात में मध्यम 199: 10% बछड़ा सीरम के साथ पूरक 1,)। बारह घंटे बाद, वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने और एक .45 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर के माध्यम से यह फिल्टर।
  5. (G41 रातोंरात amphotropic पैकेजिंग सेल लाइन PA317 5 को संक्रमित करने के लिए एकत्र सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर का प्रयोग करें और या तो 0.5 मिलीग्राम / एमएल neomycin साथ चयन के बाद एक स्थिर वायरस उत्पादक सेल लाइन प्राप्त8) CDK4 या 0.5 मिलीग्राम के लिए / hTERT के लिए hygromycin एमएल।
  6. फिर तीन फसल के लिए सतह पर तैरनेवाला हर सुबह, शाम और सुबह कटाई, निकट confluency को स्थिर पैकेजिंग कोशिकाओं से बढ़ द्वारा वायरल supernatants काम कर तैयार करें।
  7. वायरल supernatants फ़िल्टर और या तो सीधे बाद में उपयोग के लिए डिग्री सेल्सियस -80 में 1 मिलीलीटर aliquots और दुकान में उपयोग करते हैं या उन्हें विभाजित। वायरल सतह पर तैरनेवाला प्रत्येक फ्रीज पिघलना के साथ 50% संक्रमण क्षमता खो देता है कि ध्यान दें। ब्लीच-धोने के लिए वायरल कणों को छुआ है कि सब कुछ discarding से पहले याद रखें।
    नोट: स्थिर PA317 वायरस उत्पादक सेल लाइन जमे हुए और स्थायी भंडारण के लिए -150 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है (मध्यम ठंड 10% DMSO के है, 90% सीरम)।
  8. प्लेट FACS के शुद्ध myogenic कोशिकाओं / अच्छी तरह से 0.1% जिलेटिन के साथ लेपित 6 अच्छी तरह प्लेटें में 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं के घनत्व पर (1.1-1.9 चरणों में वर्णित)। कोशिकाओं वायरल संक्रमण के साथ आगे बढ़ने से पहले थाली से जुड़े होते हैं कि सुनिश्चित करें।
  9. एफ, फ़िल्टर्ड 400 μl जोड़ेंreshly रातोंरात (नियंत्रण के रूप में दो कुओं रखने के लिए) प्रत्येक छह अच्छी तरह से थाली करने के लिए वायरल सतह पर तैरनेवाला या फ्रोजन aliquots का उत्पादन किया।
  10. 2.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से ताजा पेशी मीडिया (4 के साथ कोशिकाओं को खिलाने से मध्यम बदलें:; 0.02 एम HEPES बफर, 1.4 मिलीग्राम / एल विटामिन बी 12, 15% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक एक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) और मझौले 199 0.03 मिलीग्राम / एल ZnSO4, 0.055 मिलीग्राम / एल dexamethasone, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति / एल hepatocyte वृद्धि कारक और 10 माइक्रोग्राम प्रति / एल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक)। एक ब्लीच कंटेनर में वायरल कणों से युक्त मीडिया और pipettes त्यागें। 3 दिन तो, संक्रमण से उबरने में 400 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / neomycin (CDK4 संक्रमण) या 300 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल hygromycin (hTERT संक्रमण) का उपयोग कर चयन के लिए इलाज के लिए के लिए एक ही माध्यम में कोशिकाओं को छोड़ दें।
  11. नियंत्रण पकवान मरने में कोशिकाओं (1-2 सप्ताह) जब तक दवा चयन के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने।
  12. यहां तक ​​कि selecti के दौरान, (EDTA के trypsin 0.05% का उपयोग कर 60-80 confluency%) बीतने कोशिकाओं वे मिला हुआ बनने से पहलेअवधि पर। चयन दवा के साथ पूरक ताजा myoblast मध्यम के साथ कई 10cm बर्तन में replate कोशिकाओं (2.11 में वर्णित के रूप में)। एक विषम जनसंख्या के रूप में अमर चयनित कोशिकाओं को बनाए रखने या एक पूरी तरह से सजातीय आनुवंशिक पृष्ठभूमि (हर कोशिका में transgene का एक ही प्रविष्टि) प्राप्त करने के लिए क्लोन।
  13. निम्न चरणों का उपयोग प्रतिरूप चयन का पालन:
    1. छोटी कालोनियों (10-20 कोशिकाओं) का गठन कर रहे हैं जब तक, कम घनत्व (जैसे 10 सेमी बर्तन में 300 से 500 कोशिकाओं) में कोशिकाओं बीज और लगभग दो सप्ताह के लिए उन्हें बनाए रखने के।
    2. बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए केवल एक पतली फिल्म छोड़ रहा है, इस बिंदु पर मध्यम के सबसे निकालें।
    3. (एक छोर सिलिकॉन वैक्यूम तेल में डूबा हुआ है) के साथ प्रत्येक वांछित क्लोन पर एक क्लोनिंग अंगूठी प्लेस और / trypsin EDTA की कुछ बूँदें जोड़ें।
    4. हार्वेस्ट कोशिकाओं वे ध्यान से 1 मिलीलीटर टिप या एक पाश्चर pipet का उपयोग कोशिकाओं aspirating और छोटी उपलब्ध multiwell पीएलए के लिए उन्हें स्थानांतरित से गोल हो जाते हैंते (96 या 48, 24 या 12 अच्छी तरह प्लेटें)।
    5. स्थानीय confluency को रोकने के लिए जरूरत के रूप में क्लोन का विस्तार करें।

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Representative Results

चित्रा 1 प्राथमिक ऊतक हदबंदी में शामिल महत्वपूर्ण कदम के कुछ दिखाता है: ऊतक की सही मात्रा (चित्रा 1 ए, बी) एक बाँझ टिशू कल्चर पेट्री डिश में तौला जाता है। एक ऊतक घोल (चित्रा 1C, डी) प्राप्त किया जाता है जब तक ऊतक तो पतले, बाँझ नलियां का उपयोग कर कीमा बनाया हुआ है। पाचन एंजाइमों के अलावा के बाद, प्राथमिक मांसपेशियों के ऊतकों हदबंदी आमतौर पर 45-90 मिनट के भीतर enzymatic पाचन द्वारा हासिल की है। ऊतक पाचन की प्रगति आम तौर पर overdigestion और कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए हर 15-20 मिनट पर नजर रखी है। enzymatic पाचन धीरे pipetted हो सकता है और कुछ ही समय हर 15-20 मिनट मिलाया जा सकता है। पाचन कदम के अंत में, कोशिकाओं को एक 100 माइक्रोन (चित्रा 1E, एफ) और फिर एक 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से छान रहे हैं। मांसपेशियों के ऊतकों को शुरू करने की मात्रा पर निर्भर करता है और नमूना हल्का या गंभीर रूप से प्रभावित मांसपेशी, अलग प्राथमिक सेल से प्राप्त किया जाता है कि क्यालोकसभा विषम हो जाएगा। चित्रा 1H पाचन के बाद और टिशू कल्चर व्यंजन में चढ़ाना अलग प्राथमिक कोशिकाओं 3-6 घंटा का एक उदाहरण से पता चलता है, जबकि चित्रा 1G, तुरंत पाचन निम्नलिखित निलंबन में मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का एक उदाहरण से पता चलता है। Myogenic कोशिकाओं आमतौर पर fibroblasts और adipogenic कोशिकाओं के साथ मिलाया जाएगा। इम्यून कोशिकाओं को भी सूजन मरीज की बीमारी के साथ जुड़ा हुआ है जहां मामलों में मौजूद हो सकता है। इसलिए, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के भावी जुदाई वांछनीय हो सकता है। मानव myogenic कोशिकाओं के संभावित अलगाव के लिए, CD56 या एन-सीएएम व्यापक रूप से एक विश्वसनीय मार्कर 6-9 के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इस शुद्धि शीघ्र ही myogenic progenitors के संवर्धन और सेल अमरता की प्रक्रिया के लिए पूर्व के लिए अलगाव के बाद लाभकारी हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्राथमिक कोशिकाओं की अमरता पहले से कम किया जा सकता है, तो अमर myogenic कोशिकाओं FACS द्वारा CD56 की अभिव्यक्ति के आधार पर चुना जा सकता है। एक योजनाबद्ध परपूर्व FACS छँटाई और एक FACS प्रोफाइल का एक उदाहरण के लिए आवश्यक कदम चित्रा 2 में सचित्र है। संक्षेप में, प्राथमिक कोशिकाओं की गिनती और कोशिकाओं के लिए, तो प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी विरोधी CD56) जोड़ा जाता है संकेत दिया है और incubated के रूप में उच्च एकाग्रता में resuspended हैं बर्फ पर 30 मिनट के लिए। एक धोने के बाद, कोशिकाओं को एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर के माध्यम से विश्लेषण किया और (चित्रा 2) CD56 सकारात्मक कोशिकाओं की व्याप्ति में अनुमानित उपज कुल मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के 40-70% से लेकर, नमूने के लिए नमूना से भिन्न होता है शुद्ध कर रहे हैं। उपज व्यक्ति की उम्र पर निर्भर करता है और myogenic कोशिकाओं अप्रभावित या रोगग्रस्त पेशी से निकाले जाते हैं या नहीं। Dystrophic मांसपेशियों अक्सर CD56 सकारात्मक कोशिकाओं के कम प्रतिशत है, जबकि अप्रभावित पेशी आमतौर पर, myogenic कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत है। शुद्ध कोशिकाओं पूरा myogenic मध्यम विकास में चढ़ाया जाता है (सामग्री तालिका देखें)। वे reac जब कोशिकाओं trypsinization द्वारा passaged किया जा सकता हैएच 60-70% संगम। CD56 व्यक्त कोशिकाओं myogenic और (चित्रा 3 में schematized के रूप में) myogenic कोशिकाओं की व्याप्ति अमरता दो जीन 12,13 के अनुक्रमिक अभिकर्मक की आवश्यकता है इन विट्रो 10,11 में myotubes बनाने में सक्षम हैं। Cyclin निर्भर Kinase 4 (CDK4) के कारण अपर्याप्त संस्कृति शर्तों को टिशू कल्चर के तनाव को दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और मानव टेलोमिरेज रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (hTERT) की वजह से अंत प्रतिकृति घटना से 12 टेलोमेर छोटा करने से रोकता है। दोनों पूर्व वायरल प्लास्मिड pBAbe रीढ़ वेक्टर में हैं। माउस CDK4 सीडीएनए निर्माण neomycin प्रतिरोध जीन होता है और hTERT सीडीएनए निर्माण hygromycin प्रतिरोध जीन होता है। बाद में भी hTERT / टी कैसेट के दोनों सिरों में रखा एक दाद सिंप्लेक्स वायरस thymidine kinase (टी) कैसेट और loxP साइटों में शामिल है। इस gancyclovir का उपयोग कर Cre recombinase 14 और जवाबी चयन करके पूरे अभिव्यक्ति इकाई के छांटना अनुमति देता है।

नवनियुक्त अमर कोशिकाओं को एक पूरी तरह से homogenic आनुवंशिक पृष्ठभूमि (एकल प्रविष्टि सेल जीनोम में और उसके संतान) प्राप्त करने के लिए, वायरस अलग अलग साइटों में एकीकृत, या क्लोन कर रहे हैं, जहां एक बड़ी आबादी के रूप में बनाए रखा जा सकता है। ज्यादातर मामलों में, सेल जीनोम में कैसेट की प्रविष्टि के आधार पर क्लोन के बीच मामूली अंतर में होगा परिणाम एक मुख्य आबादी से क्लोन अलग। इसके अलावा, व्यापक टिशू कल्चर विकास लाभ के साथ कोशिकाओं के बजाय को अलग है कि लोगों के चयन के पक्ष में होगा। मेँछोटी कालोनियों (10-20 कोशिकाओं) का गठन कर रहे हैं जब तक: (10 सेमी बर्तन में 300 से 500 कोशिकाओं उदाहरण के लिए) और के बारे में दो सप्ताह के लिए खेती एकल क्लोन के solation कम घनत्व में कोशिकाओं को बोने के द्वारा आसानी से किया जाता है। मध्यम से अधिकांश तो बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए केवल एक पतली फिल्म छोड़ रहा है, निकाल दिया जाता है। क्लोन क्लोनिंग के छल्ले का उपयोग कर trypsinized और जरूरत के रूप में तो विस्तार कर रहे हैं। विस्तारित अमर क्लोन ऐसे immunofluorescence द्वारा FACS, desmin और MyoD अभिव्यक्ति द्वारा CD56, या भेदभाव पर myotube गठन के रूप में आम myogenic सेल मार्कर, की अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण किया जा सकता है। 3-5 दिन (चित्रा 4) के बाद: मिला हुआ myogenic कोशिकाओं (90 confluency%) (2% घोड़े सीरम के साथ पूरक 1, 4 के अनुपात में DMEM और मझौले 199) भेदभाव मध्यम में रखा जाता है जब myotubes सबसे स्पष्ट कर रहे हैं। कोई मतभेद myotube गठन में और गैर-अमर नियंत्रण कोशिकाओं और अमर कोशिकाओं के बीच myotube संकुचन की क्षमता में देखा गया था (वीडियो 1 और 2)।

(चित्रा 5) सहित कई तरीके, assayed द्वारा किया जा सकता है। विकास घटता के उदाहरण कोशिकाओं मार्ग की विस्तारित नंबर के लिए विस्तार किया गया के रूप में टेलोमेर छोटा मनाया गया जहां चित्रा 5 ए, में दिखाए जाते हैं। इसके विपरीत, सफल अमरता वृद्धि हुई टेलोमिरेज गतिविधि के साथ जुड़ा हुआ है (चित्रा 5)

चित्रा 1
चित्रा 1:।। ऊतक की नियुक्ति निम्नलिखित खाली संस्कृति की थाली का वजनी प्राथमिक मानव मांसपेशियों के ऊतकों की हदबंदी के लिए महत्वपूर्ण कदम के चित्र (ए), पूर्व ऊतक प्लेसमेंट और (ख) से (सी) बाँझ नलियां भरती करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ऊतक, जब तक (डी) ऊतक यहस्वयं एक घोल के लिए कम है। Collagenase और dispase जोड़ रहे हैं और ऊतक 45-90 मिनट के लिए पच जाता है, तो पाचन मलबे (ई, एफ)। (जी, एच) हदबंदी के बाद तुरंत चढ़ाया हौसले से अलग कोशिकाओं के उदाहरण (जी त्यागने के लिए एक नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड है ) या 3 घंटा हदबंदी के बाद, प्राथमिक कोशिकाओं) एच (व्यवस्थित करने के लिए शुरू करते हैं।

चित्रा 2
चित्रा 2:। प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर के माध्यम से पूर्व शुद्धि के लिए मानव myoblast धुंधला में शामिल प्रक्रियाओं के कार्यप्रवाह FACS विश्लेषण से पहले मानव कोशिकाओं का धुंधला के लिए महत्वपूर्ण कदम डाला जाता है। FACS के भूखंडों के उदाहरण भी दिखाए जाते हैं। नकारात्मक नियंत्रण (बाएं पैनल) छँटाई गेट स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सही पैनल में, CD56 व्यक्त सकारात्मक कोशिकाओं gated और percenta रहे हैंसकारात्मक कोशिकाओं की जीई दिखाया गया है। इस रणनीति के पूर्व अमरता करने के लिए या अमरता प्रक्रिया के बाद या तो myogenic कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्रा 3
चित्रा 3: myoblast अमरता के लिए वायरस उत्पादन के योजनाबद्ध। रेट्रोवायरस उत्पादन के कार्यप्रवाह myoblasts अमर का इस्तेमाल किया। एक pBabe रीढ़ की हड्डी में CDK4 या floxed hTERT-टी के कैसेट या तो युक्त एक प्लाज्मिड निर्माण (बाएं) फीनिक्स ecotropic में ट्रांसफ़ेक्ट है (पीई) पैकेजिंग सेल लाइन रातोंरात polyjet का उपयोग कर (8-12 घंटा)। सतह पर तैरनेवाला तो फीनिक्स amphotropic पैकेजिंग सेल लाइन (PA317) पर छानने के बाद स्थानांतरित कर रहा है। इन कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है या कोशिकाओं के भविष्य के उपयोग के लिए एक स्थिर सेल लाइन उत्पन्न करने के लिए neomycin या hygromycin के साथ या तो चयनित किया जा सकता है। Filt की aliquotsमाना सतह पर तैरनेवाला (एक 50% दक्षता के खो) के साथ बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। ब्लीच प्रक्रिया के सभी बिंदुओं पर इस्तेमाल हर उपभोज्य साफ करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

चित्रा 4
चित्रा 4:। अमरता प्रक्रिया (ऊपर) की प्रतिवर्ती myoblast अमरता की योजनाबद्ध कार्यप्रवाह: प्राथमिक कोशिकाओं पहले CDK4 साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। Neomycin चयन के बाद, myoblasts दो चयन मार्कर युक्त एक floxed hTERT कैसेट के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं; एचएसवी टी और hygromycin। एक बाद में समय पर अगर वांछित, hTERT कैसेट बाहर Cre recombinase व्यक्त और gancyclovir साथ छांटना के लिए चयन करके "floxed" किया जा सकता है। इस myoblasts और टेलोमेर छोटा करने की फिर से दीक्षा की "पुनः mortalization" की अनुमति देता है। Telomeres 20 केबी लंबे समय से कर रहे हैं, यह अभी भी दोहरीकरण के सैकड़ों परमिट, और टी से बचा जाता है hTERT की अधिक अभिव्यक्ति की वह जटिलता। अंत में, अमर जनसंख्या से isogenic क्लोन अलग किया जा सकता है। नव अमर कोशिकाओं के myogenicity ऐसे desmin (नीचे बाएँ पैनल, विरोधी desmin, क्लोन D33 के साथ दाग मध्यम विकास में कोशिकाओं, हरा) के रूप में मांसपेशियों की कोशिकाओं के विशिष्ट मार्कर का उपयोग दिखाया जा सकता है। इस क्लोन कोशिकाओं के प्रसार की स्थिति में रखा जाता है, भले ही विभेदित कोशिकाओं में देखा जाता है, ताकि myogenic है। कोशिकाओं (2% घोड़े सीरम, मध्य और सही पैनल के साथ) भेदभाव माध्यम में भेदभाव कर रहे हैं जब myotube गठन बहुत व्यापक हो जाता है। भ्रूण मायोसिन भारी श्रृंखला (हरा) और myotubes को MF20 एंटीबॉडी के साथ दाग लगभग सभी कोशिकाओं DAPI धुंधला (नीला, सभी छवियों) द्वारा कई नाभिक है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 5: अमरता प्रक्रिया का सत्यापन। (ए) के प्राथमिक myoblast, अमर आबादी (myoblast hTERT-CDK4) और फिर से mortalized क्लोन से Isogenic क्लोन के विकास घटता उदाहरण के रूप में दिखाया जाता है (Myoblast hTERT-CDK4 floxed)। कोशिकाओं वार्धक्य तक पहुँचने से पहले विकास दर में कोई मतभेद detectable थे। Telomere छोटा टीआरएफ द्वारा मापा गया था जनसंख्या दोहरीकरण और टेलोमेर की लंबाई के एक समारोह के रूप में नजर रखी थी। (बी) के प्रारंभिक समय अंक और myoblasts (पीडी से 13-75 5 समय अंक) में देर प्रतिकृति का टीआरएफ हैं दिखाया उदाहरण हैं, फिर से mortalized myoblasts के बाद hTERT छांटना (पीडी 62 से 152 के लिए 3 समय अंक) और अमर myoblasts (पीडी 75 और 200)। (सी) सफल hTERT संक्रमण टेलोमिरेज गतिविधि में वृद्धि में तब्दील हो। पहले और hte के बाद कोशिकाओं में 15; टेलोमिरेज गतिविधि ddTRAP (परख की मात्रा का ठहराव, बाएं ddTRAP readout, दाएं) द्वारा मूल्यांकन किया गया थाआर टी संक्रमण। hTERT छांटना myoblasts में देखा मूल सीमा के टेलोमिरेज गतिविधि को समाप्त कर दिया। परिणाम सेल बराबर (पृष्ठभूमि सही) प्रति उत्पन्न कुल टेलोमिरेज उत्पादों के रूप में दिखाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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वीडियो 1 और 2 के myotubes पहले और अमरता की प्रक्रिया के बाद कोशिकाओं से उत्पन्न किया गया। प्रकोष्ठों विकास मीडिया में संगम हो गई है और 10 दिनों के लिए भेदभाव मीडिया के लिए बंद किया गया था। दोनों वीडियो में, एक या एक से अधिक myotubes के कार्यात्मक संकुचन detectable हैं। सहज हिल की रिकॉर्डिंगएक 20X लेंस का प्रयोग किया गया था। कोई मतभेद अमर और गैर-अमर कोशिकाओं के बीच मनाया गया।

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Discussion

एक उपयोगी संसाधन के रूप में कोशिकाओं

रोग के इन विट्रो मॉडल में या रोग फेनोटाइप की स्थापना जब myogenic सेल आबादी के अलगाव और संस्कृति अत्यंत उपयोगी है। यहाँ वर्णित myogenic सेल अलगाव की प्रक्रिया फिर, प्रचारित भेदभाव, या तुरंत विश्लेषण किया जा सकता है, जो कंकाल की मांसपेशी नमूनों से myoblasts और fibroblasts के अलगाव की अनुमति देता है। Myoblast संरचना और समारोह सेल अस्तित्व, सेल संलयन के मूल्यांकन के मूल्यांकन, या शाही सेना या प्रोटीन अभिव्यक्ति की आणविक अध्ययन के माध्यम से, सूक्ष्म परीक्षा के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, myoblasts ऊतकों को नुकसान निम्नलिखित मांसपेशियों के विकास और वसूली के संदर्भ में myoblast समारोह का सीधा आकलन की अनुमति देता है जो अपरिपक्व myofibers की कई विशेषताएं है कि शेयर myotubes में भेदभाव किया जा सकता है। इन phenotypes के सभी myogenic कोशिकाओं के प्रारंभिक मार्ग में काफी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो जाते हैं, वहीं कई प्राथमिक एम के व्यवहारyogenic सेल लाइनों कई मार्ग के पाठ्यक्रम पर बदला जा सकता है। नतीजतन, यह (यहाँ वर्णित) संस्कृति स्थापना की आसानी के लिए और समय की एक लंबी अवधि में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों की पीढ़ी की सुविधा कर सकते हैं, जो एक दिया myogenic सेल लाइन अमर कभी कभी वांछनीय है।

विशिष्ट सेल आबादी का चयन

इस प्रोटोकॉल एक शुद्धीकरण योजना के रूप में FACS का उपयोग कर कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों से myogenic कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन है। का चयन कोशिकाओं की प्रस्तावित रणनीति मृत कोशिकाओं, मलबे, और गैर myogenic कोशिकाओं से रहते हैं, myogenic कोशिकाओं को अलग करने के लिए propidium आयोडाइड (मृत कोशिकाओं का एक संकेतक) और CD56 (myogenic कोशिकाओं के एक मार्कर) का उपयोग भी शामिल है। CD56 नकारात्मक जनसंख्या fibroblasts और संभवतः adipogenic कोशिकाओं सहित गैर myogenic कोशिकाओं शामिल होंगे, जबकि CD56 सकारात्मक जनसंख्या में निहित प्रकोष्ठों के गठन myotubes में सक्षम myogenic progenitors शामिल होंगे। इन अंशों से हर कर सकते हैंस्वतंत्र सेल या डीएनए बैंकिंग अभ्यास या myogenic सेल संस्कृतियों पर प्रदर्शन किया जा रहा assays के लिए के रूप में अतिरिक्त नियंत्रण स्थितियों के लिए उपयोगी हो सकता है समानांतर तंतुप्रसू सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए myoblasts या fibroblasts, और क्षमता का सेल संस्कृतियों का उत्पादन करने के लिए स्वतंत्र रूप से सुसंस्कृत हो। कहीं और 16,17 वर्णित हैं जो FACS छँटाई अवांछनीय या अनुपलब्ध है जहां मामलों में पचा मांसपेशियों के ऊतकों से विशिष्ट myoblastic और तंतुप्रसू सेल संस्कृतियों का चयन, के लिए कई अन्य विकल्प हैं। Myoblastic और तंतुप्रसू संबंधी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक दिया सेल प्रकार के लिए कोशिकाओं की लगातार मार्ग को समृद्ध करने के लिए इन दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच अंतर आसंजन गुण का इस्तेमाल शामिल है। Fibroblasts की स्थापना या कोशिकाओं passaging और फिर resu होगा एक अलग पकवान पर सतह पर तैरनेवाला चढ़ाना जब लगभग 1 घंटे के लिए प्लास्टिक पर सेते सेल निलंबन की इजाजत दी, और अधिक आसानी से myoblasts से प्लास्टिक का पालन करने के रूप मेंसेल निलंबन 18 से कई fibroblasts की हटाने में एलटी।

Fibroblasts बनाम myoblasts की उपयोगिता

रोगियों से स्नायु बायोप्सी आमतौर पर हालांकि रोगग्रस्त myoblasts प्रभावी ढंग से पैदा नहीं हो सकता है, प्राथमिक मांसपेशियों की कोशिकाओं की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जाता है और केवल इस प्रकार आवश्यक डिवीजनों की उच्च संख्या तक पहुंचने के लिए सेल अमरता की आवश्यकता होती है, इन विट्रो में विभाजन की कुछ संख्या से गुजरना कर सकते हैं। वे दोनों उपयोगी हो सकता है और बहाव के अनुप्रयोगों के लिए बहुत बहुमुखी प्रतिभा की पेशकश कर सकते हैं के रूप में दोनों fibroblasts और myoblasts पेशी बायोप्सी से अलग किया जा सकता है कि यह देखते हुए, दोनों सेल भिन्न, रोगी के नमूने से बचाया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, fibroblasts के असीमित सेल नंबर और संभावित उत्पन्न करने के लिए बहुत वादा पकड़ जो प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (IPSCs), के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कई सेल प्रजातियों में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सके। इन सुविधाओं के रोगी से प्राप्त कोशिकाओं के लिए अत्यधिक वांछनीय हैंसंभवतः इन विट्रो में सही या चिकित्सीय यौगिकों के लिए खोज में प्रयोगात्मक दवा स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो दुर्लभ रोगों, के साथ है। अमर myoblasts भी दवा आधारित स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है। Fibroblasts भी प्रभावी ढंग से MyoD 19-21 व्यक्त एक वायरस के संक्रमण से एक myogenic भाग्य की दिशा में परिवर्तित किया जा सकता है। इस विधि को प्रभावी ढंग से मांसपेशियों की बीमारियों के साथ रोगियों से निकाले fibroblasts का उपयोग कर परीक्षण और MyoD व्यक्त fibroblasts के प्रभावी रूप से परिपक्व मांसपेशियों प्रोटीन व्यक्त कि myotubes फार्म कर सकते हैं कि इस बात की पुष्टि की गई है। इस प्रकार, दोनों प्रकार की कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से कई बहाव के अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया और नैदानिक ​​और चिकित्सीय अध्ययन के लिए अमूल्य सामग्री प्रदान किया जा सकता है।

अमरता का प्रभाव

सामान्य द्विगुणित कोशिकाओं की अमरता एक पूरी तरह से कई अलग अलग प्रयोगशालाओं की विशेषता है और अध्ययन किया जा सकता है कि एक स्थिर मानव कोशिका लाइन तैयार करने के लिए अनुमति देता है। स्वतंत्र से प्राथमिक संस्कृतियोंisolations के अलग-अलग हो सकता है और नुकसान हदबंदी की प्रक्रिया में या संस्कृति व्यवहार विकृत कर सकते हैं जो overdigestion, द्वारा शुरू की है, जब उनके समग्र proliferative क्षमता चर हो सकता है। टेलोमिरेज (hTERT) के उत्प्रेरक सबयूनिट की अभिव्यक्ति का उपयोग कोशिकाओं की अमरता एक स्थिर सेलुलर phenotype बनाए रखने के लिए फायदा है और कोशिकाओं को द्विगुणित रहते हैं। टेलोमिरेज Wnt मार्ग 22 न्यूनाधिक कर सकते हैं कि चूहों में रिपोर्ट किया गया है। हम मानव कोशिकाओं में इस घटना नहीं मनाया है। Telomeres लम्बी किया गया है के बाद यह निकाला जा सकता है इतना है कि हालांकि, इस तरह के संभावित जटिलता से बचने के लिए, hTERT कैसेट, Lox साइटों के साथ flanked किया गया है। लांग telomeres सबसे प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए आमतौर पर पर्याप्त अतिरिक्त डिवीजनों के सैकड़ों प्रदान करते हैं।

निरंतर सेल विस्तार हमेशा तेजी से विकास के लिए एक चयनात्मक लाभ प्रदान करता है, सेलुलर फेनोटाइप कभी कभी के कारण सबसे तेजी से विभाजित की अतिवृद्धि को पक्षपाती बन सकता हैकोशिकाओं, बल्कि सबसे अच्छा फर्क कोशिकाओं की तुलना में। यह अभी तक वर्णित विधि का उपयोग कर एक महत्वपूर्ण समस्या साबित हुई नहीं है, यह जल्दी अपनी संस्कृति के इतिहास में या वांछित phenotype के प्रदर्शन की कोशिकाओं के लिए क्लोनल चयन से जमे हुए किया गया है कि कोशिकाओं विगलन द्वारा remedied किया जा सकता है।

पास असीमित संख्या को myogenic कोशिकाओं के विस्तार दवा स्क्रीनिंग और संभव रोग मॉडलिंग के लिए फायदे हैं, जबकि अन्त में, मौजूदा तकनीक भी सेल आधारित चिकित्सा में चिकित्सीय वाहन, या के रूप में प्राथमिक नैदानिक ​​उपकरण के रूप में इन कोशिकाओं के प्रयोग को रोकने कि आंतरिक नुकसान है। दोनों इन विट्रो संस्कृति और अमरता चरणों में व्यापक उनके पैतृक राज्य की तुलना में मांसपेशियों की कोशिकाओं के phenotype बदल जाते हैं। महत्वपूर्ण बात है, इन कोशिकाओं को अपने आला के भीतर प्राथमिक उपग्रह कोशिकाओं के प्राकृतिक वातावरण से बहुत अलग है कि एक वातावरण में विस्तार कर रहे हैं। इसलिए, अमर कोशिकाओं संभवतः तीव्र सुरक्षा परीक्षण और विकास की आवश्यकता होती हैनई तकनीकों के pment वे मानव मरीज की मांसपेशी में फिर से पेश किया जा रहे हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood Baker Company, Inc. Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model  Beckman Coulter Model Allegra 6R If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope Nikon Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source Forma Scientific  Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) Becton Dickinson Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II Roche Applied Science #04942078001 Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D  Roche Applied Science #088882001 Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free GIBCO Life Technologies #14185-052
Bovine serum albumin, fraction V Sigma #05470 Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum GIBCO Life Technologies 11965-092 Contains L- glutamine
RBC lysis solution Qiagen 158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml Sigma P4170 Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry Biolegend 318310 APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE Cell Biolabs RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174 Cell Biolabs RV-102
Pig skin gelatin Sigma G1890-500g Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet  Signagen SL100688
G418 Fisher 345812
Hygromycin EMD Biosciences 400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT not commercially available Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit Qiagen 12143
Medium 199 Life Technologies  Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies  DMEM (11965-092) Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor. Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)  #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).  Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining Developmental Hybridoma Bank MF20 Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining Thermo Scientific MS-376-S0 Clone D33
Horse serum Invitrogen 26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies 11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin Fetal bovine serum: Thermo Scientific SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized Worthington 4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free Lonza 17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes GeneMate/Bioexpress C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels Aspen Surgical 372610
Hemocytometer Hausser Scientific 1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes Bellco glass 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml) Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm) BD Falcon 353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size) BD Falcon 352340 (40µm); 352360 (100µm)
 Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters Millipore SLHV013SL
Cloning rings Corning #3166-8 To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines 
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes Greiner bio-one 628160
Sterile scalpels DeRoyal D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks Techno Plastic Product, TPP 90026 sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

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