Метод Изолированные * These authors contributed equally

Medicine
 

Summary

Экс-Vivo легких перфузии (EVLP) позволило трансплантация легких у людей, чтобы стать более доступными, позволяя возможность оценить органы и расширению донорской бассейн. Здесь мы опишем развитие программы крыса EVLP и уточнений, которые позволяют воспроизводимым образцом для будущего расширения.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, K., Bobba, C., Eren, E., Spata, T., Tadres, M., Hayes, Jr., D., Black, S. M., Ghadiali, S., Whitson, B. A. Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program. J. Vis. Exp. (96), e52309, doi:10.3791/52309 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Количество допустимых легких донор для трансплантации легких сильно ограничена из-за плохого качества. Экс-Vivo легких перфузии (EVLP) позволило трансплантация легких у людей, чтобы стать более доступными, позволяя возможность оценить органы и расширению донорской бассейн. Поскольку эта технология расширяет и совершенствует, способность к потенциально оценки и повышения качества некачественных легких перед трансплантацией является острая необходимость. Для того, чтобы более строго оценивать эти подходы, воспроизводимая модель животного должно быть установлено, что позволит для тестирования усовершенствованных методов и управления пожертвованных легких, а также адресата легких трансплантации. Кроме того, модели на животных EVLP попутного патологий, например, вентиляция поражении легких (VILI), обеспечит новый метод оценки методов лечения этих патологий. Здесь мы опишем развитие крысиного программы легких EVLP и уточнений к этому меняТПК, которые позволяют воспроизводимым образцом для будущего расширения. Мы также описать применение этого EVLP системы для моделирования Вили в легких крыс. Цель состоит в том, чтобы обеспечить научному сообществу ключевой информации и «жемчужины мудрости» / методов, которые возникли из проб и ошибок, и решающее значение для создания системы EVLP, что является надежной и воспроизводимой.

Introduction

Клиническое значение

Существует в настоящее время нехватка подходящих легких, доступных для трансплантации только 19% легких, находящихся в состоянии быть использованы на национальном приводит к затяжной время ожидания, список или больных, умирающих в ожидании трансплантации 1. Нехватка может быть связано с более старых доноров, травмой, инфекцией, мульти-системы органной недостаточности, а иногда и раненых донорских лёгких на урожай 2. Кроме того, легких хрупкая орган за пределами грудной полости и стандартных методов перевозки и сохранения может привести к ухудшению и нежизнеспособных легких. Таким образом, поддержание и улучшение жизнеспособности легких экс-VIVO в последнее время стал основным направлением в трансплантации легких медицины.

Экс-естественных легких перфузии (EVLP)

Экс-естественных легких перфузии (EVLP) превратилась в постоянно заливать органы проходят оценку для трансплантации и позволяет период оценки, что всепотоки для потенциала реанимации легких или восстановления. EVLP может продлить общей из органов тела ишемии и позволяют донорских органов путешествовать дальше расстояния 3. Как правило, легкие вентилируются в размере 50% общей емкости легких или 20 CMh 2 O пика давления в дыхательных путях с долей кислорода во вдыхаемом воздухе (FiO 2) от 30% до 50% 4. Сохранение раствор перфузии при 40-60 мл / кг (приблизительно 40% от предсказанного сердечного выброса 100 мл / кг) у человека и крупных животных 5,6, но перфузии около 20% от сердечного выброса у крыс 7. Включение решения Стин позволило человека легкие путешествовать в условиях РТ без развития отека легких 9. Эта новаторская работа была уточнена Университета Торонто легких трансплантации Program 10-13 и в настоящее время оценивается в целях совершенствования оценки предельных легких доноров для трансплантации 14,15. Тем не менее, оптимальный ventilatioп и перфузии условия, необходимые для восстановления маргинальных и / или суб-стандартных легкие для трансплантации не известен, и в настоящее время активной областью исследований.

Изолированные системы легких перфузии были использованы в небольших животных, чтобы вызвать повреждение легких, заново создать респираторных заболеваний, и заливать легкие с различными решениями для предотвращения ишемического повреждения. Следователи создали небольшой животной модели трансплантации легких с помощью изолированную систему легких, перфузии, чтобы имитировать протоколы EVLP, которые могут быть использованы в организме человека и крупных животных 16-18. Тем не менее, это экспериментальная модель имеет много проблем в отношении различных методов и параметров, используемых для имитации физиологии человека. В частности, есть много тонкостей в поддержании жизнеспособности легких во время EVLP. Эти тонкости могут возникнуть из-за различий в лесозаготовительной техники, положительных значениях вентиляции давления, Перфузат состава и расхода условиях и катетеризации легких. Therefore, цель здесь заключается в обеспечении научно-исследовательского сообщества с рядом неисправностей и реализации советов, которые мы нашли в счете до надежный метод для реализации EVLP в модели грызунов.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были выполнены в соответствии с Руководством-линий Уходу за животными и руководство Национального научно-исследовательского совета за гуманное лечение и использования лабораторных животных (IACUC) и претерпел утверждения Комитетом государственного университета Огайо IACUC.

1. Начальная настройка

  1. Настройка контура EVLP и мягкое (37 ° C) Перфузат циркулирующих через систему перед введением экс-посадили легких (рис 1).
  2. Установите теплой водой ванну, используемый на обложке Перфузат водохранилища, теплообменник, и искусственного грудной клетки, до 37 ° C и оборотные (рис 1).
  3. Выполнить решение де-оксигенации (например, 6% O 2, 8% СО 2, 84% N 2) Счетчик настоящее через перфузата в газовый фильтр, чтобы обеспечить перфузат имеет ~ 6% растворенного кислорода для эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот обескислороженный Перфузат позволяет производить оценку ОF функции легких путем измерения кислорода, вводимого в перфузат, после органа.
  4. Откройте программу сбора данных и подключить датчик давления артерии легких, датчик трахеи перепада давления, дыхания Дифференциальный преобразователь давления потока, легких веса датчика, а скорость насоса датчик к цепи EVLP и конвертера данных приобретение / аналого-цифровой преобразователь ( Рисунок 2).
  5. Настройте операционный стол и рабочих органов на трассе EVLP (рис 3).
  6. Установите небольшую емкость с жидким азотом рядом с цепи EVLP если будут получены образцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: система автора был изменен, чтобы собрать предварительную орган и пост-органов перфузат, не прерывая динамику давления потока, которые потенциально могут повредить легкие.

2. Подготовка анестетиков и гепарин, обезболивания Крысы

  1. Положите на следующей индивидуальной защиты(СИЗ) перед началом работы крыс и крыс ткани: хирургические маски, хирургические перчатки, и одноразовые халат.
  2. Взвесьте крысы и записывать вес.
  3. Подготовка 1200 ед / кг гепарина.
  4. Подготовьте как 60 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина в одном шприце, подготовки кетамин первой.
  5. Внутрибрюшинно вводят смесь кетамина и ксилазина в крысы и позволить 5 мин для крысы, чтобы стать бессознательного.
  6. Подтвердите надлежащего обезболивания путем проверки схождения щепотку рефлекс. Если крыса не снять свою палец, не чувствуя боли.
  7. Перемещение крысы операционном столе, закрепить в положении лежа на спине, и спрей с алкоголем для стерилизации.

3. Добыча и первоначальная Вентиляция легких крыс

  1. Подготовка 4-20 см длиной шелковые швы (3-0 или 4-0 должно хватить).
  2. Начните записи данных с помощью программы сбора данных.
  3. Проверьте соответствующую глубину анестезии, используя хирургические ножницы введите перитонеальный окVity по срединной лапаротомии и ввести гепарин в нижнюю полую вену.
  4. Провести разрез краниально мимо рукояткой в ​​шею, пока трахеи подвергается. Не разорвать грудную полость (рис 4а).
  5. Проанализируйте кзади от трахеи в средней линии и сдвиньте шелковым швом кзади от трахеи (рис 4В).
  6. Поднимите переднюю часть трахеи и сделать поперечный надрез между хрящевых колец, высоко на трахею. Не прорезать задней мембранной части трахеи в этой точке (фиг.4С).
  7. Иглу в трахею с трахеи канюли и закрепите его с помощью шелковой нити (рис 4D). Убедитесь, что шов лигатуру закреплен в насечка, чтобы уменьшить миграцию канюли.
  8. Подключите трахеи канюли к схеме вентиляции.
  9. Включите механического вентилятора, чтобы начать механически вентиляции ЛуNGS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начальные настройки были выбраны, чтобы быть дыхательный объем 4 мл / кг и положительным давлением в конце выдоха (PEEP) 2 CMh 2 O. Эти параметры могут быть изначально установлены и в зависимости от условий эксперимента может быть скорректирована после орган в системе перфузии экс-VIVO.
  10. Введите грудной полости через грудины / xyphoid и продолжить краниально к suprasternal паз. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к легкие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В легких крыс является хрупким, любые непреднамеренные манипуляции могут привести к травме и отек легких (рис 5А).
  11. Использование 2 втягивающих, убрать грудной полости, чтобы правильно выставить анатомии (рис 5а). Опять же, позаботиться, чтобы не касаться легкие.
  12. Удалить тимус с небольшим возвышением и тупым.
  13. Сдвиг содержимого брюшной полости в сторону, чтобы выставить либо нижнюю полую вены (НПВ) или брыжеечной вены (MV).
  14. Надрезать либо IVC или MV обескровить крысу, обеспечивая эвтаназии.
  15. Поставьте шелковой нити кзади легочной артерии и аорты в рамках подготовки к обеспечению канюли в легочной артерии (рис 5б).
  16. Сделайте 2-3 мм разрез на передней поверхности правого желудочка путей оттока и поместите канюли в разрез и в легочной артерии и закрепите с помощью шелковой нити (рис 5в).
  17. Разреза на верхушке сердца, чтобы разрешить доступ к левого желудочка и очистить любые сгустки внутри легочной сосудистой проточной ~ 15 мл раствора с низкой K + электролита через легочную артерию и выходит через верхушки сердца в грудной полости ( Рисунок 5D).
  18. Подключите легочной артерии (ПА) канюли к цепи EVLP. Убедитесь, приток линия, выходящая из контура к канюли Па загрунтовать перфузат, чтобы избежать попадание воздуха сердце и легкие.
  19. ВключитеОсновной перистальтический насос и установить его на низком уровне (~ 2 мл / мин) Скорость, чтобы Перфузат запустить через легочную артерию и из левого желудочка в грудной полости. ** ВАЖНЫЙ ШАГ ** Убедитесь, что давление Па не шип, как это признак либо блокировки или плохой катетеризации (рисунок 6).
  20. Выключите перистальтического насоса.
  21. Установите шелковый шов позади сердца, вокруг желудочков (Рисунок 7).
  22. Начните процесс cannulating в левое предсердие, вставив небольшой пару хирургических щипцов в вершине, через митральный клапан, и в левое предсердие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет расширяться митрального клапана и облегчить катетеризации. Агрессивный расширение, или слишком глубоко расширение, может случайно покалечить левого предсердия рендеринга закупок неэффективно.
  23. Удалите пинцетом из сердца.
  24. Вставьте в левое предсердие канюли в вершине через митральный клапан в левый поновесие.
  25. Безопасный левого предсердия канюли с шелковой нитью за сердцем (Рисунок 8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шов может быть "предварительно связали" для облегчения катетеризации.
  26. Подключите канюли в легочной артерии, чтобы экс-естественных цепи легких перфузии (9А). Не подключать левое предсердие канюлю к схеме EVLP до блок-сердце-легкие не была полностью удалена из тела.
  27. Зажим пищевода с кровоостанавливающего и сократить ниже зажима (между зажимом и диафрагмой), так что пищевода могут быть использованы для повышения сердечно-структур цефально.
  28. Грубо рассекают окружающие ткани и вырезать нисходящей аорты и вспомогательных судов, чтобы освободить блок сердце-легкие, как его подъеме через пищевод (рис 9).
  29. Трансекта трахею медиальнее трахеи канюли совершенно бесплатно блок сердце-легкие.
  30. Снимите блок сердце-легкие и поместить в нужные местаgnated расположение на схеме EVLP (рис 9, в).
  31. Подключите левое предсердие канюли с выпускным линии и начать основную перистальтического насоса (рис 9г).

4. Ex Vivo перфузии легких

  1. Быстро удалить вентиляционную линию от верхней части аппарата EVLP и прикрепить корпус с датчиками давления, а затем вставить вентиляционную линию на верхней части корпуса на верхней части EVLP аппарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит данные вентиляции должны быть записаны и давление контролируется.
  2. Убедитесь пузырь ловушка заполняется достаточным количеством перфузата, чтобы не было воздушных пузырьков (т.е. воздуха эмболии) не будут введены в легкие.
  3. Медленно изменить вентиляции и перфузии настройки до нужной экспериментальных уровней во время начальной 15 мин. Кроме того, в течение этого начального разгона фазы, увеличить расход перфузионного к желаемой скорости и / или давления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программачисле вентилятор, чтобы произвести прерывистый вздох вдохов, которые облегчают движение жидкости из пространства легких и, следовательно, задержать наступление отека, рекомендуется. Они могут быть получены вентиляторами, оснащенными функцией вздох.
  4. Определение понятия «Время 0" как время, когда параметры вентиляции находятся на дыхательным объемом 4 мл / кг, подглядывать за 2 см Н 2 О, и параметры перфузии на их ожидаемых уровней и остается постоянным.
  5. При необходимости, принять Перфузат образцы из выборки порта, флэш-замораживание в жидком азоте, и обратите внимание на время образцов.
  6. Когда эксперимент завершится, изолировать все необходимые анатомические части для сбора и любой флэш-замораживание в жидком азоте или место в фиксирующем растворе для дальнейших исследований.

Representative Results

В режиме реального времени механические данные, собранные в рамках программы сбора данных может быть легко проанализированы, чтобы проверить любое количество гипотез. Например, 10А показывает средний вес легких через 60 мин от 10 экспериментов на крысах животные вентилируемых с низким дыхательным объемом / низкой писк 4 мл / кг и 2 CMh 2 O. Хотя существует очень незначительное увеличение веса легких в течение всего эксперимента, это увеличение не является статистически значимым (ANOVA, р = 0,92). На рис 10B показывает среднее легочное артериальное давление (PAP) через 60 мин от 12 экспериментов крысы. Ниже PAP в момент времени 0 мин является результатом низких настройках потока и вентиляции, используемых в начале всех экспериментов и ППА остается постоянной после этого момент времени без каких-либо статистически значимых изменений после Т = 10 мин (ANOVA о рангах р = 0,89). Рисунок 10C показывает легочное сосудистое сопротивление (PVR) через 60 мин от 12 крысэксперименты и хотя есть небольшое уменьшение PVR после Т = 20 мин, не было выявлено статистически значимых различий в PVR в течение этого эксперимента (ANOVA о рангах р = 0,65). По сравнению с данными PVR, показанных здесь, Noda и соавт. показал PVR слегка возрастает с течением времени в течение 4 часов. Тем не менее, эти авторы сообщают данные в PVR, начиная с 1 часа вместо начала эксперимента и не стандартного отклонения не предусмотрены 7. Нода и др. также не показывают легочных данные отек для экспериментов 4 ч, так ни в какое сравнение не могут быть сделаны с данными, представленными здесь, в фигуре 10А. Основные различия в Нода и др. Процедура по сравнению с тем, что показано в данном документе, включают в себя: 1 час сохранение холода в растворе перед LPS EVLP, крысы были первоначально вентилируют газовой смесью, в том числе изофлуран, чтобы привести их в бессознательное, перфузат раствор с добавлением 50 мг метилпреднизолона и 50 мг цефалоспоринов, общая FLвл была определена как 20% рассчитанной сердечного выброса, перфузата брали образцы только после легкого были вентилируемые на 100% O 2 в течение 5 мин и предварительного эксперимент проводили в течение 4 ч.

Образцы, отобранные в ходе эксперимента от перфузата также могут быть проанализированы для многих целей. В качестве примера, на рисунке 11 показано, как высокая дыхательный объем / высокая PEEP вентиляция может вызвать про-воспалительную реакцию в 60 мин. Для этих экспериментов, Перфузат от 4 крыс вентилируемые под вредных условиях, т.е. высокой дыхательного объема 10 мл / кг и высокой писк 8 CMh 2 O, были проанализированы на про- и противовоспалительных цитокинов IL1β, ФНО и IL-4 с использованием стандарта Методы ELISA. Как показано на фиг.11, по сравнению с уровнями цитокинов, прежде вентиляции (0 мин), 60 мин, наносящих вентиляции приводит к статистически значимому увеличению IL-1β и TNF & alpha; (провоспалительные цитокины) в го никаких изменений в IL-4 (противовоспалительный цитокин) Концентрация. Таким образом, этот EVLP система способна генерировать легких профилей травмы обычно наблюдается при механической вентиляции.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема и фотография Small Animal экс-естественных легких перфузии (EVLP) цепи. Письма в диаграмме совпадают с буквами на фотографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Все датчики надежно соединен с управляющими коробки."> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. операционный стол крыса надежно установить рядом с экс естественных легких перфузии (EVLP) цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. () разрез делается краниально подвергать трахеи. Грудная клетка не подвергается. (B) шелковой нитью помещается позади трахеи. (C) трахеи частично сократить, чтобы подготовиться к катетеризации. (D), трахеи канюли помещают в Positio п и крепится с помощью шелковой нити. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. () грудной полости отстранился, чтобы разрешить доступ к сердцу и легким. (Б) Получение для размещения шва за легочной артерии. (C) легочной артерии канюлировали и связаны с ранее размещенных шелковой нити. (D) решение с низким K + электролит пропускают через легочную артерию и из левого предсердия, чтобы удалить любые сгустки крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше версия этой фигуры.

сегда "> Рисунок 6
Рисунок 6. Увеличение легочной артерии поток при промывке легких может привести к легочной артериальное давление резко возрастет. Если катетеризация была выполнена правильно и нет Главным препятствием, давление должно уменьшаться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры ,

Рисунок 7
Рисунок 7. шелковой нити, расположенных вокруг всей сердце в рамках подготовки к левого предсердия катетеризации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

н-страницы = "всегда"> Рисунок 8
Рисунок 8. Левое предсердие канюли закреплен в месте с шелковой нитью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9
Рисунок 9. () канюли легочной артерии связан с экс-естественных легких цепи перфузии. (В) Пищевод зажимают и соединительной ткани резко расчленены, чтобы удалить блок сердца-легких. (C) блок сердце-легкие удаляется из полости грудной клетки и помещают в экс-естественных легких цепи перфузии. (D) Левое предсердие соединяется с экс-естественных легких цепи перфузии. HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" TARGET = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 10
10. (А) легких вес самцов крыс Sprague Dawley через 60 мин экс виво перфузии легких (N = 10). (B) давление в легочной артерии самцов крыс Sprague Dawley через 60 мин экс естественных условиях перфузии легких (п = 12). (C) легочного сосудистого сопротивления мужчин Sprague Dawley крыс через 60 мин экс естественных легких перфузии (п = 12), NS указывает на отсутствие статистически значимой разницы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

</ HTML "Рисунок 11" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 52309 / 52309fig11highres.jpg" />
11. Влияние 1 ч при высоких вентиляции дыхательным объемом (10 мл / кг) и высокой PEEP (8 CMH 2 O) по про- и противовоспалительных цитокинов концентрации в перфузат. П = 4, * обозначает статистически значимую разницу с уважение к 0 ч образца (р <0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 12
Рисунок 12. () правильно вентиляции и перфузии легких, подключенный к цепи EVLP. (B) Высокая положительное давление в конце выдоха (PEEP) вызывает слезу в трахеи бифуркации, вызывая пузыри, чтобы сформировать на травмы и заполнить искусственный грудную клетку. ES / ftp_upload / 52309 / 52309fig12large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 13
Рисунок 13. () канюли в легочной артерии. Это канюли меньше левого предсердия канюли. (B) левого предсердия канюли. Это канюли гораздо больше, чем канюли в легочной артерии. (С) трахеи канюли. Это канюли ребра, чтобы помочь в обеспечении трахеи с шелковой нитью. Конец, который вставляется в трахею также слегка заостренные, чтобы помочь в установке канюли в трахее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

09fig14highres.jpg "/>
Рисунок 14. (А) верхушки сердца проводится с помощью пары щипцов в правый желудочек собирается быть прорезана, чтобы иглу легочной артерии. (B) дилатация митрального клапана кольца с парой небольших тупыми концами пикапов делает его легче визуализировать тракта в левом предсердии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

СИСТЕМА МОНИТОРИНГА

Какие вещи выглядеть, когда эксперимент работает хорошо:

После того, как канюли были помещены в цепи и легкие вентиляции, есть несколько способов гарантировать, что система работает нормально. Там не должно быть никаких утечек перфузата всей линии. Легочное сосудистое сопротивление (PVR) должны оставаться относительно постоянной (при условии постоянного потока). Кислородный обмен должен увеличиться сразу вентилятор работает должным образом и расширения легких набрать больше альвеол для газообмена. 12А показывает надлежащую вентиляцию и перфузию легких, связанные с цепью EVLP внутри искусственного грудной клетки.

Какие вещи выглядеть, когда эксперимент не работает хорошо:

Есть несколько общих вопросов, которые имели самый высокий уровень наступления в начальной стадии эксперимента EVLP. Первый и самый простой тО средством является утечка в соответствии выходящего из легких. Это заметно по луже перфузата объединения в соответствии с частью схемы и уровень жидкости в бачке постоянно уменьшается. Проверьте и подтяните все разъемы трубы в районе разлива и осмотрите саму трубку для утечки. Если это происходит утечка до легких, оно также может ввести пузырьков в легких. Это должно быть исправлено как можно быстрее, как пузырьки воздуха в перфузат может привести к повреждению ткани и вызвать значительное увеличение PVR. Там также может быть утечка идет из легких или одного из канюли. Это может быть вызвано либо проскальзывание канюли или обструкции в выходящей линии вызывая повышение давления. Проверьте положение для обеих канюли, чтобы гарантировать ни поскользнулся или витой. Давление Па также должны быть проверены в ходе этого процесса, потому что мгновенно увеличение Звуковая давления явный признак, что обструкция какой-то недавно произошло. Рисунок 12BВыставки разрывом легкого, разрушившие из-за высоких давлениях. Утечка из самого легкого может также быть вызвано разрывом в ткани. Эта проблема может быть или не быть устранен, но репозиционирование и затяжки канюли является лучшим вариантом в этом сценарии.

Основные учебные Точки / возможности:

Судебная и развитие погрешность экс-естественных системе легких перфузии позволило нам определить несколько ключевых вопросов, которые мы приводим здесь, чтобы способствовать эффективной реализации системы EVLP. Во-первых, по отношению к закупок, важно, что стандартные методики анестезирующие следуют правильно анестезии животных (достаточно анестезии, инъекции в брюшину) и соблюдение всех стратегий IACUC требуется. Канюли (показано на рисунке 13 A, B, и C) должна быть повторно промыть, чтобы удалить какой-либо сгусток и / или мусор внутри легких vasculatЮр. Что касается выбора животного, мы рекомендуем использовать Sprague Dawley или крыс Льюиса весом 250-350 г. Особое внимание должно быть принято, когда cannulating крыс весом около 250 г, так как сосуды будут меньше и, следовательно, гораздо труднее вводить иглу без повреждения сосудов. Если мелкие крысы, или модель мыши, должен быть использован, меньше канюли возможно, должны быть использованы.

Трахеи катетеризации обычно не сложные тех пор, пока шовный материал прикреплен должным образом, первый прохождения шелковой нитью кзади от трахеи после рассечения окружающих панель и до катетеризации. Следуйте этому с передней разрез 1-2 кольца трахеи выше шва пройти канюли. Tie квадратных узлов в период между кольцами трахеи, чтобы обеспечить его в паз для большей безопасности (фиг.4С). Катетеризации легочной артерии (ПА) является более сложным по сравнению с трахеи канюли. Следующие шаги были использованы в этом исследованииДля этой процедуры. Во-первых, понять верхушки сердца с парой щипцов. Передайте еще пару щипцов в поперечный синус и продеть нить, чтобы закрепить канюлю в проксимальных ПА. Сразу Надрезать правый желудочек до правого желудочка путей оттока (RVOT) (рис 14а). После разрез в RVOT, канюли будет руководствоваться в сторону легких оттока артерии тракта. Наличие шва в положении позади легочной артерии / аорты перед правой ventriculotomy повышает эффективность (5С). Канюли должен быть закреплен в месте с шва, чтобы предотвратить смещение. Основным осложнением может произойти, если канюли ПА не находится в правильном анатомическом положении. Канюля может быть вставлен слишком далеко, и только заливать один филиал или стать неправильное позиционируется закручивания образца сердце-легкие после удаления из грудной полости. Это может быть легко ориентированных обратно в исходное положение, чтобы сохранить надлежащее угол anatomiкал положение. Наконец, в левом предсердии (ЛП) катетеризация является наиболее сложной частью процедуры. LA канюли должен быть помещен в левом предсердии. С тканями будучи чрезвычайно рыхлая, иметь в виду, чтобы не использовать значительную силу или скручивание, чтобы предотвратить разрыв в легочной вены и левое предсердие, которое позволило бы сделать эксперимент невозможно спасти. PA канюли лучше всего поместить перед канюли LA. Левый ventriculotomy с удалением вершины было показано, нарушить cordae tendinae и позволяют более легкий доступ через митральный листовок. Кроме того, ventriculotomy облегчает расширяются и визуализировать митрального клапана и кормить канюли через митрального клапана. Расширение митрального клапана кольца с парой небольших тупыми концами пикапов может быть сделано для того, чтобы визуализировать тракта в Лос-Анджелесе (рис 14В). Шов должен быть помещен позади сердца, прежде чем катетеризации. Это может быть сделано просто путем подъема сердце с использованием пара Smalл затупляли пикапы и размещение шва снизу и через сердце. LA теперь готов к канюлируют. Поток канюли LA через пикапов для того, чтобы должным образом визуализировать размещение канюли в левое предсердие. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не сместить канюли обратно в левый желудочек. Затем шов должен быть надежно закреплен вдоль миокарда левого желудочка. Закрепление нити в левое предсердие может закрывать всю или часть канюли.

Во время процедуры, очень важно, чтобы воздух не останется в разделе притока аппарата. Любое значительное воздух может производить воздушная эмболия увеличить PVR (эффективно "воздух-Lock"), которая приведет к гораздо более низкой перфузата потока для данного давления. Различные точки могут быть использованы для удаления воздуха в системе. Воздух в разделе выпускной ожидается и не должны иметь каких-либо вредное воздействие на легкие. Свиной модель для легочной гипертензии былПоказано, чтобы воссоздать патологию от непрерывных небольших количеств воздуха в течение 8-недельного периода. Увеличилась воздуха уменьшается количество перфузии настоящее время вызывая воспаление окружающих тканей 19.

Инициирование перфузии может возникнуть после того, как будет завершена катетеризации, но до того, как трубка идет от LA подключен к линии EVLP. Перфузат должны проходить через очистить сгустков крови, и это Перфузат может выбрасывать в стенке грудной клетки без каких-либо проблем. Переключение Перфузат насос в ручной режим и медленно увеличивая расход до ~ 2 мл / мин позволяет внимательно следить за давлением PA. Давление в течение 20-30 CMh 2 O может указывать на обструкцию и наблюдая за перфузат, выходящего из LA также индикатором, но это может быть очень трудно увидеть. Если давление не увеличивается до более чем 20-30 CMh 2 O, остановите насос и проверьте оба cannulations. После того, как давление постоянно вокруг 10-20 CMH 2 O позволяют йе Перфузат запустить через и в грудной полости в течение 2 мин. В это время линия из Лос-Анджелеса может быть подключен к цепи EVLP. Перфузат скорость насоса может быть увеличена до 5-10 мл / мин. Как глава жидкости проходит через цепи, будет увеличение давления PA-за увеличения высоты головки жидкости и, следовательно, статического давления. Если жидкость не может протекать через самую высокую точку на линии, это может быть необходимо, чтобы либо применить всасывающее усилие на противоположном конце линии или попытка снизить высокий часть линии. После того, как этот вопрос будет преодолен, Перфузат должны циркулировать без каких-либо проблем.

Несколько вопросов должны быть проверены по отношению к искусственной вентиляции легких. Во-первых, крутящий бронхов / трахеи и положение сердца и легких может возникнуть в легкие становятся более отечной и увеличение веса. Это важно для канюли оставаться в относительно тесной анатомическом положении, поэтому изменение одной или обеих канюлие может быть необходимым. Давление или объем контролируется вентиляторы, а также положительная или отрицательная вентиляция может быть использован с этой EVLP системы. Для модели крыс, мы нашли с помощью положительного давления, объема вытяжной вентиляции работает хорошо на приливных объемов между 4-10 мл / кг и при положительном давлении в конце выдоха (PEEP) между 2-8 CMh 2 O. Тем не менее, писк 8 CMh 2 O может привести к возможным разрыв в области бифуркации трахеи. После каждого эксперимента (или набор экспериментов, если выполняется спиной к спине), вентиляция линия, ведущая к трахее должен быть очищен от любой бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), которые могут путешествовали вплоть трахеи. Эта жидкость затвердеет, если остались нетронутыми, и может полностью блокировать вентиляционные линии.

Перфузат состав имеет решающее значение для успешного эксперимента EVLP. 5% декстран смесь позволяет легких перфузии, которая близка к физиологическим условиям, сохраняет стабильную онкотическое давление, чтобы управлять жидкости ВПодтверждено в сосудистую чтобы предотвратить отек и препятствует тромбообразованию в легочных сосудах. Важно отметить, что некоторые виды крыс может быть аллергия на декстран, которые могут вызвать отек легких 20. Содержание перфузат было одинаковым во всех экспериментальных группах в данном исследовании, поэтому декстран содержание не должно быть confounder. Онкотическое давление из важнейших факторов, который имеет потенциал для улучшения или производить отек тканей. Коммерчески доступные растворы перфузии, которые оптимизированы для холодной статического хранения или нормотермических перфузии были использованы в этой системе, чтобы увеличить время жизнеспособности легких. Заметим, что некоторые из этих решений содержит альбумин и один проблемой является возможность бычьего альбумина вызывая воспалительную реакцию в легких грызунов. Хотя оптимальным перфузат состав является постоянным предметом исследований, перфузат необходимо учитывать онкотического давления, осмотическое давление и буферную емкость. Wе рекомендуется раствор быть основана на модифицированной Кребса-раствора или клеточной культуральной среде. Онкотического давления должна поддерживаться декстрана или альбумина, в зависимости от применения. Скорость перфузионное давление и расход влияет органа и наднациональные физиологический параметры перфузии может сделать орган склонны к механической травмы.

Визуальные индикаторы В ходе эксперимента:

Есть много визуальные подсказки, а также указания по данным в режиме реального времени, которые могут быть использованы для определения, если эксперимент EVLP работает хорошо. Легких останется такой же размер и будет сдуваться в том же объеме после каждого вздоха. Там также не будет протекать от самого легкого. PVR, вес легких, и соблюдение будет оставаться относительно постоянной. Производство кислорода будет оставаться постоянным или незначительно увеличиться.

Есть много визуальные индикаторы, когда легких становится нарушена во время эксперимента. Легких становится отечной Ай быстро увеличивается в размере и весе. Цвет изменениями в легких (от тан-розового до белого) и карманы жидкости может быть идентифицирована в ткани. Если трахеи или легких разрывов от баротравмы или более живота, будут барботирования с точки травмы (фиг.12В). Производство кислорода будет уменьшаться, а PVR и соблюдение позволит значительно увеличить, а также.

Потенциал, используя EVLP модель на мелких животных, таких как грызуны открывает двери для будущих исследований, улучшающих лечение трансплантации легких. Тем не менее, маленькая модель животного требует лучшего понимания по-настоящему подражать трансплантацию легких. Эта модель может быть использована в будущем для улучшения медицинского лечения и определить базовые параметры для будущих исследований трансплантации легких.

Disclosures

Ни один

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить за помощь Гарвардского аппарата, особенно Стефани Pazniokas, MS (Физиология системы и регенеративной медицины) за их помощь в цепи сборки, модификации и поиска неисправностей в цепи перфузии и XVIVO перфузии (Daniel Мартинелли, КПК, CTP) для обеспечивая не-клиническое применение легких плегией.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPL-2 Basic Lung Perfusion System Harvard Apparatus
Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm Kent Scientific Corporation IND500232
Tweezer #5 Dumostar, 11 cm Kent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved Kent Scientific Corporation INS600187
McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14124
Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14003
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" Kent Scientific Corporation INS800101
Heparin 30,000 units per 30 ml APP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Ketamine 500 mg per 5 ml JHP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Xylazine 100 mg per 1 ml Akorn Supplied from OSU Pharmacy
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle B-D 309301
Hyflex NBR Ansell S-17310M Bite proof gloves
BL1500 Sartarius Practum 1102-1S Scale
Large Flat Bottom Restrainer Braintree Scientific Inc FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat  Rat tunnel for injection
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large Kiberly-Clark 50708
Rapidpoint 405 Siemens blood gas analyzer
Fiberoxygenator D150 Hugo Sachs Elektronik PY2 73-3762
LabChart v7.3.7 ADInstruments
Tracheal cannula Harvard Apparatus 733557
Pulmonary Artery cannula Harvard Apparatus 730710
Left Atrium cannula Harvard Apparatus 730712
Peristaltic Pump  Ismatec ISM 827B
Small Animal Ventilator model 683 Harvard Apparatus 55-000
Ecoline Star Edition 003, E100 Lauda LCK 1879 Water Heater
Tubing Cassette Cole-Parmer IS 0649
Connect kit D150 Cole-Parmer VK 73-3763
PowerLab 8/35 ADInstruments 730045
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-1793
SCP Servo controller for perfusion type 704 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 732806
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731747
VCM ventilator control module type 681 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731741
TCM time control module type 686 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731750
IL2 Tube set for perfusate Harvard Apparatus 733842
Tube set for moist chamber Harvard Apparatus 73V83157
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID Harvard Apparatus 721017 perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID Harvard Apparatus 721019 perfusate line leaving lung
low potassium dextran glucose solution flushing the lung

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. Available from: http://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2011 (2011).
  2. Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
  3. Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
  4. DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
  5. Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
  6. Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
  7. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
  8. Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
  9. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
  10. Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
  11. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
  12. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
  13. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
  14. Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
  15. Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs - The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
  16. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
  17. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
  18. Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
  19. Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
  20. Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics