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Summary

Ex-vivo-Lung Perfusion (EVLP) konnten Lungentransplantation beim Menschen leichter, indem du die Fähigkeit, Organe zu bewerten und zu erweitern den Spenderkreis zur Verfügung stehen. Hier beschreiben wir die Entwicklung einer Ratte EVLP Programm und Verfeinerungen, die für ein reproduzierbares Modell für zukünftige Erweiterungen zu ermöglichen.

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Nelson, K., Bobba, C., Eren, E., Spata, T., Tadres, M., Hayes, Jr., D., Black, S. M., Ghadiali, S., Whitson, B. A. Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program. J. Vis. Exp. (96), e52309, doi:10.3791/52309 (2015).

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Abstract

Die Anzahl der zulässigen Spenderlungen für Lungentransplantation verfügbar ist stark eingeschränkt aufgrund der schlechten Qualität. Ex-vivo-Lung Perfusion (EVLP) konnten Lungentransplantation beim Menschen leichter, indem du die Fähigkeit, Organe zu bewerten und zu erweitern den Spenderkreis zur Verfügung stehen. Da diese Technologie erweitert und verbessert, die Fähigkeit, potentiell Bewertung und Verbesserung der Qualität von minderwertigen Lungen vor der Transplantation eine kritische Notwendigkeit. Um strenger zu bewerten diese Ansätze, muss eine reproduzierbare Tiermodell festgelegt werden, die für die Prüfung von verbesserten Techniken und Verwaltung der gespendeten Lunge sowie auf die Lungentransplantatempfänger ermöglichen würde. Zusätzlich ist ein EVLP Tiermodell zugeordnet Pathologien, beispielsweise Lüftungs induzierten Lungenverletzung (VILI), würde ein neues Verfahren zur Behandlung dieser Krankheiten bewerten zu können. Hier beschreiben wir die Entwicklung einer Ratte EVLP Lungen Programm und Verfeinerungen dieser michthode, die für ein reproduzierbares Modell für zukünftige Erweiterungen zu ermöglichen. Wir beschreiben auch die Anwendung dieser EVLP System VILI in Rattenlungen modellieren. Ziel ist es, die Forschungsgemeinschaft mit den wichtigsten Informationen und "Weisheiten" / Techniken, die von Versuch und Irrtum entstanden und sind entscheidend für die Gründung einer EVLP System, das robust und reproduzierbar ist.

Introduction

Klinische Relevanz

Derzeit gibt es einen Mangel an geeigneten Lungen für die Transplantation zur Verfügung mit nur 19% der Lunge in der Lage, auf nationaler Ebene genutzt werden, was zu langwierigen Warteliste Zeit oder Patienten sterben auf eine Transplantation warten 1. Der Mangel kann aufgrund von älteren Spendern, Trauma, Infektion, Multiorganversagen und manchmal verletzt Spenderlungen auf Ernte 2 sein. Darüber hinaus ist die Lunge ein zartes Organ außerhalb der Brusthöhle und Standard-Transport und Konservierungstechniken können zu einer Verschlechterung und nicht lebensfähigen Lungen führen. Daher sind die Beibehaltung und Verbesserung der Lungen Rentabilität ex vivo hat vor kurzem ein wichtiger Schwerpunkt in der Lungentransplantationsmedizin zu werden.

Ex-vivo-Lung Perfusion (EVLP)

Ex-vivo-Lungendurchblutung (EVLP) hat sich weiterentwickelt, kontinuierlich durchströmen Organe, die zur Transplantation untersucht und ermöglicht eine Veranlagungszeitraum, der alleows für das Potenzial der Lungen-Wiederbelebung oder Instandsetzung. EVLP können insgesamt aus dem Körperorgan ischämischen Zeit zu verlängern und damit die Spenderorgane zur weiteren Distanzen 3 fahren. Typischerweise werden die Lungen in 50% der Gesamtlungenkapazität oder 20 cmH 2 O von Beatmungsdruck mit einem Anteil von eingeatmetem Sauerstoff (FiO 2) von 30% bis 50% 4 belüftet. Konservierungslösung wird bei 40-60 ml / kg (etwa 40% des vorhergesagten Herzleistung von 100 ml / kg) bei Menschen und Großtieren 5,6 perfundiert, aber bei etwa 20% der Herzleistung bei Ratten 7 perfundiert. Die Einbeziehung der STEEN Lösung konnten menschliche Lunge in RT-Umgebungen ohne Entwicklung eines Lungenödems 9 reisen. Diese Pionierarbeit wurde von der University of Toronto Lung Trans Programm 10-13 verfeinert worden und wird für eine verbesserte Beurteilung der Randspenderlungen zur Transplantation 14,15 ausgewertet. Allerdings ist die optimale die Lüftungn und Perfusionsbedingungen auf marginale und / oder Sub-Standard-Lungen für die Transplantation zu regenerieren benötigt, ist nicht bekannt und wird derzeit ein aktives Forschungsgebiet.

Isolierte Lungendurchblutung Systeme bei Kleintieren verwendet worden, um dazu führen, Lungenschädigung, erstellen Erkrankungen der Atemwege und Perfusion der Lunge mit verschiedenen Lösungen, um ischämischen Schäden zu vermeiden. Forscher haben eine Kleintiermodell der Lungentransplantation unter Verwendung der isolierten Lunge Perfusionssystem die EVLP Protokolle, bei Menschen und größeren Tieren 16-18 verwendet werden könnte nachahmen erstellt. Jedoch hat dieses Versuchsmodell viele Herausforderungen in Bezug auf die verschiedenen Techniken und Parameter verwendet, um menschliche Physiologie zu imitieren. Insbesondere gibt es viele Feinheiten bei der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Lunge während EVLP. Diese Feinheiten können aufgrund von Unterschieden in der Erntetechnik, Druckbeatmung Einstellungen Perfusat Zusammensetzung und Strömungsverhältnisse und Kanülierung der Lunge auftreten. Therevor, das Ziel ist hier, um die Forschungsgemeinschaft mit einer Reihe von Problemlösungen und Umsetzungstipps, die wir zu einer robusten Verfahren zur Implementierung EVLP in einem Nagetiermodell gefunden werden.

Protocol

HINWEIS: Alle Verfahren wurden nach den Führungslinien der Institutional Animal Care und des National Research Council Handbuch für das Humane Pflege und Verwendung von Labortieren (IACUC) durchgeführt und hat die Zulassung von der Ohio State University IACUC Ausschuss unterzogen.

1. Initial Setup

  1. Die EVLP Kreis gesetzt und sind in warmen (37 ° C) Perfusat zirkuliert durch das System vor der Einbeziehung der Ex-gepflanzt Lunge (Abbildung 1).
  2. Stellen Sie die warmen Wasserbad, um Jacke das Perfusat Behälter, Wärmetauscher und künstliche Brustkorb verwendet wird, auf 37 ° C und zirkulierenden (Abbildung 1).
  3. Führen einer de-Oxygenierung Lösung (zB 6% O 2, 8% CO 2, 84% N 2) im Gegenstrom durch die Perfusat im Gasfilter, um sicherzustellen das Perfusat besitzt ~ 6% gelöstem Sauerstoff für das Experiment.
    HINWEIS: Diese de-sauerstoffhaltigen Perfusat ermöglicht die Bewertung of der Lungenfunktion durch Messung des in dem Perfusat, post-Organ eingeführt Sauerstoff.
  4. Öffnen Sie das Datenerfassungsprogramm und schließen Sie den Lungenarteriendrucks Wandler, Luftröhrendifferenzdruck-Messumformer, Atemfluss Differenzdruck-Messumformer, Lungengewicht Wandler und Pumpendrehgeber auf die EVLP Kreis und dem Konverter-Box Datenerfassung / Analog-zu-Digital ( Abbildung 2).
  5. Richten Sie die OP-Tisch und Bedienwerkzeuge an der EVLP Kreis (Abbildung 3).
  6. Richten Sie einen kleinen Behälter mit flüssigem Stickstoff in der Nähe des EVLP Schaltung, wenn die Proben erhalten wird.
    HINWEIS: Der Autor System wurde geändert, um vor der Orgel und Post-Orgel Perfusat ohne Unterbrechung der Druckströmungsdynamik, die potenziell schaden kann die Lunge zu sammeln.

2. Herstellung von Anästhetika und Heparin, Betäubung der Ratte

  1. Setzen Sie auf die folgende persönliche Schutzausrüstung(PSA) vor dem Umgang mit Ratten und Rattengewebe: Mundschutz, OP-Handschuhen, und Einweg-Kleid.
  2. Wiegen Sie die Ratte und das Gewicht aufgezeichnet.
  3. Bereiten 1.200 U / kg Heparin.
  4. Bereiten Sie sowohl 60 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin in einer Spritze, die Vorbereitung der ersten Ketamin.
  5. Intraperitoneale Injektion der Mischung von Ketamin und Xylazin in der Ratte und lassen Sie 5 Minuten für die Ratte bewusstlos zu werden.
  6. Überprüfen Sie die Betäubung durch Überprüfung toe Prise Reflex. Wenn die Ratte hat seine Zehen nicht zurückziehen, wird es nicht Schmerz empfinden.
  7. Bewegen Ratte auf OP-Tisch, sichern in Rückenlage, und sprühen Sie mit Alkohol zur Sterilisation.

3. Extraktion und Initial Ventilation der Rattenlungen

  1. Bereiten 4-20 cm langen Seidenfäden (3-0 oder 4-0 sollten reichen).
  2. Starten Sie die Aufnahme-Daten mit Hilfe der Datenerfassungsprogramm.
  3. Überprüfen Sie für eine angemessene Narkosetiefe, mit chirurgische Scheren geben Bauch cavität durch eine Mittellinie Laparotomie und injizieren Heparin in der unteren Hohlvene.
  4. Tragen Sie die Inzision kranial an der Hammergriff in den Hals, bis die Luftröhre ausgesetzt ist. Sie zerbrechen nicht die Brusthöhle (4A).
  5. Sezieren hinter der Luftröhre in der Mittellinie, und schieben Sie einen Seidenfaden hinter der Luftröhre (4B).
  6. Heben Sie den vorderen Abschnitt der Luftröhre und einen Querschnitt zwischen den Knorpelringe, ganz oben auf der Luftröhre. Nicht durch die hintere häutige Teil der Luftröhre an dieser Stelle (4C) geschnitten.
  7. Kanülieren die Luftröhre mit der Trachealkanüle und sicher mit dem Seidenfaden (4D). Sicherzustellen, daß die Naht Ligatur in der Kerb befestigt Migration der Kanüle zu verringern.
  8. Schließen Sie die Trachealkanüle mit dem Ventilationskreislauf.
  9. Schalten Sie das Beatmungsgerät mechanisch starten Belüftung des lungs.
    HINWEIS: Die Anfangseinstellungen gewählt wurden, um ein Atemvolumen von 4 ml / kg und positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 2 sein cm H 2 O Diese Einstellungen sind die Anfangseinstellungen und je nach den Versuchsbedingungen angepasst, wenn die Orgel ist in der ex vivo Perfusion werden.
  10. Geben Sie die Brusthöhle durch das Brustbein / Xyphoid und kranial in Richtung der Jugulum. Achten Sie darauf, nicht an der Lunge.
    HINWEIS: Da die Rattenlunge ist zerbrechlich, kann jeder unbeabsichtigte Manipulation, um Trauma und Lungenödem (5A) zu führen.
  11. Mit 2 Wundhaken, schieben Sie der Brusthöhle, richtig setzen die Anatomie (5A). Einmal mehr kümmern und nicht an der Lunge.
  12. Entfernen Sie den Thymus mit leichter Höhe und stumpf.
  13. Verschieben Sie die Bauch-Inhalte zu einer Seite, entweder die untere Hohlvene (IVC) oder die mesenterica (MV) aus.
  14. Inzision entweder der IVC oder die MV, um die Ratte exsanguinate und bietet Sterbehilfe.
  15. Platzieren einer Seidennaht posterior der Pulmonalarterie und der Aorta in Vorbereitung zur Befestigung des Lungenarterienkanüle (5B).
  16. Machen Sie eine 2-3 mm Schnitt an der Vorderfläche des rechten Ausflusstrakt und legen Sie die Kanüle in den Einschnitt und in die Hauptlungenarterie und mit dem Seidenfaden (5C).
  17. Durchschneiden den Apex des Herzens, um den Zugang zum linken Ventrikel zu ermöglichen und zu spülen keine Gerinnsel innerhalb des Lungengefäßsystems durch Fließen ~ 15 ml eines niedrigen K + Elektrolytlösung durch die Lungenarterie und durch die Spitze des Herzens in die Brusthöhle ( 5D).
  18. Schließen Sie die Lungenarterie (PA) Kanüle in die EVLP Kreis. Sicherstellen, dass die Zulaufleitung, die von der Schaltung an die PA Kanüle mit Perfusat, um die Luft in das Herz und die Lungen zu vermeiden.
  19. Schalten Sie dieHauptschlauchpumpe und stellen Sie sie auf einem niedrigen (~ 2 ml / min) zu beschleunigen, damit Perfusat durch die Lungenarterie und aus der linken Herzkammer in die Brusthöhle führen. ** ** entscheidender Schritt sicher, dass die PA Druck nicht Spike als dies ist ein Zeichen entweder eine Blockade oder schlechte Kanülierung (Abbildung 6).
  20. Schalten Sie die Schlauchpumpe.
  21. Positionieren einer Seidennaht hinter dem Herzen, um die Ventrikel (Abbildung 7).
  22. Beginnt der Prozess der Kanülieren den linken Vorhof, indem Sie einen kleinen Paar chirurgische Pinzette in die Spitze, durch die Mitralklappe und in den linken Vorhof.
    Hinweis: das wird die Mitralklappe erweitern und erleichtern die Kanülen. Aggressive Dilatation oder zu tief Dilatation kann versehentlich zerfleischen das linke Atrium Rendern der Beschaffung unwirksam.
  23. Entfernen Sie die Zange aus dem Herzen.
  24. Setzen Sie den linken Vorhof Kanüle in der Spitze durch die Mitralklappe und in am linkenrium.
  25. Befestigen Sie den linken Vorhof Kanüle mit dem Seidenfaden hinter dem Herzen (Abbildung 8).
    HINWEIS: Diese Naht kann "pre-gebunden" sein, Kanülen zu erleichtern.
  26. Schließen Sie die Lungenarterie Kanüle auf die Ex-vivo-Lungendurchblutung Kreis (9A). Den linken Vorhof Kanüle zur EVLP Schaltung an, solange das Herz-Lungen-Blocks vollständig aus dem Körper entfernt.
  27. Klemmen Sie die Speiseröhre mit einer Gefäßklemme und unterhalb der Klemme geschnitten (zwischen Klemme und Membran), so dass der Speiseröhre kann die Herz-Lungen-Strukturen kopfwärts zu erhöhen.
  28. Stumpf sezieren das umliegende Gewebe und schneiden Sie den absteigenden Aorta und Hilfsschiffe, um die Herz-Lungen-Block zu befreien, wie es werden wird über die Speiseröhre (9B) angehoben.
  29. Durchschneiden die Luftröhre in die Trachealkanüle, um völlig frei die Herz-Lungen-Block kranial.
  30. Entfernen Sie die Herz-Lungen-Block und setzen in der DesiDesignated Standort auf dem EVLP Kreis (9C).
  31. Schließen Sie den linken Vorhof Kanüle in die Ablaufleitung und starten Sie die Hauptschlauchpumpe (9D).

4. Ex Vivo Perfusion der Lungen

  1. Schnelles Entfernen der Entlüftungsleitung von der Spitze des EVLP Gerät und befestigen Sie das Gehäuse mit den Drucksensoren, und legen Sie die Entlüftungsleitung auf der Oberseite des Gehäuses an der Oberseite des EVLP Gerät.
    ANMERKUNG: Dies ermöglicht die Belüftungs aufzuzeichnenden Daten und dem Druck überwacht.
  2. Sicherstellen, dass die Blasenfalle mit einer ausreichenden Menge an Spülflüssigkeit gefüllt ist, so dass keine Luftblasen (dh Luftembolien) an die Lungen eingeführt wird.
  3. Ventilation und Perfusion Einstellungen zu wünschen experimentellen Ebenen langsam ändern während der ersten 15 Minuten. Zusätzlich wird während dieser anfänglichen Anlaufphase, erhöhen die Perfusionsflussrate zur gewünschten Geschwindigkeit und / oder Druck.
    HINWEIS: Programming des Beatmungsgerätes an intermittierenden Seufzer Atemzügen, die eine Bewegung der Flüssigkeit aus dem Lungenraum erleichtern zu können und somit das Einsetzen der Ödeme, wird empfohlen. Diese können durch Ventilatoren mit dem Seufzer Funktion ausgestattet hergestellt werden.
  4. Definieren Sie "Time 0" als die Zeit, als Beatmungsparameter sind in einem Atemvolumen von 4 ml / kg, PEEP bei 2 cm H 2 O und Perfusion Parameter auf die erwartete Niveau und konstant bleibt.
  5. Bei Bedarf nehmen Perfusat Proben aus der Probenöffnung, Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff, und notieren Sie die Zeit der Proben.
  6. Wenn das Experiment beendet ist, zu isolieren, die notwendigen anatomischen Stücke für die Sammlung und entweder Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder in Fixier-Lösung für weitere Studien.

Representative Results

Die durch das Datenerfassungsprogramm gesammelten Echtzeit mechanischen Daten können leicht analysiert werden, um eine beliebige Anzahl von Hypothesen zu testen. Zum Beispiel zeigt Abb 10A zeigt die durchschnittliche Lungengewicht über 60 min von 10 Ratten-Experimenten, bei denen Tiere mit niedrigem Atemvolumen / low PEEP von 4 ml / kg und 2 cmH 2 O. belüfteten Zwar gibt es eine sehr geringe Zunahme der Lungengewicht während des Experiments ist dieser Anstieg nicht signifikant (ANOVA, p = 0,92). 10B zeigt die mittlere pulmonale arterielle Druck (PAP) über 60 min von 12 Rattenexperimenten. Die untere PAP in der 0 Minuten-Zeitpunkt ist ein Ergebnis der niedrigeren Strömungs und Beatmungseinstellungen zu Beginn allen Experimenten und dem PAP verwendet wird, bleibt nach diesem Zeitpunkt keine statistisch signifikanten Veränderungen konstant nach t = 10 min (ANOVA an Reihen, p = 0,89). 10C zeigt den pulmonalen Gefässwiderstands (PVR) über 60 min von 12 RattenExperimente und obwohl es eine geringe Abnahme der PVR nach t = 20 min, gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied in der PVR während dieses Experiments (ANOVA für die Ränge, p = 0,65). Im Vergleich zu den hier gezeigten PVR Daten, Noda et al. hat den PVR zu Zeit leicht 4 Stunden erhöhen gezeigt. Jedoch jene Autoren berichten Daten PVR beginnend bei 1 h anstelle der zu Beginn des Experiments und keine Standardabweichungswerte bereitgestellt 7. Noda et al. auch nicht Lungenödem Daten für die 4 h Experimente so kann kein Vergleich mit den hier in 10A dargestellten Daten werden zeigen. Wesentliche Unterschiede in Noda et al. Verfahren im Vergleich zu dem, was in dieser Arbeit gezeigt: a 1 Stunde Kaltkonservierung in LPS-Lösung vor EVLP wurden Ratten zunächst mit einem Gasgemisch mit Isofluran sie bewusstlos zu machen belüftet wurde das Perfusat Lösung mit 50 mg und 50 mg Methylprednisolon ergänzt von Cephalosporin, insgesamt flow wurde definiert als 20% der berechneten Herzleistung, Perfusat wurden Proben entnommen, nachdem der Lunge war auf 100% O 2 5 Minuten vor belüftet wurde, und das Experiment wurde 4 Stunden ausgeführt.

Proben, die während des Versuchs aus dem Perfusat genommen auch für viele Zwecke analysiert werden. Als ein Beispiel in Abbildung 11 zeigen wir, wie hohen Atemzugvolumina / high PEEP Belüftung kann eine pro-entzündliche Reaktion in 60 min zu induzieren. Für diese Experimente das Perfusat aus 4 Ratten unter schädlichen Bedingungen, dh hohe Atemvolumen von 10 ml / kg und hoher PEEP von 8 cm H 2 O belüftet, wurden pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen IL1β, TNF und IL-4 unter Verwendung von Standard analysiert ELISA-Techniken. Wie in 11 gezeigt, im Vergleich zu Cytokin-Spiegeln vor Belüftung (0 min), 60 min schädigendes Belüftung zu einer statistisch signifikanten Erhöhung der IL-1β und TNF (proinflammatorische Zytokine) a nd keine Änderung in IL-4 (ein anti-inflammatorisches Cytokin) Konzentration. Daher ist dieses System in der Lage EVLP Lungenverletzung Profile üblicherweise während der mechanischen Beatmung beobachtet erzeugen.

Figur 1
Abbildung 1: Diagramm und Fotografie der kleinen Tier ex vivo Lungendurchblutung (EVLP) Schaltung. Briefe in der Abbildung übereinstimmen mit Buchstaben auf dem Foto. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Alle Wandler sind sicher an den Schaltkästen verbunden."> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Die Ratte Operationstisch fest bis neben dem ex vivo Lungendurchblutung (EVLP) Kreis eingestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4 (A) wird ein Einschnitt kranial, um die Luftröhre aus. Die Brusthöhle wird nicht belichtet. (B) Ein Seidenfaden ist hinter der Luftröhre. (C) Die Luftröhre ist teilweise geschnitten, um zur Kanülierung vorzubereiten. (D) Die Luftröhre Kanüle in positio platziert n und mit einem Seidenfaden befestigt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5
Figur 5 (A) Die Brusthöhle zurückgezogen wird, um Zugang zum Herzen und der Lunge ermöglichen. (B) Herstellung Platzieren Naht hinter der Lungenarterie. (C) Das Lungenarterie wird eine Kanüle eingeführt und mit dem zuvor platzierten Seidenfaden gebunden. (D) Eine niedrige K + Elektrolytlösung durch die Lungenarterie und aus dem linken Vorhof gespült, um irgendwelche Blutgerinnsel zu entfernen. Klicken Sie bitte hier ein, um zu vergrößern Version dieser Figur.

mmer "> Figur 6
Abbildung 6. Erhöhung der pulmonalen arteriellen Strömung beim Spülen der Lunge kann die pulmonale arterielle Druck drastisch zu erhöhen verursachen. Wenn Kanülierung korrekt durchgeführt wurde und es gibt keine großen Blockade, sollte der Druck zu verringern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen .

7
Abbildung 7 Silk Faden wird um die gesamte Herz in der Vorbereitung für den linken Vorhof Kanülen gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 8. Die linke Vorhof Kanüle an Ort und Stelle mit einem Seidenfaden befestigt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

9
Abbildung 9. (A) Die Lungenarterie Kanüle auf die Ex-vivo-Lungendurchblutung Schaltung verbunden. (B) Die Speiseröhre eingeklemmt und das Bindegewebe stumpf präpariert, um die Herz-Lungen-Blocks zu entfernen. (C) Das Herz-Lungen-Block wird aus der Brusthöhle entfernt und in den ex-vivo Lungendurchblutung Stromkreis angeschlossen. (D) Der linke Vorhof ist mit der Ex-vivo Lungendurchblutung Schaltung verbunden. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

10
Figur 10 (A) Lungengewicht von männlichen Sprague Dawley-Ratten durch 60 min von ex vivo Lungenperfusion (n = 10). (B) Die pulmonale arterielle Druck von männlichen Sprague Dawley-Ratten durch 60 min von ex vivo Lungenperfusion (n = 12). (C) des pulmonalen Gefässwiderstands von männlichen Sprague Dawley Ratten über 60 min von ex vivo Lungendurchblutung (n = 12), NS gibt keinen statistisch signifikanten Unterschied. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 11. Wirkung von 1 Stunde Belüftung bei hohen Atemzugvolumina (10 ml / kg) und eine hohe PEEP (8 cmH 2 O) auf pro- und anti-inflammatorischen Cytokin-Konzentrationen im Perfusat. N = 4, * zeigt statistisch signifikanter Unterschied in Bezug auf 0 h Probe (p <0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

12
Figur 12 (A) Eine korrekt Lüftungs- und Perfundieren Lunge zur EVLP Schaltung verbunden. (B) Hohe positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) verursacht einen Riss an der Luftröhre Bifurkation verursacht Blasen an der Verletzung bilden und füllen Sie den künstlichen Brustkorb. es / ftp_upload / 52.309 / 52309fig12large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

13
Abbildung 13 (A) Lungenarterienkanüle. Diese Kanüle kleiner ist als der linke Vorhof Kanüle. (B) Linker Vorhof Kanüle. Diese Kanüle ist viel größer als der Pulmonalarterie Kanüle. (C) Trachealkanüle. Diese Kanüle Rippen aufweist, um das Sichern der Luftröhre mit Seidennahtmaterial zu unterstützen. Das Ende, das in die Luftröhre eingeführt wird, ebenfalls leicht zugespitzt, um beim Einführen der Kanüle in die Luftröhre zu unterstützen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 14 (A) Die Herzspitze wird von einer Pinzette als die rechte Herzkammer ist dabei, um die Lungenarterie kanülieren eingeschnitten werden gehalten. (B) Dilatation des Mitralklappenanulus mit einem Paar von kleinen stumpfen Enden Pick-ups macht es einfacher, die Darm-Trakt in den linken Vorhof sichtbar zu machen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

SYSTEMÜBERWACHUNG

Welche Dinge aussehen, wenn Experiment läuft gut:

Nachdem die Kanüle in der Schaltung gelegt, und die Lungen werden Belüften, gibt es mehrere Möglichkeiten, um sicherzustellen, das System einwandfrei arbeitet. Es darf keine Lecks an Perfusat in der gesamten Linie. Die pulmonalen Gefässwiderstands (PVR) sollte relativ konstant bleiben (unter der Annahme eines konstanten Fluss). Der Sauerstoffaustausch erhöhen sollte, wenn das Beatmungsgerät ordnungsgemäß funktioniert und die Erweiterung der Lungenbläschen, mehr für den Gasaustausch zu rekrutieren. 12A zeigt, gut belüftet und durchströmt die Lungen an die EVLP Schluss innerhalb des künstlichen Brustkorb verbunden.

Welche Dinge aussehen, wenn Experiment nicht gut läuft:

Es gibt ein paar gemeinsame Themen, die die höchste Rate des Auftretens während der Anfangsphase eines EVLP Experiment hatten. Die erste und einfachste to Mittel ist ein Leck in der Leitung, das aus der Lunge. Dies ist unter einem Teil der Schaltung und das Niveau im Vorratsbehälter kontinuierlich ab durch einen Pool von Perfusat Pooling bemerkbar. Überprüfen und ziehen Sie alle Schlauchanschlüsse auf der Austrittsbereich entfernen und überprüfen Sie den Schlauch selbst für ein Leck. Wenn dieses Leck vor der Lunge auftritt, kann es auch Blasen einzuführen in die Lunge. Dies sollte so schnell wie möglich beseitigt werden, wie Luftblasen in der Spülflüssigkeit wird in Gewebeschäden führen und bewirken eine signifikante Erhöhung der PVR. Es kann auch ein Leck aus der Lunge oder eine der Kanülen ist. Dies kann entweder durch ein Rutschen einer Kanüle oder eines Hindernisses in dem austretenden Leitungs verursacht einen Druckaufbau verursacht werden. Überprüfen Sie die Position für die beiden Kanülen, um sicherzustellen, weder verrutscht oder verdreht werden. Das PA Druck auch während dieses Prozesses zu überwachen, da ein momentaner Anstieg der PA-Druck ist ein deutliches Zeichen, dass ein Hindernis von einer Art ist vor kurzem stattgefunden hat. 12Bzeigt einen gerissenen Lunge, die durch hohe Drücke gebrochen. Ein Leck von der Lunge selbst kann auch durch einen Riss in dem Gewebe verursacht wird. Dieses Problem kann oder auch nicht, aber reparabel Neupositionierung und Nachziehen der Kanülen ist die beste Option in diesem Szenario.

Key Learning Punkte / Chancen:

Versuch und Irrtum Entwicklung der Ex-vivo Lungendurchblutung System hat uns erlaubt, mehrere wichtige Themen, die wir beschreiben hier, um eine effiziente Umsetzung des Systems zu erleichtern EVLP identifizieren. Erstens, in Bezug auf Beschaffung, ist es wichtig, dass Standard-Anästhesieverfahren eingehalten werden, um die Tiere (genug Betäubung Injektion in die Bauchhöhle) und die Einhaltung aller IACUC Politik erforderlich ist richtig betäuben. Die (in Figur 13 A, B und C gezeigt) Kanülen sollten wiederholt, um jegliche Gerinnsel und / oder Schmutz innerhalb der Lungen vasculat entfernen gespülture. In Bezug auf die Tierauswahl, empfehlen wir die Verwendung von Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht oder Lewis 250-350 g. Besondere Vorsicht ist geboten, wenn Kanülieren Ratten mit einem Gewicht in der Nähe von 250 g, da die Schiffe werden kleiner und daher viel schwieriger sein, ohne Verletzung der Gefäß kanülieren genommen werden. Wenn kleinere Ratten oder Mausmodell verwendet werden soll, müssen kleinere Kanüle verwendet werden soll.

Tracheale Kanüleneinführung üblicherweise nicht anspruchs solange die Naht korrekt, indem zuerst eine Seidennaht posterior zur Trachea nach Sezieren der umgebenden Faszie und vor Kanülierung gesichert. Folgen Sie dieser mit einem Anteriorinzision 1-2 Trachealringe über der Naht, die Kanüle übergeben. Binden Sie Quadrat Knoten zwischen den Trachealringe, um sie in eine Nut für eine höhere Sicherheit (4C) zu sichern. Kanülierung der Lungenarterie (PA) ist schwieriger verglichen mit der Trachealkanüle. Die folgenden Schritte wurden in dieser Studie verwendetfür dieses Verfahren. Zunächst erfassen die Herzspitze mit einer Pinzette. Übergeben Sie einen anderen Pinzette in Quer Sinus und Faden eine Naht, die Kanüle in der proximalen PA sichern. Inzision der rechten Herzkammer unmittelbar vor der rechten Ausflusstrakt (RVOT) (14A). Nach der Inzision in die RVOT wird die Kanüle in Richtung der Pulmonalarterie Ausflusstrakt geführt werden. Mit der Naht in Position hinter der Lungenarterie / Aorta, bevor der rechten Ventrikulotomie erhöht die Effizienz (5C). Die Kanüle sollte mit dem Nahtmaterial an Ort und Stelle befestigt werden, um Verrutschen verhindern. Eine wichtige Komplikation kann auftreten, wenn die PA-Kanüle nicht in der korrekten anatomischen Ausrichtung. Die Kanüle kann zu weit eingeführt werden, und nur ein Zweig durchströmen oder zu Fehl positioniert mit Verdrehen der Herz-Lungen-Probe bei der Entnahme aus der Brusthöhle. Dies kann leicht wieder in die Ausgangsposition, um den richtigen Winkel der anatomi bewahren orientierencal Position. Schließlich ist Left Atrial (LA) Kanülierung der schwierigste Teil des Verfahrens. Die LA Kanüle muss innerhalb des linken Vorhofs platziert werden. Mit die Gewebe extrem brüchig, darauf achten, nicht um einen Riss in der Pulmonalvene und linken Vorhof, die dann das Experiment unsalvageable würde verhindern, verwenden bedeutende Kraft oder Verdrehen. Die PA Kanüle besten vor dem LA Kanüle gelegt. Eine linke Ventrikulotomie unter Entfernung des Scheitels ist gezeigt worden, um die cordae tendinae stören und erlauben einen leichteren Zugang durch die Mitralsegel. Auch macht die Ventrikulotomie leichter zu erweitern und zu visualisieren, die Mitralklappe und die Kanüle durch die Mitralklappe zuzuführen. Dilatation des Mitralklappenanulus mit einem Paar kleiner stumpfendig Aufnehmer kann, um den Trakt in den LA (14B) sichtbar gemacht werden. Naht sollten hinter dem Herzen vor Kanülierung platziert werden. Dies kann einfach durch Anheben des Herzens unter Verwendung eines Paares von k durchgeführt werdenl stumpfen Enden Pick-ups und Platzierung der Naht unter und über dem Herzen. Die LA ist nun bereit, eine Kanüle eingeführt werden. Feed the LA Kanüle durch die Pick-ups, um die Platzierung der Kanüle in den linken Vorhof richtig zu visualisieren. Achten Sie besonders darauf, die Kanüle in die linke Herzkammer zu entfernen. Die Naht sollte dann dicht entlang dem Myokard der linken Herzkammer befestigt werden. Befestigen des Nahtmaterials an das linke Atrium kann der gesamte oder ein Teil der Kanüle zu verschließen.

Während des Verfahrens ist es wichtig, dass keine Luft in den Zulaufteil der Vorrichtung verbleiben. Jede wesentliche Luft erzeugen eine Luftembolie erhöhen die PVR (effektiv eine "Schleuse"), die in einem viel niedrigeren Perfusat Strom für einen gegebenen Druck führt. Verschiedene Punkte können verwendet werden, um Luft in dem System zu entfernen. Die Luft in dem Abflußbereich erwartet wird, und sollte keine nachteilige Wirkung auf die Lungen nicht. Ein Schweinemodell für die pulmonale Hypertonie istgezeigt, dass die Pathologie von kontinuierlichen kleine Mengen Luft über eine Dauer von 8 Wochen neu. Die erhöhte Luft verringert die Menge des vorhandenen Durchblutung während der Entstehung von Entzündungen des umgebenden Gewebes 19.

Die Initiierung der Perfusion auftreten können, sobald die Kanülierung abgeschlossen ist, aber bevor das Rohr aus dem LA kommen an den EVLP Leitung verbunden. Perfusat sollte durchlaufen zu räumen irgendwelche Blutgerinnseln und dies Perfusat kann ohne Probleme in die Brustwand zu leeren. Umschalten des Perfusat Pumpe in den Handbetrieb und die Durchflussmenge zu ~ 2 ml langsam ansteigenden / min ermöglicht eine genaue Überwachung des PA-Druck. Drücken über 20 bis 30 cm H 2 O kann ein Hindernis anzuzeigen, und gerade für Perfusat Verlassen des LA ist auch ein Indikator, aber dies kann sehr schwer zu sehen sein. Wenn der Druck nicht mehr als 20 bis 30 cm H 2 O zu erhöhen, stoppen Sie die Pumpe und überprüfen Sie beide Punktionen. Sobald der Druck konstant etwa 10-20 cm H 2 O erlauben the Perfusat durch und in die Brusthöhle für 2 Minuten ausgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Zeile aus dem LA können zur EVLP Schaltung angeschlossen werden. Das Perfusat Pumpendrehzahl kann auf 5-10 ml / min erhöht werden. Da der Fluidkopf durchläuft die Schaltung wird es zu einem Anstieg in der PA-Druck auf Grund der Zunahme der Höhe des Fluidkopfes und damit der statische Druck. Wenn die Flüssigkeit nicht über den höchsten Punkt in der Leitung fließt, kann es notwendig sein, entweder eine Saugkraft anzuwenden auf dem gegenüberliegenden Ende der Leitung oder zu versuchen, den höchsten Abschnitt der Leitung zu verringern. Sobald dieses Problem zu überwinden, sollte das Perfusat ohne Probleme zu zirkulieren.

Einige Probleme sollten in Bezug auf den Lüfter zu überwachen. Erstens kann das Verdrehen des Bronchien / Luftröhre und Herz-Lungen-Position auftreten, wie die Lunge geworden ödematösen und das Gewicht erhöht. Es ist wichtig für die Kanülen in einer relativ nahe anatomischen Position verbleibt, also zur Änderung eines oder beide Kanülene kann notwendig sein. Druck oder volumengesteuerte Beatmungsgeräte sowie positive oder negative Belüftung kann mit diesem EVLP System verwendet werden. Für die Ratten-Modell haben wir mit positivem Druck, volumenkontrollierten Beatmung arbeitet gut an Atemvolumen von 4-10 ml / kg und bei positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) zwischen 2-8 cm H 2 O. gefunden Allerdings kann ein PEEP von 8 cm H 2 O einen möglichen Bruch an der Gabelung der Luftröhre führen. Nach jedem Experiment (oder von Experimenten eingestellt werden, wenn Rücken-an-Rücken durchgeführt), die Belüftungsleitung, die zu der Luftröhre sollte jeglicher bronchoalveoläre Lavage (BAL) -Flüssigkeit, die die Luftröhre bis gereist kann gereinigt werden. Diese Flüssigkeit härtet, wenn unberührt und kann die Entlüftungsleitung vollständig zu blockieren.

Das Perfusat Zusammensetzung ist entscheidend für eine erfolgreiche EVLP Experiments. Eine 5% Dextran-Gemisch ermöglicht Lungendurchblutung, die nahe an physiologischen Bedingungen ist, unterhält eine stabile onkotischen Druck, um Flüssigkeit b fahrenack in das Gefäßsystem zu Ödemen zu verhindern und verhindert Thrombose innerhalb der Lungengefäße. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Arten von Ratten kann allergisch Dextran Lungenödem 20 bewirken könnten. Die Inhalte dem Perfusat war konsistent in allen Versuchsgruppen in dieser Studie daher sollte die Dextrangehalt kein confounder sein. Die onkotischen Druck ist eine kritische Variable, die das Potenzial zu verbessern oder zu produzieren Gewebsödeme hat. Kommerziell erhältliche Perfusionslösungen, die für kalte statische Lagerung oder normothermic Perfusionen optimiert wird, sind in diesem System verwendet wurde, um Lungen Lebensfähigkeit Zeiten erhöhen. Wir stellen fest, dass einige dieser Lösungen enthalten Albumin und eine Sorge ist die Möglichkeit, Rinderalbumin Auslösung einer Entzündungsreaktion bei Nagetieren Lunge. Obwohl optimale Perfusat Zusammensetzung weiterhin Gegenstand der Untersuchung, muss das Perfusat zur Berücksichtigung des onkotischen Drucks, den osmotischen Druck und die Pufferkapazität zu nehmen. WE wird empfohlen, die Lösung auf eine modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung oder Zellkulturmedien basieren. Der onkotische Druck sollte von Dextran oder Albumin erhalten werden, abhängig von der Anwendung. Der Perfusionsdruck und Durchflussmenge wirkt sich die Orgel und über physiologischen Perfusionsparameter kann das Organ anfällig für mechanische Trauma zu machen.

Visuelle Anzeigen beim Versuch:

Es gibt viele optische Hinweise sowie Hinweise von Echtzeitdaten, die verwendet werden können, um zu bestimmen, ob ein EVLP Experiment läuft gut. Die Lunge wird gleich groß bleibt und auf das gleiche Volumen bei jedem Atemzug zu entleeren. Es wird auch keine undichten aus der Lunge selbst. Der PVR, Lungengewicht und Compliance wird relativ konstant bleiben. Sauerstoffproduktion konstant bleiben oder leicht steigen.

Es gibt viele optische Anzeigen, wenn die Lunge wird bei einem Experiment beeinträchtigt. Die Lunge wird ödematös einnd wächst schnell in Größe und Gewicht. Die Farbe der Lungenveränderungen (von tan-rosa bis weiß) und Taschen der Flüssigkeit in dem Gewebe zu identifizieren. Wenn die Luftröhre oder Lungen Brüche Barotrauma oder Überdehnung, wird es unter dem Gesichtspunkt der Verletzung (Figur 12B) sprudeln werden. Sauerstoffproduktion ab und die PVR und Compliance wird dramatisch als auch erhöhen.

Das Potential der Verwendung eines EVLP Modell an Kleintieren wie Nagern öffnet die Tür für zukünftige Studien zur Verbesserung der Behandlung von Lungentransplantaten. Die Kleintiermodell erfordert jedoch ein besseres Verständnis, wirklich zu imitieren eine Lungentransplantation. Dieses Modell kann in der Zukunft verwendet werden, um medizinische Behandlungen zu verbessern und zu definieren Basisparameter für die künftige Lungentransplantation Studien werden.

Disclosures

Die Sonne Geht Auf

Acknowledgements

Die Autoren möchten die Hilfe von Harvard Apparatus, insbesondere Stephanie Pazniokas, MS (Physiologie Systems & Regenerative Medizin) für ihre Unterstützung bei der Schaltungsanordnung, Änderung und Fehlerbehebung des Perfusionskreislauf und XVIVO Perfusion (Daniel Martinelli, KPCh, CTP) für quittieren Bereitstellung von nicht-klinischen Einsatz Lungenquerschnittslähmung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPL-2 Basic Lung Perfusion System Harvard Apparatus
Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm Kent Scientific Corporation IND500232
Tweezer #5 Dumostar, 11 cm Kent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved Kent Scientific Corporation INS600187
McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14124
Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14003
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" Kent Scientific Corporation INS800101
Heparin 30,000 units per 30 ml APP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Ketamine 500 mg per 5 ml JHP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Xylazine 100 mg per 1 ml Akorn Supplied from OSU Pharmacy
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle B-D 309301
Hyflex NBR Ansell S-17310M Bite proof gloves
BL1500 Sartarius Practum 1102-1S Scale
Large Flat Bottom Restrainer Braintree Scientific Inc FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat  Rat tunnel for injection
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large Kiberly-Clark 50708
Rapidpoint 405 Siemens blood gas analyzer
Fiberoxygenator D150 Hugo Sachs Elektronik PY2 73-3762
LabChart v7.3.7 ADInstruments
Tracheal cannula Harvard Apparatus 733557
Pulmonary Artery cannula Harvard Apparatus 730710
Left Atrium cannula Harvard Apparatus 730712
Peristaltic Pump  Ismatec ISM 827B
Small Animal Ventilator model 683 Harvard Apparatus 55-000
Ecoline Star Edition 003, E100 Lauda LCK 1879 Water Heater
Tubing Cassette Cole-Parmer IS 0649
Connect kit D150 Cole-Parmer VK 73-3763
PowerLab 8/35 ADInstruments 730045
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-1793
SCP Servo controller for perfusion type 704 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 732806
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731747
VCM ventilator control module type 681 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731741
TCM time control module type 686 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731750
IL2 Tube set for perfusate Harvard Apparatus 733842
Tube set for moist chamber Harvard Apparatus 73V83157
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID Harvard Apparatus 721017 perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID Harvard Apparatus 721019 perfusate line leaving lung
low potassium dextran glucose solution flushing the lung

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References

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