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Summary

Ex-Vivo pulmonaire Perfusion (EVLP) a permis la transplantation pulmonaire chez l'homme pour devenir plus facilement accessible en permettant la capacité d'évaluer les organes et d'élargir le bassin de donneurs. Ici, nous décrivons l'élaboration d'un programme et des améliorations qui permettent un modèle reproductible pour l'expansion future EVLP de rat.

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Nelson, K., Bobba, C., Eren, E., Spata, T., Tadres, M., Hayes, Jr., D., Black, S. M., Ghadiali, S., Whitson, B. A. Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program. J. Vis. Exp. (96), e52309, doi:10.3791/52309 (2015).

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Abstract

Le nombre de poumons de donneurs acceptables disponibles pour la transplantation pulmonaire est très limitée en raison de la mauvaise qualité. Ex-Vivo pulmonaire Perfusion (EVLP) a permis la transplantation pulmonaire chez l'homme pour devenir plus facilement accessible en permettant la capacité d'évaluer les organes et d'élargir le bassin de donneurs. Comme cette technologie se développe et se améliore, la capacité d'évaluer et potentiellement améliorer la qualité des poumons aux normes avant la transplantation est un besoin critique. Afin d'évaluer plus rigoureusement ces approches, un modèle animal reproductible doit être établie qui permettrait pour les tests de techniques améliorées et la gestion des poumons donnés ainsi que pour le destinataire du poumon transplantation. En outre, un modèle animal de EVLP des pathologies associées, par exemple, la ventilation induit des lésions pulmonaires (IVL), fournirait une nouvelle méthode pour évaluer les traitements pour ces pathologies. Ici, nous décrivons le développement d'un programme de poumon EVLP de rat et des améliorations à ce qui methode qui permettent un modèle reproductible pour une expansion future. Nous décrivons également l'application de ce système de EVLP de modéliser IVL dans les poumons de rats. L'objectif est de fournir à la communauté de recherche des informations essentielles et «perles de sagesse" / techniques qui ont découlé de tâtonnements et sont essentielles à l'établissement d'un système de EVLP qui est robuste et reproductible.

Introduction

Pertinence clinique

Il ya actuellement une pénurie de poumons disponibles pour la transplantation appropriés avec seulement 19% des poumons pouvant être utilisés à l'échelle nationale menant à temps prolongée liste d'attente ou en attente de greffe patients mourants 1. La pénurie peut être en raison de donneurs plus âgés, traumatisme, infection, défaillance multi-système et poumons de donneurs parfois blessés sur la récolte 2. En outre, le poumon est un organe fragile à l'extérieur de la cavité thoracique et les techniques de transport et de conservation classiques peut conduire à une détérioration et non viables poumons. Par conséquent, le maintien et l'amélioration de la viabilité du poumon ex-vivo a récemment devenue une préoccupation majeure dans la médecine de transplantation pulmonaire.

Ex-vivo pulmonaire Perfusion (EVLP)

Ex-vivo poumon perfusion (EVLP) a évolué pour perfuser constamment organes étant évalués à la transplantation et permet une période d'évaluation que tous lesux pour le potentiel de la réanimation du poumon ou reconditionnement. EVLP peut prolonger totale sur l'organe du corps temps d'ischémie et de permettre les dons d'organes de voyager de plus grandes distances 3. Typiquement, les poumons sont ventilés à 50% de la capacité pulmonaire totale ou 20 cmH 2 O de pression des voies aériennes pic avec une fraction d'oxygène inspiré (FiO 2) de 30% à 50% 4. Solution de préservation est perfusé à 40-60 ml / kg (environ 40% du débit cardiaque prédite de 100 ml / kg) chez les humains et les animaux de grande taille 5,6, mais est perfusé à environ 20% du débit cardiaque chez les rats 7. L'inclusion de la solution a permis STEEN poumons humains de voyager dans des environnements RT sans développement d'un œdème pulmonaire neuf. Ce travail de pionnier a été affinée par l'Université de Toronto Lung Transplant Program 10-13 et est en cours d'évaluation pour une meilleure évaluation des poumons de donneurs marginaux pour la transplantation 14,15. Cependant, le VENTILATION optimalen et de perfusion conditions nécessaires pour régénérer les poumons marginales et / ou sous-standard pour la transplantation ne est pas connue et est actuellement un domaine de recherche actif.

Systèmes de perfusion de poumon isolées ont été utilisées chez les petits animaux de causer des lésions pulmonaires, recréer les maladies respiratoires, les poumons et perfuser des solutions différentes pour éviter des dommages ischémiques. Des chercheurs ont créé un modèle de petits animaux de transplantation du poumon en utilisant le système de perfusion pulmonaire isolée pour imiter les protocoles de EVLP qui pourraient être utilisés chez les humains et les animaux plus gros de 16 à 18. Cependant, ce modèle expérimental a de nombreux défis en ce qui concerne aux diverses techniques et paramètres utilisés pour imiter la physiologie humaine. En particulier, il ya beaucoup de subtilités dans le maintien de la viabilité du poumon au cours EVLP. Ces subtilités peuvent survenir en raison de différences de technique de récolte, les paramètres de ventilation à pression positive, les conditions de composition et de flux de perfusat et canulation du poumon. Thervant, le but ici est de fournir à la communauté de recherche avec un certain nombre de dépannage et de mise en œuvre des conseils que nous avons trouvé de plomb à une méthode robuste pour mettre en œuvre EVLP dans un modèle de rongeur.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures ont été effectuées selon les lignes-guides de la institutionnel de protection des animaux et le Guide du Conseil national de recherches pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (IACUC) Humane et a subi l'approbation par le Comité de l'Ohio State University IACUC.

1. Configuration initiale

  1. Mettre en place le circuit EVLP et ont chaud (37 ° C) perfusat circulant à travers le système avant d'intégrer le poumon de l'ex-planté (Figure 1).
  2. Réglez le bain chaud de l'eau, utilisé pour la veste de réservoir de perfusion, échangeur de chaleur, et le thorax artificielle, à 37 ° C et de circulation (Figure 1).
  3. Exécuter une solution de désoxygénation (par exemple, 6% de O 2, 8% de CO 2, 84% N 2) à contre-courant à travers le liquide de perfusion dans le filtre à gaz pour assurer le perfusat a ~ 6% d'oxygène dissous pour l'expérience.
    NOTE: Ce perfusat de-oxygéné permet l'évaluation of la fonction pulmonaire en mesurant l'oxygène introduit dans le perfusat, post-organe.
  4. Ouvrir le programme d'acquisition de données et de connecter le capteur de pression de l'artère pulmonaire, le transducteur de pression différentielle de la trachée, des voies respiratoires transducteur de pression différentielle de débit, capteur de poids du poumon, et le transducteur de vitesse de la pompe au circuit EVLP et le convertisseur d'acquisition de données / analogique-numérique ( la figure 2).
  5. Mettre en place la table d'opération et des outils d'exploitation sur le circuit EVLP (Figure 3).
  6. Mettre en place un petit contenant de l'azote liquide à proximité du circuit EVLP si les échantillons seront obtenus.
    REMARQUE: Le système de l'auteur a été modifiée pour recueillir pré-organe et de perfusion post-organe sans interrompre la dynamique pression-débit pouvant potentiellement blesser les poumons.

2. Préparation des anesthésiques et l'héparine, Anesthésie du Rat

  1. Mettez sur l'équipement de protection individuelle suivant(PPE) avant de manipuler les rats et les tissus de rat: masque chirurgical, gants chirurgicaux et robe jetable.
  2. Peser le rat et noter le poids.
  3. Préparer 1200 U / kg d'héparine.
  4. Préparer la fois 60 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine dans la même seringue, la préparation de la première kétamine.
  5. Intrapéritonéale injecter le mélange de kétamine et de xylazine dans le rat et permettent 5 min pour le rat à devenir inconscient.
  6. Confirmez anesthésie appropriée en cochant pincement de l'orteil réflexe. Si le rat ne retire pas sa pointe, il ne se sent pas la douleur.
  7. Déplacez rat pour table d'opération, sécuriser en position couchée, et vaporiser avec de l'alcool pour la stérilisation.

3. Extraction et ventilation initiale des poumons Rat

  1. Préparer 4-20 cm de long sutures de soie (3-0 ou 4-0 devrait suffire).
  2. Commencer à enregistrer des données en utilisant le programme d'acquisition de données.
  3. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie appropriée, en utilisant des ciseaux chirurgicaux entrent péritonéale cavité par une laparotomie médiane et injecter l'héparine dans la veine cave inférieure.
  4. Effectuer l'incision crânienne passé manubrium dans le cou jusqu'à la trachée est exposée. Ne pas rompre la cavité thoracique (figure 4A).
  5. Disséquer postérieure de la trachée et dans la ligne médiane postérieure de glisser une suture de soie de la trachée (figure 4B).
  6. Soulever la partie antérieure de la trachée et de faire une incision transversale entre les anneaux cartilagineux, élevés sur la trachée. Ne pas couper à travers la partie membraneuse postérieure de la trachée à ce point (figure 4C).
  7. Cathétériser la trachée avec la canule de la trachée et sécurisé avec la suture de soie (figure 4D). Se assurer que la ligature de fil de suture est fixé dans l'entaille afin d'atténuer la migration de la canule.
  8. Connecter la canule de la trachée vers le circuit de ventilation.
  9. Allumez le ventilateur mécanique de ventilation mécanique pour démarrer l'luNGS.
    REMARQUE: Les réglages initiaux ont été choisis pour être un volume courant de 4 ml / kg et de pression expiratoire positive (PEEP) de 2 cmH 2 O. Ces paramètres sont les paramètres par défaut et en fonction des conditions expérimentales peuvent être modifiées une fois que l'organe est dans le système de perfusion ex-vivo.
  10. Entrez la cavité thoracique à travers le sternum / xyphoïde et continuer crânialement vers la fourchette sternale. Prenez soin d'éviter de toucher les poumons.
    NOTE: Comme le poumon de rat est fragile, toute manipulation accidentelle peut conduire à un traumatisme et un œdème pulmonaire (figure 5A).
  11. En utilisant deux écarteurs, retirer la cavité thoracique afin d'exposer correctement l'anatomie (figure 5A). Une fois de plus, prendre soin d'éviter de toucher les poumons.
  12. Retirez le thymus avec une légère élévation et dissection.
  13. Maj le contenu abdominal à un côté pour exposer soit la veine cave inférieure (VCI) ou la veine mésentérique (MV).
  14. Inciser soit la IVC ou le MV à exsangue le rat, fournissant l'euthanasie.
  15. Placer une postérieure de suture en soie à l'artère pulmonaire et l'aorte en vue de fixer la canule de l'artère pulmonaire (figure 5B).
  16. Faire une incision de 2-3 mm sur la face antérieure du droit d'éjection du ventricule et placez la canule dans l'incision et dans l'artère pulmonaire principale et le fixer avec la suture de soie (figure 5C).
  17. TRANSECT l'apex du cœur pour permettre l'accès au ventricule gauche et rincer les caillots dans le système vasculaire pulmonaire faisant se écouler ~ 15 ml d'un K + solution faible d'électrolyte à travers l'artère pulmonaire et à travers la pointe du cœur dans la cavité thoracique ( Figure 5D).
  18. Connectez la canule l'artère pulmonaire (AP) au circuit EVLP. Se assurer que la ligne d'entrée provenant du circuit de la canule PA est amorcé avec perfusat pour éviter tout air entrant dans le coeur et les poumons.
  19. Allumez leprincipale pompe péristaltique et fixé à un faible (~ 2 ml / min) Vitesse de perfusion pour permettre de courir à travers l'artère pulmonaire et le ventricule gauche dans la cavité thoracique. ** étape critique ** Assurer la pression PA ne spike pas ce est un signe soit d'un blocage ou mauvaise canule (figure 6).
  20. Éteignez la pompe péristaltique.
  21. Placez une suture de soie derrière le cœur, autour des ventricules (figure 7).
  22. Commencez le processus de cannulating l'oreillette gauche en insérant une petite paire de pinces chirurgicales dans le sommet, à travers la valve mitrale, et dans l'oreillette gauche.
    NOTE: Ce sera dilater la valve mitrale et faciliter la canule. Dilatation agressif, ou dilatation trop profonde, peuvent, par inadvertance, lacérer l'oreillette gauche rendant l'achat inefficace.
  23. Retirez la pince du cœur.
  24. Insérez la canule de l'oreillette gauche dans le sommet à travers la valve mitrale et dans la gauche aurium.
  25. Fixez la canule de l'oreillette gauche avec la suture de soie derrière le cœur (figure 8).
    NOTE: Cette suture peut être "pré-lié" pour faciliter la canulation.
  26. Connectez la canule de l'artère pulmonaire à l'ex-vivo circuit de perfusion du poumon (Figure 9A). Ne pas connecter l'oreillette gauche canule au circuit EVLP jusqu'à ce que le bloc cœur-poumon a été complètement éliminé de l'organisme.
  27. Serrer l'oesophage avec une pince hémostatique et couper en dessous de la pince (entre la pince et le diaphragme) de sorte que l'œsophage peut être utilisé pour augmenter le cardio structures céphalique.
  28. Carrément disséquer le tissu environnant et couper l'aorte descendante et navires auxiliaires pour libérer le bloc cœur-poumons comme il est éduqué par l'œsophage (figure 9B).
  29. Transect la trachée céphalique à la canule trachéale libérer complètement le bloc cœur-poumon.
  30. Retirer le bloc cœur-poumon et les placer dans le designated emplacement sur ​​le circuit de EVLP (figure 9C).
  31. Connectez la canule de l'oreillette gauche à la ligne de sortie et commencer la principale pompe péristaltique (Figure 9D).

4. Ex Vivo perfusion des poumons

  1. Enlever rapidement la ligne de ventilation de la partie supérieure de l'appareil de EVLP et fixer le boîtier avec les capteurs de pression, puis insérez la ligne de ventilation sur le dessus du boîtier sur le dessus de l'appareil de EVLP.
    NOTE: Cela permettra aux données de ventilation pour être enregistrées et surveillées pression.
  2. Se assurer que le piège à bulles est rempli d'une quantité suffisante de liquide de perfusion de sorte qu'aucune bulle d'air (ce est à dire, embolie gazeuse) sont introduits dans les poumons.
  3. Changer lentement de ventilation et de perfusion paramètres expérimentaux à des niveaux souhaités lors de la première 15 min. En outre, durant cette phase de montée initiale, augmenter le débit de perfusion de la vitesse et / ou la pression désirée.
    NOTE: Programmetion du ventilateur pour produire des souffles de soupir intermittents, qui facilitent la circulation de fluide hors de l'espace du poumon et donc de retarder l'apparition de l'oedème, est recommandée. Ceux-ci peuvent être produits par des ventilateurs équipés de la fonction de soupir.
  4. Définir "Temps 0" comme le moment où les paramètres de ventilation sont à un volume courant de 4 ml / kg, PEEP à 2 cm H 2 O, et les paramètres de perfusion sont à leurs niveaux attendus et restant constante.
  5. Si nécessaire, prélever des échantillons de perfusat du port de l'échantillon, gel rapide dans l'azote liquide, et noter le temps des échantillons.
  6. Lorsque l'expérience est terminée, isoler les pièces anatomiques nécessaires pour la collecte et soit gel rapide dans l'azote liquide ou le lieu en solution pour poursuivre des études de fixation.

Representative Results

Les données mécaniques en temps réel recueillies par le biais du programme d'acquisition de données peuvent facilement être analysés afin de tester un certain nombre d'hypothèses. Par exemple, la figure 10A montre le poids moyen du poumon à 60 mn de 10 expériences de rat où les animaux ont été ventilés avec un faible volume de marée / bas PEEP de 4 ml / kg et 2 cmH 2 O. Bien qu'il y ait une augmentation très mineure en poids du poumon pendant toute l'expérience, cette augmentation ne est pas statistiquement significative (ANOVA, p = 0,92). La figure 10B montre la pression moyenne artérielle pulmonaire (PAP) à 60 min à partir de 12 expériences de rat. Le PAP inférieure au point de temps 0 min est le résultat de réglages de débit et de ventilation inférieures utilisées au début de toutes les expériences et le PAP reste constante après ce point de temps sans changements statistiquement significatifs après t = 10 min (ANOVA sur les rangs, p = 0,89). Figure 10C montre la résistance vasculaire pulmonaire (RVP) à 60 min de 12 ratexpériences et bien qu'il existe une légère diminution de la PVR après t = 20 min, il n'y avait aucune différence statistiquement significative dans cette expérience au cours de PVR (ANOVA sur rangs, p = 0,65). En comparaison avec les données présentées ici PVR, Noda et al. a montré le PVR à augmenter légèrement au cours du temps pendant 4 heures. Cependant, ces auteurs rapportent données dans PVR à partir de 1 h à la place du début de l'expérience et aucune valeur de déviation standard sont fournies 7. Noda et al. aussi ne montre pas les données de l'œdème pulmonaire pour les quatre expériences hr donc aucune comparaison ne peut être faite avec les données présentées ici dans la figure 10A. Des différences majeures dans Noda et al. procédure par rapport à ce qui est montré dans le présent document comprennent: une 1 h conservation par le froid en solution LPS avant EVLP, les rats ont été initialement ventilé avec un mélange de gaz, y compris l'isoflurane pour les rendre inconscient, la solution de perfusion a été complété avec 50 mg de méthylprednisolone et 50 mg des céphalosporines, fl totaleOW a été définie comme 20% du débit cardiaque calculé, les échantillons ont été perfusat prise qu'après le poumon a été ventilé à 100% O 2 pour 5 min avant et l'expérience a été de fonctionner pendant 4 heures.

Les échantillons prélevés lors de l'expérience de la perfusion peuvent également être analysées à de nombreuses fins. A titre d'exemple, la figure 11 nous montrons comment volume courant / ventilation haute PEEP élevée peut induire une réponse pro-inflammatoire dans 60 min. Pour ces expériences, la perfusion de 4 rats ventilé dans des conditions préjudiciables, ce est à dire, un volume élevé de marée de 10 ml / kg et PEP élevée de 8 cmH 2 O, ont été analysés pour les cytokines pro-inflammatoires et anti-IL1β, TNFa et IL4 utilisant la norme techniques ELISA. Comme le montre la Figure 11, par rapport aux niveaux de cytokines avant ventilation (0 min), 60 min de ventilation préjudiciable a entraîné une augmentation statistiquement significative de l'IL-1β et TNF (cytokines pro-inflammatoires) un nd aucune modification de l'IL-4 (une cytokine anti-inflammatoire) concentration. Par conséquent, ce système de EVLP est capable de générer des profils de blessures pulmonaires fréquemment observés pendant la ventilation mécanique.

Figure 1
Figure 1. Schéma et photo du petit animal ex vivo perfusion du poumon (EVLP) circuit. Lettres dans le diagramme correspondent aux lettres dans la photographie. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Tous les transducteurs sont fermement raccordés aux boîtiers de commande."> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. La table d'opération de rat est correctement mis en place adjacente au circuit ex vivo perfusion du poumon (EVLP). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. (A) Une incision est faite crânienne pour exposer la trachée. La cavité thoracique est pas exposée. (B) Une suture de soie est placé derrière la trachée. (C) La trachée est partiellement découpée pour se préparer à la canulation. (D) La canule trachéale est placé dans positio n et fixé avec une suture de soie. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. (A) La cavité thoracique est tiré vers l'arrière pour permettre l'accès au cœur et des poumons. (B) Préparation de la mise suture derrière l'artère pulmonaire. (C) L'artère pulmonaire est une canule et à égalité avec la suture de soie placé précédemment. (D) A K + solution à faible électrolyte est rincé dans l'artère pulmonaire et sur ​​l'oreillette gauche pour enlever les caillots de sang. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

oujours "> Figure 6
Figure 6. Augmenter le flux artériel pulmonaire pour le rinçage du poumon peut causer la pression artérielle pulmonaire à augmenter considérablement. Si une canule a été effectuée correctement et il n'y a pas de blocage majeur, la pression devrait diminuer. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Figure 7
Figure 7. soie suture est placé autour du cœur entier en vue de l'atrium cathétérisme gauche. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

n-page = "always"> Figure 8
Figure 8. La canule de l'oreillette gauche est maintenu en place avec une suture de soie. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9. (A) La canule artérielle pulmonaire est reliée à l'ex-vivo circuit de perfusion du poumon. (B) L'oesophage est serré et le tissu conjonctif est carrément disséqué pour enlever le bloc cœur-poumon. (C) Le bloc cœur-poumon est retiré de la cavité thoracique et placé dans l'ex-vivo circuit de perfusion du poumon. (D) L'atrium gauche est reliée à l'ex-vivo circuit de perfusion du poumon. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10. (A) de poids pulmonaire de rats Sprague Dawley mâles par 60 min de perfusion ex vivo du poumon (n = 10). (B) de la pression artérielle pulmonaire chez des rats mâles Sprague Dawley par 60 min de perfusion ex vivo du poumon (n = 12). (C) de la résistance vasculaire pulmonaire des rats Sprague Dawley mâles à 60 min de perfusion ex vivo du poumon (n = 12), NS indique aucune différence statistiquement significative. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 11. Effet de 1 h ventilation à des volumes élevés de marée (10 ml / kg) et PEP élevée (8 cmH 2 O) sur les concentrations de cytokines pro-inflammatoires et anti dans le perfusat. N = 4, * indique une différence statistiquement significative rapport à 0 h échantillon (p <0,05). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 12
Figure 12. (A) A proprement ventilation et perfusion pulmonaire relié au circuit EVLP. (B) à haute pression expiratoire positive (PEEP) provoque une déchirure à la bifurcation de la trachée causant des bulles se former à la blessure et de remplir le thorax artificielle. es / ftp_upload / 52309 / 52309fig12large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 13
Figure 13. (A) de la canule artérielle pulmonaire. Cette canule est plus petit que l'oreillette gauche canule. (B) oreillette gauche canule. Cette canule est beaucoup plus grande que la canule de l'artère pulmonaire. (C) de la trachée canule. Cette canule comporte des nervures pour aider à fixer la trachée avec une suture de soie. La fin qui est insérée dans la trachée est également légèrement en pointe pour aider à l'insertion de la canule dans la trachée. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 14. (A) Le sommet du coeur est maintenue par une paire de pinces que le ventricule droit est sur ​​le point d'être incisée pour cathétériser l'artère pulmonaire. (B) La dilatation de l'anneau de la valve mitrale avec une paire de extrémités franches petits pick-up, il est plus facile de visualiser les voies dans l'oreillette gauche. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

SYSTEME DE SURVEILLANCE

Quelles sont les choses ressembler quand l'expérience est bien en cours d'exécution:

Une fois que les canules ont été placés dans le circuit et les poumons sont de ventilation, il ya plusieurs façons de se assurer que le système fonctionne correctement. Il devrait y avoir aucune fuite de liquide de perfusion à travers la ligne. La résistance vasculaire pulmonaire (RVP) doit rester relativement constant (en supposant un flux constant). L'échange d'oxygène devrait augmenter une fois que le ventilateur fonctionne correctement et en élargissant les poumons de recruter plus alvéoles pour l'échange de gaz. Figure 12A montre bien ventilé et perfusé poumons connectés au circuit EVLP l'intérieur du thorax artificielle.

Quelles sont les choses ressembler quand l'expérience ne fonctionne pas bien:

Il ya quelques questions communes qui ont eu le plus haut taux d'occurrence pendant les premiers stades d'une expérience de EVLP. La première et la plus simple to réparation d'une fuite dans la conduite sortant du poumon. Ce est perceptible par un pool de mise en commun de perfusion sous une partie du circuit et le niveau dans le réservoir cesse de diminuer. Vérifier et serrer les connecteurs de tube autour de la zone de déversement et inspecter le tube lui-même d'une fuite. Si cette fuite se produit avant le poumon, on peut également introduire des bulles dans le poumon. Cela devrait être corrigée le plus rapidement possible que des bulles d'air dans le liquide de perfusion se traduira par des lésions tissulaires et provoquer une augmentation significative dans le PVR. Il peut également y avoir une fuite provenant du poumon ou une des canules. Cela peut être provoqué soit par glissement d'une canule ou d'une obstruction dans la conduite sortant de provoquer une accumulation de pression. Inspecter la position pour les deux canules pour assurer ni a glissé ou tordu. La pression PA devrait également être surveillée pendant ce processus car une augmentation instantanée de la pression PA est un signe évident que l'obstruction d'une certaine sorte a eu lieu récemment. Figure 12Bmontre un poumon rupture qui se est rompu en raison des pressions élevées. Une fuite du poumon lui-même peut également être causée par une déchirure dans du tissu. Ce problème peut ou peut ne pas être réparable mais repositionnement et en resserrant les canules est la meilleure option dans ce scénario.

Principaux points d'apprentissage / Opportunités:

De première instance et le développement d'erreur du système de perfusion du poumon ex-vivo a permis d'identifier plusieurs questions clés que nous décrivons ici pour faciliter la mise en œuvre efficace du système de EVLP. Tout d'abord, en ce qui concerne la passation des marchés, il est important que les techniques d'anesthésie standard sont suivies correctement pour anesthésier les animaux (assez anesthésiques, injection dans le péritoine) et le respect de toutes les politiques du IACUC est requis. Les canules (représenté sur la figure 13 A, B, et C) doit être purgé de façon répétée afin d'éliminer tout caillot et / ou de débris dans le vasculat pulmonaireure. En ce qui concerne la sélection des animaux, nous suggérons d'utiliser Sprague-Dawley ou Lewis rats pesant 250 à 350 g. Une attention particulière doit être prise lorsque cannulating rats pesant près de 250 g depuis les bateaux seront plus petits et donc beaucoup plus difficile à canuler sans blesser le système vasculaire. Si les petits rats, ou un modèle de souris, doit être utilisée, plus petite canule peut avoir besoin d'être utilisé.

Trachéale canulation ne attaque pas généralement aussi longtemps que la suture est fixée correctement par un premier passage de fil de suture postérieure de la soie à la trachée après dissection du fascia entourant et avant canulation. Suivez ce avec une incision antérieure 1-2 anneaux de la trachée-dessus de la suture de passer la canule. Nœuds carrés entre les anneaux de la trachée afin de fixer dans une rainure pour une meilleure sécurité (figure 4C). Canulation de l'artère pulmonaire (PA) est plus difficile par rapport à la canule trachéale. Les étapes suivantes ont été utilisées dans cette étudepour cette procédure. Tout d'abord, saisir l'apex cardiaque avec une paire de pinces. Passez une autre paire de pinces dans le sinus transverse et enfiler un fil de suture pour fixer la canule dans la PA proximale. Inciser immédiatement le ventricule droit avant que le droit d'éjection du ventricule (RVOT) (Figure 14A). Après l'incision dans le RVOT, la canule sera guidé vers la sortie de l'artère pulmonaire voies. Avoir la suture en position derrière l'artère pulmonaire / aorte avant que le droit ventriculotomie augmente l'efficacité (figure 5C). La canule doit être fixé en place avec la suture pour empêcher le délogement. Une complication majeure peut se produire si la canule PA ne est pas dans l'orientation anatomique correcte. La canule peut être insérée trop loin et ne perfuser une succursale ou devenir mal positionné avec torsion de l'échantillon coeur-poumon lors de l'enlèvement de la cavité thoracique. Cela peut facilement être orientée vers la position d'origine pour maintenir le bon angle de anatomiposition CAL. Enfin, auriculaire gauche (LA) canule est la partie la plus difficile de la procédure. La canule LA doit être placé à l'intérieur de l'oreillette gauche. Avec les tissus étant extrêmement friable, être attentifs à ne pas utiliser la force significative ou une torsion afin d'éviter une déchirure dans la veine pulmonaire et l'oreillette gauche qui serait alors faire l'expérience irrécupérables. La canule PA est le mieux placé avant la canule LA. Un ventriculotomie gauche avec enlèvement de l'apex a été montré pour perturber la tendineux de CORDAE et faciliter l'accès à travers les valves mitrales. En outre, le ventriculotomie rend plus facile à se dilater et de visualiser la valve mitrale et pour alimenter la canule à travers la valvule mitrale. Dilatation de l'anneau mitral avec une paire de extrémités franches petits pick-up peut être fait afin de visualiser les voies dans le LA (Figure 14B). Suture doit être placé derrière le cœur avant de cathétérisme. Cela peut être fait simplement en soulevant le coeur à l'aide d'une paire de Small extrémités franches pick-up et en plaçant en dessous et à travers le coeur de la suture. La LA est maintenant prêt à être canule. Nourrir la canule LA travers les pick-ups afin de visualiser correctement le placement de la canule dans l'oreillette gauche. Faites attention à ne pas déloger la canule de retour dans le ventricule gauche. La suture doit alors être fermement fixé le long du myocarde du ventricule gauche. Sécurisation de la suture à l'oreillette gauche pourrait obstruer la totalité ou une partie de la canule.

Au cours de la procédure, il est essentiel que l'air ne reste dans la section d'entrée de l'appareil. Tout air importante peut produire une embolie gazeuse augmenter la PVR (effectivement un «sas») qui se traduira par un flux de perfusion beaucoup plus faible pour une pression donnée. Divers points peuvent être utilisés pour éliminer l'air dans le système. L'air dans la section de sortie est prévue et ne devrait pas avoir d'effet néfaste sur les poumons. Un modèle porcin de l'hypertension pulmonaire a étéreprésenté à recréer à partir de la pathologie en continu de petites quantités d'air sur une période de 8 semaines. L'air accrue diminue la quantité de perfusion présent tout en provoquant l'inflammation des tissus environnants à 19.

L'initiation de la perfusion peut se produire une fois que la canule est terminée, mais avant que le tube en provenance de la LA est connecté à la ligne de EVLP. Perfusât doit être exécuté par le biais d'effacer tous les caillots de sang et cela peut perfusat vider dans la paroi thoracique sans aucun problème. Commande de la pompe de perfusion en mode manuel et en augmentant progressivement le taux à ~ 2 ml / min permet une surveillance étroite de la pression PA. Pressions plus de 20 à 30 cmH 2 O peuvent indiquer une obstruction et regarder pour perfusion sortant de la LA est un autre indicateur, mais cela peut être très difficile à voir. Si la pression ne augmente à plus de 20 à 30 cmH 2 O, arrêter la pompe et revérifier les deux canules. Une fois que la pression est constante autour de 10 à 20 cmH 2 O permettra ee perfusat à courir à travers et dans la cavité thoracique pendant 2 min. A ce moment la ligne de la LA peut être connecté au circuit EVLP. La vitesse de la pompe de perfusion peut être augmentée de 5 à 10 ml / min. Comme la tête fluide progresse à travers le circuit, il y aura une augmentation de la pression PA en raison de l'augmentation de la hauteur de la tête de fluide et par conséquent la pression statique. Si le liquide ne peut pas se écouler sur le point culminant de la ligne, il peut être nécessaire d'appliquer soit une force d'aspiration sur l'extrémité opposée de la ligne ou de tenter d'abaisser la partie la plus haute de la ligne. Une fois que cette question est dépassée, la perfusion doit circuler sans aucun problème.

Quelques questions doivent être surveillés par rapport au ventilateur. Tout d'abord, la torsion de bronches / trachée et la position cœur-poumon peut se produire que les poumons deviennent le poids augmente plus et oedémateux. Il est important que les canules de rester dans une position anatomique relativement étroite, par conséquent, de modifier un ou les deux canulee peut être nécessaire. Pression ou ventilateurs de volume contrôlé ainsi que la ventilation positive ou négative peuvent être utilisés avec ce système de EVLP. Pour le modèle de rat, nous avons trouvé en utilisant une pression positive, volume contrôlé ventilation fonctionne bien à des volumes de marée entre 4-10 ml / kg et à des pressions expiratoire positive (PEEP) entre 2-8 cmH 2 O. Cependant, une PEEP de 8 cmH 2 O peut provoquer une rupture possible à la bifurcation de la trachée. Après chaque expérience (ou un ensemble d'expériences si elle est effectuée dos-à-dos), la ligne de ventilation menant à la trachée doit être nettoyé de tout lavage broncho-alvéolaire (LBA) qui peuvent avoir voyagé jusqu'à la trachée. Ce fluide va durcir si laissé intact et peut bloquer complètement la ligne de ventilation.

La composition de perfusion est essentiel à une expérience de EVLP succès. Un mélange dextran 5% permet de perfusion du poumon qui est proche des conditions physiologiques, maintient une pression oncotique stable à conduire b fluideack dans le système vasculaire pour empêcher un oedème et empêche la thrombose dans les vaisseaux pulmonaires. Il est important de noter que certaines espèces de rats peuvent être allergiques à dextran qui peut provoquer un oedème pulmonaire 20. Le contenu de la perfusion a été cohérent dans tous les groupes expérimentaux dans cette étude, donc le contenu dextran ne devrait pas être un facteur de confusion. La pression oncotique est une variable critique qui a le potentiel d'améliorer ou de produire un œdème des tissus. Solutions de perfusion disponibles dans le commerce qui sont optimisés pour le stockage statique à froid ou perfusions normothermiques ont été utilisés dans ce système pour augmenter les temps de viabilité du poumon. Nous notons que certaines de ces solutions contiennent de l'albumine et une préoccupation est la possibilité d'albumine bovine déclencher une réponse inflammatoire dans les poumons des rongeurs. Bien que la composition optimale de perfusion est un sujet en cours d'enquête, la perfusion doit tenir compte de la pression oncotique, la capacité de pression et tampon osmotique. We recommande que la solution soit basée sur une solution ou une culture cellulaire médias Krebs-Henseleit modifiée. La pression oncotique doit être maintenue par du dextrane ou de l'albumine, en fonction de l'application. Le taux de pression de perfusion et la circulation affecte les paramètres de perfusion organes et supra-physiologiques peuvent faire l'organe sujettes à un traumatisme mécanique.

Indicateurs visuels cours de l'expérience:

Il existe de nombreux repères visuels ainsi que des indications à partir des données en temps réel qui peut être utilisé pour déterminer si une expérience de EVLP fonctionne bien. Le poumon restera la même taille et se dégonfle à la même volume après chaque souffle. Il y aura également aucune fuite du poumon lui-même. Le PVR, le poids du poumon, et la conformité demeureront relativement constante. La production d'oxygène restera constante ou augmenter légèrement.

Il existe de nombreux indicateurs visuels lorsque le poumon est compromise pendant une expérience. Le poumon devient oedémateuxe se développe rapidement en taille et en poids. La couleur des changements pulmonaires (à partir d'un tan-rose au blanc) et des poches de liquide peut être identifié dans le tissu. Si la trachée ou pulmonaires ruptures de barotraumatisme ou plus de distension, il y aura bouillonner du point de blessures (Figure 12B). La production d'oxygène va diminuer et le PVR et le respect va considérablement augmenter ainsi.

La possibilité d'utiliser un modèle de EVLP de petits animaux comme les rongeurs ouvre la porte à de futures études améliorer le traitement de transplantations pulmonaires. Cependant, le modèle du petit animal nécessite une meilleure compréhension pour imiter vraiment une transplantation pulmonaire. Ce modèle peut être utilisé à l'avenir pour améliorer les traitements médicaux et définir les paramètres de base pour de futures études de transplantation pulmonaire.

Disclosures

Aucun

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier l'aide de Harvard Apparatus, surtout Stephanie Pazniokas, MS (Physiologie Systems & médecine régénérative) pour leur aide dans le circuit assemblage, la modification et le dépannage du circuit de perfusion et XVIVO Perfusion (Daniel Martinelli, CCP, CTP) pour fourniture d'utilisation non clinique plégie pulmonaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPL-2 Basic Lung Perfusion System Harvard Apparatus
Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm Kent Scientific Corporation IND500232
Tweezer #5 Dumostar, 11 cm Kent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved Kent Scientific Corporation INS600187
McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14124
Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14003
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" Kent Scientific Corporation INS800101
Heparin 30,000 units per 30 ml APP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Ketamine 500 mg per 5 ml JHP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Xylazine 100 mg per 1 ml Akorn Supplied from OSU Pharmacy
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle B-D 309301
Hyflex NBR Ansell S-17310M Bite proof gloves
BL1500 Sartarius Practum 1102-1S Scale
Large Flat Bottom Restrainer Braintree Scientific Inc FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat  Rat tunnel for injection
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large Kiberly-Clark 50708
Rapidpoint 405 Siemens blood gas analyzer
Fiberoxygenator D150 Hugo Sachs Elektronik PY2 73-3762
LabChart v7.3.7 ADInstruments
Tracheal cannula Harvard Apparatus 733557
Pulmonary Artery cannula Harvard Apparatus 730710
Left Atrium cannula Harvard Apparatus 730712
Peristaltic Pump  Ismatec ISM 827B
Small Animal Ventilator model 683 Harvard Apparatus 55-000
Ecoline Star Edition 003, E100 Lauda LCK 1879 Water Heater
Tubing Cassette Cole-Parmer IS 0649
Connect kit D150 Cole-Parmer VK 73-3763
PowerLab 8/35 ADInstruments 730045
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-1793
SCP Servo controller for perfusion type 704 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 732806
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731747
VCM ventilator control module type 681 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731741
TCM time control module type 686 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731750
IL2 Tube set for perfusate Harvard Apparatus 733842
Tube set for moist chamber Harvard Apparatus 73V83157
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID Harvard Apparatus 721017 perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID Harvard Apparatus 721019 perfusate line leaving lung
low potassium dextran glucose solution flushing the lung

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References

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