माउस कोलोरेक्टल अभिवाही अंत के लिए इन विट्रो कार्यात्मक लक्षण वर्णन में

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Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J. Vis. Exp. (95), e52310, doi:10.3791/52310 (2015).

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Abstract

इस वीडियो में विस्तार से एक माउस colorectum-तंत्रिका तैयारी का उपयोग कर एक में इन विट्रो एकल फाइबर electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल को दर्शाता है। दृष्टिकोण निष्पक्ष पहचान और व्यक्तिगत कोलोरेक्टल afferents के कार्यात्मक लक्षण वर्णन अनुमति देता है। एक या कुछ अभिवाही से उत्पन्न होने वाले प्रचारित कार्रवाई क्षमता (ए पी एस) के बाह्य रिकॉर्डिंग (यानी, एकल फाइबर) colorectum में ग्रहणशील क्षेत्रों (RFS) छेड़ा तंत्रिका फाइबर fascicles से बने हैं। colorectum श्रोणि (पीएन) या काठ का आंत-संबंधी (LSN) तंत्रिका जुड़ी है और अनुलंबीय खोला साथ या तो हटा दिया जाता है। ऊतक फ्लैट टिकी है और ऑक्सीजन क्रेब्स समाधान के साथ perfused, एक रिकॉर्डिंग कक्ष में रखा गया है। फोकल बिजली की उत्तेजना कार्यात्मक पांच mechanosensi में afferents वर्गीकृत करने के लिए, (जांच कर रही श्लैष्मिक पथपाकर और परिधीय खिंचाव कुंद) आगे तीन अलग यांत्रिक उत्तेजनाओं से जांच की जाती है, जो कोलोरेक्टल अभिवाही अंत, पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता हैेश्य कक्षाएं। इन यांत्रिक उत्तेजनाओं से कोई भी का जवाब देने के अंत यंत्रवत्-असंवेदनशील afferents (MIAs) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। रसायनों के लिए RFS के स्थानीय लोगों तक पहुंचाने के द्वारा mechanosensitive और MIAs संवेदीकरण (यानी, बढ़ाया प्रतिक्रिया, कम दहलीज, और / या mechanosensitivity के अधिग्रहण) के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है, दोनों (जैसे, भड़काऊ सूप (है), capsaicin, adenosine triphosphate (एटीपी))। हम उपकरण और colorectum-तंत्रिका रिकॉर्डिंग तैयारी, संलग्न पी.एन. या LSN, तंत्रिका fascicles से colorectum, एकल फाइबर रिकॉर्डिंग में RFS की पहचान के साथ colorectum की फसल, और आरएफ के लिए रसायनों के स्थानीय आवेदन का वर्णन है। इसके अलावा, तैयारी और मानकीकृत यांत्रिक उत्तेजना के आवेदन की चुनौतियों पर भी चर्चा कर रहे हैं।

Introduction

दर्द और अतिसंवेदनशीलता स्पष्ट pathobiological कारण या ऊतकों को नुकसान के अभाव में मौजूद हैं जो चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम (IBS) सहित कार्यात्मक गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों, से पीड़ित रोगियों की प्रबल शिकायत कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, IBS के रोगियों (पेट क्षेत्र के टटोलने का कार्य करने के लिए यानी, कोमलता) सामान्य आंत्र समारोह के दौरान गुदा गुब्बारा बढ़ाव और वृद्धि की संवेदनशीलता बढ़ प्रतिक्रियाओं सहित अतिसंवेदनशीलता,, साथ ही दैहिक सिफ़ारिश की अतिसंवेदनशीलता का प्रदर्शन एक। की, बेहतर समझ; कोलोरेक्टल afferents को लक्षित IBS के रोगियों में (guanylate साइक्लेस-सी एगोनिस्ट linaclotide 4-6 की मौखिक घूस जैसे, स्थानीय anesthetics 2,3 का इंट्रा-गुदा टपकाना) दर्द और अतिसंवेदनशीलता को समाप्त करने में कारगर साबित हो गया है क्योंकि colorectum की अभिवाही तंत्रिका वितरण महत्वपूर्ण है।

कोलोरेक्टल afferents सहित आंत afferents,, / रासायनिक nutrient- और थर्मल तौर तरीकों (जैसे, 7-9) का जवाब देने में सक्षम हैं। हालांकि, यांत्रिक उत्तेजनाओं (यानी, mechanosensitive afferents) का जवाब देने के आंत afferents किया गया है यांत्रिक उत्तेजनाओं (जैसे, luminal बढ़ाव, खिंचाव) आम तौर पर तकलीफ और दर्द 10-16 सहित होश में उत्तेजना, को जन्म दे रहे हैं कि उन क्योंकि सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया। इसके अलावा, विसरा भी सामान्यतः, यंत्रवत् असंवेदनशील afferents (MIAs) द्वारा innervated मूक या सो nociceptors 17 कहा जाता है। सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, MIAs यांत्रिक उत्तेजना का जवाब या बहुत अधिक प्रतिक्रिया 18 थ्रेसहोल्ड है, लेकिन सक्रिय हो जाते हैं और pathophysiological परिस्थितियों में mechanosensitivity अधिग्रहण और अतिसंवेदनशीलता के लिए योगदान कर सकते हैं नहीं है।

यहाँ वर्णित इन विट्रो तैयारी और प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम विकसित किया है और समुद्र में एक बिजली के प्रोत्साहन रणनीति कार्यरत colorectum 19 में दोनों mechanosensitive और मिया अंत की निष्पक्ष पहचान देने के लिए उड़ान ग्रहणशील अंत, के लिए आरसीएच। कोलोरेक्टल स्फूर्तिदान काठ का आंत-संबंधी (LSN) और श्रोणि तंत्रिका (पीएन) के रास्ते से प्राप्त होता है, और पाँच mechanosensitive वर्गों (serosal, श्लैष्मिक, मांसपेशियों, मांसपेशियों-श्लैष्मिक, मेसेंतेरिक) और एक मिया कक्षा 20 में वर्गीकृत किया जा सकता है कि कोलोरेक्टल afferents भी शामिल है। इस में इन विट्रो तैयारी का उपयोग करना, हम कोलोरेक्टल MIAs का अधिग्रहण mechanosensitivity LSN मार्ग में पी.एन. मार्ग में MIAs का 71% और MIAs का 23% अवगत जो एक भड़काऊ सूप (है), के लिए अपने ग्रहणशील क्षेत्रों का संक्षिप्त प्रदर्शन के बाद (संवेदनशील बनाना) में पाया गया कि 19। हम भी लंबे समय से स्थायी व्यवहार आंत अतिसंवेदनशीलता के संदर्भ में MIAs की लंबी अवधि के संवेदीकरण (अप करने के लिए 28 दिन) प्रलेखित (zymosan 21 या 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic एसिड के साथ intracolonic उपचार प्राप्त चूहों में, यानी (TNBS) 22)

mechanosensitive afferents, मांसपेशियों और मांसपेशियों-श्लैष्मिक afferents अलावा jove_content "> (यानी, खिंचाव के प्रति संवेदनशील होते हैं) और हानिकारक कोलोरेक्टल बढ़ाव 23,24 की एन्कोडिंग साधन बनना tonically colorectum की परिधीय खिंचाव सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि केवल कक्षाओं कर रहे हैं। एक कंप्यूटर नियंत्रित का उपयोग करना बल actuator, हम चपटी कोलोरेक्टल ऊतक के परिधीय दिशा में एक मानक, सजातीय, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ramped खिंचाव आवेदन किया है और आगे खिंचाव के प्रति संवेदनशील afferents के रूप में कम-सीमा और उच्च दहलीज 23 श्रेणीबद्ध किया। इसके अलावा, खिंचाव के संवेदीकरण के समय के पाठ्यक्रम intracolonic zymosan 21 या TNBS 22 उपचार के बाद -sensitive afferents आंत का दर्द और अतिसंवेदनशीलता में खिंचाव के प्रति संवेदनशील कोलोरेक्टल afferents की भूमिका सुझाव दे, व्यवहार आंत अतिसंवेदनशीलता की शुरुआत, दृढ़ता, और / या वसूली से मेल खाती है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल की समीक्षा की और पिट्सबर्ग संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

संशोधित क्रेब्स समाधान और परीक्षण दवा aliquots की 1. तैयारी

  1. 117.9 सोडियम क्लोराइड, 4.7 KCl, 25 3 NaHCO, 1.3 नाह 2 पीओ 4, MgSO 4 1.2, 2.5 2 CaCl, 11.1 ग्लूकोज़, दो सोडियम butyrate, 20 सोडियम एसीटेट: (मिमी में) में शामिल है कि संशोधित क्रेब्स समाधान के 6 एल बनाओ , 0.004 nifedipine (सहज मांसपेशी संकुचन ब्लॉक करने के लिए), और 0.003 इंडोमेथासिन (अंतर्जात prostaglandins के संश्लेषण ब्लॉक करने के लिए)। क्रमशः ऊतक विच्छेदन और एकल फाइबर रिकॉर्डिंग, के लिए ठंडा और गर्म क्रेब्स समाधान का उपयोग करें।
  2. किसी भी रासायनिक समाधान तैयार (जैसे है, capsaicin, एटीपी) वांछित सांद्रता में aliquots में।

Colorectum-तंत्रिका ऊतक 2. विच्छेदन

  1. Anesthetize और पुरुष चूहों euthanize (6-8 सप्ताह पुरानी, ​​20 - 30 ग्राम) में10 विस्थापित कि एक प्रवाह दर पर सीओ 2 चैम्बर - चूहों तक प्रति मिनट चैम्बर मात्रा का 30% छाती आंदोलन की अनुपस्थिति से संकेत के रूप में पूरी तरह से साँस लेने बंद करो।
  2. इसके तत्काल बाद, वक्ष कक्ष खुला काटने सही आलिंद perforating, और बर्फ ठंड क्रेब्स के एक पर्याप्त मात्रा (~ 500 मिलीलीटर) में माउस शव डुबो कर इच्छामृत्यु, रक्तहीन निम्नलिखित (4 डिग्री सेल्सियस) समाधान carbogen (95% ओ 2 के साथ bubbled , 5% सीओ 2)।
  3. ध्यान से सभी विसरा लेकिन कोलोन और पेल्विक अंगों को हटा दें। थोड़ा वक्ष डायाफ्राम से ऊपर T12 रीढ़ की हड्डी में खंड भर छमाही में माउस आड़ा काट और बर्फ के ठंडे युक्त विच्छेदन चैम्बर के लिए दुम आधा हस्तांतरण, क्रेब्स समाधान bubbled।
  4. एक stereomicroscope के तहत, मूत्रमार्ग के लिए उनके जंक्शनों पर transecting से मूत्राशय और प्रजनन अंगों को हटाने, और यह आम श्रोणिफलक धमनियों में bifurcates तक उतरते / उदर महाधमनी को हटा दें। पी.एन. या उनके surroundin से LSN नि: शुल्कजी कुंद विच्छेदन से ऊतकों और L6 और S1 कशेरुकी (पी.एन. के लिए) स्तंभ या T13 और (LSN के लिए) एल 1 कशेरुका स्तंभ में अपने उदर प्रवेश बिंदु तक श्रोणिफलक शिखा बाहर से तंत्रिका का पालन करें।
  5. जघन सहवर्धन और सही है और छोड़ दिया acetabular जोड़ों काटें, और श्रोणि अस्थि हटा दें। तंत्रिका कशेरुका स्तंभ में प्रवेश करती है जहां तक ​​colorectum के करीब से जुड़ी मांसपेशियों और संयोजी ऊतक से या तो पी.एन. या LSN ध्यान से मुक्त।
  6. ध्यान से बाहर का colorectum बेनकाब करने के लिए श्रोणि अस्थि बांटना। सातत्य में संलग्न पी.एन. या LSN के साथ बाहर का colorectum बाहर काटना।
  7. ऊतक चैंबर के स्नान डिब्बे से जुड़ी तंत्रिका साथ colorectum स्थानांतरण। आगे विच्छेदन से अत्यधिक संयोजी ऊतक निकालें, और विरोधी मेसेंतेरिक सीमा पर अनुलंबीय colorectum खुला।
  8. ऊपर का सामना करना पड़ श्लैष्मिक पक्ष के साथ, chambe की सिलिकॉन आधार में रिकॉर्डिंग डिब्बे से सटे colorectum की मेसेंतेरिक बढ़त पिनआर और एक शक्ति के प्रवर्तक से जुड़ा हुक का एक रेक करने के लिए colorectum की antimesenteric लंबाई देते हैं (चित्रा 1 में सचित्र और 2A चित्रा में फोटो खिंचवाने)।
  9. एक माउस छेद और फाटक से स्नान डिब्बे से जुड़ा है जो रिकॉर्डिंग डिब्बे में पी.एन. या LSN बढ़ाएँ। धीरे तंत्रिका पालन करने के लिए एक हाइड्रोफिलिक सतह प्रदान करता है जो रिकॉर्डिंग डिब्बे में एक छोटे से कांच के दर्पण पर तंत्रिका ट्रंक रखना। गर्म के साथ स्नान डिब्बे Superfuse (30-32 डिग्री सेल्सियस), क्रेब्स समाधान ऑक्सीजन और खनिज तेल के साथ रिकॉर्डिंग डिब्बे भरें।

3. एकल फाइबर रिकॉर्डिंग और ग्रहणशील क्षेत्र का स्थानीयकरण

  1. ध्यान से उच्च वृद्धि (- 60X 50) पर stereomicroscope के तहत पी.एन. या LSN से epineurium (तंत्रिका म्यान) वापस छील। ~ 100 माइक्रोन मोटाई के 8 तंत्रिका बंडलों - ठीक संदंश का प्रयोग, 5 में तंत्रिका ट्रंक तंग।
  2. प्लैटिनम iridium संदर्भ रखेंऊतक कक्ष में क्रेब्स समाधान के साथ संपर्क में इलेक्ट्रोड। क्रमिक रूप से एक ही सामग्री के बने रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड पर व्यक्तिगत तंत्रिका बंडलों जगह है।
  3. धीरे से ऊपर पथपाकर द्वारा और कोलोरेक्टल सतह नीचे कोलोरेक्टल afferents से ए पी एस आह्वान करने के लिए एक नरम पेंट ब्रश का प्रयोग करें। पहचाने जाने एपी (कार्रवाई संभावित) रिकॉर्डिंग के माध्यम से पेट के अंदर आना कि तंत्रिका बंडल (एस) का पता लगाएँ।
    नोट: पी.एन. और LSN भी मूत्राशय और अन्य पैल्विक अंगों अंदर आना।
  4. आगे 10 माइक्रोन मोटाई ~ के ठीक गुच्छा तंतु में तंत्रिका बंडल विभाजित है और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड पर एक व्यक्ति रेशा स्थान के लिए 30 ग्राम सुई सुझावों की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  5. विद्युत वर्तमान प्रसार का एक ~ 2 मिमी त्रिज्या जो उत्पादन suprathreshold उत्तेजना तीव्रता (10 मा परिमाण, 0.3 हर्ट्ज @ 0.5 मिसे अवधि), पर अभिवाही अंत उत्तेजित करने के लिए mucosal सतह को सीधा दौर इत्तला दे दी गाढ़ा इलेक्ट्रोड रखें। व्यवस्थित ढंग (~ 1.5 मिमी चरणों इलेक्ट्रोड ले जाएँ) चपटा colorectum की लंबाई और चौड़ाई के साथ ग्रहणशील अंत करने के लिए स्थानीय।
  6. एक अभिवाही समाप्त होने के लिए उत्साहित किया जाता है, कम से कम उत्तेजना तीव्रता (प्रोत्साहन दहलीज) की आवश्यकता है कि सक्रियण (ग्रहणशील क्षेत्र, आरएफ) की साइट इंगित करने के लिए इलेक्ट्रोड स्थिति को समायोजित। > 3 मा 19 एक प्रोत्साहन सीमा के साथ अंत त्यागें।
  7. प्रोत्साहन विरूपण साक्ष्य और संभावित कार्रवाई की शुरुआत के बीच चालन वेग से 1 (सीवी)) ग्रहणशील क्षेत्र (आरएफ) में उत्तेजक इलेक्ट्रोड और रिकॉर्डिंग साइट और 2) चालन देरी (जैसे, चित्रा 2B के बीच की दूरी) की गणना ।
    सीवी (एम / सेक) = दूरी (मिमी) / चालन देरी (मिसे)।

Mechanosensitive कोलोरेक्टल afferents 4. कार्यात्मक वर्गीकरण

  1. बिजली की उत्तेजना के द्वारा एक आरएफ लगाने के बाद, आरएफ के लिए निम्न तीन यांत्रिक उत्तेजनाओं लागू होते हैं:
    1. एक calibra की नोक दबाकर की जांच कर प्रोत्साहन का संचालनटेड वॉन फ्रे की तरह नायलॉन monofilament (0.4 और 1 ग्राम बल) लंबरूप चपटी colorectum पर आरएफ की ओर।
    2. धीरे आरएफ में एक छोटे से सतह कतरनी तनाव उत्पन्न करने के लिए एक ठीक नायलॉन फिलामेंट किनारा (10 मिलीग्राम बल) के साथ कोलोरेक्टल म्यूकोसा पथपाकर द्वारा पथपाकर प्रोत्साहन आचरण।
    3. एक ramped खिंचाव बल बचाता है, जो एक कंप्यूटर नियंत्रित बल actuator, का उपयोग कर परिधीय खिंचाव आचरण - कदम 2.8 में वर्णित हुक के रेक के माध्यम से colorectum के विरोधी मेसेंतेरिक बढ़त के साथ परिधीय दिशा में (0 5 करोड़ / सेकंड में 170 MN) ।
  2. Serosal के रूप में, श्लैष्मिक (जांच कर रही कुंद करने के लिए ही जवाब) afferents वर्गीकृत पेशी (परिधीय खिंचाव का जवाब और जांच कर रही कुंद) पेशी / श्लैष्मिक (परिधीय खिंचाव, श्लैष्मिक पथपाकर का जवाब और जांच कर रही कुंद), या (पथपाकर mucosal और जांच को कुंद करने के लिए जवाब) मिया (तीन यांत्रिक उत्तेजनाओं से किसी को उत्तरदायी नहीं)।
  3. केवल में (मेसेंतेरिक afferents के लिएमुश्किल हो जाता है कि LSN स्फूर्तिदान), बिजली की उत्तेजना से चुनिंदा को सक्रिय अन्त्रपेशी की जांच कर रही / मैकेनिकल पथपाकर द्वारा उनके ग्रहणशील अंत का पता लगाने के लिए।
  4. खिंचाव के प्रति संवेदनशील afferents (मांसपेशियों और मांसपेशियों-श्लैष्मिक) के लिए, ramped खिंचाव के दौरान पहली एपी उदाहरण भी देते हैं कि शक्ति के रूप में परिभाषित किया गया है जो प्रतिक्रिया सीमा निर्धारित करते हैं।
  5. Serosal afferents के लिए, कंप्यूटर नियंत्रित बल actuator के द्वारा संचालित ग्रहणशील क्षेत्र की जांच कर रही कबरा के स्तर आरोही करने के लिए अपनी प्रतिक्रिया दर्ज करते हैं।

ग्रहणशील अंत के 5. रासायनिक आवेदन / मॉड्यूलेशन

  1. एक यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक आधारभूत प्रतिक्रिया रिकॉर्ड (यानी, ramped खिंचाव, जांच कर रही कबरा, या श्लैष्मिक पथपाकर के जवाब)।
  2. कोट नीचे ट्यूबिंग (10 मिमी उच्च और 4 x 4 मिमी 2 वर्ग या 4 पीतल या स्टेनलेस स्टील, - 5 मिमी व्यास) के एक टुकड़े के किनारे वेसिलीन के साथ और colorectum पर ग्रहणशील क्षेत्र से अधिक जगह है।
  3. हटारासायनिक (एस) के लिए परीक्षण किया जा युक्त समाधान के 5 मिनट के 170 μl - क्रेब्स ट्यूबिंग अंदर समाधान है, और 3 के लिए ग्रहणशील समाप्त होने बेनकाब।
  4. रासायनिक आवेदन के दौरान अभिवाही की प्रतिक्रिया की निगरानी (कुछ afferents chemosensitive) कर रहे हैं।
  5. रसायन की कार्रवाई को समाप्त करने के लिए रासायनिक घोल और ट्यूबिंग निकालें। 4 के भीतर - 6 मिनट, आधारभूत प्रतिक्रिया के रूप में ही यांत्रिक प्रोत्साहन के लिए अभिवाही प्रतिक्रिया का परीक्षण करें।
  6. धो-बाहर की पर्याप्त अवधि (> 15 मिनट) के बाद फिर से मैकेनिकल प्रोत्साहन पुन: लागू।

6. रिकॉर्डिंग और भेदभाव एपी के spikes

  1. 20 kHz पर एक्सोन से दर्ज की गई विद्युत संकेतों digitize और एक कंप्यूटर से डेटा को बचाने के। एक ऑडियो निगरानी के द्वारा ऑन लाइन संकेत मॉनिटर।
  2. बंद लाइन एपी spikes के विश्लेषण और व्यक्तिगत कील waveforms के 25 प्रमुख घटक विश्लेषण पर आधारित एकल इकाइयों भेदभाव।
    नोट: एक रिकार्ड वें अधिक नहीं होनी चाहिएएक दो आसानी से discriminable सक्रिय इकाइयों।

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Representative Results

सेटअप चित्रा 1 में सचित्र है। यह एक सिलिकॉन लाइन स्नान डिब्बे और एक सन्निहित खनिज तेल से भरे डिब्बे में संलग्न तंत्रिका में colorectum कि घरों में एक कस्टम निर्मित ऊतक कक्ष शामिल है। दो डिब्बे चैम्बर एक सीएनसी मशीन द्वारा एक्रिलिक प्लास्टिक का एक ठोस ब्लॉक से machined किया गया था; दोनों डिब्बों के नीचे बाद में कोलोरेक्टल ऊतक के नीचे आसान पिन अनुमति देने के लिए फर्म सिलिकॉन के साथ लाइन में खड़ा किया गया था। छेड़ा तंत्रिका fascicles से कोशिकी ए पी एस एक उच्च आम मोड अस्वीकृति अनुपात (CMRR ~ 60 डीबी) के साथ एक कम शोर, बैटरी चालित अंतर एम्पलीफायर का उपयोग कर दर्ज कर रहे हैं। एम्पलीफायर का लाभ 0.3-10 kHz पर x10,000 और बैंड फिल्टर श्रृंखला के लिए निर्धारित है। Colorectum की बिजली की उत्तेजना कोलोरेक्टल म्यूकोसा के साथ संपर्क में एक गाढ़ा इलेक्ट्रोड के माध्यम से लगातार चालू मोड में एक ऑप्टिकली युग्मित उत्तेजक द्वारा दिया जाता है। यांत्रिक उत्तेजना (कोलोरेक्टल खिंचाव और जांच कबरा) एसी द्वारा दिया जाता हैबल प्रवर्तक omputer नियंत्रित। एक विज्ञापन कनवर्टर और उपयुक्त सॉफ्टवेयर यांत्रिक और बिजली उत्तेजनाओं के साथ ही रिकॉर्डिंग आरंभ करने के लिए वोल्टेज आदेश outputs के भेजने और अंतर एम्पलीफायर से कोशिकी एपी संकेतों अंकीयकरण द्वारा दोनों उत्तेजना और रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं की निगरानी। यांत्रिक और बिजली के शोर स्रोतों से अलग करने के लिए, ऊतक कक्ष, माइक्रोस्कोप और अंतर एम्पलीफायर एक साँस हवा की मेज पर घुड़सवार एक फैराडे पिंजरे के अंदर रखा जाता है।

2A चित्रा में दिखाया गया है, संलग्न तंत्रिका साथ colorectum, एक माउस से बाहर विच्छेदित विरोधी मेसेंतेरिक बढ़त के साथ खुले में कटौती, और सिलिकॉन लाइन ऊतक कक्ष में फ्लैट टिकी है; तंत्रिका आसन्न रिकॉर्डिंग कक्ष में एक कांच के दर्पण पर रखा गया है। दहलीज पर आरएफ की बिजली की उत्तेजना के जवाब में एक संभावित कार्रवाई (एपी) के एक प्रतिनिधि रिकॉर्ड चित्रा 2B में दिखाया गया। इस रिकॉर्ड में एपी प्रोत्साहन कला के पीछे lagsifact (•) अच्छी तरह से एक बिना मेलिनकृत सी फाइबर की रेंज में, 0.43 मी / सेकंड की एक गणना चालन वेग में जिसके परिणामस्वरूप रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए आरएफ से चालन देरी की वजह से 49 मिसे ने। (वॉन फ्रे तरह monofilaments, 1 ग्राम, और आरएफ के ठीक श्लैष्मिक पथपाकर, 10 मिलीग्राम के साथ आरएफ की जांच कर) हाथ से छुड़ाया उत्तेजनाओं को एक अभिवाही के विशिष्ट प्रतिक्रियाओं चित्रा -2 में हैं पर प्रदर्शित किया। इस रिकॉर्ड के दो आसानी से discriminable afferents होता है; केवल बड़े आयाम अभिवाही पथपाकर का जवाब। चित्रा 2 डी में दिखाया गया है, जांच कर रही करने के लिए अभिवाही प्रतिक्रियाएं भी colorectum पर एक ही साइट के लिए ठीक समय पर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य यांत्रिक बलों (5, 10, 20, 40 और 80 करोड़ की एक श्रृंखला के उद्धार एक कंप्यूटर नियंत्रित बल actuator के द्वारा मूल्यांकन किया गया, 5 सेकंड की अवधि)। इसी तरह, colorectum की परिधीय खिंचाव (0 - 5 करोड़ / सेकंड में 170 MN) चित्रा 2 ई में प्रदर्शित एक प्रतिनिधि प्रतिक्रिया के साथ एक ही actuator के द्वारा दिया जाता है

चित्रा 3 में दिखाया गया है, कोलोरेक्टल afferents कार्यात्मक तीन अलग यांत्रिक उत्तेजनाओं (ऊपर 4.2 कदम देखें) करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया प्रोफाइल्स पर आधारित छह वर्गों में वर्गीकृत किया जा सकता है। मेसेंतेरिक afferents के लिए छोड़कर सभी अभिवाही अंत बिजली की उत्तेजना से स्थित थे (ई-STIM; बाएं सबसे स्तंभ, तीर प्रोत्साहन विरूपण साक्ष्य संकेत मिलता है)। यंत्रवत् असंवेदनशील afferents (MIAs) तीन यांत्रिक उत्तेजनाओं का कोई जवाब नहीं है। (- 1.4 छ 0.4) इसके विपरीत, सभी mechanosensitive अंत की जांच करने के लिए जवाब। उनमें से, मांसपेशियों और मांसपेशियों-श्लैष्मिक अंत भी परिधीय खिंचाव से सक्रिय कर रहे हैं (0-170 MN), और इस तरह खिंचाव के प्रति संवेदनशील afferents कहा जाता है; पेशी-श्लैष्मिक अंत भी (10 मिलीग्राम) पथपाकर द्वारा सक्रिय कर रहे हैं। Mucosal अंत भी (10 मिलीग्राम) पथपाकर द्वारा सक्रिय है, लेकिन लगातार नहीं और serosal अंत या तो खिंचाव या पथपाकर से सक्रिय नहीं हैं। Mesenteric अंत यंत्रवत् ख से पहचाने जाते हैंअन्त्रपेशी भागने।

चित्रा -4 ए में प्रदर्शित 5 मिनट के द्वारा अलग लगातार तीन परिधीय हिस्सों द्वारा पैदा की एक खिंचाव के प्रति संवेदनशील अभिवाही से प्रतिनिधि प्रतिक्रिया कर रहे हैं। कील संख्या समान रूप से तीन डिब्बे में binned और दोनों प्रतिक्रिया परिमाण (कील संख्या) और प्रतिक्रिया दहलीज में उच्च reproducibility खुलासा, 4B चित्रा में उत्तेजना-प्रतिक्रिया कार्यों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं।

यह इन विट्रो colorectum-तंत्रिका तैयारी भी ग्रहणशील अंत अभिवाही करने के लिए रसायनों के स्थानीय आवेदन परमिट। रसायनों के संपर्क में शारीरिक रूप से colorectum के बाकी हिस्सों से आरएफ अलग करने के लिए कोलोरेक्टल म्यूकोसा के ऊपर पीतल या स्टेनलेस स्टील टयूबिंग रखकर अभिवाही आरएफ के आसपास के क्षेत्रों तक ही सीमित है। रासायनिक आवेदन निम्नलिखित ठेठ परिणामों में शामिल हैं: एक एसिड अतिपरासारी समाधान के आवेदन पर afferents (AHS 26, चित्रा 5A) के प्रत्यक्ष सक्रियण, कोई एक भड़काऊ सूप के आवेदन के बाद एक मिया द्वारा सक्रियण, लेकिन mechanosensitivity के अधिग्रहण (19 है, चित्रा 5 ब) है, के आवेदन (चित्रा 5C) के बाद यांत्रिक खंड की वृद्धि हुई प्रतिक्रिया (यानी, संवेदीकरण), और आवेदन के बाद यांत्रिक खिंचाव को कम प्रतिक्रिया cGMP की (चित्रा 5D)।

चित्रा 1
प्रयोगात्मक सेटअप की चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। Colorectum-तंत्रिका एक दो डिब्बे ऊतक कक्ष में रखा गया है और एक फैराडे पिंजरे से अन्य इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों से अंतर एम्पलीफायर सिर मंच के साथ अलग है। प्रत्येक अभिवाही आरएफ तीन यांत्रिक उत्तेजनाओं से colorectum की बिजली की उत्तेजना (ई-STIM) द्वारा की पहचान की और परीक्षण किया जाता है: नायलॉन monofilament की जांच, श्लैष्मिक पथपाकर और परिधीय खिंचाव। ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52310/52310fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. संलग्न श्रोणि तंत्रिका (ए) के साथ विच्छेदित colorectum की stereomicroscope के माध्यम से एक छवि बी -। ई प्रतिनिधि रिकॉर्ड दिखाते हैं। (बी) के एक संभावित कार्रवाई (एपी) बिजली की उत्तेजना के द्वारा पैदा की (प्रोत्साहन विरूपण साक्ष्य, •)। (सी) विशिष्ट प्रतिक्रियाओं monofilament की जांच कर रही है और श्लैष्मिक पथपाकर से आयोजित हाथ करने के लिए। (डी, ई) की जांच करने के लिए और कंप्यूटर नियंत्रित बल actuator के द्वारा दिया परिधीय खिंचाव को जवाब, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हमेशा ">:" रख-together.within पृष्ठ = के लिए "jove_content चित्रा 3
कोलोरेक्टल अभिवाही वर्गों के चित्रा 3. कार्यात्मक लक्षण वर्णन। Afferents बिजली की उत्तेजना से (ई-STIM, ↑) colorectum की स्थित और पांच mechanosensitive वर्गों में वर्गीकृत किया और एक यंत्रवत्-असंवेदनशील अभिवाही (मिया) वर्ग तीन के लिए अपने संबंधित प्रतिक्रिया प्रोफाइल्स पर आधारित हैं यांत्रिक उत्तेजनाओं:। जांच कर रही, पथपाकर, और खिंचाव के इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, कंप्यूटर नियंत्रित यांत्रिक उत्तेजना को चित्रा 4. अभिवाही के हिमायती हैं। (ए) के एक पेशी-श्लैष्मिक एक की प्रतिक्रियाएं(-; 5 मिनट के अंतर-उत्तेजना अंतराल 5 करोड़ / सेकंड में 170 करोड़ 0) लगातार तीन को fferent हिस्सों ramped। (बी) प्रतिक्रियाओं (संभावित कार्रवाई के spikes) समान रूप से तीन डिब्बे (- 57, 57-113, और 113 - 0 170 MN) में binned गया और उत्तेजना-प्रतिक्रिया कार्यों के रूप में प्रदर्शित; प्रतिक्रिया दहलीज इनसेट में प्रदर्शित किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
अंत ग्रहणशील के लिए स्थानीय रासायनिक आवेदन करने के लिए 5 चित्रा अभिवाही के हिमायती हैं। (ए) अम्लीय अतिपरासारी समाधान (AHS) के आवेदन करने के लिए एक serosal अभिवाही की chemosensitivity का एक उदाहरण है। समाप्त होने के एक मिया द्वारा (बी) mechanosensitivity (संवेदीकरण) के अधिग्रहण का एक उदाहरण है। इस मिया सीधे जवाब नहीं दियाएक भड़काऊ सूप (है), लेकिन बाद में जांच कर 1.4 जी monofilament के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की। (सी) संवेदीकरण (प्रतिक्रिया परिमाण और प्रतिक्रिया दहलीज में कमी में वृद्धि हुई है) ने अपनी जाता है समाप्त होने के प्रदर्शन के बाद एक पेशी अभिवाही की फैलाने के लिए। प्रतिक्रिया की (डी) क्षीणन चक्रीय ग्वानोसिन मोनोफास्फेट (cGMP) को इसके समाप्त होने के प्रदर्शन के बाद एक पेशी-श्लैष्मिक अभिवाही से फैलाने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ वर्णित इन विट्रो colorectum-तंत्रिका तैयारी अच्छी तरह से आंत का संवेदी न्यूरॉन्स पर अन्य गैर कार्यात्मक दृष्टिकोण (जैसे, सेलुलर आणविक, और histological अध्ययन) का पूरक है जो व्यक्ति कोलोरेक्टल afferents, के तंत्रिका एन्कोडिंग कार्य (अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका साबित हो गया है ) विवरण के लिए समीक्षा 27 को देखते हैं। Nociception और लंबी अवधि के कोलोरेक्टल अतिसंवेदनशीलता के लिए योगदान दे neuronal तंत्र खुलासा किया गया है और औषधीय जोड़तोड़ आंत का दर्द कम हो सकता है कि पता चला लक्ष्य है कि प्रदर्शन किया गया है। इस तैयारी के सफल कार्यान्वयन से जुड़े निम्नलिखित महत्वपूर्ण अंक नीचे चर्चा कर रहे हैं: बिजली के शोर के 1) में कमी, संकेत का पता लगाने में 2) वृद्धि हुई है, और अभिवाही एन्कोडिंग के परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए एक मानकीकृत प्रोत्साहन के 3) चयन। इसके अलावा, इस तकनीक के कई सीमाओं चर्चा कर रहे हैं।

कार्रवाई क्षमता (ए पी एस) propagati130 एम वी - एनजी intracellularly तंत्रिका साथ एक्सोन आम तौर पर 100 का एक transmembrane क्षमता है। हालांकि, की वजह अक्षतंतु झिल्ली के छोटे विशिष्ट समाई करने के लिए, यह अपेक्षाकृत बड़े विध्रुवण ही आसानी से एक विद्युत प्रतिबाधा काफी कम है (जो आसपास के कोशिकी ऊतक / मध्य द्रव में नष्ट कर सकते हैं जो कोशिका झिल्ली भर में एक छोटे से बिजली के प्रभारी विस्थापन, में यह परिणाम लिपिड झिल्ली से अधिक)। तंत्रिका तंतु / एक्सोन से कोशिकी रिकॉर्डिंग के लिए, बिजली के संकेत सफल रिकॉर्डिंग के लिए शोर कम करने के लिए पहली प्राथमिकता प्रतिपादन, एक ठेठ bioelectrical रिकॉर्डिंग सेटअप के साथ जुड़े थर्मल / सफेद शोर की भयावहता के करीब microvolts, की रेंज में आम तौर पर है। सबसे अधिक प्रभावी ढंग परिवेश बिजली के शोर से बचाने के लिए, यह ऊतक कक्ष, रिकॉर्डिंग और ग्राउंडिंग इलेक्ट्रोड, अंतर एम्पलीफायर (डीसी बैटरी संचालित) और एक फैराडे पिंजरे में stereomicroscope के स्थान के लिए सहायक हो सकता है। यदि आंदोलन विरूपण साक्ष्ययांत्रिक कंपन मददगार है गीला हो जाना एक साँस हवा की मेज पर फैराडे पिंजरे रखने होते हैं। आदर्श रूप में, "+" और दर्ज करें कि रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड "-" अंतर एम्पलीफायर के बंदरगाहों, क्रमशः, उनके आम जमीन के लिए तुलनीय प्रतिबाधा रिश्तेदार होना चाहिए और एक दूसरे के करीब स्थित हो। इस प्रकार, किसी बाहरी शोर दोनों इलेक्ट्रोड द्वारा समान रूप से के बारे में दर्ज की गई और अंतर एम्पलीफायर द्वारा कड़े आम मोड अस्वीकृति के अधीन हो जाएगा।

रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड काफी प्रतिबाधा के ठीक एक तंत्रिका तंतु के साथ संपर्क में है, जबकि हमारे सेटअप (2A चित्रा) में, संदर्भ इलेक्ट्रोड ऊतक कक्ष में क्रेब्स छिड़काव समाधान में डूबा हुआ है। एक nontrivial प्रतिबाधा बेमेल साथ इस एकल इलेक्ट्रोड विन्यास शोर कम करने के लिए आम तौर पर आदर्श नहीं है। हालांकि, इस विन्यास केवल एक electr पर ठीक तंत्रिका तंतु रखने की सुविधा प्रदान करता है(- 15 मिमी 10) सीमित लंबाई का माउस कोलोरेक्टल तंत्रिका तंतु से जब रिकॉर्डिंग विशेष रूप से अपील कर रही है, जो स्तोत्र,। चोटी से पीक पृष्ठभूमि शोर रिकॉर्ड में 20 μV नीचे है जब हमारे अनुभव के आधार पर, एकल इलेक्ट्रोड विन्यास स्वीकार्य है। अन्यथा, आगे शोर में कमी ठीक तंत्रिका तंतु एक दूसरे के समानांतर रखा दोनों रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ संपर्क में हो गया है, जिसमें एक दो इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग विन्यास की मांग करेगा। फैराडे पिंजरे के अंदर सभी बड़े धातु भागों एक आम जमीन, हमारे सेटअप में एक तांबे ब्लॉक करने के लिए एक स्टार की तरह ढंग से जमीन की जरूरत है। केयर जमीन छोरों के गठन से बचने के लिए लिया जाना है।

ए पी एस के कोशिकी पता लगाने सुनिश्चित करने के लिए पहला कदम colorectum-तंत्रिका ऊतक के सफल विच्छेदन है। बन्द रखो या अचल तंत्रिका क्षति और एपी चालन को प्रभावित कर सकते हैं, जो विच्छेदन के दौरान तंत्रिका परहेज किया जाना चाहिए खींच रहा है। विच्छेदित तंत्रिका स्टेम भी टी की जरूरत हैओ क्षतिग्रस्त और विध्रुवण द्वारा तंत्रिका चालन ब्लॉक कर सकते हैं जब पोटेशियम जो लीक किसी भी जुड़ा मांसपेशियों के ऊतकों, से मुक्त हो। इस विच्छेदन कौशल आम तौर पर महीने के लिए सप्ताह से अधिक मेहनती अभ्यास के माध्यम से प्राप्त कर लिया और हैंडलिंग और सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करने में आंख हाथ समन्वय और निपुणता के एक उच्च स्तर की मांग कर रहा है। इसके अलावा, कोलोरेक्टल ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए, बिजली के खोज रणनीति एक कुंद, गोल टिप और अपेक्षाकृत बड़े व्यास (बाहरी Φ0.55 मिमी, आंतरिक Φ0.125 मिमी) है और यह द्वारा एक micromanipulator से जुड़ा है कि एक गाढ़ा इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल एक मामूली यांत्रिक शक्ति में जिसके परिणामस्वरूप एक शिकायत पुल, mucosal सतह (~ 100 मिलीग्राम) के लिए आवेदन किया। रिकॉर्डिंग का पता लगाने में एक बड़ा संकेत प्राप्त करने के लिए आदेश में, एपी प्रेरित ट्रांसमेम्ब्रेन वर्तमान मोड़ा जाना चाहिए और तंत्रिका अक्षतंतु (एस) और इलेक्ट्रोड सतह के बीच एक छोटे से प्रतिबाधा पुल बनाने के द्वारा इलेक्ट्रोड पर "फंस"। पृथक कि इस प्रकार, epineurium और perineuriumतंत्रिका 10 माइक्रोन मोटी ~ के ठीक तंतु में तंत्रिका बंटवारे की प्रक्रिया के दौरान मुक्त विच्छेदित किए जाने की जरूरत है। एपी प्रेरित ट्रांसमेम्ब्रेन वर्तमान अक्षतंतु झिल्ली से एक कम दूरी के भीतर काफी dissipates है, क्योंकि एक पतली तंत्रिका तंतु कारण आम तौर पर इलेक्ट्रोड सतह के लिए एक्सोन 'करीब निकटता के लिए एक बेहतर संकेत करने वाली शोर अनुपात में परिणाम है। खनिज तेल के चैम्बर में, तंत्रिका अक्सर पर रख दिया गया है कि दर्पण क्रेब्स समाधान (कांच की सतह हाइड्रोफिलिक है) की एक पतली परत को आकर्षित करती है। यह रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और तंत्रिका तंतु रिकॉर्डिंग के दौरान दर्पण की सतह के साथ संपर्क में नहीं हैं कि इस प्रकार आवश्यक है। इलेक्ट्रोड और दर्पण की सतह के बीच एक कम प्रतिबाधा पुल प्रदान जो क्रेब्स समाधान के किसी भी अवशिष्ट बूंदों, (यानी, shunting) काफी रिकार्ड में संकेत आयाम कम हो जाएगा।

उजागर करने के बाद यह colorectum-तंत्रिका तैयारी afferents के कार्यात्मक परिवर्तन के अध्ययन के परमिटरासायनिक मध्यस्थों और इन विट्रो में अपमान की एक किस्म के रूप में अच्छी तरह के रूप में लंबे समय तक pathophysiological शर्तों के संदर्भ में RFS (जैसे, पहले से इलाज चूहों से ली गई colorectums)। उच्च परिशुद्धता और reproducibility और 2) मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं कि अभिवाही प्रतिक्रियाओं के साथ 1) एक मानकीकृत प्रोत्साहन: afferents के कार्यात्मक परिवर्तन का एक उद्देश्य उपाय निम्न पर निर्भर करता है। आरएफ की उत्तेजनाओं की जांच कर रही है और पथपाकर colorectum करने के लिए आवेदन तीन यांत्रिक उत्तेजनाओं, अक्सर हाथ से आयोजित वॉन फ्रे तरह monofilaments द्वारा वितरित कर रहे हैं। जांच के लिए, monofilament आमतौर पर झुकने जब एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सीधा बल देने के लिए calibrated है। कोलोरेक्टल सतह (124.8 किलो पास्कल 0.4 जी के लिए और सीधा करने के लिए आवेदन किया है लेकिन, जब वॉन फ्रे तरह monofilaments (0.4 और 1 ग्राम) एक उच्च नाममात्र तनाव में जिसके परिणामस्वरूप छोटे और अलग पार के अनुभागीय व्यास (0.2 और 0.3 मिमी, क्रमशः) है, 1 ग्राम के लिए 138.7 किलो पास्कल), एक तीव्र, कबरा मैकेनिकल प्रोत्साहन Beyonसामान्य शारीरिक सीमा होगी। इसके अलावा, रेशा की तेज धार की संभावना नाममात्र तनाव (तनाव एकाग्रता) की तुलना में काफी अधिक फोकल शिखर तनाव के साथ तनाव के असमान वितरण के कारण बनता है। ठेठ आरएफ आकार (1 मिमी 2) एक monofilament के पार अनुभाग, और reproducibly एक हाथ से आयोजित monofilament के साथ समान साइट को प्रोत्साहित करने में असमर्थता की तुलना में काफी बड़ा है यह देखते हुए कि, यह अलग है कि दोहराया उत्तेजनाओं को प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करने के लिए आम बात है काफी एपी आवृत्ति और अवधि में। एक उदाहरण के रूप में, संभावना असमर्थता द्वारा करने के लिए योगदान कर रहे हैं, जो काफी विविध एक ही हाथ से आयोजित monofilament (1 जी) द्वारा चित्रा -2 में दिखाया जांच कर प्रतिक्रियाओं का reproducibly लगातार उत्तेजनाओं के बीच समान साइट और चर अवधि और अंतराल की जांच करने के लिए। Mucosal एक हाथ से आयोजित रेशा द्वारा दिया पथपाकर इसी तरह चुनौती दे रहा है और यह भी एक ही अभिवाही से चर प्रतिक्रियाओं का आह्वान करने के लिए जाता है। प्रोत्साहन reproducibility के हो सकते हैंजांच कर रही सटीक (और खिंचाव) बलों वितरित करने के लिए एक कंप्यूटर नियंत्रित बल प्रवर्तक का उपयोग करके सुधार। जांच के लिए, हम एक बड़ा व्यास के साथ एक monofilament का उपयोग (जैसे, # 6.45, 1 मिमी) और पूरी तरह से एक ठेठ अभिवाही आरएफ 24,28 को शामिल किया गया है। कंप्यूटर नियंत्रित परिधीय खिंचाव, आरएफ के लिए निर्देशित अन्य ऊतक खींच दृष्टिकोण करने के लिए विरोध के रूप में, संभव है, जिससे colorectum की लंबाई भर में सजातीय विरूपण की अनुमति देता है तुलनीय परिधीय यांत्रिक तनाव (यानी, शून्य पर आधारित अपने मूल बेलनाकार विन्यास में कोलोरेक्टल बढ़ाव के साथ सहसंबंध - 45 मिमी पारा intraluminal दबाव 23) - 170 करोड़ खिंचाव 0 के बराबर है। खिंचाव बल विरोधी मेसेंतेरिक किनारे पर समान रूप से लागू किया जाता है के बाद से, नहीं सीधे आरएफ के लिए, अभिवाही आरएफ पर पैदा स्थानीय यांत्रिक तनाव फैलाने का लगातार अनुप्रयोगों के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। इसके अलावा, एल प्रकार सीए 2 + चैनल अवरोधक nifedipine मैं करने के लिए स्नान के लिए कहाnhibit सहज चिकनी मांसपेशियों में संकुचन, ramped खिंचाव परीक्षण 23 के बीच कोलोरेक्टल अनुपालन के रखरखाव के लिए योगदान देता है। अंत में, ramped खिंचाव प्रोटोकॉल के अभिवाही प्रतिक्रियाएं उत्तेजना-प्रतिक्रिया समारोह और प्रतिक्रिया दहलीज दोनों में छोटे परिवर्तनशीलता के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साबित किया है (जैसे, चित्रा 4)। इस प्रकार, ramped खिंचाव के लिए अभिवाही प्रतिक्रियाओं का व्यापक रूप से आंत का दर्द और अतिसंवेदनशीलता (जैसे, 19-22,24,26,28-31) की न्यूरोनल तंत्र के अध्ययन में अभिवाही समारोह के परिवर्तन का एक उद्देश्य मूल्यांकन के रूप में इस्तेमाल किया गया है।

colorectum-तंत्रिका तैयारी कोलोरेक्टल आंत afferents के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, यह भी कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि में संवेदी न्यूरॉन्स की सेल शरीर के axons आणविक उन सेल निकायों की पहचान (जैसे, एकल कोशिका आरटी पीसीआर या tr के अध्ययन precluding, तैयारी में transected रहे हैंकोलोरेक्टल afferents के विभिन्न वर्गों) के anscriptome विश्लेषण। दूसरा, एकल फाइबर रिकॉर्डिंग के कम संकेत करने वाली शोर अनुपात काफी अन्य प्रयोगशालाओं में इस प्रोटोकॉल के व्यापक आवेदन सीमित इष्टतम शल्य विच्छेदन / तंत्रिका बंटवारे कौशल और कम शोर रिकॉर्डिंग की मांग। तीसरा, इस में इन विट्रो तैयारी ऐसी स्वायत्त तंत्रिका तंत्र, हार्मोन और साइटोकिन्स, आंतों microbiota परिसंचारी, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से मॉडुलन उतरते ही आंत सनसनी मिलाना कि प्रणालीगत कारकों की जांच करने के लिए लागू नहीं हो सकता।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica MZ16 stereo microscope Leica Microsystems Inc.
Leica IC D camera Leica Microsystems Inc.
Amplifier World Precision instruments, Inc. SYS-DAM80 Low-noise differential amplifier
Two-compartment tissue chamber Custom made
Power1401 Cambridge Electronic Design Limited Power1401 Data acquisition, analog signal input/out
Spike2 v5.02 Cambridge Electronic Design Limited Software package that works with the Power1401
Audio monitor Natus Am 8
Square pulse stimulator Natus S48 To deliver electrical stimuli
Photoelectric isolation unit Natus PSIU6 Stimulus isolation to reduce noise
Concentric bipolar microelectrode FHC Inc. CBFFG75 To deliver electrical stimuli
Dual-mode lever system Aurora Scientific Inc. Series 300C To deliver mechanical stimuli
Forceps Fine Science Tools 11252-00 Forceps with fine tips

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