स्पाइनल कॉर्ड संपीड़न चोट के कैलिब्रेटेड संदंश मॉडल

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McDonough, A., Monterrubio, A., Ariza, J., Martínez-Cerdeño, V. Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury. J. Vis. Exp. (98), e52318, doi:10.3791/52318 (2015).

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Abstract

Murine रीढ़ की हड्डी के संपीड़न चोटों रीढ़ की हड्डी में चोट (एससीआई) और रीढ़ की हड्डी में पुनर्योजी चिकित्सा के अध्ययन के लिए मूल्यवान पशु मॉडल हैं। संपीड़न चोट के calibrated संदंश मॉडल एससीआई के लिए एक सुविधाजनक, कम लागत, और बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पशु मॉडल है। हम Plemel एट अल द्वारा प्रकाशित विधि के अनुसार संशोधित संदंश की एक जोड़ी का इस्तेमाल किया। (2008) पार्श्व 0.35 मिमी की दूरी के लिए रीढ़ की हड्डी सेक करने के लिए। इस वीडियो में, हम संशोधित संदंश के साथ रीढ़ की हड्डी के संपीड़न द्वारा पीछा रीढ़ की हड्डी, बेनकाब करने के लिए एक पृष्ठीय laminectomy प्रदर्शन करेंगे। वीडियो में, हम भी paraplegic प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल से संबंधित मुद्दों को संबोधित करेंगे। इस चोट मॉडल अनुभूति में परेशानी होती है, साथ ही बिगड़ा hindlimb हरकत समारोह प्रदर्शन है कि चूहों पैदा करता है। Immunohistochemical विधियों द्वारा निर्धारित रूप में इसके अलावा, चोट की इस पद्धति, एससीआई की विकृति में लगातार aberrations के उत्पादन करता है। इस vid देखने के बादईओ, दर्शकों की चोट के बाद हानि को कम करने के लिए बनाया गया एससीआई और / या उपचार पर अध्ययन के लिए माउस में विभिन्न कठोर अनुशासन की एससीआई के उत्पादन के लिए आवश्यक आपूर्ति और तरीकों का निर्धारण करने में सक्षम होना चाहिए।

Introduction

एससीआई के पशु मॉडल रीढ़ की हड्डी को आघात का एक परिणाम के रूप में नुकसान को कम करने के लिए डिज़ाइन चिकित्सकीय मानदंड की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं। प्रयोगात्मक आवश्यकता से बाहर, इन मॉडलों, हरकत और संवेदी व्यवहार में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घाटे उपलब्ध कराने गंभीरता भिन्न की चोटों का उत्पादन करने के लिए समायोज्य हो सकता है, और है कि चोट की गंभीरता मनाया स्नायविक घाटे की डिग्री के साथ संबद्ध प्रदर्शन होगा। Transection, कुचलन, और संपीड़न 1: अलग चोट की सुविधाओं के साथ एससीआई के तीन मुख्य प्रकार हैं। संक्षेप में, एक transection चोट रीढ़ की हड्डी के लिए एक पंगु बनाना है, एक contusion चोट पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के लिए लागू एक संक्षिप्त, फोकल बल से उठता है, और एक संपीड़न चोट एक हानिकारक बल रीढ़ की हड्डी के लिए लागू किया जाता है, जब होता है, और यह भी हो सकता है एक क्रश चोट 2 के रूप में भेजा।

पूरा transection चोटों कुचलन एक है, जबकि मनुष्य के तीन में चिकित्सकीय दुर्लभ हैंडी संपीड़न चोटों अधिक आम हैं। संपीड़न चोट उदाहरण, ट्यूमर संपीड़न या अन्य हानिकारक compressive बलों के लिए, की वजह से मानव एससीआई में पाया जाता है क्या करने के लिए इसी तरह की एक परिणाम पैदा करता है, और उपकरणों का एक सरल सरणी का उपयोग किया जा सकता है। Contusion और संपीड़न चोटों दोनों एक compressive शक्ति हैं और दोनों ऐसे cytoarchitectonic विप्लव के रूप में इसी तरह के रोग सुविधाएँ, है कि में इसी तरह के हैं, और चोट 1,4 करने के लिए इसी तरह की अंतर्जात प्रतिक्रियाओं का आह्वान। कुचलन चोट मॉडल आमतौर पर स्पाइनल कॉलम 2,5,6 का कसाव से उत्पन्न एससीआई के मानवीय मामलों के समान तरीके में एक विशेष उपकरण का उपयोग कर पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के लिए इस बल लागू होता है। इसके विपरीत, संपीड़न चोटों पीछे की ओर या पार्श्व बल लागू करने के तरीकों की एक किस्म के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। एक संपीड़न चोट के तरीके संदंश 7, धमनीविस्फार क्लिप 2 calibrated, या रीढ़ की हड्डी 8 पर सीधे एक वजन रखने शामिल है। का एक लाभधमनीविस्फार क्लिप वे बल 9 के विभिन्न मात्रा में उपलब्ध कराने में सक्षम हैं। रीढ़ की हड्डी सीधे 8 के पृष्ठीय सतह के लिए वजन जोड़ने की विधि काफी वजह से श्वसन की वजह से वजन और आंदोलन की नियुक्ति करने के लिए सर्जरी की लंबाई बढ़ाने और विसंगतियों, जिसके परिणामस्वरूप में 10 मिनट के लिए जगह में होना करने के लिए वजन की आवश्यकता है जानवर। कारण इस तरह के कुचलन चोटों के लिए impactors के रूप में चूहों में इस्तेमाल के लिए डिजाइन विशेष apparatuses में पशुओं situating चूहों के छोटे आकार के, के लिए मुश्किल हो सकता है या असंगत चोटों 7 में परिणाम। हालांकि, चूहों एससीआई अनुसंधान के लिए बहुत उपयोगी होते हैं कि इस तरह के चूहों या खरगोश जैसे बड़े जानवरों के विपरीत, ट्रांसजेनिक उपभेदों की एक विस्तृत रेंज में उपलब्ध हैं।

रीढ़ की हड्डी सेक करने के लिए calibrated संदंश का उपयोग करने का Plemel विधि चोट की गंभीरता और न्यूरोलॉजिकल घाटा 7 के बीच संबंध का एक उच्च डिग्री के साथ एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एससीआई उत्पन्न करता है। इस शल्य चिकित्सा एससीआई मॉडल हैया तो धातु epoxy या पूर्ण बंद करने से रोकने के लिए कुछ अन्य बाधा द्वारा एक निर्धारित दूरी पर अलग आयोजित होने के लिए संशोधित नहीं 5 Dumont संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर उत्पन्न। इस इंजीनियर रिक्ति यह सुनिश्चित करता है कि हमेशा एकाधिक सर्जरी में एक निश्चित चौड़ाई के करीब है और विभिन्न उपयोगकर्ताओं द्वारा संदंश। Plemel विधि का लाभ calibrated संदंश का उत्पादन करने के लिए सामग्री को आसानी से खरीदा है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना प्रयोगशाला में इकट्ठा किया जा सकता है। ये संदंश वाष्पदावी और नसबंदी के कई दौर का सामना कर सकते हैं, और एक अलग, भारी उपकरण की कमी सर्जरी streamlines।

इस वीडियो में हम एक संपीड़न चोट उत्पन्न करने के लिए माउस रीढ़ की हड्डी पर calibrated संदंश की एक जोड़ी की शल्य चिकित्सा उपयोग के प्रदर्शन। हम भी बाद operatively उनके जीवन की गुणवत्ता में सुधार लाने और मृत्यु दर को कम करने के लिए रीढ़ की हड्डी घायल प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल करने के लिए संबंधित अद्वितीय चिंताओं को दूर।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं और जानवरों की देखभाल के तरीकों संस्था के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए।

1. शल्य चिकित्सा की तैयारी

  1. संदंश, Vana कैंची, roungeurs, प्रतिकर्षक, नलियां, कैंची, टांके, त्वचा स्टेपल, क्यू टिप्स, बाँझ खारा, शल्य स्पंज, और isoflurane: सभी आवश्यक सर्जिकल उपकरण और अभिकर्मकों इकट्ठे। तैयार है और सर्जरी से पहले शल्य चिकित्सा उपकरणों की एक पूरी पैक आटोक्लेव। एक से अधिक माउस पर सर्जरी प्रदर्शन करने वाले हैं, तो तैयार है और पशु प्रति उपकरणों में से एक पैकेट आटोक्लेव, या शल्य चिकित्सा उपकरणों का एक पैकेट आटोक्लेव और सर्जरी के बीच में एक उपकरण अजीवाणु साथ बाँझ। एक गिलास मनका उपकरण terilizer बीच में सर्जरी (5 जानवरों के बाद उपकरण को फिर से साफ किया जाना चाहिए और उपयोग करने से पहले निष्फल) उपकरण साफ करने के लिए प्रयोग किया जाता है आम तौर पर, निष्फल उपकरणों में से एक पैक 5 चूहों अप करने के लिए पर इस्तेमाल किया जा सकता है। Instituti के लिए अपने स्थानीय IACUC व्यवस्थापक से संपर्क करेंविशिष्ट दिशा निर्देशों पर।
  2. 70% isopropyl शराब पोंछे के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र जीवाणुरहित। एक बाँझ क्षेत्र सर्जरी के दौरान बनाए रखा है सुनिश्चित करने के लिए शल्य चिकित्सा पर्दे सेट करें।
  3. सर्जरी से पहले प्रत्येक माउस वजन। Subcutaneously, buprenorphine की 0.05 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की एक खुराक प्रशासन।
  4. Isoflurane मशीन की प्रेरण कक्ष में 4% की एक खुराक पर isoflurane प्रशासन द्वारा पशु anesthetize।
  5. पशु anesthetized एक बार, निर्जलीकरण को रोकने के 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग पैड पर पशु सेट, और माउस के सिर ठीक से संज्ञाहरण कोन में स्थित है यह सुनिश्चित करने के लिए आंखों को मरहम लागू होते हैं। (नोट: थर्मल जलता कारण नहीं होगा कि एक हीटिंग स्रोत का उपयोग करें, यानी, एक परिसंचारी पानी कंबल, गर्म पानी की बोतल, या समकक्ष।।) इस बिंदु पर पशु के लिए 2% isoflurane की एक खुराक प्रशासन।
  6. माउस के उद्देश्य से चीरा स्थान के आसपास लगभग 1 सेमी पृष्ठीय सतह दाढ़ी।
  7. चीरा के कीटाणुरहितएक आयोडीन के घोल (10% povidone आयोडीन, 1% उपलब्ध आयोडीन) के साथ तो, 70% isopropyl शराब पोंछे के साथ धोने से ite। तीन बार दोहराएँ।

2. पृष्ठीय Laminectomy

  1. एक चीरा बनाने से पहले, पशु ठीक से पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी विधि का उपयोग सजगता के लिए जाँच के द्वारा anesthetized है कि सुनिश्चित करते हैं।
  2. स्केलपेल और ब्लेड के साथ पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के साथ एक चीरा बनाओ, और उसके बाद फिर से सजगता के लिए जाँच करें। ठीक से मदद ऐसे कशेरुकाओं के बीच की सीमाओं के रूप में स्थलों, कल्पना करने के लिए वापस मेहराब।
  3. त्वचा के माध्यम से कट। वापस रीढ़ की हड्डी से त्वचा और प्रावरणी धारण करने के लिए प्रतिकर्षक डालें। रीढ़ की हड्डी को कवर करने की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए रीढ़ की हड्डी के दोनों तरफ के ऊतकों को साफ़ करें।
    नोट: सर्जन संरचनात्मक स्थलों से परिचित होना चाहिए। उदाहरण के लिए, कंधे की हड्डी के अवर कोण T7 के साथ मेल खाती है। माउस की रीढ़ की हड्डी के प्राकृतिक वक्र के शीर्ष T12 है और एक संदर्भ बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. पी के साथनट प्रकाश, कशेरुकाओं के बीच की जगह का निर्धारण। T10 के पीछे अंत का पता लगाएं और intervertebral डिस्क स्थान को सीधा मांसपेशियों और प्रावरणी काटा। T10 के spinous प्रक्रिया और पीछे लामिना का पर्दाफाश करने के लिए अभी पर्याप्त काटें।
  5. ठीक इत्तला दे दी ड्यूमॉन्ट # 5 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, रीढ़ की हड्डी के एक छोटे से मुट्ठी भर लोगों को बेनकाब करने के पटल और spinous प्रक्रिया से ऊतक के कुछ को हटा दें। जब आवश्यक हो, स्पाइनल कॉलम को स्थिर करने के लिए ऊतक संदंश का उपयोग करें।
  6. बांस की dorsolateral पक्ष के साथ और सिर्फ पटल के नीचे छोटे Vana कैंची की एक जोड़ी के एक तरफ डालने से laminectomy प्रदर्शन करते हैं।
    1. छोटे, सावधान snips वर्टिब्रल लामिना के पार्श्व पक्ष के माध्यम से कटौती करने के लिए सुनिश्चित करें। कोई दबाव रीढ़ की हड्डी के लिए लागू किया जाता है सुनिश्चित करें।
    2. दूसरी तरफ दोहराएँ।
    3. रीढ़ की हड्डी के लिए दबाव लागू नहीं करने के ख्याल रख रही है, एक क्यू की नोक या शल्य स्पंज के साथ आवश्यक के रूप में खून बह रहा रोकने के लिए कोमल दबाव लागू करें।
      नोट: जेल फोम की तैयारीखून बह रहा आवश्यकताओं से नियंत्रित किया जा करने के लिए है कि घटना में बाँझ खारा में भिगो।
    4. चीरों लाए जाने के बाद, बांस के पृष्ठीय पहलू बंद उठा और धीरे किसी भी ऊतक संलग्नक साफ है। यदि आवश्यक हो तो खून बह रहा नियंत्रित करने के लिए उपयुक्त साधन का प्रयोग करें।

3. स्पाइनल कॉर्ड संपीड़न

  1. Roungeurs या laminectomy के संदंश का प्रयोग, संपीड़न चोट के लिए calibrated संदंश रीढ़ की हड्डी के दोनों तरफ बैठा कर सकते हैं ताकि रीढ़ की हड्डी के पार्श्व पक्षों कशेरुकी अस्थि के लिए स्वतंत्र हैं कि सुनिश्चित करते हैं। संदंश की बाहों कशेरुका नहर की मंजिल तक पहुंचने के लिए सक्षम होना चाहिए आसन्न रीढ़ की हड्डी के पक्ष और संदंश के सुझावों पर एपीड्यूरल अंतरिक्ष के भीतर रखा जा करने में सक्षम होना चाहिए।
    1. रीढ़ की हड्डी की है कि दृश्यता अच्छा है सुनिश्चित करें।
  2. रीढ़ की हड्डी के उजागर खंड के बीच में 5 संदंश लगभग calibrated ड्यूमॉन्ट # बैठा। याद है कि बल की बाहोंपुनश्च आसन्न पक्षों पर एपीड्यूरल अंतरिक्ष के भीतर रखा जाना चाहिए और सुझावों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोटों उत्पन्न करने के लिए कशेरुका नहर की फर्श को छूने चाहिए।
  3. Spacers के कनेक्ट जब तक ध्यान से रीढ़ की हड्डी सेक। 15 सेकंड के लिए जगह में पकड़।
  4. धीरे दबाने बल जारी है और रीढ़ की हड्डी से calibrated संदंश हटा दें। बाँझ खारा घाव बंद कर दिया है पहले homeostasis को हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

4. घाव समापन

  1. ध्यान से बाधित या रीढ़ की हड्डी के लिए दबाव लागू नहीं करने के ख्याल रख रही है, रीढ़ की हड्डी से अधिक मांसपेशियों की परत सीवन।
  2. घाव पर त्वचा को बंद करने के टांके या स्टेपल या तो उपयोग करें।
  3. गैस संवेदनाहारी का उपयोग अगर, / घटना संवेदनाहारी बंद करने के लिए शुरू करते हैं।
  4. सर्जरी के दौरान और पशु सुस्त और चोट से उबरने है जब सर्जरी के बाद निर्जलीकरण के लिए खाते में मदद करने के लिए 10 ग्राम शरीर के वजन के प्रति Lactated ringers के 0.1 मिलीलीटर प्रशासन। समाधान warme होना चाहिएइंजेक्शन के लिए पहले शरीर के तापमान को डी।
  5. एक बिस्तर से मुक्त पिंजरे में माउस रखें। अन्य आधे से एक आर टी काउंटर पर आराम कर रहा है, जबकि पिंजरे देने के लिए, पिंजरे क्षेत्र के आधे पैड पर होने की अनुमति देता है एक तरह से (1.1.5 में वर्णित के रूप में) एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर आराम करना चाहिए माउस जलवायु विकल्पों में यह चल रहा है एक बार। "वसूली पिंजरे" एक शांत वातावरण में स्थित है यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना। यह माउस के बिस्तर के साथ एक नियमित पिंजरे को हस्तांतरित किया जा सकता है, जो समय पर चेतना, आ गया है जब तक बारीकी से पशु की निगरानी।

5. पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल

  1. दर्द के लक्षणों का प्रबंधन करने के लिए जरूरत के रूप में सर्जरी के बाद, तब सर्जरी के बाद पहले तीन दिनों के लिए buprenorphine subcutaneously हर 12 घंटा / किग्रा शरीर के वजन 0.05 मिलीग्राम की एक खुराक, प्रशासन और।
  2. सर्जरी के बाद 5 दिन - पहले 3 के लिए Lactated ringers (10 ग्राम शरीर के वजन subcutaneously प्रति 0.1 एमएल) की एक खुराक प्रशासन। इस खुराक दे जब / अगरimal इस प्रारंभिक समय अवधि के बाहर निर्जलीकरण के लक्षण प्रदर्शन करने के लिए शुरू होता है।
  3. मैन्युअल दो बार दैनिक Crede पैंतरेबाज़ी का उपयोग जानवरों के मूत्राशय व्यक्त करते हैं। धीरे मूत्राशय पता लगाने के लिए पशु के पेट टटोलना, और मूत्राशय खाली है तब तक कोमल नीचे दबाव लागू होते हैं।
    1. मूत्राशय खाली नहीं करता है या मूत्र खूनी या बादल है, तो 10 दिनों के लिए interperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से पशु को Baytril के शरीर के वजन से 50 मिलीग्राम / किग्रा प्रशासन।
  4. भोजी, निर्जलीकरण, और अत्यधिक वजन घटाने (शरीर के वजन के 20% से अधिक) के लक्षण के लिए जानवरों की निगरानी करें। एक जानवर इन लक्षणों के किसी भी अनुभव तो उपचार के विकल्प के संबंध के साथ तुरंत एक पशु चिकित्सक से परामर्श करें, या IACUC दिशा निर्देशों का पालन एक मानवीय तरीके से पशु euthanize करें।
    1. गतिशीलता सही सर्जरी के बाद सीमित किया जा सकता है कि यह देखते हुए, यकीन है कि जानवरों के भोजन और पानी के लिए उपयोग किया बनाने के लिए आवश्यक कदम उठाए। के रूप में अच्छी तरह से एक, गीला भोजन पूर्व पैकएस हाइड्रोजेल, इन उदाहरणों में जानवरों के लिए उपलब्ध कराया जा सकता है।

6. संपीड़न चोट से उत्पन्न ऊतकों को नुकसान का आकलन

  1. चरणों 1.4 और 1.5 में वर्णित के रूप में पशु anesthetize। पैर के अंगूठे चुटकी और निगरानी के कॉर्निया झपकी सजगता से संज्ञाहरण की गहराई से जाँच करें। पशु उत्तेजनाओं के प्रति असंवेदनशील हो गया है, 6.2 कदम आगे बढ़ना।
  2. एक intracardial छिड़काव 10 प्रदर्शन करते हैं।
    1. छाती गुहा का पर्दाफाश और बाएं निलय में एक सुई डालें। ठंडा 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 25 मिलीलीटर - 15 के द्वारा पीछा 30 मिलीलीटर बर्फ ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) - 20 के साथ मौजूदा तरल पदार्थ बाहर निकलवाने।
  3. रीढ़ की हड्डी को निकाल दें।
    1. रीढ़ की हड्डी को त्वचा पृष्ठीय काटें और स्पाइनल कॉलम की लंबाई आसपास के किसी भी अतिरिक्त ऊतक दूर साफ है।
    2. आबकारी स्पाइनल कॉलम और किसी भी शेष ऊतक दूर काटा। laminectomy और मैं के वास्तविक स्तरnjury पसलियों की गिनती से इसकी पुष्टि की जा सकती है।
    3. एक दुम-टू-व्याख्यान चबूतरे वाला दिशा में स्पाइनल कॉलम के छोटे वर्गों को विस्थापित करने के लिए Vanna कैंची और संदंश का प्रयोग करें। गर्भनाल को सुरक्षित हटाने की अनुमति के लिए पर्याप्त सामने आ रहा है जब तक कटौती करने के लिए आगे बढ़ें। काटने के स्थान और प्रक्रिया के दृश्य एक स्टिरियोस्कोप के उपयोग के माध्यम से मदद की जा सकती है।
  4. 4% पीएफए ​​में रीढ़ की हड्डी के ऊतकों रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इस समाधान में पद तय करने के लिए ऊतक की अनुमति दें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 30% sucrose में incubating द्वारा Cryoprotect ऊतक।
  6. अक्टूबर में ऊतक शामिल करें। संक्षेप में, 30% सूक्रोज ऊष्मायन से ऊतक लेने के लिए और किसी भी अतिरिक्त समाधान निकालें। अक्टूबर से भरा एक cryomold में ऊतक प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस से मोल्ड निकालें, ऊतक के दिशात्मक उन्मुखीकरण की पुष्टि (सूखी बर्फ पर 1 घंटे के लिए पूर्व ठंडा) 2-methylbutane के एक उथले डिश में ढालना डाल दिया है और अक्टूबर पूरी तरह से दृढ़ करने की अनुमति देते हैं। तुरंत या sto के प्रयोग अगर सूखी बर्फ पर रखें-80 डिग्री सेल्सियस पर कर रहे हैं।
  7. एक cryostat का उपयोग कर 20 माइक्रोन बाण के समान वर्गों में ऊतक में कटौती। स्लाइड पर सीधे माउंट ऊतक। उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  8. Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) दाग प्रदर्शन करते हैं।
    1. संक्षेप में, ऊतक (5 मिनट, 2 बार), Hematoxylin (2.5 मिनट) के साथ दाग rehydrate, और पानी (1 मिनट, 2 बार) से धो लें।
    2. 50% में ऊतक सेते हैं और फिर 70% इथेनॉल (3 मिनट प्रत्येक), eosin (45 सेकंड) के साथ दाग, और 90% (5 सेकंड), 95% (5 सेकंड) में ऊष्मायन से निर्जलीकरण, 100% इथेनॉल (2 मिनट) , और isopropanol (2 मिनट)।
    3. Xylene (5 मिनट, 3 बार) के साथ साफ़।
      नोट: एच एंड ई धुंधला विशिष्ट ऊतक मोटाई और शर्तों के साथ अलग अलग होंगे। इसलिए, मानकीकरण प्रयोगात्मक ऊतकों के नमूनों के साथ आगे बढ़ने से पहले आवश्यक है।
  9. एक पतली Permount की पट्टी (~ 100 माइक्रोन) और coverslip के साथ ऊतक कवर। तरल पदार्थ के समुचित वितरण सुनिश्चित करने के लिए coverslip के सभी पक्षों पर नीचे दबाएँ। स्लाइड हे / एन सूखी हैं।
  10. विज़साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक डिजिटल माइक्रोस्कोप और कब्जा छवियों का उपयोग ऊतक वर्गों ualize।

Representative Results

0.25 मिमी (एन = 4), 0.35 मिमी (एन = 4) और 0.55 मिमी में रीढ़ की हड्डी compressions के द्वारा पीछा ऊपर वर्णित के रूप में - (30 ग्राम 25), (एन = 4) हम 12 चूहों पर एक laminectomy प्रदर्शन किया। हम तीन में जानवरों का बलिदान (एन = 6) और सात (एन = 6) intracardiac छिड़काव द्वारा दिनों के बाद चोट। रीढ़ की हड्डी स्पाइनल कॉलम से हटा दिया गया था, और ऊतकों को तैयार है और ऊपर वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था। पूरे रीढ़ की हड्डी की छवियाँ एक Leica EZ4 डिजिटल माइक्रोस्कोप और साथ सॉफ्टवेयर के साथ ले जाया गया। रीढ़ की हड्डी वर्गों की छवियाँ एक ओलिंप डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग और सॉफ्टवेयर के साथ 2X बढ़ाई पर ले जाया गया।

हम रीढ़ की हड्डी संपीड़न संपीड़न (चित्रा 1) के स्थल पर उपरिकेंद्र के साथ एक चोट है कि उत्पादन पाया। चोट के प्रभाव व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम दिशाओं में कई मिलीमीटर का विस्तार। spacers के बीच की दूरी को कम किया है के रूप में चोट की गंभीरता वृद्धि हुई (0.25 मिमी> 0.35 मिमी>0.55 मिमी, चित्रा 2)। तीन दिन संपीड़न के बाद चोट के उपरिकेंद्र पर खून और चोट के बाद 7 दिनों के उपस्थित नहीं था कि आस-पास के क्षेत्रों में वहां गया था। 0.25 मिमी और 0.35 मिमी compressions के एक गुहा, लेकिन नहीं .55 मिमी मॉडल का उत्पादन किया। सात दिनों के बाद, पृष्ठीय और उदर सफेद बात काफी हद तक ग्रे मामले संगठन अत्यधिक विकृत किया गया था, उपरिकेंद्र पर आकार में कमी आई है, और cavitation लगातार था। ये cytoarchitectonical परिवर्तन मोटर और पशुओं के व्यवहार में संवेदी परिवर्तन में अनुवाद कर रहे हैं कि हम पिछले प्रकाशनों 8 में प्रदर्शन के रूप में इस तरह के लोकोमोटर फंक्शन के लिए बस्सो माउस स्केल और संवेदी समारोह के लिए वॉन फ्रे बाल और एथिल क्लोराइड परीक्षण के रूप में उपयुक्त परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया है।

चित्र 1
बरकरार रीढ़ की हड्डी के चित्रा 1. प्रतिनिधि छवियों से पहले और वायुसेना दोनोंआतंकवाद की चोट। (ए) बरकरार रीढ़ की हड्डी। (बी) 0.35 मिमी संपीड़न के बाद रीढ़ की हड्डी। तीर की चोट की सीमा से संकेत मिलता है। तारांकन चोट के उपरिकेंद्र indentifies। डी = पृष्ठीय, एल = लेटरल। स्केल बार:। 0.50 मिमी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
पहले और अलग संपीड़न चौड़ाई में संपीड़न चोट के बाद माउस रीढ़ की हड्डी के 2. प्रतिनिधि छवियों चित्रा। (ए) के नियंत्रण रीढ़ की हड्डी के बाण के समान अनुभाग। (बी) एक 0.35 एमएम एससीआई सात दिनों के बाद संपीड़न चोट (डीपीआई) के उपरिकेंद्र पर राज्याभिषेक अनुभाग। (सी, ई, जी) 3 डीपीआई 0.25 की चौड़ाई के लिए रीढ़ की हड्डी डोरियों के बाण के समान वर्गों , 0.35 या 0.55 मिमी। (डी, एफ, एच) एच एंड ई के बाण के समान वर्गों दाग रीढ़ की हड्डी7 0.25, 0.35 या 0.55 मिमी की चौड़ाई के लिए डीपीआई। तारांकन चोट के उपरिकेंद्र indentifies। सभी वर्गों एच एंड ई के साथ दाग। डी = पृष्ठीय, एल = लेटरल। स्केल बार:। 1.25 मिमी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एक एससीआई मॉडल के विकल्प एससीआई के मानवीय मामलों के लिए उपचार की प्रभावकारिता निर्धारित करने के प्रयोगों को डिजाइन करने में महत्वपूर्ण है। इस तरह के प्रयोगों अनिर्णायक डेटा में हो सकता है कि परिवर्तनशीलता सीमित करने के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि एक पशु मॉडल की आवश्यकता होती है। उन्होंने यह भी सही रूप में वे मॉडलिंग कर रहे हैं मानव की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए नैदानिक ​​प्रासंगिकता की होनी चाहिए। कि अंत करने के लिए, एक transection के ऊपर एक compressive या contusive चोट चुनने अधिक चिकित्सकीय 3 प्रासंगिक है। हालांकि, कुचलन चोटों के लिए impactors और वजन छोड़ apparatuses महंगा और जटिल मशीनरी के उपयोग की आवश्यकता है। इसके विपरीत, एससीआई के calibrated संदंश मॉडल आम प्रयोगशाला सामग्री से आसानी से इकट्ठा कर रहे हैं कि संदंश संशोधित इस्तेमाल करता है, और सर्जरी रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए एक मानक पृष्ठीय laminectomy के बाद केवल एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता है। हालांकि, इस पद्धति का उपयोग करने का एक दोष यह है कि compressive ताकत हमेशा की तरह, पार्श्व बल्कि पीछे की ओर से लागू किया जाता है वह यह है किसबसे अधिक बार विधि कुचलन मॉडल 1,2 से ऊतक का एक बड़ा व्याख्यान चबूतरे वाला दुम हद तक प्रभावित कर का उपयोग कर उत्पन्न एससीआई 9, और compressive चोटों के मानव नैदानिक ​​मामलों में देखा जाता है। इस मॉडल को तकनीक के originators द्वारा प्रदर्शन किया गया है, और हमें, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एससीआई 7,11 उत्पन्न करने के लिए, और चूहों के आकार को अच्छी तरह से अनुकूल है। जानवरों जानवरों की एक पलटन एक ही चोट की गंभीरता का हिस्सा है कि सत्यापित करने के लिए इस तरह की हरकत के लिए बस्सो माउस स्केल और वॉन फ्रे बाल परीक्षण के रूप में व्यवहार परीक्षण, के एक भीड़ का उपयोग सर्जरी और चिकित्सीय उपचार के बाद मूल्यांकन करने के लिए इसके अलावा, इस चोट मॉडल की अनुमति देता है और न्यूरोलॉजिकल घाटा 7,11-13। ये वही तकनीक भी एससीआई 2,7 के लिए उपचारों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल पशु मॉडल के लिए सामान्य मानदंडों को पूरा करने, खोजी अध्ययन के दौरान जानवरों को दिलाई उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

calibrated forcep उत्पादन की विधिचोट मॉडल के लिए आसान है और अलग अलग तरीकों की एक किस्म के साथ पूरा किया जा सकता है। हम Plemel 7 द्वारा प्रकाशित के रूप में, स्पेसर विधि 11 का इस्तेमाल किया है, और यह भी संपीड़न डिवाइस बनाने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है, जो न केवल एक छोटा सा पेंच, का उपयोग संदंश संशोधित किया है, लेकिन यह भी की, अंतिम संपीड़न चौड़ाई का समायोजन में बहुमुखी प्रतिभा के लिए अनुमति देता है तुलनात्मक अध्ययन के लिए लाभ। संदंश बनाने में विकल्पों की सीमा के इतने लंबे समय स्पेसर (ओं) को हमेशा ही दूरी संदंश बंद करने के लिए एक स्थिर साधन उपलब्ध कराने और वाष्पदावी और नसबंदी सामना कर सकते हैं के रूप में लगभग असीमित है। इस वीडियो के भीतर वर्णित शल्य चिकित्सा पद्धतियों हालांकि यह laminectomy के प्रदर्शन और रीढ़ की हड्डी में वृद्धि हो सकती है कि किसी भी अतिरिक्त compressive बलों ग्रस्त नहीं है कि इतनी प्रक्रिया का प्रदर्शन किया गया है के बाद पशु suturing जब ध्यान रखा जाना आवश्यक है कि, उपयोगकर्ताओं को भर में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं चोट की गंभीरता और भविष्य प्रयोगों उलझाना। उचित प्रशिक्षण और अभ्यास के साथ, संपीड़न चोट के calibrated संदंश मॉडल मनुष्य 2,3,7 में मनाया नैदानिक ​​मामलों की नकल है कि चूहों में एससीआई के प्रदर्शन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। चोट की वजह गंभीरता के भिन्न डिग्री के चूहे, संदंश बनाने के उत्पादन की आसानी के लिए आसानी से किया जा सकता है। इस ट्रांसजेनिक चूहों में गंभीरता के भिन्न डिग्री के एससीआई पर आनुवंशिक प्रभाव का अवलोकन करने के साथ ही चूहों में स्टेम सेल प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए महान लाभ के लिए किया जाएगा। साहित्य में अध्ययन के बहुमत के कारण आम तौर पर प्रदर्शन करने के लिए सर्जरी आसान बना देता है जो उनके आकार, के लिए चूहों पर प्रदर्शन किया गया है। हालांकि इस वीडियो में Plemel एट अल। 7 से प्रकाशित किया है और हमारे द्वारा वर्णित विधि बड़ी आसानी और reproducibility के साथ चूहों पर किया जाना एससीआई सक्षम होना चाहिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane machine Smiths Medical PM, Inc VCT302
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical NDC: 66794-013-25
Dissecting Scope Seiler Precision Microscopes SSI 202/402
Germinator-500 (tool sterilizer) Thomas Scientific 3885A20
Puralube (eye ointment) Dechra NDC 17033-211-38
Scalpel handle (#3) Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blade (#11) Fisher Scientific  08-914B
Retractor (Colibri) Fine Science Tools 17000-03
Friedman Pearson roungeur Fine Science Tools 16021-14
Vanna (Castroviejo) scissors Roboz RS-5658
Tissue forceps Fine Science Tools 11029-14
Laminectomy forceps (Dumont #2) Fine Science Tools 11223-20
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20
Stapler Fine Science Tools 12031-07
Staples (wound clips) Reflex7 203-1000
Sutures Henry Schein 101-2636
Needles (30 G x ½) BD Biomedical 305106
Syringe (1 ml) BD Biomedical 309659
Baytril (enrofloxacin) Bayer NADA 140-913
Buprenex (buprenorphine) Cardinal Health NDC 12496-0757-1

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References

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