Calibrado Fórceps Modelo de Lesão Medular Compression

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McDonough, A., Monterrubio, A., Ariza, J., Martínez-Cerdeño, V. Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury. J. Vis. Exp. (98), e52318, doi:10.3791/52318 (2015).

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Abstract

Lesões de compressão da medula espinhal murino são valiosos modelos animais para o estudo da lesão medular (SCI) e terapia regenerativa espinhal. O modelo de lesão compressão forceps calibrado é um conveniente, de baixo custo, e modelo animal muito reprodutível para SCI. Foi utilizado um par de fórceps modificados de acordo com o método publicado por Plemel et al. (2008), para comprimir lateralmente a medula espinal a uma distância de 0,35 mm. Neste vídeo, iremos demonstrar uma laminectomia dorsal para expor a medula espinhal, seguido de compressão da medula espinal com o fórceps modificados. No vídeo, vamos também abordar questões relacionadas com os cuidados de animais de laboratório paraplégicos. O modelo de lesão produz camundongos que apresentam prejuízo na sensação, assim como o comprometimento da função dos membros posteriores locomotor. Além disso, este método produz lesão de aberrações consistentes na patologia da SCI, conforme determinado por métodos imuno-histoquímicos. Depois de assistir a este video, os espectadores deve ser capaz de determinar as fontes e métodos necessários para a produção de várias gravidades SCI no rato para os estudos sobre a SCI e / ou tratamentos concebidos para mitigar prejuízo após a lesão.

Introduction

Modelos animais de SCI são ferramentas valiosas para avaliar a eficácia de paradigmas terapêuticas destinadas a mitigar os danos como conseqüência do trauma na medula espinhal. Em caso de necessidade experimental, estes modelos devem fornecer défices reprodutíveis no locomotora e os comportamentos sensoriais, ser ajustável para produzir lesões de gravidade diferente, e demonstrar que a gravidade da lesão correlaciona com o grau de déficit neurológico observado. Existem três tipos principais de SCI com características distintas de lesão: transection, contusão, e compressão 1. Resumidamente, uma lesão é uma laceração transecção da medula espinhal, uma contusão surge a partir de uma breve força, aplicada focal para a espinal medula dorsal, e uma lesão por compressão ocorre quando uma força é aplicada prejudicial para a medula espinhal, e pode também ser referido como uma lesão por esmagamento 2.

Lesões transecção completa são clinicamente rara em seres humanos 3, enquanto uma contusãod lesões de compressão são mais comuns. A lesão de compressão produz um resultado semelhante ao que é encontrado em SCI humana causada por, por exemplo, por compressão do tumor ou outras forças compressivas prejudiciais, e pode ser realizada utilizando um simples conjunto de ferramentas. Ferimentos contusos e compressão são semelhantes em que ambos são uma força de compressão e ambos têm características patológicas semelhantes, como desorganização citoarquitetônicos, e evocam respostas endógenas semelhantes a lesão 1,4. O modelo de lesão por contusão geralmente aplica-se esta força com a medula espinal dorsal utilizando um aparelho especial de uma maneira semelhante aos casos humanos de LM resultantes de uma impacção da coluna vertebral 2,5,6. Em contraste, as lesões de compressão podem ser gerados por uma variedade de métodos de aplicação de força dorsalmente ou lateralmente. Métodos de uma lesão de compressão incluem pinças 7, clips de aneurisma calibrada 2, ou colocando um peso diretamente na medula espinhal 8. Uma vantagem doclips de aneurisma é que eles são capazes de fornecer quantidades diferentes de força 9. O método de adição de pesos para a superfície dorsal da medula espinhal directamente 8 requer o peso de estar no lugar durante 10 minutos, aumentando drasticamente o comprimento da cirurgia e resultando em inconsistências devido à colocação do peso e o movimento devido à respiração do animal. Devido ao tamanho pequeno dos ratos, situando animais em aparelhos especializados para a utilização em ratos, tais como pêndulos para lesões contusas, pode ser difícil ou causar ferimentos inconsistentes 7. No entanto, os ratinhos são disponíveis em uma ampla gama de estirpes transgénicas, ao contrário dos animais maiores tais como coelhos ou ratos que são muito úteis para a investigação SCI.

O método Plemel de usar fórceps calibrados para comprimir a medula espinhal gera um SCI reprodutível com um elevado grau de correlação entre a gravidade da lesão e déficit neurológico 7. Este modelo SCI cirúrgico égerado usando um par de fórceps Dumont No. 5 adaptados para serem mantidas afastadas a uma distância definida por um epoxi de metal ou algum outro obstrução para impedir o fechamento completo. Este espaçamento engenharia garante que a pinça vai sempre perto de uma determinada largura de múltiplas cirurgias e por diferentes usuários. A vantagem do método é que Plemel os materiais para produzir as pinças calibrados podem ser facilmente adquiridos e montados no laboratório sem necessidade de equipamento especializado. Esta pinça pode suportar vários ciclos de tratamento em autoclave e esterilização, e pela falta de um aparelho separado, volumoso simplifica cirurgias.

Neste vídeo demonstramos a utilização cirúrgica de um par de pinças calibrados na medula espinal do rato para gerar uma lesão por compressão. Nós também lidar com as preocupações originais relacionados ao cuidado de medula espinhal feridos animais de laboratório para melhorar a sua qualidade de vida no pós-operatório e reduzir a mortalidade.

Protocol

Todos os procedimentos com animais e métodos de cuidados de animais deve ser aprovado pela Institutional Animal Care e Uso Comitê da instituição (IACUC).

1. Preparação Cirúrgica

  1. Montar todos os instrumentos cirúrgicos necessários e reagentes: fórceps, tesouras vana, roungeurs, afastador, bisturis, tesouras, suturas, grampos de pele, cotonetes, soro fisiológico estéril, esponjas cirúrgicas, e isoflurano. Preparar e autoclave um pacote completo de ferramentas cirúrgicas antes da cirurgia. Se a realização de cirurgias em mais de um rato, preparar e autoclave de um pacote de ferramentas por animal, ou autoclave de um pacote de instrumentos cirúrgicos e esterilizar com um esterilizador ferramenta entre cirurgias. Geralmente, um pacote de ferramentas esterilizadas podem ser utilizadas em até 5 ratinhos se uma ferramenta terilizer esferas de vidro é usado para limpar as ferramentas no meio cirurgias (5 animais após as ferramentas devem ser re-limpos e esterilizados antes da utilização). Por favor, verifique com o administrador IACUC local para INSTITUTIsobre as orientações específicas.
  2. Esterilizar o campo cirúrgico com 70% de algodão embebido em álcool isopropílico. Configurar campos cirúrgicos para garantir um campo estéril é mantida durante a cirurgia.
  3. Pesar cada rato antes da cirurgia. Administrar uma dose de 0,05 mg / kg de peso corporal de buprenorfina, por via subcutânea.
  4. Anestesiar o animal através da administração de isoflurano a uma dose de 4% na câmara de indução da máquina de isoflurano.
  5. Uma vez que o animal é anestesiado, aplicar pomada para os olhos para impedir a desidratação, definir o animal numa almofada de aquecimento a 37 ° C, e assegurar que a cabeça do rato está adequadamente situado no cone de anestesia. (Nota: Utilizar uma fonte de aquecimento que não irá causar queimaduras térmicas, ou seja, uma manta de circulação de água, a garrafa de água quente, ou equivalente..) Neste ponto de administrar uma dose de 2% de isoflurano para o animal.
  6. Raspar a superfície dorsal do rato, aproximadamente 1 cm ao redor do local da incisão que se destina.
  7. Desinfetar a incisão site por lavagem com 70% de toalhetes de álcool isopropílico, em seguida, com uma solução de iodo (10% Povidona-iodo, 1% de iodo disponível). Repita 3 vezes.

2. Dorsal Laminectomy

  1. Antes de fazer uma incisão, garantir que o animal está devidamente anestesiados, verificando reflexos usando o método pitada toe ou cauda.
  2. Faça uma incisão ao longo da espinha dorsal com bisturi e lâmina, e, em seguida, verificar se há reflexos novamente. Arquear as costas para ajudar a visualizar correctamente pontos de referência, como as fronteiras entre as vértebras.
  3. Corte através da pele. Insira afastador para manter a pele e fáscia de volta da medula espinhal. Limpar o tecido em ambos os lados da medula espinal para expor os músculos que cobrem a espinha.
    NOTA: O cirurgião deve estar familiarizado com os marcos anatômicos. Por exemplo, o ângulo inferior da escápula corresponde com T7. A parte superior da curva natural da medula do rato é T12 e pode ser utilizado como um ponto de referência.
  4. Com piluminação Roper, determinar o espaço entre as vértebras. Encontre a extremidade posterior do T10 e cortar músculos e fáscia perpendicular ao espaço em disco intervertebral. Corte apenas o suficiente para expor o processo e posterior lamina espinhoso de T10.
  5. Utilizando um par de ponta fina Dumont # 5 fórceps, remover uma parte do tecido da lâmina e processo espinhoso para expor uma pequena porção da medula espinhal. Quando necessário, utilizar uma pinça para estabilizar a coluna vertebral.
  6. Realizar a laminectomia, inserindo um lado de um par de tesouras pequenas vana ao longo do lado dorsolateral da vértebra e logo abaixo da lâmina.
    1. Faça pequenas, snips cuidadosas para cortar a lateral da lâmina vertebral. Assegure-se que não é aplicada pressão para a medula espinhal.
    2. Repita no outro lado.
    3. Aplique uma leve pressão para parar o sangramento, se necessário com um Q-tip ou esponja cirúrgica, tendo o cuidado de não aplicar pressão sobre a medula espinhal.
      Nota: Preparar espuma gelembebido em solução salina estéril no caso em que as necessidades de sangramento a ser controlada.
    4. Uma vez que as incisões foram feitas, retire o aspecto dorsal da vértebra e limpar suavemente quaisquer acessórios de tecido. Utilize os meios adequados para controlar o sangramento, se necessário.

3. compressão da medula espinhal

  1. Usando fórceps ou roungeurs laminectomia, assegurar que os lados laterais da medula espinal são livres de osso vertebral, de modo que a pinça calibrada para a lesão por compressão pode situar em ambos os lados da medula espinal. Os braços da pinça deve ser capaz de ser colocado no interior do espaço epidural em lados adjacentes da espinal medula e as pontas das pinças tem de ser capaz de atingir o chão do canal vertebral.
    1. Certifique-se de que a visibilidade da medula espinhal é bom.
  2. Situar o calibrado Dumont # 5 fórceps aproximadamente no meio do segmento exposto da espinal-medula. Recorde-se que os braços da forçaps deve ser colocada dentro do espaço epidural em lados adjacentes e as pontas deve tocar o solo do canal vertebral para gerar lesões reprodutíveis.
  3. Comprimir cuidadosamente a medula espinal até que os espaçadores ligar. Mantenha no lugar por 15 segundos.
  4. Suavemente libertar a força de compressão e remover as pinças calibrados a partir da medula espinal. Salina estéril deve ser usada para recuperar antes da homeostase ferida é fechada.

4. Wound Encerramento

  1. Suturar com cuidado a camada muscular ao longo da medula espinal, tendo o cuidado de não perturbar ou aplicar pressão para a medula espinhal.
  2. Utilize qualquer suturas ou grampos para fechar a pele sobre a ferida.
  3. Se estiver usando gás anestésico, começam a afunilar / desligar o anestésico.
  4. Administrar 0,1 ml de Ringer com lactato por 10 g de peso corporal para ajudar a conta para a desidratação durante a cirurgia e após a cirurgia quando o animal está letárgico e se recuperando da lesão. A solução deve ser warmed a temperatura do corpo antes da injecção.
  5. Posicione o mouse em uma gaiola sem roupa de cama. A gaiola deveria assentar no topo de uma almofada de aquecimento (conforme descrito em 1.1.5) de uma maneira que permite que metade da superfície da gaiola estar na almofada, enquanto a outra metade está apoiada sobre um contador de RT, a fim de dar a opções de clima do mouse uma vez que é ambulatorial. Tome cuidado para garantir que a "gaiola de recuperação" está localizado em um ambiente silencioso. Acompanhar de perto o animal até que ele recuperou a consciência, momento em que o rato pode ser transferido para uma gaiola regular com roupa de cama.

Cuidados 5. Pós-operatório

  1. Após a cirurgia, administrar uma dose de 0,05 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por via subcutânea a cada 12 horas durante os primeiros 3 dias após a cirurgia, e em seguida, conforme necessário para controlar os sintomas de dor.
  2. Administrar uma dose de Ringer com lactato (0,1 ml por 10 g de peso corporal por via subcutânea) para os primeiros 3-5 dias após a cirurgia. Dê esta dose se / quando a umimal começa a exibir sinais de desidratação fora deste período de tempo inicial.
  3. Expressar manualmente a bexiga dos animais utilizando a manobra Crede duas vezes por dia. Gentilmente apalpar o abdômen do animal para localizar a bexiga, e em seguida, aplicar uma pressão descendente suave até a bexiga está vazia.
    1. Se a bexiga não se esvazia ou a urina é sangue ou nublado, administrar 50 mg / kg por peso corporal de Baytril para o animal, por injecção intraperitoneal, durante 10 dias.
  4. Monitorizar os animais quanto a sinais de autofagia, desidratação e perda excessiva de peso (superior a 20% do peso corporal). Se um animal experimenta algum destes sintomas, consulte um veterinário imediatamente com relação a opções de tratamento, ou a eutanásia do animal de forma humana seguindo orientações IACUC.
    1. Dado que a mobilidade pode ser limitado logo após a cirurgia, tomar as medidas necessárias para garantir que os animais têm acesso a comida e água. Pré-embalados alimentos úmidos, bem como umas hidrogel, pode ser disponibilizado para animais nestes casos.

6. Avaliar os danos do tecido resultante da lesão Compression

  1. Anestesiar animal, tal como descrito nas etapas 1.4 e 1.5. Verifique a profundidade da anestesia, pela pitada toe e monitoramento dos reflexos de pestanejar córnea. Quando o animal é insensível aos estímulos, vá para o passo 6.2.
  2. Executar uma perfusão intracardíaca 10.
    1. Expor a cavidade torácica e inserir uma agulha no interior do ventrículo esquerdo. Lave fluidos existentes com 20 - 30 ml de fosfato gelada solução salina tamponada (PBS) seguida de 15 - 25 ml de gelado a 4% de paraformaldeído (PFA).
  3. Remover a medula espinhal.
    1. Cortar a pele dorsal da medula espinal e limpar qualquer excesso de tecido em torno do comprimento da coluna vertebral.
    2. Excise coluna vertebral e cortar qualquer tecido remanescente. O nível real da laminectomia e injury pode ser confirmada pela contagem costelas.
    3. Use tesouras e pinças vanna para deslocar pequenas seções da coluna vertebral em uma direção caudal-to-rostral. Continuar a cortar até que o cabo está exposto o suficiente para permitir a remoção segura. A visualização do local de corte e processo pode ser facilitado através da utilização de um estereoscópio.
  4. Coloque tecido da medula espinhal em 4% PFA. Permitir que o tecido para pós-fix nesta solução por 24 horas a 4 ° C.
  5. Cryoprotect tecido, por incubação em sacarose a 30% durante 24 horas a 4 ° C.
  6. Tecido Incorporar em outubro Resumidamente, o tecido de tomar a incubação de sacarose a 30% e remover qualquer excesso de solução. Colocar o tecido em um cryomold preenchido com outubro e incubar durante 1 hora a 4 ° C.
    1. Retirar o molde de 4 ° C, confirmar a orientação direccional do tecido, colocar o molde num prato raso de 2-metilbutano (pré-arrefecido durante 1 hora em gelo seco) e permitir OCT para solidificar completamente. Manter em gelo seco se usar imediatamente ou store-se a -80 ° C.
  7. Cortar o tecido em 20 mm sagitais utilizando um criostato. Mount tecido diretamente sobre slides. Armazenar a -20 ° C até o uso.
  8. Execute Hematoxilina e Eosina (H & E) mancha.
    1. Resumidamente, re-hidratar o tecido (5 minutos, 2 vezes), mancha com hematoxilina (2,5 min), e lava-se com água (1 min, 2 vezes).
    2. Incubar o tecido em 50% e em seguida de etanol a 70% (3 min cada), com mancha de eosina (45 seg), e desidratar por incubação em 90% (5 segundos), 95% (5 segundos), etanol a 100% (2 min) , e isopropanol (2 min).
    3. Limpar com xileno (5 min, 3 vezes).
      NOTA: H & E coloração varia em função da espessura e das condições de tecido específico. Portanto, a padronização é necessária antes de prosseguir com amostras de tecidos experimentais.
  9. Cobrir o tecido com uma fina tira de Permount (~ 100 mm) e lamela. Pressionar para baixo em todos os lados da lamela para assegurar a distribuição apropriada do fluido. Deixe secar lâminas O / N.
  10. Visualize cortes de tecido usando um microscópio e de captura de imagens digitais usando o software que o acompanha.

Representative Results

Foi realizada uma laminectomia em 12 ratinhos (25 - 30 gramas), como descrito acima, seguidos por compressões medulares a 0,25 mm (n = 4), 0,35 mm (n = 4) e 0,55 mm (n = 4). Nós nos sacrificamos animais em três (n = 6) e sete (n = 6) dias após a lesão por perfusão intracardíaca. A medula foi retirada da coluna vertebral, e o tecido foi preparado e processado como descrito acima. Imagens da medula espinhal todo foram tiradas com um microscópio digital Leica EZ4 e software que o acompanha. Imagens de secções da espinal medula foram tiradas com uma ampliação de 2X usando um microscópio digital Olympus e software que o acompanha.

Descobrimos que a compressão da medula espinal produz uma lesão com o epicentro no local da compressão (Figura 1). Os efeitos da lesão estender vários milímetros na direcção rostral e caudal. A gravidade da lesão como o aumento da distância entre os espaçadores diminuída (0,25 mm> 0,35 milímetros>0,55 milímetros, Figura 2). Três dias após a compressão havia sangue no epicentro da lesão e regiões vizinhas que não estava presente 7 dias após a lesão. As compressões de 0,25 milímetros e 0,35 milímetros produzida uma cavidade, mas não o modelo de 0,55 milímetros. Após 7 dias, a substância branca dorsal e ventral diminuiu largamente em tamanho no epicentro, a organização matéria cinzenta foi altamente distorcida, e cavitação foi persistente. Essas alterações cytoarchitectonical são traduzidos para limitações motoras e sensoriais em comportamento animal avaliado através de testes adequados, como o Basso Rato Scale for Locomotor Função e os cabelos e cloreto de etila testes de von Frey para a função sensorial como demonstramos em publicações anteriores 8.

Figura 1
Figura 1. Imagens representativas da medula espinhal intacta antes e aflesão ter. (A) medula espinhal intacta. (B) da medula espinhal após a compressão 0,35 milímetros. As setas indicam a fronteira de lesão. Asterisk identifica epicentro da lesão. D = Dorsal, L = Lateral. Barra de escala:. 0,50 milímetros Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Imagens representativas de rato medula espinhal antes e após a lesão de compressão em diferentes larguras de compressão. (A) Corte sagital de controle da medula espinhal. (B) Secção coronal no epicentro de um 0,35 milímetros SCI sete dias lesão compressão post (dpi). (C, E, G) seções sagital da medula espinhal 3 dpi para uma largura de 0,25 , 0,35 ou 0,55 milímetros. (D, F, H), sagitais de H & E manchada medula espinhals 7 dpi para uma largura de 0,25, 0,35 ou 0,55 milímetros. Asterisk identifica epicentro da lesão. Todas as seções coradas com H & E. D = Dorsal, L = Lateral. Barra de escala:. 1,25 milímetros Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A escolha de um modelo SCI é importante na concepção de experiências para determinar a eficácia de tratamentos para os casos humanos de LM. Tais experiências requerem um modelo animal que é altamente reprodutível para limitar a variabilidade que pode resultar em dados inconclusivos. Eles também devem ser de relevância clínica para avaliar com precisão a condição humana que está modelando. Para esse efeito, a escolha de uma lesão ou de compressão ao longo de um transecção contundente é mais clinicamente relevante 3. No entanto, pêndulos e aparelhos de queda de peso para os ferimentos contusos requerem o uso de maquinaria cara e complicada. Em contraste, o modelo da SCI pinça calibrada utiliza uma pinça, que são fáceis de montar a partir de materiais comuns de laboratório modificada, e a cirurgia exige apenas uma etapa adicional após a laminectomia dorsal padrão para expor a medula espinhal. No entanto, uma desvantagem da utilização deste método é que a força de compressão deve ser sempre aplicada lateralmente e não dorsalmente, comoé mais freqüentemente vista em casos clínicos humanos da SCI 9, e lesões de compressão gerados usando o método afeta em maior medida rostral-caudal de tecido do que os modelos contusão 1,2. Este modelo tem sido demonstrado pelos criadores da técnica, e nós, para gerar reprodutível SCI 7,11, e é bem adequado para o tamanho de ratos. Além disso, este modelo de lesão permite aos animais a serem avaliadas após cirurgia e tratamentos terapêuticos usando uma multiplicidade de testes comportamentais, tais como a Escala de Basso rato para locomoção e o teste de cabelo de von Frey, para verificar que um grupo de animais partilham a mesma gravidade de lesão e déficits neurológicos 7,11-13. Estas mesmas técnicas também podem ser usadas para avaliar a eficácia dos tratamentos administrados aos animais durante os estudos de investigação, que preencham os critérios gerais para os modelos animais utilizados para avaliar as terapias para a SCI 2,7.

O método de produção da pinça calibradas para o modelo de lesão é simples e pode ser realizado com uma variedade de métodos diferentes. Temos utilizado o método espaçador 11, conforme publicado pela Plemel 7, e também modificado fórceps usando um pequeno parafuso, o que não só proporciona um método mais fácil para a criação do dispositivo de compressão, mas também permite a versatilidade em ajustar a largura de compressão final, de benefício para estudos comparativos. A gama de opções na criação da pinça é praticamente ilimitado, desde que o espaçador (s) fornecer um meio estáveis ​​de fechar a pinça sempre à mesma distância e pode suportar tratamento em autoclave e esterilização. Os métodos cirúrgicos descritos neste vídeo são altamente reprodutível entre os usuários, no entanto, é necessário ter o cuidado ao realizar a laminectomia e suturar o animal após o procedimento foi realizado para que a medula espinhal não sofre quaisquer forças de compressão adicionais que podem aumentar a gravidade da lesão e confundir experimentos futuros. Com treino e prática adequada, o modelo de lesão de compressão pinça calibrada é bem adequado para a realização de SCI em ratos que imitam casos clínicos observados em humanos 2,3,7. Devido à facilidade de criação de uma pinça, produzindo camundongos de diferentes graus de gravidade da lesão pode ser feito facilmente. Isto será de grande benefício para a observação de efeitos genéticos em SCI de diferentes graus de severidade em camundongos transgênicos, bem como a avaliação da eficácia dos transplantes de células-tronco em camundongos. A maioria dos estudos na literatura foram realizados em ratos, devido ao seu tamanho, o que geralmente faz cirurgias mais fácil de executar. No entanto, o método publicado por Plemel et al. 7 e descrito por nós neste vídeo deve permitir SCI para ser realizado em ratinhos com grande facilidade e reprodutibilidade.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane machine Smiths Medical PM, Inc VCT302
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical NDC: 66794-013-25
Dissecting Scope Seiler Precision Microscopes SSI 202/402
Germinator-500 (tool sterilizer) Thomas Scientific 3885A20
Puralube (eye ointment) Dechra NDC 17033-211-38
Scalpel handle (#3) Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blade (#11) Fisher Scientific  08-914B
Retractor (Colibri) Fine Science Tools 17000-03
Friedman Pearson roungeur Fine Science Tools 16021-14
Vanna (Castroviejo) scissors Roboz RS-5658
Tissue forceps Fine Science Tools 11029-14
Laminectomy forceps (Dumont #2) Fine Science Tools 11223-20
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20
Stapler Fine Science Tools 12031-07
Staples (wound clips) Reflex7 203-1000
Sutures Henry Schein 101-2636
Needles (30 G x ½) BD Biomedical 305106
Syringe (1 ml) BD Biomedical 309659
Baytril (enrofloxacin) Bayer NADA 140-913
Buprenex (buprenorphine) Cardinal Health NDC 12496-0757-1

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References

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