Gransker spredning og Toxicity of prion-lignende Proteiner Bruke metazoan modellorganisme

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mange nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), og overførbare spongiforme encefalopatier (TSE), er assosiert med aggregering utsatt proteiner og er derfor kollektivt kjent som protein misfolding lidelser (pmds ). TSE eller prionsykdommer utgjør en unik klasse av pmds i at de kan være smittsomme i både mennesker og dyr en. På molekylært nivå, prioner replikere ved å rekruttere og konvertere monomerisk α-helix-rik host-kodet cellular PrP (PrP C) inn i patologisk β-sheet-rik PrP ​​Sc konformasjon 2,3. Selvforplantende protein aggregater er også identifisert i sopp, som deler viktige kjennetegn med pattedyr prioner 4,5. I tillegg pattedyr prioner er i stand til å bevege seg fra celle til celle og infisere naive celler 6,7.

Mens pmds other enn TSE er ikke smittsom, men de deler en felles sykdomsfremkallende prinsipp med prionsykdommer 8,9. Selv om proteiner knyttet til hver av de pmds ikke er relatert i struktur eller funksjon, er de alle danner aggregater via en krystallisering lignende prosess som kalles kjernedannelse eller polymeriseringen; dessuten proteinholdige frø vokse ved å rekruttere sine løselig isoformer 2,10,11. Effektiviteten til selv forplante varierer in vivo, avhengig av de iboende egenskapene til protein som sammen med ekstra cellulære faktorer som molekyl anstand i siste instans bestemmer utbredelsen av aggregatkjernedannelse, såing, fragmentering og sprer 12-15. Derfor må det finnes en fin balanse mellom disse faktorene som gjør det mulig effektiv spredning av protein aggregering. Dette kan også forklare hvorfor bare noen amyloidogene aggregater havn som kjennetegner et prion, og dermed ikke alle pmds er smittsomme. Prioner ser ut til å representere «topp-utøvere 'ofa bredt spekter av selvreproduserende protein aggregater, noe som gjør dem et kraftig verktøy for å studere pmds 8,13.

Forbløffende nok toksisitet assosiert med sykdomsrelaterte aggregater har ofte et ikke celle autonom komponent 16,17. Dette betyr at de påvirker naboceller som ikke uttrykker det tilsvarende gen, i motsetning til et strengt celle autonom virkning, noe som innebærer at bare de celler som uttrykker genet som oppviser den spesifikke fenotype. Dette ble overbevisende demonstrert av vev-spesifikke uttrykk eller slå ned på de respektive proteiner i mange modeller av nevrodegenerative sykdommer 18-26. Forskjellige mekanismer er blitt foreslått som et grunnlag for denne ikke-autonome celletoksisitet i pmds, herunder redusert næringstilførsel, ubalanse i neuronal signalering, glutamat eksitotoksisitet og nevroinflammasjon 16,27,28. I tillegg er en prion-lignende bevegelse av sykdomsbundne aggregater mellom cellene might bidra til dette aspektet 29,30. Økende bevis tyder på at protein andre inneslutninger enn prioner kan overføre fra celle til celle, noe som kan forklare den karakteristiske spredning av patologi observert i mange pmds 30-36. Men det har ennå ikke bestemt hvorvidt det er en klar årsakssammenheng mellom inter bevegelse av sykdomsproteiner og toksisk effekt på nabocellene. Derfor er nødvendig og avgjørende for utvikling av nye terapeutiske midler en bedre forståelse av de cellulære mekanismer som ligger til grunn for celle-til-celle overføring og ikke-autonome celletoksisitet. Imidlertid er mange aspekter av prion-lignende spredning og cellulære faktorer som påvirker celle-til-celle-transmisjon av misfoldede proteiner i metazoans ikke godt forstått, spesielt ved organismenivået.

Den nematode Caenorhabditis elegans har flere fordeler som gir potensial til å oppdage nye fasetter av prion-lignende SPREADIng i metazoans 17. Det er gjennomsiktig, slik at for in vivo sporing av fluorescent merkede proteiner i den levende organisme. Videre er mange cellulære og fysiologiske prosesser som påvirkes av sykdom bevart fra ormer til menneske, og C. elegans er også mottagelig for en rekke genetiske manipulasjoner og molekylære og biokjemiske analyser 37-39. Nøyaktig 959 somatiske celler utgjør voksen hermafroditt med en enkel kropp plan som fortsatt har flere forskjellige typer vev, inkludert muskel, nevroner og tarmen.

Å etablere en ny prion modell i C. elegans, valgte vi å eksogent uttrykke godt karakterisert glutamin / asparagin (Q / N) rik prion domene NM av cytosolisk gjær prionproteinet Sup35, siden det er ingen kjente endogene prionproteiner i ormer 4,40. Gjær prioner har vært uvurderlig i å belyse grunnleggende mekanismer for prion replikering 41-44. Videre er NM furust cytosoliske prion-lignende protein som har vist seg å rekapitulere hele livsløpet til et prion i pattedyrcellekultur 45,46. Likeledes, når det uttrykkes i C. elegans, den Sup35 prion domene vedtatt bemerkelsesverdig godt til de ulike krav til forplantning i metazo celler sammenlignet med gjærceller og utstilt viktige funksjoner i prion biologi 40. NM aggregering var assosiert med en dyp giftig fenotype, herunder avbrudd av mitokondriell integritet og utseende ulike autofagi relatert blemmer på cellenivå, samt embryonale og larve arrest, forsinket utvikling, og en utbredt forstyrrelse av proteinfolding miljø på organismenivå. Påfallende, prion domene viser celle autonome og ikke celle autonom toksisitet, påvirker nabo vev der transgenet ikke ble uttrykt. Videre er vesikulær transport av prion domenet i og mellom cellene overvåkes i sanntid <em> in vivo 40.

Her beskriver vi hvordan vi skal undersøke prion-lignende formidling i C. elegans. Vi vil forklare hvordan å overvåke intra- og inter transport av vesikler som inneholder prion domene som bruker time-lapse fluorescens mikroskopi. Vi vil legge vekt på bruk av vevsspesifikke folding sensorer og allestedsnærværende uttrykt belastnings journalister å evaluere cellestyrte og ikke-celle autonome effekter på celle fitness. Til slutt vil vi beskrive prosedyren av en nylig utført genom bred RNA interferens (RNAi) skjermen for å identifisere nye modifikatorer av prion-indusert toksisitet. I kombinasjon, kan disse metodene bidra til å erte hverandre genetiske trasé involvert i inter bevegelse av proteiner og deres non celle autonome toksisitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Overvåking transcellulær Spredning av prion-lignende proteiner ved In Vivo Time-lapse Imaging

MERK: Grow C. elegans villtype (WT) (N2) og transgene linjer i henhold til standard metoder og nøye kontrollere dyrking temperatur 47.

  1. Generere transgene linjer av C. elegans uttrykker prion-lignende protein, merket med monomerisk rød fluorescerende protein (mRFP). Se denne videoen som viser hvordan du bruker mikroinjeksjon 48. For ytterligere detaljer og metoder som beskriver hvordan du kan integrere disse ekstrakromosomale linjer, se 49.
  2. Forbered synkroniserte populasjoner av egg legging eller bleking henhold til standard metoder 50.
    1. Synkronisering av egglegging
      1. Transfer 10 - 20 gravid voksne på en tallerken og la dem legge egg 1 - 2 timer. Fjern voksne fra platen og la avkommet vokse til den ønskede alder.
    2. <li> Synkronisering av bleking
      1. Samle en usynkroniserte populasjon av gravid voksne og bleke dem med alkalisk hypokloritt-oppløsning (250 mM NaOH og 1: 4 (v / v) fortynning av kommersiell blekemiddel i H 2 O). Vask eggene to ganger (218 xg for 1 min) med M9 buffer 47 (21 mMNa 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, en mMMgSO 4 · 7H 2 O, legge dH 2 O opp til 1 L).
      2. Tillate dem å klekkes i M9 buffer med forsiktig omrøring O / N ved 20 ° C. Ormen utvikling vil stanse ved L1 fase i fravær av en næringskilde, og etterlater en synkronisert populasjon. Overføre L1S på fersk nematode vekstmedier (NGM) plater seeded med OP50 E. coli-bakterier og la avkommet utvikler til ønsket alder 47.
  3. Forberede 2% agarose pads (i H 2 O) på et objektglass som beskrevet 50.
    1. Forbered to microscope slides med etikette tape plasseres over hele sin lengde for å brukes som avstandsstykker. Plasser en tredje objektglass mellom dem.
    2. Løs opp 2% agarose i H 2 O og pipette en dråpe på ren raset.
    3. Plasser en fjerde glidevinkelrett på de tre andre glir på toppen av agaren dråpe. Trykk den nedover å flate puten til samme tykkelse som merking tape.
    4. La det tørke i 1 minutt før du fjerner avstandsstykkene og forsiktig dra lysbildene fra hverandre. Agar pad vil holde seg til en av dem.
  4. Pipette ~ 10 pl bedøvelse (2 mM levamisole i M9 buffer) til puten og overføring ~ 10 dyr med en platinatråd hakke. Dekk med et dekkglass (~ 22 x 22 mm) og ta bilder i en time.
  5. Alternativt, om å kjøpe filmer over en lengre periode eller for å ytterligere redusere muligheten for enhver bevegelse av dyrene, bruke en kombinasjon av bedøvelse og perle immobilisering 51.
    1. Forbered 10% agarose pads (i M9 buffer) som beskrevet 51 og legge ormer til 3 mL nanosfære størrelse standarder løsning (isopor perler, 100 nm) pluss 3 pl anestesi (4 mm levamisole i M9 buffer). Dekk forsiktig med et dekkglass. For å unngå uttørking, forsegle dekkglass med VALAP (blanding av like mengder vaselin, lanolin, og parafinvoks).
  6. Bilde immobilisert ormer bruker en konfokal mikroskop.
    MERK: Resultatene er oppnådd ved bruk av en Spinning Disc AF Confocal mikroskop utstyrt med en EM-CCD kamera og en Mikros Automation & bildeanalyse Programvare som MetaMorph og skissere de nærmere nedenfor, men andre sammenlign konfokal bildesystemer kan også brukes.
    1. Bruke 63X eller 100X / 1.4NA objektiv olje og plasser objektglass som inneholder ormer inn i mikroskop lysbildeholderen.
    2. Åpne programvaren. Justere laser makt og filtre for mRFP bildebehandling. Bruk 561 nm laser på 10% effekt og utslipp filter> 600 nm.
    3. Under "Saving" -kategorien velge eller opprette katalogen mappen hvor filene skal lagres. Tilordne et navn til filen.
    4. Under "Wave Length" -kategorien velger du riktig belysning og justere eksponering og gain. Bruk "YokoQuad Red" (eller tilsvarende belysning setting for mRFP imaging) med en eksponering mellom 100 og 300 msek og et kamera gevinst mellom 100 og 300, avhengig av den enkelte prøven (vurdert ved hjelp av levende bildet).
    5. Under "Timelapse" -kategorien velge "Antall tidspunkter" = 301, "Varighet" = 5 min og "Time / Intervall" = 1 sek.
    6. Under "Journals" -kategorien velger Journal: "AFC SET Z HOLD" og "AFC Return til Z HOLD", Type: &# 8220; Special "(to ganger), Initial Point:" Starten på tidspunkt "og" End of tidspunkt ". Dette autofokus alternativet er viktig å avbilde det samme avsnitt over en lengre tidsperiode.
    7. Når installeringen er ferdig, trykk "Hent". Timelapse video er safed som separate TIFF-filer.
    8. Åpne alle TIFF filer av et gitt tidsserier i ImageJ. Gå til "Image" → "Stacks" → "bilder til Stacks". Eventuelt justere lysstyrke og kontrast, legge størrelse bar, etc. Eksportere filmen under "File" → "Lagre som" → "AVI ..." (for et eksempel, se Video 1 og 2 tilsvarende figur 1).

2. Bruk Folding Sensorer og Stress Reporters å undersøke Cell autonome og ikke-celle autonome Påvirker på Proteostasis og giftighet

  1. Generere transgene linjer som coexpress en sammenleggbar sensor eller stress reporter sammen med prion-lignende protein. For metoder på hvordan å etablere kors eller generere transgene linjer, se 48,49,52. Se tabell 1 for en oversikt over C. elegans stammer som kan brukes.
  2. Forberede synkroniserte bestander av transgene dyr og dyrke dem til ønsket alder som beskrevet ovenfor (avsnitt 1.2) 50.
  3. Ved hjelp av en stereomikroskop, undersøke respektive fenotype av folde sensor eller stress reporter.
    1. Brette sensor, bestemme antall dyr skjuler tilslag på hver dag etter synkronisering (for et eksempel, se Figur 2E og F).
    2. For stress reporter, test hvis koekspresjonen av prion-lignende protein fører til økt fluorescens av reporteren (for et eksempel, se figur 3).

3. Genome-wide Screen for bekjempelse av Prion-indusert toksisitet i C. elegans

Figur 4
Figur 4. Skjematisk fremstilling av RNAi screening-protokollen. Se protokoll avsnitt 3 for en nærmere beskrivelse av de enkelte trinn.

  1. Synkronisering av C. elegans ormer og duplisering av RNAi bibliotek
    1. For RNAi skjermen, bruker Ahringer RNAi bibliotek (eller Vidal RNAi bibliotek) 53,54. Rearray RNAi-bibliotek fra den opprinnelige 384 brønners format i 96-brønners plater ved å fylle platene med 100 pl LB-amp-media (50 ug / ml ampicillin i LB) supplert med 10% glycerol og inokulere ved anvendelse av en 96-pinners replikator. Vokse ved 37 ° CO / N med agitasjon og oppbevares ved -80 ° C.
    2. Opprettholde C. elegans WT og transgene linjer ved 20 ° C på NGM plater seeded med OP50 E. coli-bakterier i henhold til standardmetoder 47.
    3. Synkronisere prion domene transgen og WT (kontroll) nematoder etter bleking (se avsnitt 1.2).
    4. På samme dag som ormene er bleket, forberede LB media supplert med 50 mikrogram / ml ampicillin. Bruke en automatisert dispenser for å dispensere reagens (eller pipette manuelt) 65 ul av de LB-amp mediet i hver brønn av en 96-brønners plate.
    5. Fjern 96 vel Ahringer RNAi bibliotek plater fra -80 ° C og bringe dem til en steril hette foret med papirhåndklær. Umiddelbart fjerne forseglingen-tape ved å holde platen opp ned mens platene er fortsatt frosset, er forsiktig med å unngå forurensning fra isen på utsiden av platene. Reinvertere platene og la dem tine i ca. 30 minutter.
    6. Dypp en steril 96 pin portreplikator til ett RNAi bibliotek plate, og deretter inn i en frisk LB-amp plate. Bruk en frisk steril portreplikator for hver plate. Forsegl plater med klebende folie båndet og returnere bibliotek platene til -80 ° C. Replikatorene kan bli dynket i blekemiddel, skylles,og autoklaveres for å brukes på nytt.
    7. Tillat dupliserte RNAi platene til å vokse O / N i en inkubator innstilt på 37 ° C og 300 rpm. Å bruke HT115 E. coli-bakterier som huser den tomme vektoren (L4440) som en kontroll, blir det separat i en kultur røret og deretter pipettere 65 pl av kulturen med en multikanal pipette inn i en fjerdedel av to 96-brønners plater.
  2. Induksjon av bakteriell dsRNA produksjon og tillegg av ormer
    1. Fortynn Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) til en 5 mM konsentrasjon i DDH 2 O. Bruke en automatisert arbeidsstasjon med en flerhode for å dispensere (eller pipette manuelt) 10 ul fortynnet IPTG i hver brønn av RNAi bakterier og styreplatene. Tett og legg platene tilbake i kuvøse. La dem rister i 3 timer ved 37 ° C.
    2. Mens bakterier skjelver, forberede ormer. Bland M9 / orm suspensjon godt, og pipetter en liten prøve (~ 5-10 mL) til et glass objektglass. Telleantall ormer under et stereomikroskop, og beregne antall ormer per mL.
    3. Ved å bruke steril teknikk, fremstille en oppløsning av supplert M9 (M9 +) med følgende sluttkonsentrasjoner: 0,20 mg / ml IPTG, 8,0 ug / ml kolesterol, 50 ug / ml ampicillin, 9,6 ug / ml tetracyklin, 0,0835 ug / ml Fungizone, og 15 ormer per 50 pl.
      1. Lage egne løsninger for prion domene transgen og WT ormer. Det endelige volum av M9 + orm oppløsning som er nødvendig, vil avhenge av antall RNAi plater kopiert (se nedenfor), i tillegg til ~ 30 ml av dødvolum som vil forbli i reservoaret, hvis en automatisert dispenser benyttes.
    4. Etter tre timers induksjon av bakteriell dsRNA produksjon, ta platene ut av inkubatoren og la dem avkjøles til romtemperatur (~ 30 min) for å unngå varme stresse dyrene.
    5. Fordeles 50 mL M9 + prion domene transgen ormen løsning til hver brønn av RNAi plater og en av de tomme vektor kontroll plater. Gjøresørge for å blande ormen løsningen før hvert trinn som dyrene har en tendens til å sedimentere til bunnen av reservoaret.
    6. Dispensere WT ormer inn i den andre styreplate. La platene utette å tillate lufting. For å holde den flytende kultur fordamper, stable 4-5 plater sammen og pakk med en fuktig papirhåndkle og aluminiumsfolie. Inkuber ved 200 rpm ved 20 ° C i 4 dager.
  3. Scoring
    MERK: Etter fire dager i kuvøse, vil ormer være på den andre dagen av voksenlivet, og er klar til skjermen. La dyrene justere til ikke risting forholdene i 30 min før screening for å sikre uforstyrret juling.
    1. Ved hjelp av en Falcon 4M60 kamera koblet til en datamaskin med en skjerm, skjerm visuelt for økt juling sammenlignet med kontroll behandlet prion domenetransgene dyr.
    2. Utarbeide en liste over foreløpige treff å bekrefte hjelp wrMTrck (se neste avsnitt).

4. Bekreftelse av PreliminarySkjerm Hits

  1. Motilitet analysen på solide plater
    1. Forbered plater med NGM supplert med 100 ug / ml ampicillin, 12,5 ug / ml tetracyklin og 1 mM IPTG, i henhold til standardmetoder 47. Hvis mulig, bruk en plate-helle maskin for å sikre alle platene har samme høyde på media, som vil gi rom for en mer strømlinjeformet video anskaffelsesprosess.
    2. Dyrke de forskjellige RNAi-kloner i ~ 1 ml LB + 50 ug / ml ampicillin, O / N ved 37 ° C og 250 rpm.
    3. Neste dag, indusere uttrykk for dsRNA med 1 mM IPTG i 3 timer. Seed platene med 150 ul av hver bakteriell RNAi klon, fordelt i et tynt lag. La bakteriene tørre i 2 dager ved romtemperatur i mørke. Forbered tre plater per RNAi klone.
    4. Synkron ormen befolkningen ved bleking henhold til standard metoder 50 (se avsnitt 1.2), og la eggene klekkes O / N i M9 media.
    5. Ta en prøve av ormen suspensjon og bestemme mengden av nematodes per mikroliter på stereomikroskop. Deretter pipettere riktig volum av M9 pluss ormer i hver forsøksplaten slik at den inneholder 25-30 L1 ormer. Vokser de nematoder ved 20 ° C i 4 dager inntil ormer kommer dag 2 av voksenlivet.
  2. Kvantitativ analyse av orm motilitet med wrMTrck plugin for ImageJ
    MERK: Videoene ble registrert med en stereo på 10X forstørrelse med en Hamamatsu Orca-R2 digitalkamera C10600-10B og Hamamatsu Enkelt PCI bildebehandlingsprogrammer.
    1. Slå på kameraet og Simple PCI bildebehandlingsprogrammer. Klikk på «Live" for å tillate justering av bildeforhold.
    2. Sette opp videoforhold som følger: Gain = 0; Lys Mode = høy; Hastighetsindeks = 1; Binning = 2. Klikk på "Auto Expose" og deretter justere lysforhold, flytte mikroskopet speil og lysstyrke og kontrast ringer.
      MERK: Videoen må ha en høy kontrast uten å være overexposed, slik at vises dyrene som svarte figurer på en lys bakgrunn.
    3. Klikk på "Time Scan" og velge en mappe og et filnavn. Still "Field Delay" til 20 ms og "Stopp ved Time" til 30 sek. Trykk på "Live Review" for å velge området av platen for å spille inn (der de fleste ormer er). På platen tre eller fire ganger på scenen, raskt bekrefte sin posisjon i synsfeltet og trykk "Start".
    4. Etter filmen slutter opptaket, høyreklikk på bildet og velg "Export Montage Sequence" å eksportere filmen fra en .cxd format til en .avi.
  3. Analysere motilitetsmidler videoer
    1. Åpne ImageJ programvare, gå til "Plugins" fanen, deretter "wrmtrck" og velg "wrMTrck Batch". Velg katalogen som inneholder alle filene som skal analyseres.
    2. I hovedinngangen vinduet i wrMTrck_Batch, legger inngangsverdiene som beskrevet i Figure 5C. Forklaring for hver av parameterne kan bli funnet i instruksjonene som følger med plugin. Klikk "OK" og la bevegelsesanalyse løp.
    3. Å kuratere resultatene og bekrefter at alle oppdagede sporene er fra selve C. elegans og eliminere gjenstander, åpne hver av .txt filer som er opprettet for hver film og kopiere informasjonen til en dataanalyse programvare fil. Åpne "* _labels.zip" filer som er opprettet og kjøre den resulterende "* _labels.tif" for å kontrollere og eliminere falske ormen spor manuelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overvåking intercellulært spredning av prion-lignende proteiner ved in vivo time-lapse bildebehandling

Transgen C. elegans linjer som uttrykker prion domenet er spesielt godt egnet for analyse av visse aspekter av prion-lignende proteiner, f.eks, celle-til-celle overføring og ikke-autonome celletoksisitet. Gjennomsiktigheten dyrene muliggjør sporing av fluorescently tagget proteiner fra i levende organisme i alle faser av livet. Å ta fordel av dette, er bevegelsen av prion-lignende proteiner på tvers av celler og vev ved hjelp av et fluorescens-mikroskop synlig. En 63X eller 100X / 1.4NA olje Målet er nødvendig for å løse de vesikulær strukturer. Viktigere, har prion domene for å bli merket med mRFP, for å forbli fluorescently synlig innenfor disse antagelig sure vesikler 40. Gul fluoriserende protein (YFP), som ofte brukes som en tag, jeger ikke egnet, fordi det bråkjøles i et miljø med lav pH 40,55. Stamme AM815 uttrykker RFP-merket R2E2 (en sterkt aggregering utsatt og toksisk form av prion domene NM) som samler seg i rørformede vesikler, mens RFP tag alene forblir løselig (figur 1A og B). Ved hjelp av in vivo time-lapse bildebehandling, kan det observeres at disse rørformede vesikler transporteres i og mellom celler 40 (figur 1C og D, Video 1 og 2) [sted linker til video 1 og 2 her].

Ved hjelp av folde sensorer og stress journalister å undersøke cellestyrte og ikke-celle autonome effekter på proteostasis og giftighet

Prioner er i stand til å krysse frø beslektede proteiner og forstyrre den cellulære proteinfolding miljø. Dette kan bli avslørt gjennom koekspresjon av passende folding sensors. Folding sensorer er ikke-essensielle metastabile proteiner som er avhengige av en funksjonell proteostasis nettverk til å kaste riktig. Noen eksempler er den velkjente ildflueluciferase og proteiner skjuler temperaturfølsomme (TS) mutasjoner 56-66. En forstyrrelse av proteostasis fører til uriktig folding av reporter, som kan oppdages ved visuell undersøkelse av aggregater, eller ved påvirkning av den respektive ts mutant fenotype ved permissive temperaturen. Strekninger av polyglutamine (polyQ) med en lengde på terskelen til aggregering (rundt 40 rester) er også ofte brukt fordi de viser en aldersavhengig aggregering 67-69. Tidligere utbruddet av aggregering avslører en kompromittert folding miljø. Her benyttet vi et prion mutant RΔ2-5 som forblir løselig når uttrykt i C. elegans kroppsveggen muskel (BWM) celler og tarmen 40 (figur 2A og C). Ved samtidig uttrykk med R2E2 i BWM celler, RΔ2-5 readily aggregater (figur 2B), avslører en celle autonom effekt av R2E2 på proteinfolding miljø. Den utstrakte innvirkning på proteostasis og induksjon av misfolding tvers vev kan evalueres ved ekspresjon av det sammenleggbare sensoren i en distinkt vev som ikke uttrykker sterkt aggregering utsatt form av prion-domenet. R2E2 ble uttrykt under en BWM celle promoter (myo-3p), mens RΔ2-5 ble uttrykt under en tarm-promoter (VHA-6p). Aggregering av intestinal RΔ2-5 viser at R2E2 påvirker proteinfolding i en ikke celle autonom måte 40 (figur 2D). I stedet for å bruke RΔ2-5, hvor aggregater bare kan detekteres med høy oppløsning, ved bruk av polyQ44 uttrykt i tarmen (Q44i) tillater visualisering av aggregater med lav oppløsning under et stereomikroskop (figur 2E og F). Videre gir dette en kvantifisering av animals med aggregater, samt en kvantifisering av antallet av aggregater.

For å undersøke ikke-autonome celletoksisitet av prion domene, vi tidligere undersøkt nærliggende vev som ikke uttrykker R2E2 ved elektronmikroskopi og funnet at ekspresjonen av prion domenet i muskelceller fører til en ikke celleautonome forstyrrelser av mitokondriell integritet i tilstøtende vev, f.eks som tarmen 40. Mitokondrie dysfunksjon resulterer i økt reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon og oksidativt stress. En ikke-invasiv måte å visualisere induksjon av den oksidative stressrespons, er å bruke en oksidativt stress induserbar reporter 70. Belastningen CF1553 uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under oksidativt stress induserbar promoter torv-3 70. Ved krysset til dyr som uttrykker prion domene R2E2 i BWM celler, ble reporteren signifikant oppregulert i BWM celler så vel som i en rekke ikke-BWM vev ( Tabell 1 gir en liste over C. elegans stammer uttrykke folding sensorer og stress reportere som kan brukes analogt.

Genome-wide screen for undertrykkelse av prion-indusert toksisitet i C. elegans

Komplekset toksisitet fenotype av prion domene uttrykt i C. elegans er spesielt interessant på grunn av mangelen på merkbar toksisitet ble observert i de fleste in vitro-modeller prion 71. Denne modellen kan avsløre nye veier som kan påvirke toksisitet forbundet med prioner i metazoans. For å løse dette, har vi vist for gener som, når RNAi-utarmet, ville forbedre bevegeligheten defekt R2E2 transgene dyr. Kontroll behandlet WT ormer kan anvendes som en positiv control, selv om de fleste kandidatgener vil ikke gi en fullstendig bevegelse fenotype redning, på grunn av den variable RNAi pene og den høye toksisitet av transgenet. Dyrene ble behandlet for 4 dager med RNAi, fra den første larve tilstand L1 til dag 2 av voksenlivet. Innen den tid, er den juling av ubehandlede R2E2 dyr betydelig tregere enn juling av WT dyr, noe som er viktig fordi vi er screening for en forbedring av bevegeligheten. F1 avkom vil være tilstede (~ L1S), men er lett å skille fra P0 generasjon. Bare P0 generasjon er scoret. Denne første skjermen er synlig og ikke kvantitative, og derfor ble en lav terskel brukes til å identifisere innledende treff, noe som betyr at hver bakteriell RNAi-klon som så ut til å øke juling av prion-uttrykkende dyr ble testet på nytt i en kvantitativ kryp assay. Figur 4 skisserer hovedtrinn av skjermen setup. Den høye oppløsningen på Falcon 4M60 kamera aktivert en visuell screening av en quarter av platen på en gang på en dataskjerm, som tillot skjermen for å være ferdig mer effektivt. Mens nyttig, er dette ikke nødvendig. Den visuelle undersøkelse av orm juling kan også utføres ved hjelp av et stereoskop ved lav forstørrelse (10X).

Bekreftelse av foreløpige skjerm treff

Store gjennomgangs skjermene er utført som en tilnærming som tillater analyse av genomet brede effekter for å oppnå en primær liste med kandidatgener som kan bli raffinert ved komplementære fremgangsmåter. Validering av skjermen resultatene er derfor viktig å eliminere mulige falske positiver, som kan resultere fra å utføre en skjerm med bare ett eksperimentell prøve per RNAi. R2E2 transgene dyr ble matet med RNAi kloner av primær treff og målte hastigheten på NGM plater på den andre dagen av voksenlivet, som en kvantifiserbar avlesning av bevegelighet og redusert toksisitet. Vi brukte wrMTrck plugin for ImageJ, utviklet i vårlaboratorium, som nøyaktig identifiserer C. elegans i videoer og følger deres bevegelser. Den wrMTrck plugin og skript for automatisk analyse er åpen kildekode og offentlig tilgjengelig på http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, sammen med detaljerte instruksjoner om hvordan du bruker den. Etter nedlasting, kopiere hele wrMTrck mappen til Plugins mappen av ImageJ. Denne protokollen beskriver wrMTrck_Batch metoden, foretrukket for å analysere et stort antall videoer på en gang, men instruksjoner for en manuell, film etter film, analyse er også tilgjengelig med plugin nedlasting. WrMTrck_Batch konverterer en original video (Figur 5A) i et binært format med bakgrunn subtraksjon og hver ormen er tildelt et spor. Hver av de fremstilte bilder senere kan sees med disse sporene lagt oppå hverandre, for å eliminere eventuelle gjenstander som ble feilaktig identifisert som ormer (e. G., Spor 1 på figur 5B) manuelt. En effektiv måte å eliminere bakgrunnsteknikken ifacts (indikert med en pil på figur 5B) er å velge nøye minimum og maksimum størrelse på objektene som skal identifiseres (figur 5C). Fra de forskjellige utganger av wrMTrck plugin, bruker vi kroppslengder per sekund (BLPS) parameter som måler den gjennomsnittlige hastigheten til hvert dyr, representert ved lengden av hvert spor dividert med kroppslengde på hvert objekt, og dermed å normalisere for potensialforskjeller i størrelsen på nematoder (figur 5d). Ved hjelp av denne metoden, har vi identifisert 35 undertrykkere av prion-indusert toksisitet (sopt) som økte bevegeligheten fenotype i R2E2 uttrykker C. elegans til minst 133%, og opp til 256% sammenlignet med tom vektorbehandlede ormer (figur 6). Disse sopt genene representerer endelig bekreftet hits som resulterte fra våre høy gjennomstrømning screening innsats.

21fig1highres.jpg "/>
Figur 1. prion domene forskjellene mellom celler og vev i C. elegans med vesicular transport. (A) Kollapset konfokale z-stabler av nematoder som uttrykker RFP i kroppsveggen muskel (BWM) celler (RFPm). (B) Kollapset konfokale z-stabler av nematoder uttrykker svært giftig og aggregering utsatt NM variant, R2E2 I BWM celler (R2E2m). Piler indikerer rørformede vesikler, indikerer pilspiss samlet. (C + D) Time-lapse serie av dyr uttrykker RFPm (C) og R2E2m (D). Piler indikerer områder av vesicular bevegelse. RFPm viser stort sett en diffus flekker. Selv når RFPm er funnet i vesikler, disse knapt bevege seg. R2E2m lokaliserer til mange vesikler som transporteres i og mellom cellene. Skala barer: 10 mikrometer. De vedlagte Videoer 1 og 2 [sted linker til Video 1 og 2 her] tilsvarer figurene 1C og D,henholdsvis.

Figur 2
Figur 2. Folde sensorer avsløre den utbredte effekten av prion domene på proteostasis. (A + B) Koekspresjon av R2E2m fremmer RΔ2-5m aggregering. Konfokale bilder av (A) RΔ2-5m kontroll og (B) RΔ2-5m kouttrykte med R2E2m i BWM celler. (C + D) Muskel uttrykt R2E2m fremmer tarm RΔ2-5i aggregering. (C) Confocal bilde av kontroll dyr som uttrykker RΔ2- 5i i tarmcellene. (D) Confocal bilde av dyr som uttrykker R2E2m i BWM celler og RΔ2-5i i tarmen. Skala barer: 10 mikrometer (E + F) R2E2m induserer ikke celle autonome aggregering av Q44i (E) Representative fluorescerende bilder av Q44i og Q44i, R2E2m dyr fire dager etter overføring synkronisert L1 lar..VEK på ferske OP50-seeded NGM plater. Ekspresjonen av R2E2 i BWM celler fører til en tidligere inntreden av Q44i aggregering i tarmen. (F) Kvantifisering av dyr med aggregater (i%) på angitte dager etter synkronisering. Feilfelt representerer SD Dette tallet har blitt forandret fra 40.

Figur 3
Figur 3. torv-3p :: GFP transcriptional stresset reporter avslører at prion domenet forårsaker celle autonome og ikke celle autonom induksjon av oksidativt stress. (A + B) Representative fluorescerende bilder (bruker samme eksponeringstid) av torv-3p :: GFP uttrykke kontrolldyrene (A) og torv-3p :: GFP;. R2E2m dyr (B) på dag to av voksenlivet (C) Uttrykket av R2E2 i BWM celler fører til en induksjon av reporteren ikke bare i BWM celles (I), men også i tarmen (II), nerveledning (III), svelget og hode nevroner (IV).

Figur 5
Figur 5. Analyse av snekkebevegelse med wrMTrck plugg for ImageJ. (A) Eksempel på en inngangs film som genereres ved hjelp av en passende forstørrelse (~ 10X) for å overvåke flere dyr om gangen. (B) "* _labels.tif" filer er en effekt på wrMTrck_Batch og gi rom for manuell konservering av analyseresultater. Pil viser et objekt som var riktig ekskludert fra analysen på grunn av et passende valg av minimum og maksimum størrelse parametere. (C) Input vinduet i wrMTrck_Batch, viser parametrene som brukes for denne protokollen. Disse parametrene må justeres i henhold til de enkelte mikroskop og filminnstillinger. (D) Output resultater fra movement analyse av (B), med BLPS kolonne merket med gult. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 6. R2E2 ormer som ble behandlet med RNAi-kloner som er supressors av prion-indusert toksisitet (sopt) viser forbedret motilitet. Motilitet er vist som relativ BLPS når sammenlignet med den negative kontroll (tom vektor). Vist er alle statistisk signifikante (student t-test) RNAi kloner identifisert i HTP-skjermen. svart stjerne representerer treffet vises som et eksempel i figur 5. Resultatene er fra tre filmer, med 17 <n <53 spor per tilstand. Feilfelt representerer SEM. </ P>

Tabell 1. C. elegans stammer uttrykke folding sensorer og stress reportere.

Strain navn genotype Kommentarer Strain kilde
Folding sensorer
transgener
AM140 unc-54p :: polyQ35 :: YFP muskel-spesifikke uttrykk for polyQ35, aldersavhengig aggregering CGC eller Morimoto lab
AM141 unc-54p :: polyQ40 :: YFP muskel-spesifikke uttrykk for polyQ40, age avhengige aggregering CGC eller Morimoto lab
AM801 unc-54p :: RΔ2-5 :: YFP muskel-spesifikke uttrykk for kimdannelse inhabil prion domene Morimoto lab
OG412 VHA-6p :: polyQ44 :: YFP tarmen spesifikke uttrykk for polyQ44, aldersavhengig aggregering CGC
AM809 VHA-6p :: RΔ2-5 :: GFP; myo-2p :: mcherry tarmen spesifikke uttrykk for kimdannelse inhabil prion domene Morimoto lab
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: CFP nevron spesifikke uttrykk for polyQ40, celletype bestemt aggregering Morimoto lab
AM982 unc54p :: luciferase :: YFP muskel-spesifikke uttrykk for WT ildflueluciferase Morimoto lab myo-3p :: luciferase :: GFP; rol-6 muskel-spesifikke uttrykk for WT ildflueluciferase Behl lab
SNG-1p :: luciferase :: GFP; rol-6 muskel-spesifikke uttrykk for WT ildflueluciferase Behl lab
FUH55 unc54p :: Fluc :: EGFP; rol-6 muskel-spesifikke uttrykk for WT ildflueluciferase Hartl lab
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 muskel-spesifikke uttrykk for R188Q mutant ildflueluciferase Hartl lab
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 muskel-spesifikke uttrykk for R188Q + R261Q dobbel mutant ildflueluciferase Hartl lab
FUH48 F25B3.3p :: Fluc :: EGFP; rol-6 nevron spesifikke uttrykk for WT firefly luciferaSE Hartl lab
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 nevron spesifikke uttrykk for R188Q mutant ildflueluciferase Hartl lab
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 nevron spesifikke uttrykk for R188Q + R261Q dobbel mutant ildflueluciferase Hartl lab
ts mutanter
CB1402 unc-15 (e1402) Jeg Paramyosin (TS), temperatur sensitive Unc-lammet, La CGC
CB1157 unc-54 (E1157) Jeg Myosin (ts), temperatur sensitive Unc CGC
CB1301 unc-54 (e1301) Jeg Myosin (ts), temperatur sensitive Unc CGC
CB286 unc-45 (E286) III Unc-45 (TS), temperatur sensitive, langsom bevegelse Unc, Egl CGC
HE250 unc-52 (e669su250) II Perlecan (ts), temperatur sensitive Unc, stiv lammelse CGC
SD551 la-60 (ga89) IV Ras (ts), temperatur sensitive Muv, Ste, Let, Lva, Osm CGC
CX51 dyn-en (ky51) X Dynamin (ts), temperatur sensitive Unc CGC
CW152 gass-1 (fc21) X Gass-1 (ts), temperaturfølsom EtOH følsomhet CGC
ZZ26 unc-63 (x26) Jeg Acetylcholin-reseptor (TS), temperaturfølsom motstand levamisol CGC
Stress journalister
CL2070 hsp-16.2p :: gfp; rol-6 termiske spenninger; UPR CYTO CGC
TJ375 hsp-16.2p :: GFP termiske spenninger; UPR CYTO CGC
TJ3000, TJ3001 hsp-16.2p :: GFP; Cbr-unc-119 (+) termiske spenninger; UPR CYTO CGC
AM446 hsp70p :: GFP, rol-6 termiske spenninger; UPR CYTO Morimoto lab
AM722 hsp70p :: mcherry; myo-2p :: CFP termiske spenninger; UPR CYTO Morimoto lab
AM799 hsp90p :: GFP termiske spenninger; UPR CYTO Morimoto lab
OG497 HSF-1p :: HSF-1 :: gfp; Cbr-unc-119 (+) termiske spenninger; UPR CYTO CGC
CF1553 torv-3p :: GFP, rol-6 oksidativt stress CGC
KN259 torv-3p :: GFP, rol-6 oksidativt stress CGC
CL2166 GST-4p :: GFP :: NLS oksidativt stress CGC
LD1171 GCS-1p :: GFP, rol-6 oksidativt stress CGC
LD1 SKN-1p :: SKN-1 :: GFP; rol-6 oksidativt stress CGC
IG274 NLP-29p :: GFP osmotisk stress CGC
BC20309 MTL-1p :: GFP metall stresset Baillie lab
BC20342 MTL-2p :: GFP metall stress Baillie lab
BC20314 ELT-2p :: GFP metall stresset Baillie lab
SJ4005 hsp-4p :: GFP UPR ER CGC
SJ4100 hsp-6p :: GFP UPR mito CGC
SJ4058 hsp-60p :: GFP UPR mito CGC

CGC: Caenorhabditis Genetics Center; ts = temperaturfølsomme; UPR = utfoldet protein respons; CYTO = cytosolic; mito = mitokondrie; ER = endoplasmatiske retikulum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene som beskrives her for å hjelpe til å illustrere spredning og komplekset celleautonome og ikke-autonome celletoksisitet av prion-lignende proteiner. Vi har nylig oppdaget at en aggregering utsatt cytosoliske prion domene er tatt opp i membranbundne vesikler i en autophagy relatert prosess. En spesifikk undergruppe av disse vesikler transporterer prion domenet i og mellom celler og vev 40. Nøkkelen for å overvåke deres bevegelse i det levende dyr er at proteinet har til å bli merket med mRFP, fordi bare mRFP-kodede proteiner var synlige i disse formodentlig sure vesikler. Med samme tilnærming, er vi nå mulighetene prion-lignende oppførsel av enkelte sykdomsrelaterte proteiner, slik som superoksyddismutase 1 (SOD1) (koblet til ALS), alfa-synuclein (knyttet til PD) eller TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) (koblet til ALS). Selv om denne intercellulære transport innen vesikler ser ut til å bli brukt av flere andre proteiner, kan det være endditional trasé som tillater spredning.

Bruken av godt karakteriserte folde sensorer er et kraftig verktøy for å overvåke effekten på cellulært protein folding miljø i C. elegans 63-66. Her har vi vist hvordan du bruker aldersavhengig opphopning av fluorescently merkede aggregering utsatt proteiner uttrykt under vevsspesifikke arrangører å visuelt overvåke folding kapasitet på forskjellige vev samtidig. Andre muligheter for å studere den organisme proteostasis nettverk omfatter bruk av endogene ts mutante proteiner. Disse metastabile proteiner vil fungere normalt på givende temperatur (15 ° C), men misfold og bli ikke-fungerende på restriktiv temperatur (25 ° C), viser sine karakteristiske mutant fenotype. I nærvær av en aggregering utsatt protein eller under aldring, TS mutant fenotype blir synlige selv på permissive betingelser 63-66. Noen av disse ts mutanter er uttrykt i oNLY en undergruppe av vev eller utstilling vevsspesifikke fenotyper, noe som gjør disse spesielt nyttig for å teste for celle autonome og ikke cellestyrte proteotoxic effekter. For eksempel kan en ts mutant av LA-60, et medlem av GTP-bindende RAS protoonkogenet familien, Ras (ts), er ubikvitært uttrykt, men viser vevsspesifikt mutante fenotyper 63,66. Ved å bruke denne ts mutant, ble effekten av polyQ utvidelser på den cellulære proteostasis vist å være celle-autonome 63. Ekspresjon av polyQ i genetisk bakgrunn av ras (ts) viste bare den mutante fenotype bestemt til vevet i hvilken proteinet ble uttrykt. Eksponeringen av flere mutante fenotyper skulle tilsi at et protein har ikke-celle autonome proteotoxic effekter.

I tillegg til å teste for virkninger på cellulært stress veier, er det et stort utvalg av in vivo fluorescerende spennings reportere i C. elegans 72. Disse er vanligvis transkripsjonal reportere som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under en stress-induserbar promoter, som hsp-16.2p eller torv-3p, som rapporterer om termisk eller oksidativt stress, henholdsvis 72. Ved hjelp av egnede journalister i kombinasjon med prion-lignende proteiner, kan man overvåke en potensiell induksjon av stressresponser i andre enn den som uttrykker den respektive transgenet vev. En påminnelse, er imidlertid at disse spennings reportere er ofte ikke er følsom nok til å avsløre subtile oppregulering av en gitt bane (upubliserte observasjoner).

På våre forsøk på å undersøke hvorvidt gener som påvirker den ikke-celle autonome toksisitet også påvirker protein sprer seg, begynte vi ved screening for gener som, når slått ned, vil bli forbedret bevegelses defekter. Ved hjelp av visuell evaluering av svømmepriser som en read-out, var vi i stand til komfortabelt analysen ~ 25 plater per sesjon og utføre to runder av denne protokollen per uke, noe som resulterer i ferdigstillelsenav det første skjermbildet innen 6 uker. Bekreftelsen av hits, ved kvantitativ analyse av ormen bevegelse på solide plater, i tre paralleller, ved hjelp wrMTrck ble utført i ytterligere tre uker. En påminnelse, er imidlertid at ved å bruke gjennomgangen i plater i stedet for svømming i flytende medier som en lese-out kan man miste enkelte kandidat gener, som svømming og kryp er ikke identiske bevegelser og kan påvirkes av forskjellige mekanismer, 73. Dermed, hvis noen kandidat gener ikke kan bekreftes på solide plater, de bør testes på nytt i flytende medier, der bading kan kvantifiseres ved å telle juling frekvens innenfor en gitt tid.

Screening protokollen beskrevet her bruker automatisert væskehåndtering arbeidsstasjoner, som i stor grad reduserer variasjon. Ulempen er at et overskudd av væske til reservoaret av robotene er nødvendig, noe som kanskje ikke alltid være mulig. Dette screening oppsett kan enkelt tilpasses for andre skjermer i C. elegans </ Em> at bruken juling som et lese-out.This skjermen er ikke utformet for direkte å identifisere gener som påvirker spredningen eller ikke celle autonom toksisitet av prion domene, som genomet brede skjermer skal være enkel i konstruksjon, slik som å bli utført innen rimelig tid. Motilitet defekter kan stammer ikke bare fra muskulær, men også fra neuronal skade og fra en rekke andre defekter 53 gen. Således, ved hjelp av denne avlesning, kan vi finne ikke bare modifiseringsmidler av muskel-spesifikk toksisitet. Vi tester for tiden kandidatgener for deres effekt på prion domene spredning og ikke-autonome celletoksisitet ved hjelp av de metoder som er beskrevet ovenfor. Disse forsøk vil etterhvert avdekke om transcellulær spredning av proteinaggregater er direkte knyttet til toksisitet ble observert i andre vev eller celle-til-celle overføring og ikke-autonome celletoksisitet kan frakoples.

Til sammen kan de beskrevne metoder brukes for å undersøke potensialet prion-lignende oppførsel av proteiner på celle og organismenivå ved hjelp C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73, (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2, (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264, (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75, (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79, (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501, (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459, (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274, (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286, (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123, (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442, (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179, (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187, (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7, (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22, (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14, (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302, (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46, (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22, (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16, (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45, (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10, (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97, (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209, (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33, (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11, (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4, (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10, (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12, (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9, (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268, (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400, (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482, (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8, (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5, (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16, (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5, (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12, (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26, (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283, (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115, (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71, (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (52), 20982-20987 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics