Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l'utilisation des Métazoaires organisme modèle

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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

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Abstract

Introduction

Beaucoup de maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (PD), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), sont associés à des protéines d'agrégation sujette et sont donc collectivement connus comme mauvais repliement des protéines troubles (PMD ). EST ou maladies à prions constituent une classe unique de PMD en ce qu'ils peuvent être infectieux chez les humains et les animaux 1. Au niveau moléculaire, les prions répliquent par le recrutement et la conversion de monomère α-hélice riche PrP cellulaire codée par l'hôte (PrP C) dans le pathologique β-feuille riche PrP Sc conformation 2,3. agrégats auto-propagation protéines ont également été identifiés dans les champignons, qui partagent des caractéristiques importantes des prions de mammifères 4,5. En outre, les prions de mammifères sont capables de se déplacer de cellule à cellule et infectent les cellules naïves 6,7.

Alors que PMD OTHer que les EST ne sont pas infectieux, ils partagent un principe pathogène commun avec les maladies à prions 8,9. Bien que les protéines liées à chacun des PMD ne sont pas liés dans la structure ou la fonction, ils tous les agrégats de formulaire via un processus de cristallisation comme appelés nucléé ou la polymérisation ensemencées; ailleurs semences protéiques grandir en recrutant leurs isoformes solubles 2,10,11. L'efficacité de l'auto-propagation in vivo varie, en fonction des propriétés intrinsèques de la protéine, qui, avec d'autres facteurs cellulaires tels que les chaperons moléculaires finalement déterminer les taux de nucléation agrégat, l'ensemencement, la fragmentation et la diffusion de 12 à 15. Par conséquent, il doit exister un juste équilibre entre ces facteurs qui permet la propagation efficace de l'agrégation des protéines. Cela pourrait aussi expliquer pourquoi seuls certains agrégats amyloïdogéniques abritent les caractéristiques d'un prion, et donc tous les PMD sont infectieux. Prions semblent représenter l'o 'top-interprètesfa large éventail d'agrégats protéiques auto-réplication, qui en fait un outil puissant pour étudier PMD 8,13.

Curieusement, la toxicité associée aux agrégats liés à la maladie a souvent un composant non cellulaire autonome 16,17. Cela signifie qu'ils affectent des cellules voisines qui ne expriment pas le gène correspondant, par opposition à un effet strictement cellule autonome, ce qui implique que seules les cellules exprimant le gène présentent le phénotype spécifique. Cela a été démontré de façon convaincante par l'expression spécifique d'un tissu ou d'abattre les protéines respectives dans de nombreux modèles de maladies neurodégénératives 18-26. Divers mécanismes ont été suggérés comme une base pour cette toxicité autonome non-cellule dans les PMD, y compris l'approvisionnement en éléments nutritifs diminué, déséquilibre dans la signalisation neuronale, excitotoxicité du glutamate et neuroinflammation 16,27,28. En outre, un mouvement de prion comme des agrégats de maladies liées entre cellules MIGHt contribuer à cet aspect 29,30. Des preuves croissantes suggèrent que les protéines autres que les inclusions peuvent transmettre prions de cellule à cellule, ce qui peut expliquer la propagation de la caractéristique de la pathologie observée dans de nombreux PMD 30-36. Cependant, il n'a pas encore été déterminé se il existe un lien de causalité évident entre le mouvement intercellulaire de protéines de la maladie et l'effet toxique sur les cellules voisines. Par conséquent, une meilleure compréhension des voies cellulaires qui sous-tendent la transmission de cellule à cellule et la toxicité cellulaire non autonome est nécessaire et essentiel pour le développement de nouveaux produits thérapeutiques. Cependant, de nombreux aspects de prion-like facteurs d'étalement et cellulaires qui influencent la transmission des protéines mal repliées de cellule à cellule dans métazoaires ne sont pas bien comprises, en particulier au niveau de organismal.

Le nématode Caenorhabditis elegans a plusieurs avantages qui fournissent le potentiel de découvrir de nouvelles facettes de prion-like spreading chez les métazoaires 17. Il est transparent, ce qui permet le suivi in vivo de protéines par fluorescence marqués dans l'organisme vivant. En outre, de nombreux processus cellulaires et physiologiques touchées par la maladie sont conservés des vers pour la santé humaine, et C. elegans est également prête à une grande variété de manipulations génétiques et les analyses moléculaires et biochimiques de 37 à 39. Exactement 959 cellules somatiques constituent l'hermaphrodite adulte avec un plan de corps simple qui a encore plusieurs types de tissus distincts, y compris musculaires, les neurones et l'intestin.

Pour établir un nouveau modèle de prion en C. elegans, nous avons choisi d'exprimer la glutamine exogène / asparagine bien caractérisés (Q / N) riche prion domaine NM de la protéine cytosolique levure prion Sup35, car il n'y a pas de protéines prions endogènes connus vers 4,40. prions de levure ont été inestimables pour élucider les mécanismes de base de la réplication du prion 41-44. En outre, NM est le sapinst cytosolique protéine prion-like qui a été montré pour récapituler le cycle de vie complet d'un prion dans la culture de cellules de mammifères 45,46. De même, lorsqu'il est exprimé dans C. elegans, le domaine de prion Sup35 adoptée remarquablement bien aux différentes exigences pour la propagation dans les cellules de métazoaires par rapport à des cellules de levure et les principales caractéristiques exposées de la biologie du prion agrégation 40. NM a été associée à un phénotype toxique profonde, y compris la perturbation de l'intégrité mitochondriale et l'apparence de diverses vésicules autophagie liés au niveau cellulaire, ainsi que l'arrestation embryonnaire et larvaire, retard de développement, et une perturbation généralisée de l'environnement de repliement des protéines au niveau de organismal. Étonnamment, le domaine de prion cellulaire présente une toxicité cellulaire autonome et non autonome, affectant les tissus avoisinants, dans lequel le transgène ne est pas exprimé. En outre, le transport vésiculaire du domaine des prions dans et entre les cellules est surveillée en temps réel <em> in vivo 40.

Nous décrivons ici comment examiner prion-like diffusion en C. elegans. Nous allons vous expliquer comment surveiller le transport intra et intercellulaire de vésicules contenant le domaine de prion utilisant time-lapse microscopie à fluorescence. Nous mettrons l'accent sur l'utilisation de capteurs de pliage tissu-spécifiques et exprimée de manière ubiquitaire journalistes de stress pour évaluer les effets cellulaires autonomes cellules autonomes et non sur la forme physique cellulaire. Enfin, nous allons décrire la procédure d'un écran récemment effectué du génome grande interférence ARN (ARNi) pour identifier de nouveaux modificateurs de la toxicité induite par le prion. En combinaison, ces méthodes peuvent aider à démêler les voies génétiques impliquées dans le mouvement intercellulaire de protéines et de leur toxicité autonome non cellulaire.

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Protocol

1. Surveillance transcellulaire épandage des protéines à prions comme par In Vivo imagerie time-lapse

NOTE: Cultivez C. elegans de type sauvage (WT) (N2) et lignées transgéniques selon des méthodes standard et de contrôler attentivement la température de la culture 47.

  1. Générer des lignées transgéniques de C. elegans exprimant la protéine prion-like, marqués avec la protéine fluorescente rouge monomère (RDRF). Regardez cette vidéo qui montre comment utiliser la micro-injection 48. Pour plus de détails et les méthodes décrivant comment intégrer ces lignes extrachromosomiques, voir 49.
  2. Préparer populations synchronisés par ponte ou de blanchiment selon les méthodes standard 50.
    1. Synchronisation par la ponte
      1. Transfert 10-20 adultes gravides sur une plaque et les laisser pondent des œufs pour les 1-2 heures. Retirer les adultes de la plaque et laisser la descendance grandir jusqu'à l'âge désiré.
    2. <li> Synchronisation par le blanchissement
      1. Recueillir une population non synchronisé des adultes gravides et de les blanchir avec une solution alcaline d'hypochlorite (NaOH 250 mM et 1: 4 (v / v) la dilution d'eau de Javel commerciale en H 2 O). Lavez les œufs deux fois (218 g pendant 1 min) avec le tampon M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, une mMMgSO 4 · 7H 2 O, ajoutez dH 2 O jusqu'à 1 L).
      2. Permettez-leur d'éclore dans un tampon M9 avec agitation douce O / N à 20 ° C. le développement de Worm arrêtera au stade L1 en l'absence d'une source de nourriture, laissant une population synchronisée. Transfert N1 sur frais nématodes croissance médias (NGM) plaques ensemencées avec OP50 E. coli et bactéries permettent de développer la descendance jusqu'à 47 l'âge désiré.
  3. Préparer tampons d'agarose à 2% (en H 2 O) sur une lame de microscope 50 comme décrit.
    1. Préparer deux kmdiapositives croscope avec du ruban d'étiquetage placé sur toute leur longueur à être utilisés comme entretoises. Placez tiers lame de microscope entre eux.
    2. Dissoudre 2% d'agarose en H 2 O et une pipette goutte sur la lame propre.
    3. Placez quart diaporama perpendiculaire aux trois autres diapositives sur le dessus de la chute agar. Appuyez doucement sur pour aplatir le pad pour la même épaisseur que la bande d'étiquetage.
    4. Laissez sécher pendant 1 min avant de retirer les entretoises et en tirant doucement les lames dehors. Le pad agar se en tiendra à l'un d'eux.
  4. Introduire à la pipette 10 ul ~ anesthésique (2 lévamisole mM dans du tampon M9) sur le tampon et le transfert ~ 10 animaux en utilisant une pointe de fil de platine. Couvrir avec une lamelle (~ 22 x 22 mm) et de prendre des images dans une heure.
  5. Alternativement, d'acquérir des films sur une période de temps plus ou pour réduire davantage la possibilité de tout mouvement des animaux, utiliser une combinaison d'anesthésique et le talon 51 immobilisation.
    1. Préparer 10% agatampons rose (dans du tampon M9) comme décrit 51 ajouter et vers solution à 3 ul de standards de taille de nanosphères (billes de polystyrène, de 100 nm) plus 3 ul d'anesthésie (4 lévamisole mM dans du tampon M9). Couvrir délicatement avec une lamelle. Pour éviter la dessiccation, sceller la lamelle avec valap (mélange de quantités égales de la vaseline, de la lanoline, la cire de paraffine).
  6. Image en immobilisée vers l'utilisation d'un microscope confocal.
    NOTE: Les résultats sont obtenus en utilisant un disque Spinning AF microscope confocal équipé d'une caméra EM-CCD et un logiciel Microscopie Automation & Analyse d'image tels que MetaMorph et décrivent les détails ci-dessous, mais d'autres systèmes d'imagerie confocale comparables peuvent également être utilisés.
    1. Utilisez l'objectif 63X ou 100X / 1.4NA pétrole et placer la lame de microscope contenant des vers dans le support de lame de microscope.
    2. Ouvrez le logiciel. Régler la puissance du laser et des filtres pour l'imagerie mRFP. Utilisez le laser 561 nm à 10% de la puissance et l'émission filtre> 600 nm.
    3. Sous l'onglet "Enregistrement" sélectionner ou créer le dossier du répertoire où les fichiers doivent être sauvegardés. Attribuez un nom au fichier.
    4. Sous l'onglet "Wave Longueur" sélectionnez l'éclairage approprié et ajuster l'exposition et gain. Utiliser "YokoQuad Red" (ou un réglage d'éclairage pour l'imagerie mRFP équivalent) avec une exposition entre 100 et 300 ms et un gain de la caméra entre 100 et 300, en fonction de l'échantillon individuel (évaluée en utilisant l'image en direct).
    5. Sous l'onglet «Timelapse», sélectionnez «Nombre de points de temps" = 301, "Durée" = 5 min et "Durée / Intervalle" = 1 sec.
    6. Dans le cadre du "Journaux" Sélectionnez l'onglet Journal: "AFC SET Z HOLD" et "AFC retour à Z HOLD", Type: &# 8220; spécial "(deux fois), point de départ:" Début de l'heure le point "et" Fin de point de temps. " Cette option de mise au point est important pour l'image de la même section sur une période de temps plus longue.
    7. Lorsque l'installation est terminée, appuyez sur "Acquérir". La vidéo timelapse est Safed sous forme de fichiers TIFF séparés.
    8. Ouvrez tous les fichiers .tiff d'une série de temps donné dans ImageJ. Allez à "Image" → "Stacks" → "Images à Stacks". Eventuellement, régler la luminosité et le contraste, ajouter une barre de taille, etc. exporter le film dans "Fichier" → "Enregistrer sous" → "AVI ..." (pour un exemple, voir la vidéo 1 et 2 correspondant à la figure 1).

2. Utilisation de capteurs pliants et Reporters stress d'enquêter cellulaire autonome et non cellulaire autonome affecte sur protéostasie et toxicité

  1. Générer des lignées transgéniques qui coexprimer un capteur de pliage ou de stress reporter avec la protéine prion-like. Pour les méthodes sur la façon d'établir des croix ou de générer des lignées transgéniques, voir 48,49,52. Voir le tableau 1 pour une liste de C. elegans souches qui peuvent être utilisées.
  2. Préparer populations synchronisées d'animaux transgéniques et de les cultiver jusqu'à l'âge désiré comme décrit ci-dessus (section 1.2) 50.
  3. L'utilisation d'un stéréomicroscope, d'examiner le phénotype du capteur respectif de pliage ou de stress reporter.
    1. Pour le capteur de pliage, de déterminer le nombre d'animaux hébergeant agrégats de chaque jour après la synchronisation (pour un exemple, voir la figure 2E et F).
    2. Pour le journaliste de stress, test si la co-expression des résultats de protéines prion-like dans une fluorescence accrue de la journaliste (pour un exemple, voir la figure 3).

3. Écran d'échelle du génome pour la répression de la toxicité induite Prion-en C. elegans

Figure 4
Figure 4. Représentation schématique du protocole de dépistage ARNi. Voir la section 3 du protocole pour une description détaillée des étapes individuelles.

  1. Synchronisation de C. vers elegans et le dédoublement de la bibliothèque de l'ARNi
    1. Pour l'écran ARNi, utiliser la bibliothèque Ahringer ARNi (ou la bibliothèque Vidal ARNi) 53,54. Rearray la bibliothèque de l'ARNi 384 format bien d'origine dans des plaques 96 puits en remplissant les plaques avec 100 ul de milieu LB-amp (50 ug / ml d'ampicilline dans LB) supplémenté avec 10% de glycerol et inoculer en utilisant un réplicateur à 96 broches. Croître à 37 ° CO / N avec agitation et conserver à -80 ° C.
    2. Maintenir C. elegans WT et lignées transgéniques à 20 ° C sur des plaques NGM ensemencées avec OP50 E. bactéries coli selon des procédés standard 47.
    3. Synchronisez le domaine de prion transgénique et WT (contrôle) nématodes par le blanchiment (voir section 1.2).
    4. Le même jour que les vers sont blanchies, préparer milieu LB additionné de 50 ug / ml d'ampicilline. Utilisez un distributeur de réactif automatisée à distribuer (ou d'une pipette manuelle) 65 pi des médias LB-ampères dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
    5. Retirer 96 des plaques de bibliothèque Ahringer ARNi de -80 ° C et les amener à une hotte stérile avec des serviettes en papier. Immédiatement retirer le joint-bande en maintenant la plaque à l'envers pendant plaques sont encore gelés, prenant soin d'éviter la contamination de la glace à l'extérieur des plaques. Reinvert les plaques et laissez-les décongeler pendant environ 30 min.
    6. Trempez une stérile 96 broches réplicateur dans une plaque bibliothèque ARNi, puis dans une plaque LB-ampères frais. Utilisez un réplicateur frais stérile pour chaque plaque. Sceller toutes les plaques avec du papier adhésif et retourner les plaques de la bibliothèque à -80 ° C. Les réplicateurs peuvent être trempées dans l'eau de Javel, rincées,et passé à l'autoclave pour être utilisé à nouveau.
    7. Permettre plaques ARNi doubles de croître O / N dans un incubateur réglé à 37 ° C et 300 rpm. Pour utiliser HT115 E. coli bactéries hébergeant le vecteur vide (L4440) comme témoin, se développent séparément dans un tube de culture puis pipeter 65 pi de la culture avec une pipette multicanaux en quart de deux plaques à 96 puits.
  2. Induction de la production bactérienne ARNdb et l'ajout de vers
    1. Diluer isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) à une concentration de 5 mM dans ddH 2 O. Utilisez un poste de travail automatisé avec une tête multicanal à distribuer (ou une pipette manuelle) 10 pi de IPTG dilué dans chaque puits des bactéries ARNi et les plaques de contrôle. Refermer et placer les plaques de nouveau dans l'incubateur. Qu'ils tremblent pendant 3 heures à 37 ° C.
    2. Alors que les bactéries sont tremblaient, préparer les vers. Mélanger le / ver suspension M9 bien, et la pipette un petit échantillon (~ 5-10 pi) sur une lame de microscope en verre. Compterle nombre de vers sous un stéréomicroscope et de calculer le nombre de vers par ul.
    3. En utilisant une technique stérile, préparer une solution de M9 supplémenté (M9 +) avec les concentrations finales suivantes: 0,20 mg / ml d'IPTG, 8,0 ug / Cholestérol ml, 50 pg / ml d'ampicilline, 9,6 pg / ml de tetracycline, 0,0835 ug / ml de Fungizone, et 15 vers par 50 ul.
      1. Faire des solutions séparées pour le domaine de prion transgénique et les vers WT. Le volume final de la solution de ver M9 + nécessaire dépendra du nombre de plaques ARNi copiés (voir ci-dessous), plus ~ 30 ml de volume mort qui restera dans le réservoir, si un distributeur automatique est utilisé.
    4. Après l'induction de 3 h de la production bactérienne ARN double brin, prendre les plaques de l'incubateur et laisser refroidir à température ambiante (~ 30 minutes) pour éviter la chaleur soulignant les animaux.
    5. Distribuer M9 + solution de ver transgénique de domaine prion de 50 ul à chaque puits des plaques ARNi et l'une des plaques de lutte antivectorielle vides. FaireAssurez-vous de mélanger la solution à vis sans fin, avant chaque étape que les animaux ont tendance à sédimenter au fond du réservoir.
    6. Distribuer vers WT dans la seconde plaque de commande. Laissez les plaques non scellées pour permettre l'aération. Pour garder la culture liquide de se évaporer, empiler 4-5 plaques ensemble et enveloppez-les avec une serviette en papier humide et une feuille d'aluminium. Incuber à 200 tours par minute à 20 ° C pendant 4 jours.
  3. Points
    NOTE: Après 4 jours dans l'incubateur, les vers seront à la deuxième journée de l'âge adulte et sont prêts à l'écran. Laissez les animaux à se adapter à des conditions non secousse pendant 30 min avant de dépistage pour se assurer volée sans être dérangé.
    1. L'utilisation d'un appareil Falcon 4M60 connecté à un ordinateur avec un moniteur, écran visuellement augmenté volée par rapport aux témoins traités domaine prion animaux transgéniques.
    2. Dresser une liste de hits préliminaires pour confirmer utilisant wrMTrck (voir la section suivante).

4. Confirmation de préliminaireVisites écran

  1. Motilité test sur des plaques solides
    1. Préparer des plaques NGM avec supplémenté avec 100 ug / ml d'ampicilline, 12,5 ug / ml de tetracycline et 1 mM d'IPTG, selon des procédés standard 47. Si possible, utilisez une machine en forme de plaque de coulée pour assurer toutes les plaques ont la même hauteur des médias, ce qui permettra un processus d'acquisition vidéo plus simple.
    2. Cultiver les différents clones d'ARNi dans ~ 1 ml de LB + 50 ug / ml d'ampicilline, O / N à 37 ° C et 250 tours par minute.
    3. Le lendemain, induisent l'expression de l'ARN double brin avec IPTG 1 mM pendant 3 heures. Ensemencer les plaques avec 150 pi de chaque clone bactérien ARNi, répartis dans une couche mince. Que les bactéries sèches pendant 2 jours à la température ambiante dans l'obscurité. Préparer 3 plaques par ARNi clone.
    4. Synchroniser la population du ver par blanchiment selon des méthodes standard 50 (voir section 1.2), et de laisser les œufs éclosent O / N dans des milieux M9.
    5. Prélever un échantillon de la suspension de vis sans fin et déterminer le montant de nematodes par ul à la loupe binoculaire. Puis, une pipette le bon volume de M9 ainsi vers dans chaque plaque expérimentale de sorte qu'il contient 25 à 30 vers L1. Cultivez les nématodes à 20 ° C pendant quatre jours jusqu'à ce que les vers atteignent deux jours de l'âge adulte.
  2. L'analyse quantitative de ver motilité avec le plugin pour ImageJ wrMTrck
    REMARQUE: Les vidéos ont été enregistrés en utilisant un stéréomicroscope à un grossissement de 10X avec un Hamamatsu Orca-R2 appareil photo numérique C10600-10B et le logiciel d'imagerie PCI simple Hamamatsu.
    1. Allumez l'appareil photo et le logiciel d'imagerie PCI simple. Cliquer sur "direct" pour permettre le réglage des conditions de formation d'image.
    2. Mettre en place les conditions vidéo comme suit: Gain = 0; Mode Voyant = haut; Indice de vitesse = 1; Binning = 2. Cliquez sur «Exposer Auto», puis ajuster les conditions d'éclairage, le déplacement des miroirs de microscope et la luminosité et le contraste cadrans.
      REMARQUE: La vidéo doit avoir un contraste élevé sans être EXPOSED, de sorte que les animaux affichent comme des formes noires sur un fond clair.
    3. Cliquez sur "Scan Time" et choisissez un dossier et un nom de fichier. Réglez "Champ Delay" à 20 ms et "Arrêtez-vous à l'heure" à 30 sec. Appuyez sur "Revoir Live" pour choisir la zone de la plaque d'enregistrer (où la plupart des vers sont). Appuyez sur la plaque 3 ou 4 fois sur la scène, rapidement confirmer sa position dans le champ de vision et appuyez sur "Démarrer".
    4. Après le film a fini d'enregistrer, cliquez droit sur l'image et choisissez "Exporter Montage Séquence" pour exporter le film d'un format à un .cxd .avi.
  3. L'analyse des vidéos de la motilité
    1. Ouvrez le logiciel ImageJ, allez dans l'onglet "Plugins", puis "wrmtrck" et sélectionnez "Batch wrMTrck". Sélectionnez le répertoire contenant tous les fichiers à analyser.
    2. Dans la fenêtre de wrMTrck_Batch d'entrée principale, charger les valeurs d'entrée comme détaillé dans Figure 5C. Explication pour chacun des paramètres peut être trouvée dans les instructions qui accompagnent le plugin. Cliquez sur "OK" et laisser l'analyse du mouvement terme.
    3. Pour prendre soin des résultats et de confirmer que toutes les pistes sont détectées à partir réelle C. elegans et éliminer les artefacts, ouvrir chacun des fichiers .txt créés pour chaque film et de copier les informations dans un fichier de logiciel d'analyse de données. Ouvrez les "*" _labels.zip fichiers créés et exécutez le résultat "* _labels.tif" pour vérifier et éliminer les pistes de vers de fausses manuellement.

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Representative Results

Suivi intercellulaire propagation de protéines prion-like in vivo par imagerie time-lapse

Transgénique C. elegans lignes exprimant le domaine des prions sont particulièrement bien adaptées pour l'analyse de certains aspects de protéines prions en forme, par exemple, la transmission de cellule à cellule et la toxicité non autonome cellulaire. La transparence des animaux permet un suivi de fluorescence protéines marquées au sein de l'organisme vivant à chaque étape de la vie. Profitant de ce mouvement des protéines prion-like à travers les cellules et les tissus en utilisant un microscope à fluorescence sont visualisées. Un objectif de l'huile 63X ou 100X / 1.4NA est nécessaire pour résoudre les structures vésiculaires. Fait important, le domaine de prion doit être étiqueté avec mRFP, afin de rester visible par fluorescence à l'intérieur de ces vésicules acides 40 probablement. La protéine fluorescente jaune (YFP), qui est souvent utilisé comme une étiquette, is ne convient pas car il est trempé dans un environnement à faible pH 40,55. Strain AM815 exprime DP-étiqueté R2E2 (une forme hautement agrégation sujette et toxiques du domaine de prion NM) qui se accumule dans des vésicules tubulaires, tandis que la balise DP seule reste soluble (figure 1A et B). En utilisant l'imagerie in vivo time-lapse, on a pu observer que ces vésicules tubulaires sont transportés à l'intérieur et entre les cellules 40 (figure 1C et D, vidéo 1 et 2) [placer des liens vers la vidéo 1 et 2 ici].

Grâce à des capteurs de pliage et journalistes de stress pour enquêter cellulaires effets autonomes autonomes et non-cellulaires sur protéostasie et la toxicité

Les prions sont capables de traverser protéines apparentées de semences et de perturber l'environnement de repliement des protéines cellulaires. Cela peut être révélé par la co-expression de senso de pliage appropriérs. Capteurs pliantes sont des protéines métastables non essentiels qui dépendent d'un réseau de protéostasie fonctionnel pour plier correctement. Quelques exemples sont la luciférase et protéines hébergeant sensibles à la température (ts) mutations 56-66 luciole bien connu. Une perturbation de protéostasie conduit à un mauvais repliement du rapporteur, qui peut être détecté par examen visuel d'agrégats ou par exposition du phénotype mutant ts respectif à des températures permissives. Étendues de polyglutamine (polyQ) avec une longueur au seuil de l'agrégation (environ 40 résidus) sont aussi souvent utilisés parce qu'ils présentent une agrégation dépendant de l'âge 67-69. Apparition plus précoce de l'agrégation révèle un environnement pliage compromise. Ici, nous avons utilisé un mutant de prion RΔ2-5 qui reste soluble lorsqu'elle est exprimée en C. elegans paroi du corps musculaire (BWM) cellules et de l'intestin 40 (figure 2A et C). Lors de l'expression simultanée avec R2E2 dans les cellules de BWM, RΔ2-5 reaDily agrégats (figure 2B), révélant un effet cellulaire autonome de R2E2 sur le milieu de repliement des protéines. L'effet généralisé sur protéostasie induction de repliement et à travers les tissus peut être évaluée par l'expression du capteur de pliage distinct dans un tissu qui ne exprime pas la forme du domaine des prions très sujettes à l'agrégation. R2E2 a été exprimé sous un promoteur spécifique d'une cellule BWM (myo-3p), tandis que RΔ2-5 a été exprimé sous un promoteur spécifique de l'intestin (VHA-6p). Agrégation des intestinale RΔ2-5 démontre que R2E2 affecte le repliement des protéines d'une manière autonome non cellulaire 40 (figure 2D). Au lieu d'utiliser RΔ2-5, où les agrégats ne peuvent être détectées à haute résolution, l'utilisation de polyQ44 exprimé dans l'intestin (Q44i) permet la visualisation des agrégats à faible résolution sous un stéréomicroscope (Figure 2E et F). En outre, cela permet une quantification des animals avec des agrégats, ainsi que la quantification du nombre de agrégats.

Pour étudier toxicité cellulaire non autonome du domaine de prion, que nous avons déjà examiné les tissus qui ne expriment pas R2E2 par microscopie électronique voisin et a constaté que l'expression du domaine des prions dans les cellules musculaires conduit à une cellule perturbations autonome non de l'intégrité mitochondriale dans les tissus adjacents, tels comme 40 l'intestin. Résultats de la dysfonction mitochondriale chez les espèces réactives de l'oxygène augmentation (ROS) et le stress oxydatif. Une façon non invasive pour visualiser l'induction de la réponse au stress oxydatif est d'utiliser un stress oxydatif rapporteur inductible 70. La souche CF1553 exprime la protéine fluorescente verte (GFP) sous le stress oxydatif promoteur inductible gazon 3-70. Lorsque traversé les animaux exprimant le domaine du prion dans les cellules R2E2 BWM, le rapporteur est significativement régulée à la hausse dans des cellules de BWM ainsi que dans de nombreux tissus non-BWM ( Le tableau 1 présente une liste de C. elegans souches exprimant capteurs pliantes et journalistes de stress qui peuvent être utilisés de manière analogue.

écran échelle du génome pour la suppression de la toxicité induite prion en C. elegans

Le phénotype de la toxicité du complexe domaine de prion exprimée en C. elegans est particulièrement intéressant en raison de l'absence de toxicité observée dans plus perceptible dans des modèles in vitro 71 à prions. Ce modèle pourrait révéler de nouvelles voies qui peuvent influer sur la toxicité associée à prions chez les métazoaires. Pour résoudre ce problème, nous avons examiné des gènes qui, lorsque ARNi épuisée, permettant d'améliorer le défaut de motilité de R2E2 animaux transgéniques. Témoin traité vers WT peuvent être utilisés en tant que co positifntrol, bien que la plupart des gènes candidats ne fourniront pas un sauvetage plein mouvement de phénotype, en raison de la pénétrance variable ARNi et la forte toxicité du transgène. Les animaux ont été traités pendant 4 jours avec l'ARNi, à partir du premier état larvaire L1 à jour 2 de l'âge adulte. En ce moment, la raclée des animaux non traités R2E2 est significativement plus lent que la raclée des animaux WT, ce qui est important parce que nous contrôlons pour une amélioration de la motilité. F1 descendance sera présent (~ N1), mais est facile à distinguer de la génération de P0. Seulement la génération de P0 est marqué. Cet écran initial est visuel et non quantitative et donc, un seuil bas a été utilisé pour identifier les résultats préliminaires, ce qui signifie que chaque clone de l'ARNi bactérienne qui semblait augmenter la raclée des animaux à prions exprimant été testé de nouveau dans un dosage quantitatif de ramper. La figure 4 décrit les principales étapes de la configuration de l'écran. La haute résolution de la caméra Falcon 4M60 a permis à un dépistage visuel d'un quarter de la plaque à la fois sur un écran d'ordinateur, ce qui a permis à l'écran pour être rempli de manière plus efficace. Bien qu'elles soient utiles, ce ne est pas nécessaire. L'examen visuel de ver volée peut également être effectuée en utilisant un stéréoscope à faible grossissement (10X).

Confirmation de préliminaires hits écran

Écrans à haut débit sont réalisées comme une approche qui permet de larges effets du génome d'analyse pour obtenir une liste primaire des gènes candidats qui peuvent être affinés par des méthodes complémentaires. Validation des résultats de l'écran est donc essentiel d'éliminer les éventuels faux positifs, qui pourraient résulter de l'exécution d'un écran avec un seul échantillon expérimental par ARNi. R2E2 animaux transgéniques ont été nourris avec les clones d'ARNi de résultats primaires et mesuré leur vitesse sur des plaques NGM le deuxième jour de l'âge adulte, comme une lecture quantifiable de la motilité et une diminution de la toxicité. Nous avons utilisé le plugin pour ImageJ wrMTrck, développé dans notrelaboratoire, qui identifie avec précision C. elegans dans les vidéos et suit leur mouvement. Le plugin et son exécution pour l'analyse automatisée wrMTrck sont open-source et disponible au public à http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, avec des instructions détaillées sur la façon de l'utiliser. Après le téléchargement, copier le dossier de wrMTrck ensemble dans le dossier Plugins de ImageJ. Ce protocole décrit la méthode wrMTrck_Batch, pratique pour l'analyse d'un grand nombre de vidéos à la fois, mais les instructions pour un manuel, film par film, analyse sont également disponibles avec le téléchargement du plugin. WrMTrck_Batch convertit une vidéo originale (Figure 5A) dans un format binaire avec soustraction du fond et chaque vis sans fin est affectée une piste. Chacune des vidéos traitées peuvent ensuite être visualisées avec ces pistes superposées, afin d'éliminer manuellement les artefacts qui ont été faussement identifiées comme des vers (piste 1 e. G., La figure 5B). Un moyen efficace pour éliminer art de fond iFACTS (indiqués par une flèche sur la figure 5B) est de choisir soigneusement la taille minimale et maximale des objets à être identifiés (Figure 5C). A partir des différentes sorties du plugin wrMTrck, nous utilisons les longueurs du corps par seconde (BLPS) paramètre qui mesure la vitesse moyenne de chaque animal, représentée par la longueur de chaque piste divisée par la longueur du corps de chaque objet, normalisant ainsi des différences possibles la taille des nématodes (Figure 5D). En utilisant cette méthode, nous avons identifié 35 suppresseurs de la toxicité induite par le prion (sopt) qui a augmenté le phénotype de la motilité dans R2E2 exprimant C. elegans à au moins 133% et jusqu'à 256% par rapport à vers traitées par le vecteur vide (figure 6). Ces gènes Sopt représentent la finale hits qui ont résulté de nos efforts de criblage à haut débit confirmé.

21fig1highres.jpg "/>
Figure 1. Le domaine de prion se propage entre les cellules et les tissus en C. elegans par transport vésiculaire. (A) Collapsed confocale z-piles de nématodes exprimant RFP dans la paroi du corps musculaire (BWM) cellules (RFPM). (B) Collapsed confocale z-piles de nématodes exprimant la variante hautement toxique et l'agrégation NM sujettes, R2E2 , dans les cellules BWM (R2E2m). Les flèches indiquent vésicules tubulaires, flèche indique globale. (C + D) série Time-lapse d'animaux exprimant RFPM (C) et R2E2m (D). Les flèches indiquent les zones de mouvement vésiculaire. RFPM présente surtout une coloration diffuse. Même lorsque RFPM se trouve dans des vésicules, ce à peine bouger. R2E2m localise à de nombreuses vésicules qui sont transportés à l'intérieur et entre les cellules. Barres d'échelle: 10 um. Les vidéos d'accompagnement 1 et 2 [placer des liens vers la vidéo 1 et 2 ici] correspondent à la figures 1C et D,respectivement.

Figure 2
Figure 2. capteurs pliantes révèlent l'effet généralisé du domaine de prion sur protéostasie. (A + B) co-expression de R2E2m favorise l'agrégation RΔ2-5m. Les images confocales de (A) le contrôle RΔ2-5m et (B) RΔ2-5m co-exprimées avec R2E2m dans les cellules de BWM. (C + D) Muscle exprimé R2E2m favorise l'agrégation RΔ2-5i intestinale. (C) l'image confocale du contrôle des animaux exprimant RΔ2- 5i dans les cellules intestinales. (D) de l'image confocale de R2E2m animaux exprimant dans les cellules BWM RΔ2-5i et dans l'intestin. Barres d'échelle: 10 um (E + F) R2E2m induit non cellulaire autonome de l'agrégation Q44i (E) images fluorescentes représentatifs de Q44i et Q44i; animaux R2E2m quatre jours après le transfert synchronisé lar L1..vae sur des plaques fraîches OP50 graines NGM. L'expression dans des cellules de R2E2 BWM conduit à une apparition plus précoce de l'agrégation Q44i dans l'intestin. (F) Quantification des animaux avec des granulats (en%) aux jours indiqués après la synchronisation. Les barres d'erreur représentent SD Ce chiffre a été modifié depuis 40.

Figure 3
Figure 3. La première pelletée de terre 3p :: GFP transcriptionnelle de stress journaliste révèle que le domaine de prion cellulaire provoque l'induction des cellules autonomes et non autonomes du stress oxydatif. (A + B) des images représentatives fluorescentes (utilisant le même temps d'exposition) de gazon-3p :: GFP exprimant animaux témoins (A) et gazon-3p :: GFP;. Animaux R2E2m (B) le jour 2 de l'âge adulte (C) L'expression de R2E2 dans les cellules de BWM conduit à une induction de le reporter non seulement dans la cellule BWMs (I), mais aussi dans l'intestin (II), le nerf cordon (III), les neurones du pharynx et de la tête (IV).

Figure 5
Figure 5. Analyse de mouvement sans fin avec le plugin wrMTrck pour ImageJ. (A) Exemple d'un film d'entrée généré en utilisant un grossissement approprié (~ 10X) pour surveiller plusieurs animaux à la fois. (B) "*" _labels.tif fichiers sont une sortie de wrMTrck_Batch et permettre curation manuelle des résultats d'analyse. La flèche indique un objet qui a été correctement exclu de l'analyse en raison d'un choix approprié des paramètres minimum et maximum taille. (C) la fenêtre d'entrée de wrMTrck_Batch, montrant paramètres utilisés pour ce protocole. Ces paramètres doivent être ajustés en fonction des paramètres individuels de microscope et de cinéma. (D) les résultats de sortie de movemeanalyse nt de (B), avec la colonne BLPS surligné en jaune. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 1
Figure 6. vers R2E2 traités avec des clones d'ARNi qui sont suppresseurs de prion induite-toxicité (sopt) montrent l'amélioration de la motilité. La mobilité est montré comme BLPS relatifs par rapport au contrôle négatif (vecteur vide). Affichés sont toutes statistiquement significatives (test t de Student) clones ARNi identifiés dans l'écran d'HTP. étoile noire représente le hit présentée comme un exemple de la figure 5. Les résultats sont de 3 films, avec 17 <n <53 pistes par état. Les barres d'erreur représentent SEM. </ P>

Tableau 1. C. elegans souches exprimant capteurs pliantes et journalistes de stress.

nom de la souche génotype Commentaires Souche source de
Capteurs pliantes
transgènes
AM140 unc-54p :: :: polyQ35 YFP musculaire spécifique expression de polyQ35, l'agrégation dépendante de l'âge CCG ou Morimoto laboratoire
AM141 unc-54p :: :: polyQ40 YFP expression spécifique du muscle de polyQ40, age agrégation dépendante CCG ou Morimoto laboratoire
AM801 unc-54p :: :: RΔ2-5 YFP expression spécifique du muscle de la nucléation domaine prion incompétents Morimoto laboratoire
OG412 VHA-6p :: :: polyQ44 YFP intestin spécifique expression de polyQ44, l'agrégation dépendante de l'âge CCG
AM809 VHA-6p :: RΔ2-5 de la GFP; myo-2p :: mCherry expression spécifique intestin de nucléation domaine prion incompétents Morimoto laboratoire
AM47 F25B3.3p :: :: polyQ40 cfp expression spécifique de neurone de polyQ40, l'agrégation de type spécifique de cellules Morimoto laboratoire
AM982 unc54p :: :: YFP luciférase expression spécifique du muscle du WT luciférase de luciole Morimoto laboratoire myo-3p :: :: gfp luciférase; rol-6 expression spécifique du muscle du WT luciférase de luciole Behl laboratoire
sng-1p :: :: gfp luciférase; rol-6 expression spécifique du muscle du WT luciférase de luciole Behl laboratoire
FUH55 unc54p :: :: FLUC egfp; rol-6 expression spécifique du muscle du WT luciférase de luciole Hartl laboratoire
FUH134 unc54p :: :: FLUCSM egfp; rol-6 expression spécifique du muscle du mutant R188Q luciférase de luciole Hartl laboratoire
FUH135 unc54p :: :: FLUCDM egfp; rol-6 expression spécifique du muscle de R188Q + double mutant R261Q luciférase de luciole Hartl laboratoire
FUH48 F25B3.3p :: :: FLUC egfp; rol-6 expression spécifique des neurones du WT lucifera lucioleSE Hartl laboratoire
FUH136 F25B3.3p :: :: FLUCSM egfp; rol-6 expression spécifique des neurones du mutant R188Q luciférase de luciole Hartl laboratoire
FUH137 F25B3.3p :: :: FLUCDM egfp; rol-6 expression spécifique de neurone de R188Q + double mutant R261Q luciférase de luciole Hartl laboratoire
mutants ts
CB1402 unc-15 (e1402) Je Paramyosine (ts), sensible à la température Unc-paralysé, Let CCG
CB1157 unc-54 (e1157) Je Myosine (ts), la température Unc sensibles CCG
CB1301 unc-54 (e1301) Je Myosine (ts), la température Unc sensibles CCG
CB286 unc-45 (E286) III Unc-45 (ts), sensible à la température, lente Unc déplacer, Egl CCG
HE250 unc-52 (e669su250) II Perlecan (ts), la température Unc sensibles, la paralysie raide CCG
SD551 laissez-60 (ga89) IV Ras (ts), la température Muv sensible, Ste, Que, Lva, Osm CCG
CX51 dyn-1 (ky51) X Dynamin (ts), la température Unc sensibles CCG
CW152 gaz-1 (FC21) X Gaz-1 (ts), sensible sensibilité de EtOH de température CCG
ZZ26 unc-63 (x26) Je récepteur de l'acétylcholine (ts), la résistance de lévamisole sensible à la température CCG
journalistes de stress
CL2070 HSP-16.2p :: gfp; rol-6 contrainte thermique; Cyto EPU CCG
TJ375 HSP-16.2p :: gfp contrainte thermique; Cyto EPU CCG
TJ3000, TJ3001 HSP-16.2p :: GFP; CBR-unc-119 (+) contrainte thermique; Cyto EPU CCG
AM446 GFP de hsp70p; rol-6 contrainte thermique; Cyto EPU Morimoto laboratoire
AM722 hsp70p :: mCherry; myo-2p :: cfp contrainte thermique; Cyto EPU Morimoto laboratoire
AM799 hsp90p de la gfp contrainte thermique; Cyto EPU Morimoto laboratoire
OG497 HSF-1p :: HSF-1 :: gfp; CBR-unc-119 (+) contrainte thermique; Cyto EPU CCG
CF1553 SOD-3p :: GFP; rol-6 stress oxydatif CCG
KN259 SOD-3p :: GFP; rol-6 stress oxydatif CCG
CL2166 gst-4p :: :: GFP nls stress oxydatif CCG
LD1171 gcs-1p :: GFP; rol-6 stress oxydatif CCG
LD1 skn-1p :: SKN-1 :: GFP; rol-6 stress oxydatif CCG
IG274 PNL-29p :: gfp stress osmotique CCG
BC20309 mtl-1p :: gfp le stress métallique Baillie laboratoire
BC20342 mtl-2p :: gfp str métalliqueess Baillie laboratoire
BC20314 ELT-2p :: gfp le stress métallique Baillie laboratoire
SJ4005 HSP-4p :: gfp EPU ER CCG
SJ4100 HSP-6p :: gfp EPU mito CCG
SJ4058 HSP-60p :: gfp EPU mito CCG

CCG: Caenorhabditis Centre de génétique; ts = sensible à la température; = Réponse de la protéine dépliée EPU; cyto = cytosolique; mito = mitochondrial; ER = réticulum endoplasmique.

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Discussion

Les procédés décrits ici permettent d'illustrer la propagation cellulaire et la toxicité de la cellule autonome et non autonome complexe de protéines prion-like. Nous avons récemment découvert que un domaine prion cytosolique agrégation sujette est repris dans des vésicules membranaires dans un processus d'autophagie liés. Un sous-ensemble spécifique de ces vésicules transporte le domaine de prion dans et entre les cellules et les tissus 40. La clé pour contrôler leur mouvement dans l'animal vivant est que la protéine doit être étiqueté avec mRFP, parce que seuls les protéines mRFP-marqués étaient visibles dans ces vésicules vraisemblablement acides. En utilisant la même approche, nous étudions actuellement le comportement potentiel de prion-like de certaines protéines liées à la maladie, comme la superoxyde dismutase 1 (SOD1) (lié à la SLA), l'alpha-synucléine (lié à PD) ou TAR protéine de liaison à l'ADN 43 (TDP-43) (lié à la SLA). Bien que ce type de transport intercellulaire à l'intérieur de vésicules semble être utilisé par plusieurs autres protéines, il pourrait y avoir unSUPPLEMENTAIRES voies qui permettent la diffusion.

L'utilisation de capteurs pliage bien caractérisés est un outil puissant pour surveiller les effets sur la protéine cellulaire pliage environnement dans C. elegans 63-66. Ici, nous avons montré comment utiliser l'accumulation dépend de fluorescence d'âge les protéines marquées à l'agrégation sujettes exprimé sous promoteurs spécifiques de tissus de surveiller visuellement la capacité de pliage de tissus distincts simultanément. Autres possibilités d'étudier le réseau de protéostasie organismal comprennent l'utilisation de protéines mutantes ts endogènes. Ces protéines métastables fonctionneront normalement à la température permissive (15 ° C), mais misfold et devenir non fonctionnel à la température restrictive (25 ° C), présentant leur phénotype mutant caractéristique. En présence d'une protéine sujettes d'agrégation ou au cours du vieillissement, les ts phénotype mutant se trouve exposé même à des conditions permissives 63-66. Certains de ces mutants ts sont exprimés en oeul un sous-ensemble des tissus ou des phénotypes spécifiques de tissus exposition, rendant ces particulièrement utile pour tester les cellules cellules autonomes et non autonomes protéotoxique effets. Par exemple, un mutant ts de louer-60, un membre de la famille de proto-oncogène RAS de liaison au GTP, Ras (ts), est exprimée de manière ubiquitaire, mais montre mutant spécifique de tissu phénotypes 63,66. En utilisant ce mutant ts, a montré l'effet de l'expansion de polyQ sur le protéostasie cellulaire à cellulaire autonome 63. L'expression de polyQ dans le fond génétique de ras (TS) a révélé que le phénotype mutant spécifique au tissu dans lequel la protéine a été exprimée. L'exposition de plusieurs phénotypes mutants indique qu'une protéine a non-cellulaires effets protéotoxique autonomes.

En outre, pour tester les effets sur les voies de stress cellulaire, il ya une grande sélection de in vivo journalistes de stress fluorescentes dans C. elegans 72. Ce sont généralement des transcriptional journalistes qui expriment la protéine fluorescente verte (GFP) sous un promoteur inductible par le stress, tels que hsp-16.2p ou de gazon-3p, qui rendent compte de la contrainte thermique ou oxydante, respectivement 72. En utilisant journalistes appropriées en combinaison avec des protéines à prions comme, on peut surveiller une induction possible de réponses au stress dans les tissus autres que celle exprimant le transgène respective. Une mise en garde, cependant, est que ces journalistes de stress sont souvent pas assez sensible pour révéler régulation positive subtile d'une voie donnée (observations non publiées).

Sur notre quête d'examiner si les gènes qui influencent la toxicité autonome non-cellulaire affectent également la protéine propagation, nous avons commencé par le dépistage des gènes qui, lorsque renversé, permettraient d'atténuer les défauts de mouvement. Utilisation de l'évaluation visuelle des taux de natation comme une température lue, nous avons pu confortablement test ~ 25 plaques par session et d'effectuer deux tours de ce protocole par semaine, ce qui entraîne l'achèvementde l'écran initial dans les six semaines. La confirmation des résultats, par analyse quantitative du mouvement de la vis sans fin sur des plaques solides, en triple, en utilisant wrMTrck a été effectuée en une période supplémentaire de 3 semaines. Une mise en garde, cependant, est que l'aide de ramper dans des plaques au lieu de nager dans des milieux liquides comme une lecture on pourrait perdre certains gènes candidats, nager et de ramper ne sont pas des mouvements identiques et peuvent être influencés par des voies distinctes 73. Ainsi, si certains gènes candidats ne peuvent être confirmées sur des plaques solides, ils devraient être testés dans des milieux liquides, où la baignade peut être quantifiée en comptant la fréquence de volée dans un temps donné.

Le protocole de dépistage décrit ici utilise automatisée des postes de travail de manutention de liquides, ce qui réduit considérablement la variabilité. L'inconvénient est que l'excès de fluides pour le réservoir des robots est nécessaire, ce qui pourrait ne pas être toujours possible. Cette configuration de dépistage peut être facilement adaptée à d'autres écrans en C. elegans </ Em> que l'utilisation volée comme un écran de lecture-out.This n'a pas été conçu pour identifier les gènes qui influencent directement la non toxicité cellulaire autonome étalement ou du domaine de prion, comme génome écrans larges doivent être simples dans la conception, de manière à être exécuté en temps opportun. anomalies de la motilité peuvent provenir non seulement de musculaire, mais aussi à partir de lésions neuronales et d'un certain nombre d'autres 53 anomalies génétiques. Ainsi, en utilisant cette lecture, nous pourrions trouver non seulement des modificateurs de toxicité spécifique du muscle. Nous testons actuellement les gènes candidats pour leurs effets sur le domaine de la diffusion et de la toxicité prion autonome non cellulaire en utilisant les méthodes décrites ci-dessus. Ces expériences seront éventuellement révéler si transcellulaire diffusion d'agrégats de protéines est directement lié à la toxicité observée dans d'autres tissus ou si la transmission de cellule à cellule et la toxicité cellulaire non autonome peuvent être désaccouplé.

Pris ensemble, les méthodes décrites peuvent être utilisées pour examiner le potentiel prle comportement des ions comme des protéines au niveau cellulaire et organismique utilisant C. elegans.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

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