Undersøgelse Spredningen og toksicitet af Prion-lignende proteiner Brug af metazoan modelorganismen

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mange neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), og overførbare spongiforme encephalopatier (TSE), er forbundet med sammenlægning-tilbøjelige proteiner og er derfor kollektivt kendt som protein misfoldning lidelser (PMDs ). TSE eller prionsygdomme udgør en unik klasse af PMDs i, at de kan være infektiøs i både mennesker og dyr 1. På molekylært niveau, prioner replikere ved at rekruttere og omdannelse monomert α-helix-rige vært kodet cellulær PrP (PrP C) i den patologiske β-ark-rige PrP Sc konformation 2,3. Selvpropagerende proteinaggregater er også identificeret i svampe, som deler vigtige egenskaber med pattedyr prioner 4,5. Derudover mammale prioner er i stand til at bevæge sig fra celle til celle og inficere naive celler 6,7.

Mens PMDs othER end TSE er ikke smitsomme, de deler en fælles patogen princip med prionsygdomme 8,9. Selvom proteiner knyttet til hver af de PMDs ikke er forbundet i struktur eller funktion, de alle danne aggregater via en krystallisation-lignende proces kaldet nukleeret eller podet polymerisation; desuden proteinholdige frø vokse ved at ansætte deres opløselige isoformer 2,10,11. Effektiviteten til selv Propagate varierer in vivo, afhængig af de iboende egenskaber af proteinet, som sammen med yderligere cellulære faktorer såsom molekylære chaperoner i sidste ende bestemmer satser samlede kernedannelse, såning, fragmentering og spredning 12-15. Derfor skal der findes en fin balance mellem disse faktorer, der muliggør effektiv udbredelse af proteinaggregering. Dette kan også forklare, hvorfor kun nogle amyloidogene aggregater harbor kendetegnene for en prion, og dermed ikke alle PMDs er infektiøse. Prioner synes at repræsentere 'bedste lande' ofa bredt spektrum af selv-replikerende proteinholdige aggregater, hvilket gør dem et kraftfuldt værktøj til at studere PMDs 8,13.

Interessant nok toksiciteten forbundet med sygdomsrelaterede aggregater ofte har en ikke celle autonom komponent 16,17. Dette betyder, at de påvirker tilstødende celler, som ikke udtrykker det tilsvarende gen, i modsætning til en strengt celleautonom virkning, hvilket indebærer, at kun de celler, der udtrykker genet udviser specifik fænotype. Dette blev overbevisende demonstreret ved vævsspecifik ekspression eller vælte af de respektive proteiner i adskillige modeller for neurodegenerative sygdomme 18-26. Forskellige mekanismer er blevet foreslået som grundlag for denne ikke-celle autonome toksicitet i PMDs, herunder mindsket næringsstof forsyning, ubalance i neuronal signalering, glutamatexcitotoksicitet og neuroinflammation 16,27,28. Desuden et prion-lignende bevægelse af sygdomsspecifikke forbundet aggregater mellem celler might bidrage til dette aspekt 29,30. Stigende bevis antyder, at andre protein indeslutninger end prioner kan overføre fra celle til celle, hvilket kan forklare den karakteristiske spredning af patologi observeret i mange PMDs 30-36. Men det er endnu ikke afgjort, om der er en klar årsagssammenhæng mellem intercellulære bevægelse af sygdoms-proteiner og den toksiske effekt på de omkringliggende celler. Derfor er nødvendigt og væsentligt for udviklingen af ​​hidtil ukendte terapeutiske midler en bedre forståelse af de cellulære veje, der ligger til grund for celle-til-celle-transmission og ikke celleautonom toksicitet. Men mange aspekter af prion-lignende spredning og cellulære faktorer, der påvirker celle-til-celle-transmission af fejlfoldede proteiner i metazoans ikke godt forstået, navnlig i organismal niveau.

Nematoden Caenorhabditis elegans har flere fordele, der giver mulighed for at opdage nye facetter af prion-lignende spreading i metazoans 17. Det er transparent, hvilket muliggør in vivo sporing af fluorescens-mærkede proteiner i den levende organisme. Desuden er mange cellulære og fysiologiske processer er ramt af sygdom bevaret fra orme til menneske, og C. elegans er også modtagelig for en bred vifte af genetiske manipulationer og molekylære og biokemiske analyser 37-39. Nøjagtigt 959 somatiske celler udgør voksen hermafrodit med et simpelt organ plan, der stadig har flere forskellige vævstyper, herunder muskel, neuroner og tarmen.

At etablere en ny prion model C. elegans, valgte vi at eksogent udtrykker velkarakteriseret glutamin / asparagin (Q / N) -rige prion domæne nm af cytosoliske gær prionprotein Sup35, da der ikke er nogen kendte endogene prionproteiner i orme 4,40. Gær prioner har været uvurderlig i at belyse grundlæggende mekanismer i prion replikation 41-44. Endvidere NM er first cytosolisk prion-lignende protein, der har vist sig at rekapitulere det fulde livscyklus prion i pattedyrcellekultur 45,46. Ligeledes, når det udtrykkes i C. elegans, Sup35 prion domænet vedtaget bemærkelsesværdigt godt til de forskellige krav til opformering i metazoan celler sammenlignet med gærceller og udstillet centrale elementer i prion biologi 40. NM sammenlægning var forbundet med en dyb giftig fænotype, herunder afbrydelse af mitokondrie integritet og udseende forskellige autophagy relaterede blærer på celleniveau samt embryonale og larver anholdelse, forsinket udvikling, og en udbredt forstyrrelse af proteinfoldning miljøet på organismal niveau. Slående, prion domæne udviser celleautonom og ikke celleautonom toksicitet, der påvirker tilstødende væv, i hvilke transgenet ikke blev udtrykt. Endvidere er vesikulær transport af prion-domænet i og mellem celler overvåges tidstro <em> in vivo 40.

Her beskriver vi, hvordan at undersøge prion-lignende udbredelse i C. elegans. Vi vil forklare, hvordan at overvåge intra- og intercellulære transport af vesikler, der indeholder prion domæne ved hjælp tidsforskudt fluorescens mikroskopi. Vi vil lægge vægt på brugen af ​​vævsspecifikke folde sensorer og ubikvitært udtrykte stress journalister at evaluere celle autonome og ikke celle autonome virkninger på cellulær fitness. Endelig vil vi beskrive proceduren for en nylig udført genom bred RNA-interferens (RNAi) skærmen for at identificere nye modifikatorer af prion-induceret toksicitet. I kombination, kan disse metoder bidrage til drille hinanden genetiske veje er involveret i intercellulære bevægelse af proteiner og deres ikke celleautonom toksicitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Overvågning transcellulær Spredning af Prion-lignende proteiner ved in vivo Time-lapse Imaging

BEMÆRK: Grow C. elegans vildtype (WT) (N2) og transgene linjer ifølge standardmetoder og omhyggeligt kontrollere dyrkning temperatur 47.

  1. Generere transgene linjer C. elegans udtrykker prion-lignende protein, tagget med monomert rødt fluorescerende protein (mRFP). Se denne video, der viser, hvordan man bruger mikroinjektion 48. For yderligere oplysninger og metoder, der beskriver hvordan man kan integrere disse ekstrakromosomale linjer, se 49.
  2. Forbered synkroniserede befolkninger ved æglægning eller blegning ifølge standardmetoder 50.
    1. Synkronisering af æglægning
      1. Overførsel 10 - 20 drægtige voksne på en tallerken og lad dem lægge æg til 1 - 2 timer. Fjern voksne fra pladen og lad afkommet vokse, indtil den ønskede alder.
    2. <li> Synkronisering ved blegning
      1. Saml en usynkroniseret population af drægtige voksne og blege dem med alkalisk hypochloritopløsning (250 mM NaOH og 1: 4 (v / v) fortynding af kommerciel blegemiddel i H2O). Vask æggene to gange (218 xg i 1 min) med M9 buffer 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, tilføje dH2O op til 1 L).
      2. Lad dem klække i M9 buffer under forsigtig omrøring O / N ved 20 ° C. Worm udvikling vil standse på L1 fase i fravær af en fødekilde, efterlader en synkroniseret population. Overførsel L1s på frisk nematodevækst Media (NGM) plader podet med OP50 E. coli bakterier og lad afkommet udvikles, indtil den ønskede alder 47.
  3. Forbered 2% agarose puder (i H 2 O) på et objektglas som beskrevet 50.
    1. Forbered to microscope lysbilleder med mærkning tape placeret over hele deres længde, der skal bruges som afstandsstykker. Placer en tredje objektglas mellem dem.
    2. Opløs 2% agarose i H2O og pipette en dråbe på ren dias.
    3. Placer en fjerde slide vinkelret på de tre andre glider på toppen af ​​agar dråbe. Tryk det forsigtigt ned til at flade puden til samme tykkelse som mærkning tape.
    4. Lad det tørre i 1 min, før du fjerner afstandsstykkerne og forsigtigt trække dias fra hinanden. Agar pad vil holde sig til en af ​​dem.
  4. Pipette ~ 10 pi bedøvelsesmiddel (2 mM levamisol i M9 buffer) til puden og overførsel ~ 10 dyr ved hjælp af en platintråd pick. Dæk med et dækglas (~ 22 x 22 mm) og tage billeder inden for 1 time.
  5. Alternativt til at erhverve film over en længere periode, eller for yderligere at reducere muligheden for enhver flytning af dyrene, bruge en kombination af bedøvelsesmiddel og perle immobilisering 51.
    1. Forbered 10% AGArose pads (i M9-puffer) som beskrevet 51 og tilføje orme til 3 pi nanosfære størrelsesstandarder opløsning (polystyrenperler, 100 nm) plus 3 pi anæstetiske (4 mM levamisol i M9 buffer). Dæk forsigtigt med en dækglas. For at undgå udtørring, forsegle dækglasset med VALAP (blanding af lige mængder af vaseline, lanolin, og paraffin).
  6. Billede immobiliserede orme ved anvendelse af et konfokalt mikroskop.
    Bemærk: Resultaterne opnået ved anvendelse af en roterende skive AF konfokalt mikroskop udstyret med en EM-CCD-kamera og en Microscopy Automation & Image Analysis Software såsom MetaMorph og skitsere detaljerne nedenfor, men andre tilsvarende konfokal billeddannelse kan også anvendes.
    1. Brug 63X eller 100X / 1.4NA objektiv olie og placere mikroskopobjektglasset indeholder orme i mikroskop slide indehaveren.
    2. Åbne softwaren. Juster laser magt og filtre til mRFP billeddannelse. Brug 561 nm laser ved 10% effekt og emission filter> 600 nm.
    3. Under "Lagring" fanen vælge eller oprette mappen mappe, hvor filerne skal gemmes. Tildel et navn til filen.
    4. Under fanebladet "bølgelængde" vælge det relevante belysning og justere eksponering og forstærkning. Brug "YokoQuad Rød" (eller en tilsvarende belysning indstilling for mRFP billeddannelse) med en eksponering på mellem 100 og 300 ms og et kamera gevinst mellem 100 og 300, afhængigt af den enkelte prøve (vurderet ved hjælp af live-billede).
    5. Under "Timelapse" fanen skal du vælge "Antal tidspunkter" = 301, "Varighed" = 5 min og "Time / Interval" = 1 sek.
    6. Under "Tidsskrifter" fanen vælge Journal: "AFC SET Z HOLD" og "AFC Retur til Z HOLD", Type: &# 8220; Special "(to gange), Initial Point:" Start af tidspunkt "og" End of tidspunkt ". Denne autofokus mulighed er vigtigt at afbilde samme sektion over en længere periode.
    7. Når opsætningen er færdig, skal du trykke på "Acquire". Den timelapse video safed som separate TIFF-filer.
    8. Åbn alle .tiff filer af en serie givet tidspunkt i ImageJ. Gå til "Image" → "Stacks" → "billeder til Stacks". Eventuelt justere lysstyrke og kontrast, tilføje størrelse bar osv eksportere filmen under "File" → "Gem som" → "AVI ..." (for eksempel se Video 1 og 2 svarende til figur 1).

2. Brug Folding Sensorer og Stress Journalister at undersøge Cell selvstyrende og Non celle selvstyrende Påvirker på Proteostasis og toksicitet

  1. Generere transgene linjer, der co-udtrykker en sammenfoldelig sensor eller stress reporter sammen med prion-lignende protein. For metoder til, hvordan man etablerer kors eller generere transgene linjer, se 48,49,52. Se tabel 1 for en liste over C. elegans stammer, som kan anvendes.
  2. Forbered synkroniserede populationer af transgene dyr og dyrke dem indtil den ønskede alder som beskrevet ovenfor (afsnit 1.2) 50.
  3. Ved hjælp af et stereomikroskop, undersøger de respektive fænotype foldning sensor eller stress reporter.
    1. For folde sensor, bestemme antallet af dyr, der huser aggregater på hver dag efter synkronisering (for eksempel, se Figur 2E og F).
    2. For stress reporter, test hvis coekspression af prion-lignende protein resulterer i en forøget fluorescens af reporter (for eksempel se figur 3).

3. Genom-bredformat til bekæmpelse af Prion-induceret toksicitet i C. elegans

Figur 4
Figur 4. Skematisk repræsentation af RNAi screeningsprotokol. Se protokol sektion 3 for en nærmere beskrivelse af de enkelte trin.

  1. Synkronisering af C. elegans orme og dobbeltarbejde RNAi bibliotek
    1. For skærmen RNAi bruge Ahringer RNAi bibliotek (eller Vidal RNAi bibliotek) 53,54. Rearray RNAi bibliotek fra den oprindelige 384 brøndsformatet i 96 brønds plader ved at fylde pladerne med 100 pi LB-amp medium (50 ug / ml ampicillin i LB) suppleret med 10% glycerol og podning ved hjælp af en 96-pin replicator. Grow ved 37 ° CO / N med agitation og opbevares ved -80 ° C.
    2. Vedligehold C. elegans WT og transgene linjer ved 20 ° C på NGM plader podet med OP50 E. coli-bakterier ifølge standardmetoder 47.
    3. Synkroniser prion domæne transgene og WT (kontrol) nematoder ved blegning (se afsnit 1.2).
    4. På samme dag, som ormene bleges, fremstille LB-medier suppleret med 50 ug / ml ampicillin. Brug en automatiseret reagens dispenser til at dispensere (eller pipette manuelt) 65 pi LB-amp medier i hver brønd på en plade med 96 brønde.
    5. Fjern 96 brønde Ahringer RNAi bibliotek plader fra -80 ° C og bringe dem til en steril hætte foret med køkkenrulle. Fjern omgående forseglingen-båndet ved at holde pladen på hovedet, mens plader stadig er frosset, være omhyggelig med at undgå forurening fra is på ydersiden af ​​pladerne. Reinvert pladerne og lad dem tø i ca. 30 min.
    6. Dyp en steril 96 pin replikator i en RNAi bibliotek plade, og derefter ind i en frisk LB-amp plade. Brug en frisk steril Replicator for hver plade. Forsegl alle plader med selvklæbende folie tape og returnere biblioteket plader til -80 ° C. Replikatorerne kan lægges i blød i blegemiddel, skylles,og autoklaveret at blive brugt igen.
    7. Tillad duplikerede RNAi plader til at vokse O / N i en inkubator indstillet til 37 ° C og 300 rpm. Hvis du vil bruge HT115 E. coli bakterier, der huser den tomme vektor (L4440) som en kontrol, vokser det separat i en kultur rør og derefter pipette 65 pi af kultur med en multikanalpipette i en fjerdedel af to plader med 96 brønde.
  2. Induktion af bakteriel dsRNA produktion og tilsætning af orme
    1. Fortynd isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) til en 5 mM koncentration i ddH 2 O. Brug en automatiseret arbejdsstation med en multikanal hoved til at dispensere (eller pipette manuelt) 10 pi fortyndet IPTG i hver brønd i RNAi bakterier og kontrolpladerne. Tillukkes og placere pladerne tilbage i inkubatoren. Lad dem omrystes i 3 timer ved 37 ° C.
    2. Mens bakterier omrystning forberede orme. Bland M9 / orm suspension godt, og afpipetteres en lille prøve (~ 5 - 10 pi) til et objektglas. Tælantallet af orme under et stereomikroskop og beregne antallet af orme pr pi.
    3. Anvendelse af steril teknik fremstilles en opløsning af suppleret M9 (M9 +) med følgende slutkoncentrationer: 0,20 mg / ml IPTG, 8,0 ug / ml kolesterol, 50 ug / ml ampicillin, 9,6 ug / ml tetracyclin, 0,0835 ug / ml Fungizone, og 15 orme pr 50 pi.
      1. Gør separate løsninger for prion domæne transgene og WT orme. Det endelige volumen M9 + orm opløsning nødvendig, vil afhænge af antallet af RNAi plader kopieret (se nedenfor), plus ~ 30 ml døde volumen, som vil forblive i reservoiret, hvis der anvendes en automatiseret dispenser.
    4. Efter 3 timers induktion af bakteriel dsRNA produktion, tage pladerne ud af inkubatoren og lad dem afkøle til stuetemperatur (~ 30 min) for at undgå varme stresse dyrene.
    5. Dispenser 50 pi M9 + prion domæne transgen orm opløsning til hver brønd af RNAi plader og en af ​​de tomme vektor kontrol plader. LaveSørg for at blande ormen opløsning før hvert trin som dyrene har tendens til at sedimentere til bunden af ​​reservoiret.
    6. Dispenser WT orme i den anden kontrol pladen. Lad pladerne forseglede at tillade beluftning. For at holde den flydende kultur i at fordampe, stak 4 - 5 plader sammen og wrap med en fugtig køkkenrulle og aluminiumsfolie. Inkuber ved 200 rpm ved 20 ° C i 4 dage.
  3. Scoring
    BEMÆRK: Efter 4 dage i inkubatoren, vil orme være på den anden dag i voksenalderen og er klar til at screene. Lad dyrene tilpasse til ikke rystende forhold i 30 minutter, før screening for at sikre uforstyrret prygle.
    1. Ved hjælp af en Falcon 4M60 kamera sluttet til en computer med en skærm, skærm visuelt for øget prygl i forhold til kontrol behandlet prion domæne transgene dyr.
    2. Udarbejde en oversigt over foreløbige hits for at bekræfte at bruge wrMTrck (se næste afsnit).

4. Bekræftelse af foreløbigeScreen Hits

  1. Motilitet assay på faste plader
    1. Forbered plader med NGM suppleret med 100 ug / ml ampicillin, 12,5 ug / ml tetracyclin og 1 mM IPTG, ifølge standardmetoder 47. Brug om muligt en plade-hælde maskinen til at forsikre alle plader har samme højde medier, hvilket vil give mulighed for en mere strømlinet video tilegnelsesproces.
    2. Grow de forskellige RNAi kloner i ~ 1 ml LB + 50 ug / ml ampicillin, O / N ved 37 ° C og 250 rpm.
    3. Den næste dag, inducerer ekspressionen af ​​dsRNA'et med 1 mM IPTG i 3 timer. Seed pladerne med 150 pi af hver RNAi bakteriel klon spredt i et tyndt lag. Lad bakterierne tørre i 2 dage ved stuetemperatur i mørke. Forbered 3 plader pr RNAi klon.
    4. Synkroniser ormen befolkning ved blegning efter standardmetoder 50 (se afsnit 1.2), og lad æggene klækker O / N i M9 medier.
    5. Tag en prøve af orm suspension og bestemme mængden af ​​NEMatodes pr pi på stereomikroskop. Derefter pipetteres en korrekt mængde M9 plus orme i hver eksperimentel pladen, så at det indeholder 25-30 L1 orme. Grow nematoderne ved 20 ° C i 4 dage indtil ormene nå dag 2 i voksenalderen.
  2. Kvantitativ analyse af ormen motilitet med wrMTrck plugin til ImageJ
    BEMÆRK: Videoerne blev registreret ved hjælp af et stereomikroskop ved 10X forstørrelse med en Hamamatsu Orca-R2 digitalkamera C10600-10B og Hamamatsu Simple PCI imaging software.
    1. Tænd for kameraet og Simple PCI billedbehandlingssoftware. Klik på "live" for at give mulighed for justering af de billeddannende forhold.
    2. Opsætning video betingelser som følger: Gain = 0; Lys tilstand = Høj; Speed ​​Index = 1; Binning = 2. Klik på "Auto Expose" og derefter justere lysforhold, flytte mikroskop spejle og lysstyrke og kontrast ringer.
      BEMÆRK: Videoen skal have en høj kontrast uden at være overexposed, så dyrene vises som sorte figurer på en lys baggrund.
    3. Klik på "Time Scan", og vælg en mappe og et filnavn. Indstil "Felt Delay" til 20 ms og "Stop ved Time" til 30 sek. Tryk på "Levende anmeldelse" for at vælge det område af pladen for at optage (hvor de fleste orme er). Tryk på pladen 3 eller 4 gange på scenen, hurtigt bekræfte sin position i synsfeltet og tryk på "Start".
    4. Når filmen er færdig optagelsen, skal du højreklikke på billedet og vælg "Export Montage Sequence" for at eksportere filmen fra en .cxd format til en .avi.
  3. Analyse motilitet videoer
    1. Åbn ImageJ software, gå til "Plugins" fanen, derefter "wrmtrck" og vælg "wrMTrck Batch". Vælg den mappe, der indeholder alle de filer, der skal analyseres.
    2. I de vigtigste input vindue wrMTrck_Batch, indlæse inputværdierne som beskrevet i Figure 5C. Forklaring for hver af parametrene findes i den vejledning, der følger med plugin. Klik på "OK", og lad bevægelsen analyse løb.
    3. For at kuratere resultaterne bekræfter, at alle detekterede spor er fra faktiske C. elegans og fjerne artefakter, åbne hver af de .txt filer oprettet for hver film og kopiere oplysninger til en dataanalyse software fil. Åbn "* _labels.zip" filer oprettet og køre den resulterende "* _labels.tif" for manuelt at kontrollere og eliminere falske ormen spor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overvågning intercellulære spredning af prion-lignende proteiner ved in vivo time-lapse billeddannelse

Transgene C. elegans linjer udtrykker prion domæne er særligt velegnede til analyse af visse aspekter af prion-lignende proteiner, fx celle-til-celle-transmission og ikke celleautonom toksicitet. Gennemsigtigheden af ​​dyrene muliggør sporing af fluorescens mærkede proteiner inde fra levende organisme i alle faser af livet. Ved at udnytte dette, er bevægelse af prion-lignende proteiner tværs celler og væv under anvendelse af et fluorescensmikroskop visualiseret. En 63X eller 100X / 1.4NA målsætning olie er nødvendig for at løse de vesikulære strukturer. Vigtigere er det, prion domæne skal mærkes med mRFP for at forblive fluorescens synlig inden for disse formentlig sure vesikler 40. Gult fluorescerende protein (YFP), der ofte anvendes som et tag, ier ikke egnet, fordi det er standset i en lav pH-miljø 40,55. Strain AM815 udtrykker RFP-mærkede R2E2 (en meget aggregation-tilbøjelige og toksiske form af prion domæne NM), der akkumuleres i rørformede vesikler, mens RFP tag alene forbliver opløselig (figur 1A og B). Brug in vivo time-lapse billeddannelse, kan det bemærkes, at disse rørformede vesikler transporteres i og mellem celler 40 (figur 1C og D, Video 1 og 2) [placere links til video 1 og 2 her].

Brug af folde sensorer og stress journalister til at undersøge celle autonome og ikke-celle autonome virkninger på proteostasis og toksicitet

Prioner er i stand til at krydse frø beslægtede proteiner og forstyrre cellulære proteinfoldning miljø. Dette kan afsløres ved coekspression af passende foldning Sensors. Folding sensorer er ikke-væsentlige metastabile proteiner, der er afhængige af en funktionel proteostasis netværk til at folde korrekt. Nogle eksempler er den velkendte ildflueluciferase og proteiner huser temperaturfølsomme (ts) mutationer 56-66. En afbrydelse af proteostasis fører til fejlfoldning af reporteren, som kan påvises ved visuel undersøgelse af aggregater eller ved udsættelse af den respektive ts mutant fænotype ved tolerante temperaturer. Strækninger af polyglutamine (polyQ) med en længde på tærsklen til sammenlægning (ca. 40 rester) er også ofte brugt, fordi de udviser en aldersafhængig sammenlægning 67-69. Tidligere indtræden af ​​sammenlægning afslører en kompromitteret folde miljø. Her har vi ansat en prion mutant RΔ2-5 der forbliver opløselig udtrykt i C. elegans kropsvæggen muskel (BWM) celler og tarm 40 (figur 2A og C). Efter samtidig ekspression med R2E2 i BWM celler RΔ2-5 readily aggregater (figur 2B), afslører en celleautonom virkning R2E2 på proteinfoldning miljø. Den udbredte virkning på proteostasis og induktion af misfoldning tværs væv kan vurderes ved ekspression af foldningen sensor i et særskilt væv, der ikke udtrykker den meget aggregation-tilbøjelige form af prion-domænet. R2E2 blev udtrykt under en BWM celle promotor (myo-3p), mens RΔ2-5 blev udtrykt under en tarm-promotor (VHA-6p). Sammenlægning af intestinal RΔ2-5 viser, at R2E2 påvirker protein foldning i en ikke celle autonom måde 40 (figur 2D). I stedet for at bruge RΔ2-5, hvor aggregater kan kun påvises ved høj opløsning, anvendelse af polyQ44 udtrykt i tarmen (Q44i) muliggør visualisering af aggregater ved lav opløsning under et stereomikroskop (figur 2E og F). Desuden er dette muliggør en kvantificering af animals med aggregater samt en kvantificering af antallet af aggregater.

For at undersøge non celleautonom toksicitet prion domæne, vi tidligere har undersøgt tilstødende væv, der ikke udtrykker R2E2 ved elektronmikroskopi og fandt, at ekspression af prion domæne i muskelceller fører til en ikke celleautonom forstyrrelse af mitokondrisk integritet i tilstødende væv, såsom som tarmen 40. Mitokondriel dysfunktion resulterer i øget reaktive ilt arter (ROS) produktion og oxidativ stress. En ikke-invasiv måde at visualisere induktion af oxidativt stress reaktion er at bruge en oxidativ stress inducerbar reporter 70. Stammen CF1553 udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under oxidativ stress promotor SOD-3 70. Når krydset dyr udtrykker prion domæne R2E2 i BWM celler blev reporter signifikant opreguleret i BWM celler såvel som i mange ikke-BWM væv ( Tabel 1 giver en liste over C. elegans stammer, der udtrykker folde sensorer og stress reportere, der kan anvendes analogt.

Genom-bredformat til undertrykkelse af prion-induceret toksicitet i C. elegans

Komplekset toksicitet fænotype prion domænet udtrykt i C. elegans er særlig interessant på grund af den manglende mærkbare toksicitet observeret i de fleste in vitro prion modeller 71. Denne model kan afsløre nye veje, der kan påvirke toksicitet forbundet med prioner i metazoans. For at løse dette har vi screenet for gener, der, når RNAi-forarmet, ville forbedre motilitet defekt R2E2 transgene dyr. Kontrol behandlet WT orme kan anvendes som en positiv control, vil selv om de fleste kandidatgener ikke give en fuldstændig bevægelse fænotype redning, på grund af den variable RNAi penetrans og den høje toksicitet af transgenet. Dyrene blev behandlet i 4 dage med RNAi fra den første larver tilstand L1 til dag 2 i voksenalderen. Ved det tidspunkt thrashing ubehandlede R2E2 dyr er betydeligt langsommere end thrashing WT dyr, hvilket er vigtigt, fordi vi screening for en forbedring af motilitet. Afkom F1 vil være til stede (~ L1s), men er let at skelne fra P0 generation. Kun P0 generation er scoret. Denne indledende skærm er visuelle og ikke kvantitative og derfor blev en lav tærskel anvendes til at identificere indledende hits, hvilket betyder, at hver bakteriel RNAi klon, der syntes at øge thrashing af prion-udtrykkende dyr blev testet igen i et kvantitativt crawling assay. Figur 4 skitserer vigtigste trin i opsætningen. Den høje opløsning på Falcon 4M60 kamera aktiveret en visuel screening af en Quarter af pladen på et tidspunkt på en computerskærm, som tillod skærmen for at være afsluttet mere effektivt. Mens nyttige, er dette ikke nødvendigt. Den visuelle undersøgelse af orm thrashing kan også udføres ved hjælp af en stereoskop ved lav forstørrelse (10X).

Bekræftelse af foreløbige skærm hits

High throughput skærme udføres som en tilgang, der giver mulighed for at analysere genom brede effekter for at opnå en primær liste over kandidatgener, der kan raffineres ved supplerende metoder. Validering af resultaterne skærmen er derfor vigtigt at fjerne eventuelle falske positive, som kan skyldes, at udføre en skærm med kun en eksperimentel prøve pr RNAi. R2E2 transgene dyr blev fodret med RNAi kloner af primære hits og målte deres hastighed på NGM plader på andendagen af ​​voksenalderen, som en kvantificerbar udlæsning af motilitet og nedsat toksicitet. Vi brugte wrMTrck plugin til ImageJ, udviklet i voreslaboratorium, der præcist identificerer C. elegans i videoer og følger deres bevægelser. Den wrMTrck plugin og scripts til automatiseret analyse er open source og offentligt tilgængelige på http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, sammen med detaljerede instruktioner om, hvordan man bruger det. Efter downloading kopiere hele wrMTrck mappe til Plugins mappen ImageJ. Denne protokol beskriver wrMTrck_Batch metode foretrækkes til analyse af en lang række videoer på et tidspunkt, men instruktioner til en manual, film ved film, analyse fås også med plugin download. WrMTrck_Batch konverterer en original video (figur 5A) til et binært format med baggrundssubtraktion og hver orm er tildelt et nummer. Hver af de forarbejdede videoer kan senere ses med disse spor overlejrede for at manuelt fjerne eventuelle artefakter, der blev fejlagtigt identificeres som orme (e. G., Spor 1 i figur 5B). En effektiv måde til at fjerne baggrund teknik ifacts (markeret med en pil på figur 5B) er at omhyggeligt vælge minimum og maksimum størrelse på de objekter, der skal identificeres (figur 5C). Fra de forskellige udgange på wrMTrck plugin, bruger vi kroppens længder per sekund (BLPS) parameter, der måler den gennemsnitlige hastighed på hvert dyr, ved længden af ​​hvert spor divideret med kropslængde på hvert objekt, således at normalisere for potentielle forskelle i størrelsen af nematoder (figur 5D). Ved hjælp af denne metode, vi identificeret 35 undertrykkere af prion-induceret toksicitet (streamsink) at øget motilitet fænotype i R2E2 udtrykker C. elegans til mindst 133% og op til 256% sammenlignet med tom vektor-behandlede orme (figur 6). Disse streamsink gener udgør den endelige bekræftede hits, der førte fra vores high throughput screening indsats.

21fig1highres.jpg "/>
Figur 1. prion domæne spreder mellem celler og væv i C. elegans af vesikulær transport. (A) kollapsede konfokale z-stakke af nematoder, der udtrykker RFP i kroppen væg musklen (BWM) celler (RFPm). (B) kollapsede konfokale z-stakke af nematoder udtrykker det meget giftige og sammenlægning tilbøjelige NM variant, R2E2 i BWM celler (R2E2m). Pile angiver rørformede vesikler, pilespids angiver aggregat. (C + D) Time-lapse række dyr udtrykker RFPm (C) og R2E2m (D). Pile angiver områder af vesikulær bevægelse. RFPm udviser hovedsagelig en diffus farvning. Selv når RFPm findes i vesikler, disse næppe flytte. R2E2m lokaliserer til talrige vesikler, der transporteres inden for og mellem celler. Scale barer: 10 pm. De ledsagende videoer 1 og 2 [sted links til Video 1 og 2 her] svarer til figurerne 1C og D,henholdsvis.

Figur 2
Figur 2. Folding sensorer afslører udbredt virkning af prion domæne på proteostasis. (A + B) Coekspression af R2E2m fremmer RΔ2-5m sammenlægning. Konfokale billeder af (A) RΔ2-5m kontrol og (B) RΔ2-5m co-udtrykt med R2E2m i BWM celler. (C + D) Muscle udtrykte R2E2m fremmer tarm RΔ2-5i sammenlægning. (C) Konfokal billede af kontrol dyr udtrykker RΔ2- 5i i tarmcellerne. (D) Konfokal billede af dyr, der udtrykker R2E2m i BWM celler og RΔ2-5i i tarmen. Scale barer: 10 pm (E + F) R2E2m inducerer ikke celle autonom sammenlægning af Q44i (E) Repræsentative fluorescerende billeder af Q44i og Q44i; R2E2m dyr 4 dage efter overførsel synkroniseret L1 lar..VAE på friske OP50-seeded NGM plader. Ekspressionen af R2E2 i BWM celler fører til en hurtigere indsættende Q44i aggregering i tarmen. (F) Kvantificering af dyr med aggregater (i%) på angivne dage efter synkronisering. Error søjler repræsenterer SD Dette tal er blevet ændret fra 40.

Figur 3
Figur 3. SOD-3p :: GFP transkriptionel stress reporter afslører, at prion domænet forårsager celle selvstændige og ikke celle autonom induktion af oxidativt stress. (A + B) Repræsentative fluorescerende billeder (med samme eksponeringstid) af SOD-3p :: GFP udtrykke kontroldyr (A) og SOD-3p :: GFP;. R2E2m Dyr (sort) på dag 2 i voksenalderen (C) Ekspressionen af ​​R2E2 i BWM celler fører til en induktion af journalisten ikke kun i BWM celles (I), men også i tarmen (II), nerve- ledning (III), svælg og hoved neuroner (IV).

Figur 5
Figur 5. Analyse af orm bevægelse med wrMTrck plugin ImageJ. (A) Eksempel på et input film dannet ved anvendelse af en passende forstørrelse (~ 10X) for at overvåge flere dyr ad gangen. (B) "* _labels.tif" filer er et output af wrMTrck_Batch og muliggøre manuel datasikring af analyseresultater. Pil viser et objekt, der var korrekt udelukket fra analysen på grund af et passende valg af minimum og maksimum størrelse parametre. (C) Input vindue wrMTrck_Batch, viser parametre, der anvendes til denne protokol. Disse parametre skal justeres i forhold til de enkelte mikroskop og filmindstillinger. (D) Output resultater fra movement analyse af (B), med BLPS kolonnen markeret med gult. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 1
Figur 6. R2E2 orme behandlet med RNAi kloner, der supressors af prion-induceret toksicitet (streamsink) viser forbedret motilitet. Motilitet er vist som relative BLPS sammenlignet med den negative kontrol (tom vektor). Vist er alle statistisk signifikante (student t-test) RNAi kloner identificeret i HTP-skærmen. sort stjerne repræsenterer hit vist som et eksempel i figur 5. Resultaterne er fra 3 film, med 17 <n <53 spor pr stand. Fejlsøjler repræsenterer SEM. </ P>

Tabel 1. C. elegans stammer, der udtrykker folde sensorer og stress journalister.

Strain navn genotype Kommentarer Strain kilde
Folding sensorer
transgener
AM140 UNC-54p :: polyQ35 :: YFP muskel-specifikke ekspression af polyQ35, alder afhængig sammenlægning CGC eller Morimoto lab
AM141 UNC-54p :: polyQ40 :: YFP muskel-specifikke ekspression af polyQ40, age afhængig sammenlægning CGC eller Morimoto lab
AM801 UNC-54p :: RΔ2-5 :: YFP muskel-specifikke ekspression af kimdannelse inkompetente prion domæne Morimoto lab
OG412 VHA-6p :: polyQ44 :: YFP tarm-ekspression af polyQ44, alder afhængig sammenlægning CGC
AM809 VHA-6p :: RΔ2-5 :: GFP; myo-2p :: mcherry tarm-ekspression af kimdannelse inkompetente prion domæne Morimoto lab
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: FFP neuron-specifik ekspression af polyQ40, celletypespecifik sammenlægning Morimoto lab
AM982 unc54p :: luciferase :: YFP muskel-specifikke ekspression af WT ildflueluciferase Morimoto lab myo-3p :: luciferase :: GFP; rol-6 muskel-specifikke ekspression af WT ildflueluciferase Behl lab
SNG-1p :: luciferase :: GFP; rol-6 muskel-specifikke ekspression af WT ildflueluciferase Behl lab
FUH55 unc54p :: Fluc :: EGFP; rol-6 muskel-specifikke ekspression af WT ildflueluciferase Hartl lab
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 muskel-specifikke ekspression af R188Q mutant ildflueluciferase Hartl lab
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 muskel-specifikke ekspression af R188Q + R261Q dobbelt mutant ildflueluciferase Hartl lab
FUH48 F25B3.3p :: Fluc :: EGFP; rol-6 neuron-specifik ekspression af WT ildflue LuciferaSE Hartl lab
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 neuron-specifik ekspression af R188Q mutant ildflueluciferase Hartl lab
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 neuron-specifik ekspression af R188Q + R261Q dobbelt mutant ildflueluciferase Hartl lab
ts mutanter
CB1402 UNC-15 (e1402) I Paramyosin (TS), temperaturfølsomt Unc-lammet, lad CGC
CB1157 UNC-54 (E1157) I Myosin (ts), temperaturfølsomme UNC CGC
CB1301 UNC-54 (e1301) I Myosin (ts), temperaturfølsomme UNC CGC
CB286 UNC-45 (E286) III UNC-45 (TS), temperaturfølsomt, langsomme Unc, EGL CGC
HE250 UNC-52 (e669su250) II Perlecan (ts), temperaturfølsomme UNC stiv lammelse CGC
SD551 Lad-60 (ga89) IV Ras (ts), temperaturfølsomt MUV, Ste, lad, Lva, Osm CGC
CX51 Dyn-1 (ky51) X Dynamin (ts), temperaturfølsomme UNC CGC
CW152 gas-1 (fc21) X Gas-1 (ts), temperaturfølsomme EtOH følsomhed CGC
ZZ26 UNC-63 (x26) I Acetylcholinreceptor (TS), temperaturfølsomme levamisol modstand CGC
stress reportere
CL2070 HSP-16.2p :: gfp; rol-6 termisk stress; UPR CYTO CGC
TJ375 HSP-16.2p :: GFP termisk stress; UPR CYTO CGC
TJ3000, TJ3001 HSP-16.2p :: GFP; CBR-UNC-119 (+) termisk stress; UPR CYTO CGC
AM446 hsp70p :: GFP; rol-6 termisk stress; UPR CYTO Morimoto lab
AM722 hsp70p :: mcherry; myo-2p :: FFP termisk stress; UPR CYTO Morimoto lab
AM799 hsp90p :: GFP termisk stress; UPR CYTO Morimoto lab
OG497 HSF-1p :: HSF-1 :: gfp; CBR-UNC-119 (+) termisk stress; UPR CYTO CGC
CF1553 SOD-3p :: GFP, rol-6 oxidativt stress CGC
KN259 SOD-3p :: GFP, rol-6 oxidativt stress CGC
CL2166 GST-4p :: GFP :: NLS oxidativt stress CGC
LD1171 GCS-1p :: GFP; rol-6 oxidativt stress CGC
LD1 SKN-1p :: SKN-1 :: GFP; rol-6 oxidativt stress CGC
IG274 NLP-29p :: GFP osmotisk stress CGC
BC20309 mtl-1p :: GFP metal stress Baillie lab
BC20342 mtl-2p :: GFP metal stress Baillie lab
BC20314 ELT-2p :: GFP metal stress Baillie lab
SJ4005 HSP-4p :: GFP UPR ER CGC
SJ4100 HSP-6p :: GFP UPR Mito CGC
SJ4058 HSP-60p :: GFP UPR Mito CGC

CGC: Caenorhabditis Genetik Center ts = temperaturfølsomme; UPR = udfoldet protein reaktion; CYTO = cytosolisk; Mito = mitokondrie; ER = endoplasmatiske reticulum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De her beskrevne metoder hjælper til at illustrere spredning og komplekset celleautonom og ikke celleautonom toksicitet prion-lignende proteiner. Nylig opdagede vi, at en sammenlægning-tilbøjelige cytosoliske prion domæne optages i membranbundne vesikler i et autophagy relateret proces. En specifik undergruppe af disse vesikler transporterer prion domæne inden for og mellem celler og væv 40. Nøglen til at overvåge deres bevægelse i levende dyr er, at proteinet skal være mærket med mRFP, fordi kun mRFP-mærkede proteiner var synlige i disse formentlig sure vesikler. Ved hjælp af samme metode, er vi i øjeblikket undersøger mulighederne prion-lignende opførsel af visse sygdomsrelaterede proteiner, såsom superoxiddismutase 1 (SOD1) (koblet til ALS), alfa-synuclein (knyttet til PD) eller TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) (koblet til ALS). Selv om denne intercellulære transport inden vesikler synes at blive brugt af flere andre proteiner, kan der være enØ veje, der tillader spredning.

Anvendelsen af velkarakteriserede folde sensorer er et kraftfuldt værktøj til at overvåge virkninger på det cellulære protein folding miljø i C. elegans 63-66. Her har vi vist, hvordan du bruger en alder afhængige akkumulering af fluorescens mærkede sammenlægning tilbøjelige proteiner udtrykt under vævsspecifikke promotorer til visuelt at overvåge folde evne forskellige væv samtidig. Andre muligheder for at studere organismal proteostasis netværk indbefatter anvendelsen af ​​endogene ts mutantproteiner. Disse metastabile proteiner vil fungere normalt ved den permissive temperatur (15 ° C), men fejlfolde og blive funktionelt ved den restriktive temperatur (25 ° C), der udviser deres karakteristiske mutant fænotype. I nærvær af en sammenlægning tilbøjelige protein eller under ældning, TS mutant fænotype bliver udsat selv ved tolerante betingelser 63-66. Nogle af disse ts mutanter udtrykkes i oun en delmængde af væv eller udstille vævsspecifikke fænotyper, hvilket gør disse særligt nyttigt at teste for celle selvstændige og ikke celle selvstændige proteotoxic effekter. For eksempel kan en ts mutant af LET-60, et medlem af GTP-bindende RAS protoonkogenet familie, Ras (ts), udtrykkes ubikvitært, men viser vævsspecifikke mutant Fænotypers 63,66. Ved at bruge denne ts mutant, blev virkningen af polyQ udvidelser på cellulære proteostasis vist sig at være celleautonom 63. Ekspression af polyQ i den genetiske baggrund af ras (TS) afslørede kun mutantfænotypen specifik for væv, hvori proteinet blev udtrykt. Eksponeringen af ​​flere mutante fænotyper tyder på, at et protein har ikke-celleautonom proteotoxic virkninger.

Derudover, for at teste for virkninger på cellulære stress veje, er der et stort udvalg af in vivo fluorescerende stress reportere i C. elegans 72. Disse er normalt transskriptional reportere, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under en stress-promotor, såsom hsp-16.2p eller græstørv-3p, der rapporterer om termisk eller oxidativt stress, henholdsvis 72. Ved at bruge passende reportere i kombination med prion-lignende proteiner, kan man overvåge en potentiel induktion af stressreaktioner i andre end den, der udtrykker den respektive transgen væv. En advarsel, er imidlertid, at disse stress reportere er ofte ikke følsomme nok til at afsløre subtile opregulering af en given vej (upublicerede observationer).

På vores søgen efter at undersøge, om gener, der har indflydelse på ikke-celle autonom toksicitet også påvirker protein spredning, vi startede ved screening for gener, der, ved hammerslaget, vil rette op bevægelse defekter. Brug af visuel vurdering af svømning satser som en udlæsning, var vi i stand til komfortabelt assay ~ 25 plader per session og udføre to runder af denne protokol om ugen, hvilket resulterer i færdiggørelsenpå den oprindelige skærm inden for 6 uger. Bekræftelsen af ​​de hits, ved kvantitativ analyse af ormen bevægelse på faste plader, tredobbelt, hjælp wrMTrck blev udført i yderligere 3 uger. En advarsel, er imidlertid, at ved at bruge gennemsøgning i plader i stedet for svømning i flydende medier som en udlæsning man kan miste nogle kandidatgener, som svømning og kravle ikke er identiske bevægelser og kan være påvirket af forskellige veje 73. Så hvis nogle kandidatgener ikke kan bekræftes på faste plader, skal de testes igen i flydende medier, hvor svømning kan kvantificeres ved at tælle prygl frekvens inden for en given tid.

Screeningen protokollen beskrevet her anvender automatiseret håndtering af flydende arbejdsstationer, hvilket i høj grad reducerer variation. Ulempen er, at der er behov for et overskud af væsker til reservoiret af robotter, som måske ikke altid være muligt. Denne screening setup kan nemt tilpasses til andre skærme i C. elegans </ Em> at brugen thrashing som en skrivebeskyttet ud.Dette skærm er ikke designet til direkte at identificere gener, der påvirker spredningen eller ikke celleautonom toksicitet prion domæne, som genom brede skærme skal være enkel i design, således at der skal udføres rettidigt. Motilitet defekter kan ikke kun stammer fra muskelkraft, men også fra neuronal beskadigelse og fra en række andre gendefekter 53. Således ved hjælp af denne udlæsning, kan vi finde ikke blot modifikatorer af muskel-specifik toksicitet. Vi tester i øjeblikket de kandidatgener for deres virkninger på prion domæne spredning og ikke celle autonom toksicitet under anvendelse af de metoder, der er beskrevet ovenfor. Disse eksperimenter vil i sidste ende vise, om transcellulær spredning af proteinaggregater er direkte forbundet med toksicitet observeret i andre væv, eller hvis celle-til-celle-transmission og ikke celleautonom toksicitet kan frakobles.

Tilsammen kan de beskrevne metoder anvendes til at undersøge potentialet prion-lignende opførsel af proteiner på celle- og organismal niveau ved hjælp af C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73, (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2, (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264, (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75, (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79, (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501, (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459, (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274, (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286, (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123, (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442, (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179, (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187, (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7, (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22, (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14, (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302, (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46, (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22, (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16, (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45, (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10, (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97, (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209, (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33, (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11, (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4, (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10, (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12, (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9, (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268, (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400, (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482, (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8, (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5, (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16, (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5, (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12, (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26, (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283, (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115, (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71, (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (52), 20982-20987 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics