قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jespersen, B., Tykocki, N. R., Watts, S. W., Cobbett, P. J. Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (95), e52324, doi:10.3791/52324 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

انضباط الصيدلة استخدمت نظام حمام الأنسجة المعزولة لأكثر من 150 عاما. وقد سمح براعة هذا النظام العلماء في جميع أنحاء العالم لتوصيف مستقبلات وإشارة المستقبلة التنبيغ، مع هذه المعرفة التي تشكل أساس العلاجات التي تعامل الملايين من الأفراد الذين يعانون من أمراض أو اضطرابات مثل ارتفاع ضغط الدم وفشل القلب، والسكري، وأمراض الجهاز الهضمي والمثانة اختلال وظيفي، والربو، واضطرابات البلع، على سبيل المثال لا الحصر. حتى يومنا هذا، لا يزال حمام الأنسجة المعزولة جانبا مهما من تطوير الأدوية والبحوث الأساسية، لأنها تسمح الأنسجة لتكون بمثابة الأنسجة. في هذا الدرس إن الرب، وتتقاسم بروتوكول رسمي لإثبات تجربة بصرية والافتراضية باستخدام بيانات من الأنسجة التجربة حمام معزولة الذي يقيس تقلص متساوي القياس، الذي يسمح توصيف مستقبلات.

والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن الأنسجة يعيش فيوظائف ND بمثابة النسيج كله، مع النتيجة الفسيولوجية (تقلص أو الاسترخاء) التي هي ذات الصلة إلى الجسم. ومن توليفة من الخطوات (المخدرات التفاعل مستقبلات، نقل الإشارة، وتوليد رسول الثاني، وتغير في استثارة العضلات الملساء، والتغيير في وظيفة الأنسجة). في حين غيرها من التقنيات تسمح دراسة كل من هذه الخطوات (على سبيل المثال جين مشع ملزمة للتقارب المخدرات، وقياس رسل الثانية)، وتقنية معزولة حمام الأنسجة تسمح لدمج كل هذه الخطوات من 1. ميزة أخرى هي أن الإبقاء على وظيفة الأنسجة يسمح حساب المتغيرات الدوائية المهمة التي هي أكثر وضوحا في نسيج مقابل إعداد الخلوي. يتعلق الأمر أقرب إلى كيفية فحص المخدرات ستعمل في الجسم ككل.

Protocol

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات الموضحة في هذه الورقة وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة ولاية ميشيغان.

1. إعداد النظام والإعداد

  1. جعل 5 L من محلول ملحي الفسيولوجية (PSS)، وهو المبلغ اللازم لإجراء تجربة انكماش حمام الأنسجة التي يستخدم ما يصل الى 50 مل حمامات الأنسجة. انظر الجدول رقم 2 لPSS صفة. حساب مجموع الكمية المطلوبة بضرب عدد من الحمامات الأنسجة أضعاف حجم الحمام ثم ضرب من قبل عدد من يغسل الأنسجة المطلوبة.
    1. استخدام الجدول 2 كدليل لجعل PSS. حل الأملاح في ما يقرب من 4 L من الماء. ويوصى نوع I المياه - HPLC: ملاحظة
    2. إضافة 8 مل من 1 M CaCl 2 الحل (147 غرام / L إذا باستخدام الملح ثنائي الهيدرات) إلى حل، وبالتالي فإن الحل النهائي هو 1.6 ملي الكالسيوم.
    3. الكم sufficit حل PSS إلى 5 L.
    4. سخن نظام حمام الأنسجة إلى 37 درجة مئوية تحول على إعادة تدوير حمام ماء ساخن. الخطوة الحاسمة: كل مكون من مكونات النظام هو محاط بالماء، وضمان أن يتم توصيلها في مسلسل لبعضها البعض. اتجاه تدفق أمر بالغ الأهمية - ضمان تدفق المياه إلى كل عنصر في أدنى اتصال الشائكة والخروج على أعلى اتصال الشائكة.
    5. تشغيل نظام الحصول على البيانات. الطاقة على محولات القوة لا يقل عن 15 دقيقة قبل التجربة للتوازن درجة الحرارة.
      ملاحظة: معظم محولات القوة تستخدم أجهزة قياس الضغط التي تعتبر حساسة للتغيرات في درجة الحرارة وتظهر الانجراف الحراري في البداية بعد تطبيق السلطة.
    6. إطلاق برنامج الحصول على البيانات وضمان اتصال مع نظام الحصول على البيانات. يرجى اتباع التعليمات تصنيع لتمكين تسجيل البيانات.
    7. تأكد من معايرة محولات قوة قبل أن يتم وضع الأنسجة في الحمام الأنسجة وقبل بدء تسجيل البيانات؛ FOتعليمات الشركة llow للمعايرة.
    8. ربط نظام حمام الأنسجة إلى O 95٪ 05/02٪ CO اسطوانة غاز 2 الصف الطبية وتحقق من وجود تسرب للغاز ومن ثم الضغط على النظام.
    9. ملء خزانات حمام الأنسجة مع PSS وإتاحة الوقت للوصول إلى حل درجة الحرارة المثلى. رئيس النظام وإزالة أي فقاعات الهواء داخل منظومة والأنابيب.
    10. تحقق أجهزة التهوية حمام الأنسجة لضمان متسقة تهوية الحل الذي بالأكسجين المخزن المؤقت PSS ويوفر الحركة البراونية لتوزيع الأدوية التي سيتم تقديمها في الحمام الأنسجة أثناء التجربة. تأكد من تهوية / فقاعات لا يسبب حركة الأنسجة، والتي سوف تعطيل تسجيلات البيانات؛ انخفاض تدفق الغاز عند الضرورة.
      ملاحظة: حمام الأنسجة ونظام الحصول على البيانات جاهزة الآن لبدء التجربة.

    2. إعداد الأنسجة

    1. من الناحية المثالية، تشريح الأنسجة من الحيوان مباشرة قبل الاستخدام ووضع مباشرة طn لPSS.
      ملاحظة: يمكن حفظ بعض الأنسجة في PSS بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، ولكن الضوابط المناسبة يجب القيام به للتحقق من صحة وظيفة الأنسجة بعد التخزين لفترات طويلة. انظر القسم 6.
    2. استخدام الأبهر الصدري كما الأنسجة في هذه العملية.
    3. تخدير الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ووضع الجانب الظهري الفئران إلى أسفل. تأكيد التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم وفقدان استجابة رد الفعل لهذا بالألم.
      ملاحظة: هذا البروتوكول يستخدم 70 ملغ / كغ من بنتوباربيتال تسليمها عن طريق الحقن داخل الصفاق. قد تختلف المبادئ التوجيهية المؤسسية للتخدير القوارض.
    4. إنشاء استرواح الصدر من خلال خلق شق مع مقص على طول الحجاب الحاجز في الجزء السفلي من القفص الصدري. ثم، ومواصلة شق من الجزء السفلي من القفص الصدري إلى القص وشطر.
    5. تشريح بعيدا أو ضع جانبا تلك الأجهزة التي هي على أعلى العمود الفقري وتحديد الشريان الأورطي، والتي تقع مباشرة على طول العمود الفقري.
      ملاحظة: هذه ليالييوفر TEP مساحة عمل واضح لتشريح من الشريان الأورطي.
    6. قطع كافة الاتصالات إلى الشريان الأورطي. من المريء والرئة وغيرها، وقطع الشريان الأورطي عمودي على العمود الفقري على مستوى الحجاب الحاجز.
    7. عقد بلطف الشريان الأورطي مع ملقط واستخدام مقص لتشريح الشريان الأورطي من العمود الفقري. بدء تشريح في منطقة الحجاب الحاجز السفلي المجاورة للعمود الفقري والعمل نحو القلب. للتأكد من اتخاذ الاحتياطات اضافية للا سحب أو الساحبة على النسيج الأبهري، والذي قد يؤدي إلى تلف الأنسجة.
    8. وضع على الفور الشريان الأورطي في طبق تشريح استعداد تحتوي PSS.
      ملاحظة: تشريح الشريان الأورطي إلى حلقات من الأفضل القيام في طبق تشريح له أساس silastic الأسود. وهذا يسمح لاستخدام الأسلاك التي يمكن استخدامها ليقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي ويتم تثبيتها على طبق، وتوفير الاستقرار أثناء وجوده في طبق تشريح. توفر خلفية سوداء المقابل أن يساعد تشريح. ينبغي توخي الحذر في استخدام الأسلاك cannulating باسم endothelويمكن إزالة طبقة الخلايا الاتحاد العالمي للتعليم مع فرك الزائد من الأسلاك ضد التجويف للسفينة.
    9. خذ سلك وجعل صغيرة زاوية 90 درجة في نهاية واحدة، ودفع نهاية الزاوية في الأساس silastic لترسيخ السلك الدليل. ضع الشريان الأورطي كله في طبق تشريح.
    10. عقد نهاية السلك دليل بالملقط، والخيط ثم بلطف السلك في تجويف الشريان الأورطي.
    11. استخدام ملقط وحرك الشريان الأورطي على السلك. عندما يكون الطرف الحر من السلك دليل مرئيا، منحنى السلك بلطف وتضع نهاية خالية في الأساس silastic من الطبق لتحقيق الاستقرار في الأنسجة.
    12. باستخدام vannas مقص صغير وملقط، إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية وجميع الأنسجة الغريبة الأخرى، جلطات الدم، وما إلى ذلك حتى يظهر الأبهر الصدري الأبيض ويفي إلى حد ما.
    13. إزالة الشريان الأورطي تنظيفها من الأسلاك واستخدام مقص لقطع الشريان الأورطي في الحلقات التي هي حوالي 3-5 ملم في العرض.
    14. وضع حلقة الأبهر على واحد من زوج من منظمة الشفافية الدوليةالسنانير ssue من خلال عقد ربط واستخدام ملقط لتنزلق برفق عصابة على هوك. كرر هذه العملية مع هوك الثاني. الحرص على ضمان السنانير لا متشابكة. انظر الشكل 3.
    15. تحقق من أن كل هوك لديه خياطة الحرير مختلفة المرفقة. تأكد من أن هوك واحد لديه حلقة صغيرة معقود من الحرير الذي يسمح لمرفق إلى الزجاج أو الفولاذ المقاوم للقضيب من الصلب، في حين أن الآخر هو 10-4 سم قطعة طويلة خياطة الجروح التي سيكون لمحول قوة اليد تعادل. انظر الشكل 3.
      ملاحظة: عندما يتم تأمين الشريان الأورطي إلى السنانير، والأنسجة مستعدة لتركيبها في حمام الأنسجة. انظر الشكل 3.
    16. كرر الخطوات 2،14-2،15، لتركيب حلقة الأبهر الثانية في غرفة حمام الأنسجة الثانية.

    3. التنسيب الأنسجة في باث

    1. لاحظ أنه في هذا النظام، والحمامات الأنسجة نفسها هي ثابتة. في هذا الوقت، وملء حمامات الأنسجة مع حرارة، PSS الهوائية والسماح الحل أن يأتي إلى درجة حرارةه.
    2. مع خياطة الحرير، وربطة عنق واحدة من السنانير على إعداد الأنسجة إلى ربط على قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ. ضع هذه الغاية في غرفة حمام الأنسجة. ربط قضبان الى موقف حلقة ووضع الطرف الآخر في طبق تلطيخ مليئة PSS للحفاظ على الأنسجة مغمورة في المخزن. انظر الشكل 3.
      1. وضع قضيب والأنسجة في غرفة حمام الأنسجة والتأكد من الأنسجة مغمورة تماما في PSS وقضيب آمن. انظر الشكل 3.
      2. ربط الخيط أخرى إلى محول القوة وللتأكد من ترك الركود في خياطة الجروح بين الأنسجة ومحول القوة.
        ملاحظة: سيتم إزالة هذا الركود عن طريق ضبط ميكرومتر. انظر الشكل 3.
    3. كرر هذه الخطوات لعصابة وحمام الأنسجة الأبهر الغرفة الثانية.

    4. ضبط التوتر السلبي

    ملاحظة: كل الأنسجة لديها طول (لو) في خلايا العضلات الملساء التي تستجيب أوبتيماLLY. التجارب الأولية لتحديد التوتر تمتد الأمثل الذي يحقق هذا الطول يجب أن يؤديها لكل نوع الأنسجة الفردية لتكون فحصها. الشريان الأورطي الصدري الفئران لديه الأمثل السلبي التوتر تمتد من 4 ز.

    1. استخدام ميكرومتر / رف جناح الطائر وتزيد من حالة التوتر إلى 2 غرام وانتظر الأنسجة للوصول إلى الهضبة. مرة واحدة يتم التوصل الهضبة، وزيادة التوتر 2 غرام آخر وانتظر الأنسجة إلى الهضبة.
      ملاحظة: في حلقات الأبهري، بعد أن ضبط التوتر الأولي من 2 غرام وصلت الهضبة، والأنسجة وينبغي بعد ذلك الاسترخاء إلى ~ 1.6 غرام. ومن شأن التطبيق الثاني من 2 ز تجلب الأنسجة إلى ~ 3.6 غرام، والتي من الأنسجة والاسترخاء مرة أخرى، وسوف تقلل التوتر. وهكذا، بعد أن أضاف 4 غرام من التوتر الكلي، يجب أن البرنامج تشير إلى ما يقرب من 3.2 غرام من التوتر.
    2. كرر هذه الخطوات لعصابة وحمام الأنسجة الأبهر الغرفة الثانية.

    5. موازنة وصنع المخدرات

    1. تتوازن الأنسجة ل60 دقيقة بعد تطبيق التوتر السلبي إلى الأنسجة.
    2. خلال مرحلة التوازن، وغسل الأنسجة كل 15-20 دقيقة. استنزاف حمام الأنسجة واستبدال PSS مع PSS من خزان تحسنت.
      ملاحظة: وخلال هذا الوقت، فإن الأنسجة الاسترخاء، والتي دلت على ذلك فقدان التوتر السلبي.
    3. خلال هذا الوقت، وإعداد المخدرات للتجربة، والتي تحتاج إلى أن تكون على الأقل 1،000 مرات أكثر تركيزا من التركيز الفعلي في الحمام، لذلك هناك حاجة فقط حجم صغير من الأسهم المخدرات لتحقيق التركيز المطلوب.

    6. التحدي الأولي

    1. في نهاية الفترة موازنة، وغسل الأنسجة مرة واحدة نهائية، وحفظ البيانات، وإعادة الصفر جميع المدخلات.
    2. اختيار ناهض (المركب الذي سوف يسبب انكماش النشطة) التي تستجيب الأنسجة.
      ملاحظة: في الفئران الأبهر الصدري، فإن العضلات الملساء في الشرايين التعاقد بنشاط إلى ناهض ألفا الأدرينالية مستقبلات بسبب تعصيب للالأنسجة من قبل الجهاز العصبي الودي. ومن شأن ناهض الأدرينالية لا يكون مفيدا في أنسجة الأمعاء نظرا لمنبهات الأدرينالية تسبب الاسترخاء. في هذه الحالة يمكن استخدام ناهض مستقبلات الأستيل كولين مثل (مستقبلات الكوليني). بديل لكلا فينيليفرين والأستيل كولين هو استخدام ناهض غير مستقبلات مثل البوتاسيوم عالية (K)، والتحدي الأول. في العضلات الملساء، وارتفاع K تعمل على فتح قنوات الكالسيوم بشكل غير مباشر، وبالتالي ينظر باعتباره المؤشر العام لسلامة العضلات الملساء.
      1. نفذ التحدي الأول أو التحدي إيقاظ بإضافة 10 -5 M فينيليفرين إلى الحمام الأنسجة. لتحقيق هذا التركيز في 50 مل حمام الأنسجة، وإضافة 50 ميكرولتر من حل فينيليفرين 10 -2 M.
        ملاحظة: 50 ميكرولتر في 50 مل من PSS هو 1 / 1،000 التخفيف، وبالتالي فإن التركيز النهائي هو 1،000x أقل من الأسهم، أو 10 -5 م. معرفة حجم وصيانة متسقة من حجم داخل حمام الأنسجة جهامبر أمر بالغ الأهمية لتحديد تركيز الدواء النهائي.
    3. إضافة 10 -5 M فينيليفرين إلى الحمام الأنسجة والسماح للانكماش إلى الذروة ثم الهضبة، عندما المنحدر من البيانات يصبح صفرا. تأكد من تسجيل كل حدث تجريبي لمساعدة تحليل ما بعد التجريبي.
    4. بعد الهضبة، وغسل ناهض على أكمل وجه من خلال تفريغ وإعادة تعبئة غرفة حمام الأنسجة مع PSS الجديد. تأكد من تسجيل هذه الأحداث أيضا.
      ملاحظة: بحكم التجربة هو أن تركيز ناهض في الحمام يتم تخفيض 10 أضعاف مع كل غسل. وعلى الرغم من ذلك، قد يكون أكثر من 3-4 يغسل الضروري لتحقيق الأنسجة التراجع إلى لهجتها توازن خط الأساس (التوتر).
    5. ترك بقية الأنسجة في لهجة أساسية ل~ 10 دقيقة قبل المتابعة.

    7. تجربة

    ملاحظة: برازوسين، ألفا الأدرينالية مستقبلات، وسيتم عرض إلى غرفة حمام الأنسجة لتحويل التركيب تركيزمنحنى onse إلى فينيليفرين (PE)؛ هذا هو العداء واضح.

    1. لحمام واحد، إضافة سيارة (H 2 O) التي تم حل برازوسين. إلى آخر، إضافة تركيز مناسب من برازوسين. في هذا المثال، إضافة 25 ميكرولتر من السيارة لحمام واحد و 25 ميكرولتر من 10 -5 M تركيز برازوسين إلى أخرى لتحقيق 5 × 10 -9 M أو تركيز 5 نانومتر في الحمام.
      ملاحظة: على الرغم من إضافة السيارة تبدو غير ضرورية في هذا المثال، لا بد من القيام بذلك عند استخدام المركبات الأخرى التي لديها القدرة على أن يكون فعال في الأوعية (على سبيل المثال، DMSO، والإيثانول، خلات). إضافة السيارة المقابلة حتى لو القليل من الأدلة موجودة من أجل أن يكون فعال في الأوعية.
    2. ترك السيارة / برازوسين في الحمامات وعدم غسل الأنسجة لمدة 1 ساعة.
      1. بينما الأنسجة وتحقيق التوازن، وإعداد تركيزات متعددة من ناهض (PE). تشمل مجموعة واسعة من تركيزات، من تركيزات انتزاع أي رد (على سبيل المثال، </ م> 10 -9 M PE) لتركيزات التي تفوق الاستجابة القصوى (على سبيل المثال، 10 -4 M PE). منذ منحنيات التركيز والاستجابة لوغاريتمي في الطبيعة، وجعل ستة حلول منفصلة الأسهم من PE (10 -6 -10 -1 M) من خلال التخفيفات المسلسل من M حل الأوراق المالية 10 -1. تأكد من أن حجم اللازمة لكل تركيز أكبر قليلا من ثلاثة أضعاف حجم الكلي اللازم لجميع الحمامات (أي> 300 ميكرولتر).
    3. انتقل إلى مضيفا ناهض، كما هو موضح في الجدول 1.
      ملاحظة: هذه التجربة توليد منحنى استجابة تركيز التراكمي لPE. كل التكرار يأخذ في الاعتبار كمية المادة أضفت إلى الحمام. تحدث إضافات حتى أنها لم تعد زيادة الانكماش، أو فقد استقر منحنى كله.
      1. إضافة كل تركيز الدواء بشكل فردي حتى يتم الوصول إلى عتبة الأنسجة.
      2. إذا حدث أي تغيير، إضافة تركيز المقبل فيسلسلة؛ انظر الجدول 2.
        ملاحظة: إن توقيت هذه الإضافات يعتمد على ناهض المستخدمة. على سبيل المثال، بافراز وفينيليفرين انكماش يتطور بسرعة، ويجب أن الاستقرار في غضون دقائق. على النقيض من ذلك، endothelin-1 انكماش يتطور ببطء وقد لا الهضبة لما يقرب من 45 دقيقة. ويمكن أن يتم التجريب الآخرين على النسيج بعد بناء منحنى مثل هذا، ما دام (1) مادة يغسل بها؛ و (2) إذا أمكن إثبات أن الأنسجة يعود إلى سلوك مقلص العادي ولا تتأثر التحفيز السابقة.

    8. تحليل البيانات

    1. تأكد من حفظ البيانات على الفور قبل وبعد التدخل (على سبيل المثال، إيقاظ أو منحنى الكامل).
    2. البحث وتحديد خط الأساس الأنسجة لكل حمام الأنسجة قناة غرفة / المدخلات، والتي سوف تساعد في تحليل البيانات.
    3. مرة واحدة يتم تحديد خط الأساس، والعثور على الاستجابة القصوى لكل تركيز، وتسجيل تشانجنرال الكتريك من الأساس. بالتتابع التحرك من خلال كل من تركيزات وتسجيل تحول خط الأساس.
    4. الرسم البياني البيانات الناتجة. القيام بذلك في أي برنامج الرسوم البيانية.
      ملاحظة: تم تصميم الرسم البياني الوسادة بريزم للصيادلة، وهذا هو المثل الأعلى لنوع من التجربة المقدمة هنا.

Representative Results

من حيث التحولي، والكفاءة النسبية (E MAX) وقوة (EC 50) من ناهض في نسيج معين ويمكن حساب ومقارنة ردود منبهات أخرى في نفس الأنسجة 1. في تجربتنا، وحضنت الفئران الأبهر الصدري مع أي مركبة أو α 1 الأدرينالية مستقبلات برازوسين (5 نانومتر) لمدة ساعة واحدة قبل إضافة α 1 الأدرينالية ناهض فينيليفرين إلى الحمام الأنسجة وتوليد انكماش (الشكل 1).

الشكل 2 يعرض تعديل نتائج الشكل 1. وقد اتسمت ردود الخضراء أقصى الانكماش التي كتبها PE يتحقق وضع علامة كحد أقصى، الحد الأقصى للانكماش ½ ملحوظ على هذا النحو ثم يرتبط مع تركيز PE التي تسببت في هذا الرد. تحديد هذه القيم هو تحديد تركيز الفعال لناهض الذي يحقق نصف كحد أقصى (50٪) استجابة أو EC 50 القيم.

في توليد وتفسير هذه النتائج، فمن المهم استخدام كل من تركيزات منخفضة وعالية من ناهض لإنشاء منحنى التركيز والاستجابة. دون ما يكفي من النقاط لإظهار خط الأساس مستقرة والحد الأقصى الهضبة، EC 50 و E MAX يمكن تقدير فقط. وقد تم ذلك بوضوح في هذا المثال. برامج الكمبيوتر التي تستخدم وظائف اللوجستية لمنحنيات السيني يمكن أن تستخدم لمنحنى المناسب وحساب EC 50 القيم.

الشكل (1)
الشكل 1: الأنسجة حمام تخطيطي الكرتون تمثل حلقة من الأنسجة وضعها في المزدوج الجدار والماء تغلف با الأنسجة عشر. وينظم عازلة تدفق وتدفق من 3 في اتجاه الزجاج محبس دمجها في قاعدة للغرفة. وانفجر O 2 / CO 2 في خلال إشباع بالهواء الذي مختومة مع طوقا لمنع تسرب PSS أو الغاز. مدخلات إعادة تدوير أدناه هو الإخراج، للحفاظ على إعادة تدوير السليم ومنع تشكيل جيوب الهواء التي من شأنها أن تسبب درجات الحرارة disregulation.

الشكل 2
الشكل 2: الجرذ الصدر الأبهر + البطانة Endothelium الشكل أعلاه يصور أربع تجارب منفصلة (الحيوانات المختلفة والذي قام به المحققون مختلفة على شكا من مجموعة مختلفة ممثلة في ألوان مختلفة) لاختبار قدرة برازوسين لتحويل الانكماش الناجم عن PE. برازوسين (5 نانومتر) تحول واضح الناجم عن PE منحنى انكماش اليمين على نحو مواز.

> الشكل (3)
الشكل 3: الجرذ الصدر الأبهر + البطانة Endothelium تقدير الرسومية من EC 50 قيم PE في غياب (مركبة) وجود (برازوسين) من خصم. الخط الأخضر (المجموعة C) يتم وضع علامة فقط.

ملح MW (ز / مول) 5 لترات النهائي ملي
(غرام)
كلوريد الصوديوم 58.45 37.99 130
بوكل 74.56 1.75 4.7
KH2PO4 136.1 0.8 1.18
MgSO4• 7H20 246.5 1.45 1.17
NaHCO3 84.21 6.25 14.9
سكر العنب 180.16 5 5.5
EDTA 380 0.05 0.03

الجدول 1: عادي الفسيولوجية محلول الملح (PSS) وصفة محتويات PSS-مخزنة بيكربونات المستخدمة في هذه التجربة. وشملت هي الأوزان الجزيئية للجميع الأملاح والمبلغ المضاف إلى 5 L من درهم 2 O لتحقيق التركيز المطلوب.

التركيز في الحمام إضافة ناهض المبذولة لحمام
1 × 10 -9 M 50 مل 1 × 10 -6 M
3 × 10 -9 M 100 مل 1 × 10-6 M
1 × 10 -8 M 35 مل 1 × 10 -5 M
3 × 10 -8 M 100 مل 1 × 10 -5
1 × 10 -7 M 35 مل 1 × 10 -4 M
3 × 10 -7 M 100 مل 1 × 10 -4 M
1 × 10 -6 M 35 مل 1 × 10 -3 M
3 × 10 -6 M 100 مل 1 × 10 -3 M
1 × 10 -5 M 35 مل 1 × 10 -2 M
3 × 10 -5 M 100 مل 1 × 10 -2 M
1 × 10 -4 M 35 مل 1 × 10 -1 M

الجدول 2: الأنسجة حمام مضافة ناهض تركيزات مقدار ناهض لتضاف إلى كل حمام إلى properly بناء التراكمية منحنيات التركيز والاستجابة. ويتحقق تركيز حمام المرجوة من خلال إضافة كميات متتابعة من زيادة تركيزات ناهض. كل إضافة تأخذ في الاعتبار تركيز ناهض موجودة بالفعل في الحمام. ويتم ذلك للحد من الزيادة في حجم في الحمام الأنسجة التي من شأنها أن تنتج عن استخدام الكميات المتزايدة من تركيز واحد من ناهض.

Discussion

قياس قوة متساوي القياس كأداة بحث أكثر من 150 سنة، لكنه لا يزال تقنية نموذجية لتوصيف مستقبلات في أنسجة مقلص 2. قوة هذه التقنية هي في بساطتها والتنوع: من خلال تسجيل الاستجابات التي تسببها زيادة تركيزات ناهض في وجود أو عدم وجود خصم، عدد لا يحصى من المعلومات يمكن أن تستمد حول الخصائص الدوائية من كل دواء ومستقبلات التي فإنه يلزم 3-5. تجارب من هذا النوع أيضا جمع معلومات حول تنافسية مقابل الطبيعة غير التنافسية للمضادات المستخدمة، وكذلك مستقبلات عدم التجانس والآثار غير محددة المخدرات 6-8. وهكذا، مع التباديل بسيطة لهذه التجربة حمام الأنسجة المعزولة، يمكن أن تتولد لمحة الدوائية كاملة نسبيا من المستقبلات التي تتوسط تقلص العضلات الناجم عن ناهض.

من حيث التحولي، الالبريد الكفاءة النسبية (E MAX) وقوة (EC 50) من ناهض في نسيج معين ويمكن حساب ومقارنة ردود منبهات أخرى في نفس الأنسجة 1. في تجربتنا، وحضنت الفئران الأبهر الصدري مع أي مركبة أو α 1 الأدرينالية مستقبلات برازوسين (5 نانومتر) لساعة واحدة قبل إضافة α 1 الأدرينالية ناهض فينيليفرين إلى الحمام الأنسجة وتوليد تقلص الشكل 2 يعرض تعديل النتائج في الشكل 1. وقد تم وضع علامة على الردود الخضراء مع الحد الأقصى للانكماش كتبها PE حققت علامة ماكس، وضع علامة الحد الأقصى للانكماش ½ على هذا النحو ثم يرتبط مع تركيز PE التي تسببت في هذا الرد. تحديد هذه القيم هو تحديد تركيز الفعال لناهض الذي يحقق نصف كحد أقصى (50٪) استجابة أو EC 50 قيمة.

لسوء الحظ، وذلك باستخدام المعلمة التي تعتمد على ناهضليالي وحده لتحديد الخصائص ملزمة مستقبلات يمكن أن يكون معقدا 9. من الناحية المثالية، تجارب إضافية باستخدام مضادات مستقبلات تسمح حساب اثنين من المعالم الهامة التي هي المفتاح لتحديد التفاعل بين المخدرات والمستقبلة: و-log 10 من التفكك خصم ثابت (PK B) و-log 10 من خصم المولي التركيز الضروري يثير شقين التحول نحو اليمين في منحنى التركيز والاستجابة (PA 2) 10. كلا K B والسلطة الفلسطينية 2 مكاسب فائدتها من حقيقة أنها هي القيم ناهض مستقل، وتظل ثابتة حتى بين الأنسجة المختلفة 11. من البيانات في الشكل 2، ويمكن حساب PK B باستخدام المعادلة التالية وعلى أساس EC 50 القيم المحسوبة في أي مكان آخر:

EC 50 في غياب برازوسين = 2 × 10 -8 M
EC 50 في مرحلة ما قبلالعمالي من برازوسين = 7 × 10 -6 M

حل لK B في المعادلة التالية:
تسجيل (DR-1) = تسجيل الدخول [B] - تسجيل K B
أين:
[B] = تركيز خصم، أو 5 × 10 -9 م. تسجيل (5 × 10 -9 M) = -8.3
الدكتور = نسبة جرعة من EC 50 قيمة في وجود خصم / EC 50 في الغياب. إذا كان هناك تحولا نحو اليمين، وهذه القيمة تكون أكبر من واحد. على النحو التالي:
الدكتور = 7 × 10 -6 M / 2 × 10 -8 M أو 700 × 10 -8 M / 2 × 10 -8 M = 700/2 = 350
استبدال ل[B] والدكتور:
تسجيل (350-1) = -8 - تسجيل K B
2.54 = -8 - تسجيل KB
PK B = 10.54

هذه القيمة لبرازوسين تتفق مع القيم التي تم الحصول عليها عندما يتفاعل برازوسين مع α 1 الأدرينالية باستقبالأو 12،13، مما يدل على أن مستقبلات هرمون التوتر التوسط تقلص إلى فينيليفرين هو الأدرينالية مستقبلات α 1.

عدة خطوات حاسمة لنجاح هذه التجارب. يجب أن تبقى الأنسجة في PSS بعد تشريح لمنع فقدان الجدوى الأنسجة. أي تحضير العضلات متساوي القياس لديه علاقة طول التوتر الأمثل الذي يولد قوة قصوى ضد التوتر السلبي 14،15. للتجربة وصفها في هذا البروتوكول، تقرر التوتر السلبي الأمثل سابقا بزيادات مضيفا فترة وجيزة من 0.5 غرام من التوتر السلبي إلى الأنسجة. وينبغي أن تبدأ الأنسجة دون لهجة وثم بعد 30 دقيقة من موازنة، وطعن في الأنسجة مع التركيز القصوى من بوكل (80 ملم)، التي ولدت لهجة نشطة. ثم، وجرفت الأنسجة ويسمح لهم بالعودة إلى لهجة خط الأساس. بعد 15 دقيقة في الأساس، وضعت 0.5 غرام آخر من التوتر السلبي وتتكرر هذه العملية حتى هضبة منوقد تحقق التوتر النشط مع التوتر السلبي إضافية. في التجارب الأولية، تم تحديد 4 ز مجموعه التوتر السلبي لتحقيق جيل التوتر نشط القصوى في حلقات الأبهري، وبالتالي يتم وضع هذا المبلغ الإجمالي للتوتر على الحلقات قبل موازنة. من الناحية الإجرائية، فمن الأفضل أن الصفر تطبيق التوتر السلبي مسبق، ولكن يمكن القيام به في أي وقت قبل التجربة. الإفراط في التمدد الأنسجة، وعند أي نقطة في التجربة أو التشريح، وسوف تؤثر سلبا على قابلية الأنسجة والنتائج التجريبية. هذا هو الأكثر الضروري عند وضع الأنسجة في الحمام، وهذه الخطوة لديها أعلى احتمال امتداد المفرط. مطلوب غسل الكافي، في عدد ومدة للآثار استنساخه. التحدي الثاني قريبا جدا بعد التحدي الأولي، أو قبل عادوا إلى الأنسجة التوتر خط الأساس، سوف يؤدي إلى استجابات الشاذة. إذا دراسة الخصوم عكسها / مثبطات، لا يجب غسل الأنسجة قبل ناهض بالإضافة إلى ذلك، كما inhibiسيتم انخفض تركيز تور.

هناك مزايا وعيوب ملحوظة إلى المعزولة المقايسات حمام الأنسجة.

العيوب: الأنسجة قد تواجه درجات مختلفة من الضرر أثناء الاستئصال الجراحي أو وضع حلقات على السنانير. منذ الخلية البطانية هي البطانة الداخلية للحلقة الأبهر، يجب الحرص على وضع الطوق على السنانير حتى لا تتلف هذه الطبقة الخلية. قد يكون الأنسجة أيضا أطوال مختلفة بوضوح من الوقت في التي هي قابلة للحياة في الحمام الأنسجة، وهذا لابد من تحديدها. ليس كل الأنسجة هي نفسها. على طول هذه الخطوط، قد تتغير الأنسجة في استجابتها طوال اليوم مثل أن الضوابط الوقت تصبح السيطرة اللازمة لكل تجربة. وخير مثال على ذلك هو القصبة الهوائية خنزير غينيا الذي يحسن في انقباض أقصى بنسبة 100٪ خلال التجربة 8 ساعة نموذجية. الأدوية التي هي سيئة للذوبان في الماء قد تترسب في PSS. أخيرا، وهو التراكميالثانية الإضافات غير تراكمية من المخدرات التي هي ناهض يمكن أن يؤدي إلى نتائج مختلفة إذا حدثت مستقبلات الحساسية إلى ناهض. أنجيوتنسين II هو واحدة من هذه المخدرات مما يدل tachyphylaxis السريعة.

المزايا: واحدة من المزايا الأساسية من الأنسجة التجارب حمام هو أنه في الوقت الحقيقي. يمكن للمرء أن يرى التجربة فور وقوعها ويمكن أن تجعل بسرعة الاستنتاجات وتخطيط الخطوات المقبلة، فضلا عن استكشاف أخطاء أثناء التجربة. تجربة يأخذ يوميا للقيام به. يمكن عادة أنسجة متعددة تكون مستعدة من حيوان واحد بحيث حيوان يمكن أن تكون بمثابة السيطرة الخاصة بها، والتي تضيف قوة إلى التجربة. واحد يمكن عزل الأنسجة من العوامل الأخرى وذلك لاختبار استجابة نقية نسبيا من الأنسجة إلى المخدرات. وفي التجارب المختبرية مثل نظام حمام الأنسجة تسمح أيضا استخدام كمية صغيرة من المخدرات مقارنة تجربة في الجسم الحي.

التصميم التجريبي الأساسي الموصوفة هنا يمكن أن يكونتعديل على نطاق واسع للسماح لتسجيل معلمات إضافية أو إدخال مؤثرات الخارجية الأخرى. على سبيل المثال، إضافة أقطاب تسمح لتحفيز الحقل الكهربائي للأعصاب التعصيب 16،17. مع إضافة تحقيقات الحرارية أو درجة الحموضة، وآثار درجة الحرارة ودرجة الحموضة على ردود مقلص ويمكن أيضا أن تقاس 18،19. وبالمثل، والأكسجين يمكن أن تكون بديلا جزئيا أو كليا مع N 2 لتقييم الآثار التي يسببها نقص الأكسجة. وعلاوة على ذلك، وهي نفس المبادئ الأساسية لقياس انقباض متساوي القياس المستخدمة في هذا الفيديو يمكن استخدامها لتطوير الأنظمة التي تسمح بقياس ما يصاحب ذلك من تطور التوتر متساوي القياس والتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا 20. كما يتم دراسة نقل الإشارة بسهولة، لأن وجود الأنظمة التي يمكن تجميد بسرعة عينة الأنسجة خلال ردا على ذلك، مثل أن النشاط من التنبيغ نظام المسار إشارة يمكن التحقق كيميائيا.

تباين من الأجهزةipment التي يمكن استخدامها للقيام بذلك هو هائل. هذا النظام برمته، إما ناحية بناؤها أو الآلي، ويمكن شراؤها من شركات مختلفة متعددة. وكانت الحمامات الأنسجة وأصحاب الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول اليد في مهب (حمامات الأنسجة) واليد التي شيدت (حامل اللقب) من قبل في المنزل جامعة ولاية ميشيغان المحلات التجارية آلة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LabChart Software ADInstruments 7.2
PowerLab (4 channel)  ADInstruments ML760
QuadBridge (4 channel) ADInstruments ML112 ML112
Grass Adapter Cable ADInstruments MLAC11 MLAC11
Grass Force-displacement Transducer Grass Instrument Co FT03 FT03
Grass Transducer Cable Grass Instrument Co TAC-7 REV-1
BNC to BNC Cable ADInstruments MLAC01
IsoTemp 2100 Fisher Scientific IC-2100
Tissue Bath Multiple Sources 
Physiological Salt Solution PSS
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Ring Stand Humboldt MFG Co H-2122 7
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Tygon Tubing VWR Scientific 63010-100 R-3603
Hose Clamps Cole-Parmer Instrument Co 06832-08 SNP-8
50 ml Muscle Bath Eberhartglass Blowing Custom
250 ml Warming Chambers Eberhartglass Blowing Custom
Gas Dispersion Tube Ace Glass 7202-06 7202-02
Micrometer
Custom Stands
Three-prong Clamps VWR International Talon
S-connector VWR International Talon
Tissue Hooks Hand Made in House Custom
Tissue Dissection
Leica Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source Fisher Scientific 12562-36 12562-36
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Sylgard Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150 160-150
Splinter & Fixation Forceps George Tiemann & Co 160-55 160-55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
  2. Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
  3. Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
  4. Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
  5. Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
  6. Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
  7. Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
  8. Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
  9. Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).
  10. Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
  11. Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120, (4), 29-46 (1997).
  12. Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
  13. Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
  14. Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
  15. Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
  16. Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
  17. Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
  18. Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
  19. Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
  20. Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics