מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jespersen, B., Tykocki, N. R., Watts, S. W., Cobbett, P. J. Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (95), e52324, doi:10.3791/52324 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

המשמעת של פרמקולוגיה השתמשה במערכת האמבטיה רקמה המבודדת למעלה מ -150 שנה. צדדיות של מערכת זו אפשרה למדענים ברחבי העולם כדי לאפיין קולטנים והעברת אותות קולט, עם הידע הזה עומד בבסיס הטיפולים שטופלו מיליוני אנשים עם מחלות או הפרעות כגון יתר לחץ דם, אי ספיקת לב, סוכרת, מחלות במערכת העיכול, שלפוחית ​​השתן הפרעות בתפקוד, אסטמה, ובליעה, לשם רק כמה. עד עצם היום הזה, האמבטיה הרקמה המבודדת נשארה פן חשוב של פיתוח תרופות ומחקר בסיסי, שכן היא מאפשרת לרקמות לתפקד כרקמה. בשיעור זה יופיטר, פרוטוקול רשמי משותף להפגין ניסוי חזותי ווירטואלי ניצול נתונים מניסוי מבודד רקמת אמבטיה המודד כיווץ איזומטרי, המאפשר אפיון רצפטור.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שרקמת חייםפונקציות nd בכללותה רקמה, עם תוצאה פיזיולוגית (כיווץ או הרפיה) שהוא רלוונטי לגוף. זה הוא סינתזה של צעדים (אינטראקציה תרופה-קולטן, הולכים אותות, דור שליח שני, שינוי ברגישות שריר חלק, ושינוי בתפקוד רקמות). בעוד שיטות אחרות מאפשרות לימוד של כל אחד משלבים הבאים (לדוגמא radioligand מחייב לזיקת סמים, מדידה של שליחים שני), טכניקת האמבטיה רקמה המבודדת מאפשרת אינטגרציה של כל 1 את הפעולות הבאות. יתרון נוסף הוא ששמירה על תפקוד רקמות מאפשרת חישוב של משתנים תרופתיים חשובים, כי הם יותר משמעותיים ברקמה לעומת הגדרה סלולרית; מדובר קרוב יותר לאופן שבו התרופות שנבדקו היו עובדות בגוף כולו.

Protocol

הערה: כל ההליכים המתוארים במאמר זה מבוצעים על פי הנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת מדינת מישיגן.

הכנת מערכת 1. והתקנה

  1. הפוך 5 L של תמיסת מלח פיסיולוגי (PSS), המהווה את הסכום הדרוש לניסוי התכווצות אמבטיה רקמות המשתמש עד 50 מיליליטר אמבטיות רקמות; ראה טבלה 2 למתכון PSS. חישוב כולל נפח הנדרש על ידי הכפלת פעמים מספר אמבטיות רקמת האמבטיה הנפח ולאחר מכן הכפלה במספר שטיפות רקמה הנדרשת.
    1. השתמש בטבלה 2 כמדריך לביצוע PSS. ממיסים את המלחים בכ -4 ליטר מים. הערה: HPLC - Type I מים מומלץ
    2. הוסף 8 מיליליטר של 1 M CaCl 2 פתרון (147 גר '/ L אם באמצעות מלח dihydrate) לפתרון, ולכן הפתרון הסופי הוא 1.6 מ"מ סידן.
    3. פתרון PSS sufficit Quantum 5 ל '
    4. מחממים את מערכת האמבטיה רקמה עד 37 ° C על ידי סיבוב על אמבט מים מחומם הסירקולציה המחודשת. שלב קריטי: כל רכיב במערכת מים במעייל, לוודא שהם מחוברים בסדרתי אחד לשני. כיוון הזרימה הוא קריטי - להבטיח שתזרים מים לכל רכיב בחיבור התיל הנמוך ביותר ואת בחיבור התיל הגבוה ביותר.
    5. הפעל נתוני מערכת רכישה. כוח על מתמרים הכוח לפחות 15 דקות לפני הניסוי לאזן טמפרטורה.
      הערה: רוב מתמרים הכוח להעסיק מודד מתח שרגישים לשינויים בטמפרטורה ולהציג סחיפה תרמית בתחילה לאחר הכח מוחל.
    6. תוכנת הפעלת רכישת נתונים ולהבטיח חיבור עם נתוני מערכת רכישה. אנא עקוב אחר הוראות ייצור ולמאפשר הקלטת נתונים.
    7. ודא מתמרים הכוח מכויל לפני הרקמה ממוקמת באמבטיה הרקמות ולפני הקלטת נתונים החלה; foהוראות יצרן llow לכיול.
    8. חבר את מערכת האמבטיה רקמות לO 95% 2/5 CO% בלון גז 2 כיתה רפואית ולבדוק אם קיים דליפת גז ולאחר מכן חצים על המערכת.
    9. למלא את מאגרי האמבטיה רקמות עם PSS ולאפשר זמן הפתרון להגיע לטמפרטורה אופטימלית. ראש המערכת ולהסיר את כל בועות אוויר בתוך המערכת והצינורות.
    10. בדוק aerators אמבטיה רקמות כדי להבטיח אוורור פתרון עקבי, שoxygenates חיץ PSS ומספק תנועה בראונית להפיץ סמים שיושקו באמבטיה הרקמה במהלך הניסוי. הפוך אוורור בטוח / בועות אינה גורמות לתנועת רקמות, אשר תשבש הקלטות נתונים; להפחית את זרימת גז במידת צורך.
      הערה: נתוני מערכת רכישת האמבטיה והרקמה מוכנה להתחיל את הניסוי עכשיו.

    2. רקמות הכנה

    1. באופן אידיאלי, לנתח רקמות מבעלי החיים באופן מיידי לפני שימוש ומניחה ישירות in כדי PSS.
      הערה: ניתן לשמור רקמות מסוימות בPSS הלילה ב 4 ° C, אבל בקרות מתאימות צריכים להיעשות כדי לאמת את תפקוד רקמות לאחר אחסון ממושך; ראה סעיף 6.
    2. השתמש באב העורקים החזי כמו הרקמה בתרגיל הזה.
    3. להרדים את העכברוש בהתאם להנחיות מוסדיות ומניח בצד גב העכברוש למטה. לאשר הרדמה באמצעות הבוהן קמצוץ ואובדן תגובת רפלקס לגירוי כואב זו.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש 70 מ"ג / קילוגרם של pentobarbital מועברת באמצעות הזרקת intraperitoneal. הנחיות מוסדיות להרדמה מכרסם עשויות להיות שונות.
    4. צור pneumothorax על ידי יצירת חתך במספריים לאורך הסרעפת בחלק התחתון של כלוב הצלעות. לאחר מכן, המשך את החתך מהחלק התחתון של בית החזה כדי עצם החזה ולחצות.
    5. שם לנתח או הניחו בצד אלה איברים שנמצאים בחלק העליון של עמוד השדרה ולאתר את אב העורקים, הנמצא באופן ישיר לאורך עמוד השדרה.
      הערה: זה זהTEP מספק מרחב עבודה ברור לנתח את אב העורקים.
    6. לנתק את כל הקשרים לאב העורקים; מהוושט, הריאות, וכו 'וחתך את אב העורקים בניצב לעמוד השדרה ברמה של הסרעפת.
    7. צמד בעדינות את אב העורקים עם מלקחיים ולהשתמש במספריים לנתח את אב העורקים מעמוד השדרה. התחל הנתיחה באזור הסרעפת הנמוכה הסמוך לשדרה והעבודה לכיוון הלב. הקפד לנקוט אמצעי זהירות נוסף שלא למשוך או משיכה ברקמות של אב העורקים, שעלול לגרום נזק לרקמות.
    8. מייד למקם את אב העורקים בצלחת לנתיחה מוכנה המכילה PSS.
      הערה: Dissection של אב העורקים לטבעות נעשה הכי טוב בצלחת לנתח כי יש בסיס silastic שחור. זה מאפשר לשימוש בחוטים שיכולים לשמש לcannulate אב העורקים ולהיות מהודקות לצלחת, מתן יציבות ואילו בצלחת לנתיחה. הרקע השחור מספק ניגוד שמסייע לנתיחה. יש להיזהר בשימוש בחוטי cannulating כendothelשכבת תא ial ניתן להסיר עם שפשוף עודף של החוט נגד לומן של כלי השיט.
    9. קח חוט ולעשות זווית של 90 מעלות קטנות בקצה אחד ודחוף את קצה הזווית לתוך בסיס silastic לעגן את חוט המדריך. מניחים את כל אב העורקים בצלחת לנתיחה.
    10. החזק את קצה חוט המדריך עם מלקחיים, ולאחר מכן בעדינות חוט התיל לתוך לומן של אב העורקים.
    11. שימוש במלקחיים והחליקו את אב העורקים על החוט. כאשר הקצה החופשי של חוט המדריך גלוי, עקומת החוט בעדינות ומניח את הקצה החופשי לתוך בסיס silastic של המנה כדי לייצב את הרקמות.
    12. בעזרת מספריים ומלקחי Vannas קטנים, להסיר את רקמת שומן perivascular וכל רקמות החיצוניות האחרות, קרישי דם, וכו 'עד אב העורקים החזי מופיע לבנים וסיבי במקצת.
    13. הסר את אב העורקים ניקו מחוט ולהשתמש במספריים לחתוך את אב העורקים בטבעות שהם כ 3-5 מ"מ ברוחב.
    14. מניחים טבעת אב העורקים באחד מזוג tiווי ssue ידי החזקת הוו ובאמצעות מלקחיים כדי להחליק את הטבעת על וו בעדינות. חזור על תהליך זה עם הוו השני. תשמור על מנת להבטיח ווים לא להסתבך; ראה איור 3.
    15. בדוק שיש לכל וו תפר משי שונה מצורף. בדוק שיש קרס אחד לולאה מסוקסת קטנה של משי, המאפשר לקובץ מצורף לזכוכית או מוט פלדת אל-חלד, ואילו השני הוא תפר פיסה ארוכה 10-4 סנטימטר שיהיה יד קשורה למתמר הכוח; ראה איור 3.
      הערה: ברגע שהאב העורקים הוא מאובטח לקרסים, הרקמה מוכנה להיות מותקן באמבטיה הרקמות; ראה איור 3.
    16. חזור על שלבים 2.14-2.15, לעלות טבעת אב העורקים שנייה בתא האמבטיה רקמות השני.

    3. מיקום רקמות באמבט

    1. שים לב כי במערכת זו, אמבטיות הרקמה עצמם נייחות. בשלב זה, למלא את אמבטיות רקמה עם PSS התחמם, סודה ולאפשר הפתרון לבוא לtemperaturדואר.
    2. עם תפר המשי, עניבה אחד הווים בהכנת הרקמה ליתד על מוט פלדת אל-חלד. הנח סוף זה לתוך תא האמבטיה רקמות. חבר את המוט לעמדת טבעת ומניח את הקצה השני בצלחת מכתים מלאה PSS לשמור רקמה שקועה במאגר; ראה איור 3.
      1. מניחים את המוט והרקמות בתא האמבטיה רקמות ולוודא הרקמה שקועה לחלוטין בPSS והמוט הוא מאובטח; ראה איור 3.
      2. לקשור את התפר האחר למתמר הכוח והקפד להשאיר את הרפיון בתפר בין הרקמות ומתמר הכוח.
        הערה: רפוי זו תוסר על ידי התאמת מיקרומטר; ראה איור 3.
    3. חזור על שלבים אלה עבור חדר טבעת ואמבטית רקמות אב העורקים השני.

    4. הגדרת מתח פסיבי

    הערה: לכל רקמה אורך (Lo) שבו תאי שריר חלק להגיב אופטימהlly. ניסויים ראשוניים על מנת לקבוע את מתח המתיחה האופטימלי אשר משיג אורך זה חייבת להתבצע עבור כל סוג רקמה בודד להיבדק. יש אב העורקים החזי עכברוש מתח מתיחה פסיבי אופטימלי של 4 g.

    1. השתמש במיקרומטר / מדף והאברה להגביר מתח עד 2 גרם ולחכות לרקמה להגיע מישור. ברגע שמגיעה רמה, להגדיל את המתח עוד 2 g ולחכות לרקמות לרמה.
      הערה: בטבעות אב העורקים, לאחר המתח הראשוני של 2 גר 'קבע ורמה הגיעה, הרקמה צריכה אז להירגע ל~ 1.6 גר'. יישום שני של 2 גר 'יביא את הרקמה ל~ 3.6 גר', שממנו הרקמה שוב להירגע והמתח יקטן. כך, לאחר שהוסיף 4 גרם של מתח כולל, התוכנה צריכה לציין בערך 3.2 גרם של מתח.
    2. חזור על שלבים אלה עבור חדר טבעת ואמבטית רקמות אב העורקים השני.

    5. איזון וביצוע בסמים

    1. לאזן את הרקמה ל60 דקות לאחר החלת מתח פסיבי לרקמות.
    2. בשלב שיווי המשקל, לשטוף את הרקמה בכל דקות 15-20. מסננים את האמבטיה הרקמות ולהחליף את PSS עם PSS ממאגר חימם.
      הערה: במהלך תקופה זו, הרקמה להירגע, אשר מסומן על ידי האובדן של מתח פסיבי.
    3. במהלך תקופה זו, להכין תרופות לניסוי, אשר צריך להיות לפחות 1,000 פעמים מרוכזות יותר הריכוז בפועל באמבטיה, כך יש צורך בנפח קטן בלבד של המניות בסמים כדי להשיג את הריכוז הרצוי.

    6. אתגר ראשוני

    1. בתום תקופת האיזון, לשטוף את הרקמה הפעם אחרונה, לשמור את הנתונים, ומחדש אפס את כל התשומות.
    2. בחר אגוניסט (מתחם שיגרום התכווצות פעילה) שלרקמות מגיבה.
      הערה: באב העורקים החזי החולדה, שריר חלק העורקים יהיה פעילה חוזה לאגוניסט קולטן adrenergic אלפא בשל העצבוב שלרקמה על ידי מערכת עצבים הסימפתטית. אגוניסט אדרנרגי לא יהיה שימושי ברקמות מעי בהתחשב בכך שאגוניסטים אדרנרגיים לגרום הרפיה. במקרה זה יכול לשמש אגוניסט קולטן כגון אצטילכולין (קולט כולינרגית). אלטרנטיבה לשני phenylephrine ואצטילכולין היא להשתמש אגוניסט שאינו קולט כגון אשלגן גבוה (K) כאתגר הראשון. בשריר חלק, גבוה K פועל לבעקיפין ערוצי סידן פתוח ובכך נתפס כמדד כללי של שלמות שריר חלק.
      1. בצע את האתגר הראשון או אתגר ההשכמה על ידי הוספת 10 -5 phenylephrine M לאמבטיה הרקמות. כדי להשיג ריכוז זה ב 50 מיליליטר אמבטיה רקמות, להוסיף 50 μl של פתרון phenylephrine 10 -2 M.
        הערה: 50 μl לתוך 50 מיליליטר של PSS היא דילול 1/1000, כך הריכוז הסופי הוא 1,000x פחות ממנייה, או 10 -5 מ ' ידע של נפח ותחזוקה של הנפח עקבי בתוך האמבטיה רקמות גhamber הוא קריטי לקביעת ריכוז התרופה הסופית.
    3. הוסף 10 -5 phenylephrine M לאמבטיה הרקמות ולאפשר ההתכווצות לשיא ואז רמה, כאשר השיפוע של נתונים הופך לאפס. הקפד לרשום כל אירוע ניסיוני כדי לסייע ניתוח שלאחר ניסוי.
    4. אחרי הרמה, לשטוף ביסודיות על ידי אגוניסט ריקון ומילוי חדר האמבטיה רקמות עם PSS החדש. הקפד לרשום אירועים אלה, כמו גם.
      הערה: כלל אצבע הוא שהריכוז של אגוניסט באמבטיה מצטמצם פי 10 עם כל שטיפה. אמנם, יותר מ 3-4 שטיפות עשויות להיות נחוצות כדי להביא את הרקמה בחזרה לטון שלה שיווי משקל בנקודת ההתחלה (מתח).
    5. תן את שאר רקמות בטון בסיס ל~ 10 דקות לפני שתמשיך.

    ניסוי 7.

    הערה: prazosin, אנטגוניסט לרצפטור אדרנרגי אלפא, יושקו לתא האמבטיה רקמות להעביר את שו"ת הריכוזעקומת onse לphenylephrine (PE); זה אנטגוניזם להדגמה.

    1. לאמבטיה אחד, להוסיף את הרכב (H 2 O), שבי prazosin התפרק. למשנהו, להוסיף את הריכוז המתאים של prazosin. במקרה זה, להוסיף 25 μl של רכב לאמבטיה אחת ו -25 μl של 10 -5 ריכוז M של prazosin לאחרים כדי להשיג 5 x 10 -9 M או 5 ריכוז ננומטר באמבטיה.
      הערה: בעוד שהתוספת של רכב נראית מיותרת בדוגמא זו, קיימת הכרח לעשות זאת בעת שימוש בכלי רכב אחרים שיש להם פוטנציאל להיות vasoactive (למשל, DMSO, אתנול, אצטט). הוסף את הרכב המתאים גם אם מעט עדויות קיימת כדי שזה יהיה vasoactive.
    2. השאר רכב / prazosin באמבטיות ולא לשטוף את הרקמה עבור שעה 1.
      1. בעוד רקמות equilibrating, להכין ריכוזים רבים של אגוניסט (PE). כולל מגוון רחב של ריכוזים, מריכוזים לעורר שום תגובה (לדוגמא, </ Em> 10 -9 M PE) לריכוזים העולים תגובה המקסימלי (למשל, 10 -4 M PE). מאז עקומות ריכוז-תגובה הן לוגריתמים בטבע, לעשות שישה פתרונות נפרדים המניה של PE (10 -6 -10 -1 M) באמצעות דילולים סדרתי מפתרון מניות M 10 -1. ודא שעוצמת הקול הנדרשת לריכוז כל היא מעט גדולה יותר מפי שלושה מהנפח הכולל הנדרש לכל האמבטיות (μl כלומר> 300).
    3. המשך להוספת אגוניסט, כפי שמתואר בטבלה 1.
      הערה: ניסוי זה יפיק עקומת תגובת הריכוז מצטברת לPE; כל איטרציה לוקחת בחשבון את כמות החומר שכבר הוסיפה לאמבטיה. תוספות להתרחש עד שהם כבר לא להגדיל את ההתכווצות, או כל העקומה שהתייצבה.
      1. הוסף כל ריכוז תרופה בנפרד, עד שיגיע לסף הרקמה.
      2. אם לא יחולו שינוי, להוסיף את הריכוז הבא בסדרה; ראה טבלה 2.
        הערה: התזמון של תוספות אלה תלוי באגוניסט בשימוש. לדוגמא, נוראפינפרין והתכווצות phenylephrine מתפתחים במהירות, וצריכים שיא תפוקה בתוך דקות. בניגוד לכך, התכווצות אנדותלין -1 מתפתחת לאט וייתכן שלא שיא תפוקה קרוב ל- 45 דקות. ניסויים אחרים ניתן לעשות זאת על הרקמה לאחר הבנייה של עקומה כגון זה, כל עוד (1) חומר שטיפה החוצה; ו- (2) שניתן להוכיח כי הרקמה חוזרת לקדמותו התנהגות התכווצות ואינה מושפעת מהגירויים הקודמים.

    ניתוח נתונים 8.

    1. הקפד לשמור את הנתונים באופן מיידי לפני ואחרי התערבות (למשל, תתעורר או עקומה מלאה).
    2. מצא ולהגדיר את נקודת ההתחלה הרקמה לכל ערוץ קאמרי / קלט אמבטיה רקמות, אשר יסייע בניתוח הנתונים.
    3. ברגע שהבסיס מוגדר, למצוא את התגובה המקסימלי עבור כל ריכוז, ולהקליט change מנקודת ההתחלה. רצף לעבור כל אחד מהריכוזים ולהקליט את השינוי בנקודת ההתחלה.
    4. גרף נתונים שהתקבלו. לעשות את זה בכל תכנית גרפים.
      הערה: גרף Pad Prism מיועד לpharmacologists, ואת זה הוא אידיאלי לסוג הניסוי שהוצג כאן.

Representative Results

במונחים של agonism, היעילות היחסית (E MAX) והעצמה (50 EC) של אגוניסט ברקמות נתון יכולות להיות מחושבת ובהשוואה לתגובות של אגוניסטים אחרים באותו הרקמה 1. בניסוי שלנו, אב העורקים החזי העכברוש הודגרה גם עם רכב או prazosin α 1 adrenergic אנטגוניסט לרצפטור (5 ננומטר) לשעה אחת לפני הוספת phenylephrine אגוניסט אדרנרגי α 1 לאמבטיה הרקמה ויצירת התכווצות (איור 1).

2 מתנות איור שונה תוצאות של איור 1. התגובות הירוקות סימנו ההתכווצות המרבית מושגת על ידי PE סומנה כמקסימום, ההתכווצות המרבית ½ המסומן ככאלה ולאחר מכן קשורים עם ריכוז PE שגרם שתגובה. זיהוי ערכים אלה הוא זיהוי הריכוז היעיל של אגוניסט שמשיג תגובת מחצית מקסימום (50%) או EC 50 ערכים.

ביצירה ופירוש התוצאות הללו, חשוב להשתמש בשני ריכוזים נמוכים וגבוהים של אגוניסט ליצור עקומת ריכוז התגובה. בלי מספיק נקודות כדי להראות בסיס יציב ורמה המרבית, ניתן להעריך EC 50 ו- E MAX בלבד. זה נעשה בצורה גרפית בדוגמא זו. תוכנת מחשב שמשתמשת בפונקציות לוגיסטי לעקומות sigmoidal יכולה לשמש לעקומה ראויה וחישוב EC 50 ערכים.

איור 1
איור 1:, ba רקמת מים במעייל רקמות אמבט סכמטי Cartoon מייצג טבעת של רקמה ממוקמת בקיר דו-. ה. זרימת החיץ ויצוא מוסדרים על ידי ברזלים זכוכית 3-בדרך שולבו בבסיס של החדר. O 2 / CO 2 הוא מבעבע בבאמצעות aerator שהוא חתום עם אטם כדי למנוע דליפה של PSS או גז. קלט מחזור נמוך מהתפוקה כדי לשמור על מחזור תקין ולמנוע היווצרות של כיסי אוויר שיגרמו disregulation טמפרטורה.

איור 2
איור 2:. עכברוש בית החזה אב העורקים + האנדותל איור לעיל מתאר ארבעה ניסויים נפרדים (בעלי חיים שונים ועל ידי חוקרים שונים על עליות להגדיר שונות כפי שהוא מיוצג על ידי צבעים שונים) כדי לבדוק את היכולת של prazosin להעביר התכווצות מושרה PE. Prazosin (5 ננומטר) באופן ברור העביר ימינה עקומת התכווצות מושרה PE באופן מקביל.

> איור 3
איור 3: עכברוש בית חזה אב העורקים + האנדותל הערכה גרפית של EC 50 ערכים לPE בהעדר (הרכב) ונוכחות (prazosin) של אנטגוניסט.. קו ירוק (C קבוצה) רק מסומן.

מלח MW (ז / שומה) 5 ליטר מ"מ FINAL
(גרם)
NaCl 58.45 37.99 130
KCl 74.56 1.75 4.7
KH2PO4 136.1 0.8 1.18
MgSO4• 7H20 246.5 1.45 1.17
NaHCO3 84.21 6.25 14.9
דקסטרוז 180.16 5 5.5
EDTA 380 0.05 0.03

מתכון רגיל פיזיולוגית תמיסת מלח (PSS) תוכן של PSS-נאגר ביקרבונט השתמש בניסוי זה: טבלה 1.. נכללים המשקל המולקולרי של כל המלחים והסכום נוסף ל5 L של DH 2 O כדי להשיג את הריכוז הרצוי.

ריכוז באמבטיה תוספת של אגוניסט עשתה לאמבטיה
1 x 10 -9 M 50 מיליליטר 1 x 10 -6 M
3 x 10 -9 M 100 מיליליטר 1 x 10-6 M
1 x 10 -8 M 35 מיליליטר 1 x 10 -5 M
3 x 10 -8 M 100 מיליליטר 1 x 10 -5
1 x 10 -7 M 35 מיליליטר 1 x 10 -4 M
3 x 10 -7 M 100 מיליליטר 1 x 10 -4 M
1 x 10 -6 M 35 מיליליטר 1 x 10 -3 M
3 x 10 -6 M 100 מיליליטר 1 x 10 -3 M
1 x 10 -5 M 35 מיליליטר 1 x 10 -2 M
3 x 10 -5 M 100 מיליליטר 1 x 10 -2 M
1 x 10 -4 M 35 מיליליטר 1 x 10 -1 M

טבלה 2:. רקמות אמבט תוסף אגוניסט ריכוזי הסכום של אגוניסט שיש להוסיף לכל אמבט לפרוperly לבנות עקומות ריכוז תגובה מצטברות. ריכוז האמבטיה הרצויה מושגת באמצעות תוספת הסכומים רציפים של ריכוזים גוברים של אגוניסט. כל תוספת לוקחת בחשבון את הריכוז של אגוניסט כבר מקיים באמבטיה. הדבר נעשה כדי למזער את הגידול בהיקף באמבטיה הרקמות שכתוצאת משימוש כרכים הולכים וגדל של ריכוז יחיד של אגוניסט.

Discussion

מדידה של כוח איזומטרי ככלי מחקר היא בן למעלה מ -150 שנים, אבל היא ממשיכה להיות הטכניקה הטיפוסית לאפיון רצפטור ברקמות התכווצות 2. כוחה של טכניקה זו הוא בפשטות וברבגוניות שלו: על ידי הקלטת תגובות שהושרו על ידי הגדלת ריכוזים של אגוניסט בנוכחותו או היעדריו של יריבו, מספר עצום של מידע ניתן לגזור על המאפיינים תרופתיים של כל תרופה והקולט ש הוא נקשר 3-5. ניסויים מסוג זה גם לגייס מידע על התחרותי מול הטבע הלא תחרותי של היריבים משמשים, כמו גם ההטרוגניות קולט והשפעות תרופה שאינן ספציפיות 6-8. לפיכך, עם תמורות פשוטות לניסוי אמבטיה רקמה מבודד זה, פרופיל תרופתי יחסית מלא של קולטנים אשר מתווכים התכווצות שרירים הנגרם אגוניסט יכול להיות שנוצר.

במונחים של agonism, הניתן לחשב דואר יעילות היחסית (E MAX) ועצמה (50 EC) של אגוניסט ברקמות נתון ובהשוואה לתגובות של אגוניסטים אחרים באותו הרקמה 1. בניסוי שלנו, אב העורקים החזי העכברוש הודגרה גם עם רכב או prazosin α אדרנרגיים 1 אנטגוניסט לרצפטור (5 ננומטר) במשך שעה אחת לפני הוספת phenylephrine אגוניסט אדרנרגי 1 α לאמבטיה הרקמה ויצירת התכווצות. איור 2 מתנות שונה תוצאות של איור 1. התגובות הירוקות סומנו בהתכווצות המרבית מושגת על ידי PE סומנו כמקסימום, ההתכווצות המרבית ½ מסומן ככאלה ולאחר מכן קשור עם ריכוז PE שגרמה שתגובה. זיהוי ערכים אלה הוא זיהוי הריכוז היעיל של אגוניסט שמשיג תגובת מחצית מקסימום (50%) או ערך EC 50.

למרבה הצער, שימוש בפרמטר אגוניסט תלויזה לבד כדי לקבוע יכול להיות מסובכים מאפיינים מחייבים קולט 9. באופן אידיאלי, ניסויים נוספים באמצעות יריבים הקולטן לאפשר החישוב של שני פרמטרים חשובים, כי הם מפתח להגדרת האינטראקציה בין תרופה וקולט: 10 -log של דיסוציאציה אנטגוניסט הקבועה (PK B) ו-log 10 של היריב טוחנת ריכוז דרוש כדי לעורר שינוי הכפול ימינה בעקומת ריכוז התגובה (PA 2) 10. שני K B והרשות פלסטיני 2 רווח התועלת שלהם מהעובדה שהם ערכי אגוניסט-עצמאי, ויישארו קבוע גם בין רקמות שונות 11. מהנתונים בתרשים 2, PK B יכול להיות מחושב באמצעות המשוואה הבאה ומבוסס על EC 50 ערכים מחושבים במקום אחר:

EC 50 בהעדר prazosin = 2 x 10 -8 M
EC 50 במראשהיגיון של prazosin = 7 x 10 -6 M

לפתור עבור K B במשוואה הבאה:
יומן (dr-1) = להיכנס [B] - יומן K B
איפה:
[B] = ריכוז antagonist, או 5 x 10 מ '-9 יומן (5 x 10 -9 M) = -8.3
dr = יחס מינון של ערך EC 50 בנוכחות של אנטגוניסט / 50 EC בהעדר. אם יש תזוזה ימינה, ערך זה יהיה גדול יותר מפעם אחת. כך:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M או 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
מחליף [B] וdr:
יומן (350-1) = -8 - יומן K B
2.54 = -8 - להיכנס KB
PK B = 10.54

ערך זה לprazosin עולה בקנה אחד עם הערכים שהתקבלו כאשר prazosin אינטראקציה עם recept adrenergic 1 αאו 12,13, דבר המצביע על כך שהקולטן adrenergic תיווך התכווצות לphenylephrine הוא קולטן adrenergic α 1.

כמה צעדים הם קריטיים להצלחה של ניסויים אלה. רקמות חייבת להישאר בPSS לאחר נתיחה כדי למנוע אובדן של כדאיות רקמות. יש כל הכנת השרירים איזומטרי יחסי אורך-מתח אופטימלי שיוצר כוח מקסימאלי נגד מתח פסיבי 14,15. לניסוי המתואר בפרוטוקול זה, מתח פסיבי אופטימלי נקבע בעבר על ידי מרווחי הוספה בקצרה של 0.5 גרם של מתח פסיבי לרקמות. הרקמה צריכה להתחיל בלי טון ואז אחרי 30 דקות של איזון, הרקמה אותגרה עם ריכוז מקסימאלי של KCl (80 מ"מ), שנוצר צליל פעיל. לאחר מכן, הרקמות נשטפו והורשו לחזור לטון בתחילת מחקר. אחרי 15 דקות בתחילת המחקר, 0.5 גר 'נוסף של מתח פסיבי הוצב והתהליך הזה שוב ושוב עד לרמה שלמתח פעיל הושג עם מתח פסיבי נוסף. בניסויים ראשוניים, 4 סך גרם של מתח הפסיבי היה נחוש להשיג דור מתח פעיל מקסימאלי בטבעות אב העורקים, ובכך סכום כולל זו של מתח מושם על הטבעות לפני האיזון. פרוצדורלית, עדיף להתמקד יישום מתח פסיבי לפני, אבל ניתן לעשות זאת בכל עת לפני הניסוי. המשתרע על פני-רקמות, בכל נקודה בניסוי או לנתיחה, תשפיע לרעה על כדאיות רקמות ותוצאות ניסוי. זה הכרחי ביותר בעת ביצוע רקמות באמבטיה, כצעד זה יש הסבירות הגבוהה ביותר של מתיחה מוגזמת. שטיפה נאותה, במספר ומשך נדרשת לאפקטים לשחזור. אתגר שני מוקדם מדי אחרי אתגר ראשוני, או לפני הרקמות חזרו למתח בסיסי, יגרום לתגובות חריגות. אם לומדים יריבים / מעכבים הפיכים, לא צריכים לשטוף רקמות לפני אגוניסט בנוסף, כinhibiריכוז טור יהיה ירידה.

ישנם יתרונות וחסרונות בולטים למבחני אמבטיה רקמות המבודדים.

חסרונות: רקמות עלולות להיתקל בדרגות שונות של נזק במהלך ניתוח להסרת או מיקום של טבעות על ווים. מאז התא האנדותל הוא הציפוי הפנימי של טבעת אב העורקים, יש להקפיד על המיקום של הטבעת על ווים, כדי שלא לפגוע בשכבת תאים זו. רקמות יכולות להיות גם באורכים שונים במובהק מהזמן שבו הם קיימא באמבטיה הרקמות, ואת זה יש שייקבע; לא כל הרקמות זהות. לאורך שורות אלה, רקמות עשויות להשתנות בהיענות שלהם לאורך כל היום כך שהבקרה בזמן הפכה לשליטה הנדרשת עבור כל ניסוי. דוגמא טובה לכך היא קנה הנשימה חזיר גינאה שמשפרת במקסימום התכווצות ב -100% במהלך ניסוי 8 שעות טיפוסיות. תרופות שהן מסיסים היטב במים עלולות לעורר בPSS. לבסוף, מצטברnd תוספות שאינן מצטברות של תרופה שהיא אגוניסט עלול לגרום לתוצאות שונות אם הפחתת רגישות הקולטן לאגוניסט מתרחשת; אנגיוטנסין II הוא תרופה אחת כזו שמראה tachyphylaxis המהיר.

יתרונות: אחד היתרונות העיקריים של ניסויי אמבטיה רקמה הוא שזה בזמן אמת; ניתן לראות את ניסוי עת התרחשותה ומהירות יכולה לעשות את המסקנות ולתכנן את הצעדים הבאים, כמו גם פתרון בעיות במהלך ניסוי. ניסוי לוקח יום לעשות. בדרך כלל ניתן להכין רקמות מרובות מחיה אחת כזאת שחיה יכולה לשמש כשליטה שלו, וזה מוסיף כוח לניסוי. אפשר גם לבודד את הרקמה מגורמים אחרים כדי לבחון את התגובה טהורה יחסית של הרקמה לתרופה. בניסויים במבחנה, כגון מערכת האמבטיה הרקמות מאפשרים גם שימוש בכמות קטנה של תרופה בהשוואה לניסוי in vivo.

עיצוב ניסיוני הבסיסי שתואר במסמך זה יכול להיותשינוי נרחב כדי לאפשר הקלטה של ​​פרמטרים נוספים או ההקדמה של גירויים חיצוניים אחרים. לדוגמא, תוספת של אלקטרודות לאפשר לגירוי שדה חשמלי של עצבי innervating 16,17. עם התוספת של בדיקות תרמית או pH, ניתן גם למדוד את ההשפעות של טמפרטורה ו- pH על תגובות התכווצות 18,19. באופן דומה, חמצן ניתן להחליף באופן חלקי או במלואו עם N 2 כדי לבדוק את ההשפעות מושרה היפוקסיה. יתר על כן, אותם העקרונות הבסיסיים של מדידת התכווצות איזומטרי בשימוש בוידאו זה יכול לשמש לפיתוח מערכות המאפשרות מדידה במקביל לפיתוח מתח איזומטרי ושינויים בסידן תוך תאי 20. התמרה אות היא גם למדה בקלות, שכן מערכות קיימות שיכול במהירות להקפיא דגימת רקמה בתגובה, כך שהפעילות של מערכת מסלול העברת אותות ניתן לאמת ביוכימית.

הווריאציה של סוסיםipment שיכול לשמש כדי לעשות את זה הוא עצום. מערכת זו כולה, כל היד שנבנתה או אוטומטית, ניתן לרכוש מחברות שונות מרובות. אמבטיות הרקמה ובעלי רקמת שימוש בפרוטוקול זה היו מנופח ביד (אמבטיות רקמה) ויד שנבנתה (בעלים) על ידי מכונה חנויות אוניברסיטת מישיגן בבית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LabChart Software ADInstruments 7.2
PowerLab (4 channel)  ADInstruments ML760
QuadBridge (4 channel) ADInstruments ML112 ML112
Grass Adapter Cable ADInstruments MLAC11 MLAC11
Grass Force-displacement Transducer Grass Instrument Co FT03 FT03
Grass Transducer Cable Grass Instrument Co TAC-7 REV-1
BNC to BNC Cable ADInstruments MLAC01
IsoTemp 2100 Fisher Scientific IC-2100
Tissue Bath Multiple Sources 
Physiological Salt Solution PSS
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Ring Stand Humboldt MFG Co H-2122 7
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Tygon Tubing VWR Scientific 63010-100 R-3603
Hose Clamps Cole-Parmer Instrument Co 06832-08 SNP-8
50 ml Muscle Bath Eberhartglass Blowing Custom
250 ml Warming Chambers Eberhartglass Blowing Custom
Gas Dispersion Tube Ace Glass 7202-06 7202-02
Micrometer
Custom Stands
Three-prong Clamps VWR International Talon
S-connector VWR International Talon
Tissue Hooks Hand Made in House Custom
Tissue Dissection
Leica Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source Fisher Scientific 12562-36 12562-36
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Sylgard Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150 160-150
Splinter & Fixation Forceps George Tiemann & Co 160-55 160-55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
  2. Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
  3. Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
  4. Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
  5. Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
  6. Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
  7. Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
  8. Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
  9. Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).
  10. Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
  11. Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120, (4), 29-46 (1997).
  12. Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
  13. Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
  14. Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
  15. Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
  16. Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
  17. Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
  18. Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
  19. Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
  20. Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics