A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

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Jespersen, B., Tykocki, N. R., Watts, S. W., Cobbett, P. J. Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (95), e52324, doi:10.3791/52324 (2015).

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Abstract

Introduction

A disciplina de farmacologia tem usado o sistema isolado banho de tecidos para mais de 150 anos. A versatilidade deste sistema permitiu aos cientistas em todo o mundo para caracterizar os receptores de transdução do sinal do receptor e, com este conhecimento formando a base de terapias que têm tratados milhões de indivíduos com doenças ou distúrbios, tais como hipertensão, insuficiência cardíaca, diabetes, doença gastrointestinal, a bexiga disfunção, asma, e os transtornos de deglutição, para citar apenas alguns. Até hoje, o banho de tecido isolado permanece uma importante faceta do desenvolvimento da droga e pesquisa de base, uma vez que permite que o tecido para funcionar como um tecido. Nesta lição JoVE, um protocolo formal é partilhada para demonstrar uma experiência visual e virtuais utilizando os dados a partir de um tecido isolado experimento banho que mede a contracção isométrica, que permite a caracterização do receptor.

A principal vantagem desta técnica é que o tecido vivo é umnd funções como um tecido de todo, com um resultado fisiológico (contracção ou relaxação) que é relevante para o corpo. É uma síntese de etapas (de interação droga-receptor, de transdução de sinal, de segunda geração messenger, alteração na excitabilidade do músculo liso, e mudanças em função do tecido). Enquanto outras técnicas de permitir o estudo de cada um destes passos (por exemplo, ligação de radioligandos para a afinidade da droga, a medição de segundos mensageiros), o banho de tecido isolado técnica permite a integração de todos estes passos 1. Outra vantagem é o facto de conservar a função do tecido permite o cálculo de variáveis ​​farmacológicas importantes que são mais significativo num tecido contra um ambiente celular; se aproxima mais como as drogas analisadas iria trabalhar no corpo como um todo.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade Estadual de Michigan.

1. Sistema de Preparação e Configuração

  1. Adicione 5 L de uma solução de sal fisiológico (PSS), que é a quantidade necessária para um experimento contracção banho de tecido que utiliza cerca de 50 ml de banhos de tecido; ver Tabela 2 para a receita PSS. Calcular o volume total necessário por multiplicação do número de banhos de tecido vezes o volume do banho e em seguida multiplicando pelo número de lavagens de tecidos necessários.
    1. Use a Tabela 2 como um guia para fazer PSS. Dissolve-se os sais em cerca de 4 L de água. NOTA: HPLC - Tipo I água é recomendado
    2. Adiciona-se 8 ml de 1 M de solução de CaCl 2 (147 g / L de se utilizar o sal di-hidrato) para a solução, de modo que a solução final é de 1,6 mM de cálcio.
    3. Solução PSS Quantum sufficit a 5 L.
    4. Pré-aqueça o sistema de banho de tecido a 37 ° C por ligar o banho de água aquecida a recirculação. Passo Crítica: Cada componente do sistema é jaqueta de água, assegurar que eles estão ligados em série uns aos outros. A direção do fluxo é crítica - garantir que os fluxos de água para cada componente com o menor conexão farpado e, ao mais alto conexão farpado.
    5. Ligue sistema de aquisição de dados. Ligue os transdutores de força, pelo menos, 15 minutos antes do experimento para equilibrar a temperatura.
      NOTA: A maioria dos transdutores de força empregar medidores de tensão que são sensíveis a variações de temperatura e exibem deriva térmica inicialmente depois que a energia é aplicada.
    6. Lançamento software de aquisição de dados e garantir a conexão com o sistema de aquisição de dados. Por favor, siga as instruções de fabricação para permitir a gravação de dados.
    7. Certifique-se que os transdutores de força são calibrados antes de tecido é colocado no banho de tecidos e antes de gravação de dados já começou; foinstruções do fabricante Llow para calibração.
    8. Ligue o sistema de banho de tecido a um 95% de O2 / 5% de CO 2 cilindro de gás de grau médico e verifique se há vazamentos de gás e, em seguida, pressurizar o sistema.
    9. Encha os reservatórios de banho tecido com PSS e permitir que o tempo de solução para atingir a temperatura ideal. Primeiro o sistema e remover as bolhas de ar dentro do sistema e tubos.
    10. Verifique aeradores de banho tecido para garantir a aeração solução consistente, que oxigena o tampão PSS e proporciona movimento browniano para distribuir drogas que serão introduzidas no banho de tecidos durante o experimento. Certifique-se de aeração / bolhas não causar o movimento do tecido, o que vai atrapalhar as gravações de dados; diminuir o fluxo de gás, conforme necessário.
      NOTA: O banho de tecidos e sistemas de aquisição de dados agora está pronto para iniciar a experiência.

    2. Preparação de tecidos

    1. Idealmente, dissecar os tecidos a partir do animal imediatamente antes do uso e colocar directamente into PSS.
      NOTA: Alguns tecidos podem ser salvos no PSS noite a 4 ° C, mas os controles apropriados deve ser feito para validar a função do tecido após um armazenamento prolongado; veja Seção 6.
    2. Use a aorta torácica como o tecido neste exercício.
    3. Anestesiar o rato, de acordo com as diretrizes institucionais e coloque o lado dorsal do rato para baixo. Confirme anesthetization via um dedo do pé-pitada ea perda de resposta reflexa a esse estímulo doloroso.
      NOTA: Este protocolo utiliza 70 mg / kg de pentobarbital fornecido através de uma injecção intraperitoneal. Diretrizes institucionais para anestesia roedor pode ser diferente.
    4. Criar um pneumotórax, criando uma incisão com tesoura ao longo do diafragma na parte inferior da caixa torácica. Em seguida, continuar a incisão da parte de baixo da caixa torácica para o esterno e bifurcar.
    5. Dissecar fora ou colocar de lado os órgãos que estão no topo da coluna vertebral e localize a aorta, que se encontra diretamente ao longo da coluna vertebral.
      NOTA: Este étep fornece um espaço de trabalho claro para dissecar a aorta.
    6. Sever todas as ligações à aorta; a partir do esófago, pulmão, etc, e cortar a aorta perpendicular à coluna vertebral ao nível do diafragma.
    7. Suavemente segurar a aorta com uma pinça e utilize uma tesoura para dissecar a aorta a partir da espinha. Comece a dissecção na área inferior do diafragma ao lado da coluna vertebral e do trabalho em direção ao coração. Certifique-se de tomar cuidado extra para não puxar ou puxão na tecido aórtico, o que pode danificar o tecido.
    8. Colocar imediatamente a aorta no prato dissecção preparado contendo PSS.
      NOTA: A dissecção da aorta em anéis é o melhor feito em um prato de dissecação que tem um silastic fundação preto. Isto permite a utilização de fios que podem ser usados ​​para canular a artéria aorta e ser fixada ao prato, proporcionando estabilidade ao mesmo tempo no prato de dissecação. O fundo preto fornece contraste que auxilia dissecção. Cuidados devem ser tomados na utilização de fios canulação como o endotelialcamada de células ial pode ser removido com um excesso de atrito do fio contra o lúmen do vaso.
    9. Tomar um fio e fazer um pequeno ângulo de 90 ° em uma extremidade e empurrar a extremidade em ângulo para a base de silastic para ancorar o fio de guia. Coloque toda a aorta no prato dissecção.
    10. Segurar a extremidade do fio de guia, com uma pinça, e, em seguida, passe suavemente o fio no interior do lúmen da aorta.
    11. Use uma pinça e deslize a aorta para o fio. Quando a extremidade livre do fio de guia é visível, o fio suavemente curva e colocar a extremidade livre para a fundação de silastic do prato para estabilizar o tecido.
    12. Usando pequenos Vannas tesoura e pinça, retire o tecido adiposo perivascular e todos os outros tecidos estranhos, coágulos de sangue, etc., até a aorta torácica aparece em branco e um pouco fibrosa.
    13. Remover a aorta a partir de arame limpa e utilize uma tesoura para cortar em anéis da aorta, que são cerca de 3-5 mm de largura.
    14. Inserir um anel aórtico de um de um par de tiganchos ssue por segurar o gancho e usando uma pinça para deslizar suavemente o anel no gancho. Repita este processo com o segundo gancho. Tome cuidado para garantir os ganchos não emaranhado; veja a Figura 3.
    15. Verifique se cada gancho tem um fio de seda diferente anexado. Verificar que um gancho tem um pequeno laço de seda atado que permite a ligação de um vidro ou uma haste de aço inoxidável, enquanto que o outro é uma peça 10-4 cm de comprimento de sutura que vai ser amarrado o transdutor de força à mão; veja a Figura 3.
      Observação: Uma vez que a aorta é fixada aos ganchos, o tecido é preparado para ser montado no banho de tecido; veja a Figura 3.
    16. Repita os passos de 2,14-2,15, para montar um segundo anel aórtico na segunda câmara do banho de tecido.

    3. Colocação Tissue em Bath

    1. Note-se que neste sistema, os próprios banhos de tecido são estacionários. Neste momento, preencher os banhos de tecido com aquecido, PSS aerado e permitir que a solução para vir a temperature.
    2. Com a sutura de seda, amarrar um dos ganchos na preparação de tecido para o pino na vara de aço inoxidável. Coloque este final para a câmara de banho de tecido. Ligue a vara a um stand anel e coloque a outra extremidade no prato de coloração com PSS para manter o tecido imerso em tampão; veja a Figura 3.
      1. Coloque a haste e tecido na câmara de banho de tecidos e certifique-se que o tecido é totalmente imerso no PSS e da haste é segura; veja a Figura 3.
      2. Amarre a outra sutura para o transdutor de força e certifique-se de deixar uma folga na sutura entre o tecido e o transdutor de força.
        NOTA: Este folga vai ser removido através do ajuste do micrómetro; veja a Figura 3.
    3. Repita essas etapas para o segundo anel e banho de tecidos câmara aórtica.

    4. Definir tensão passiva

    NOTA: Cada tecido tem um comprimento (Lo) em que células musculares lisas responder optimally. As experiências preliminares para determinar a tensão de alongamento óptimo que alcança este comprimento devem ser realizados para cada tipo de manipulação de tecidos a ser examinado. O rato aorta torácica tem uma tensão de alongamento passivo ideal de 4 g.

    1. Use o micrômetro / cremalheira e pinhão para aumentar a tensão de 2 g e esperar que o tecido para chegar planalto. Uma vez patamar é atingido, aumentar a tensão de 2 g e outra esperar para o tecido para estabilizar.
      NOTA: Nos anéis de aorta, após a tensão inicial de 2 g definiu e planalto atingido, o tecido deve então relaxar a ~ 1,6 g. Uma segunda aplicação de 2 g iria levar o tecido a ~ 3,6 g, a partir do qual o tecido novamente irá relaxar e tensão irá diminuir. Assim, depois de ter adicionado 4 g de tensão total, o software deve indicar cerca de 3,2 g de tensão.
    2. Repita essas etapas para o segundo anel e banho de tecidos câmara aórtica.

    5. Equilíbrio e Confecção de Drogas

    1. Equilibrar a tecido para60 min após a aplicação de tensão passiva para o tecido.
    2. Durante a fase de equilíbrio, lavar o tecido a cada 15-20 min. Escorra o banho de tecidos e substituir o PSS com PSS de um reservatório aquecido.
      NOTA: Durante este tempo, o tecido irá relaxar, o que é indicado pela perda de tensão passiva.
    3. Durante este tempo, preparar medicamentos para o experimento, que necessitam de ser de pelo menos 1000 vezes mais concentrada que a concentração real no banho, de modo que apenas um pequeno volume da reserva de fármaco necessária para atingir a concentração desejada.

    6. desafio inicial

    1. No final do período de equilíbrio, lavar o tecido um tempo final, com excepção de dados, e re-zero de todas as entradas.
    2. Escolher um agonista (composto que irá provocar a contracção activo) ao qual o tecido responde.
      NOTA: No rato aorta torácica, o músculo liso arterial irá contrair ativamente para um agonista do receptor adrenérgico alfa devido à inervação dotecido pelo sistema nervoso simpático. Um agonista adrenérgico não seria útil em tecidos intestinais dado que os agonistas adrenérgicos causar relaxamento. Neste caso, um agonista de receptor, tais como acetilcolina (receptor colinérgico) poderia ser utilizado. Uma alternativa para a fenilefrina e a acetilcolina é a utilização de um agonista não-receptoras tais como níveis elevados de potássio (K) como o primeiro desafio. No músculo liso, K elevado opera para indirectamente os canais abertos de cálcio e, portanto, vistos como um índice geral da integridade do músculo liso.
      1. Execute o primeiro desafio ou o desafio de despertar pela adição de 10 -5 M fenilefrina ao banho de tecidos. Para atingir esta concentração em 50 mL de banho de tecidos, adicionar 50 ul de uma solução de fenilefrina 10 -2 M.
        NOTA: 50 ul em 50 ml de PSS é uma diluição 1 / 1.000, de modo que a concentração final é de 1.000x inferior a lingua, ou 10 -5 M. Conhecimento de volume e manutenção constante do volume dentro do banho de tecido cHamber é crítico para a determinação da concentração final da droga.
    3. Adicionar 10 -5 M fenilefrina ao banho de tecidos e permitir a contracção de pico e, em seguida, planalto, quando a inclinação dos dados torna-se zero. Certifique-se de gravar cada evento experimental para auxiliar a análise pós-experimental.
    4. Depois de planalto, lave o agonista para fora completamente por esvaziamento eo reenchimento da câmara de banho de tecido com o novo PSS. Certifique-se de registrar esses eventos também.
      NOTA: A regra de ouro é que a concentração de agonista no banho é reduzida 10 vezes com cada lavagem. Embora, mais do que 3-4 lavagens podem ser necessários para pôr o tecido de volta para baixo para o seu tom de linha de base de equilíbrio (tensão).
    5. Deixe o resto do tecido em tom de linha de base para ~ 10 min antes de prosseguir.

    7. Experiment

    NOTA: Prazosin, um antagonista dos receptores adrenérgicos alfa, será apresentado à câmara de banho de tecido para mudar a resp concentraçãocurva onse à fenilefrina (PE); este é um antagonismo demonstrável.

    1. Para um banho, adicionar o veículo (H 2 O) em que prazosina foi dissolvido. Para outro, adicione a concentração adequada de prazosin. Neste exemplo, adicionar 25 uL de veículo a um banho e 25 ul de 10 -5 M de concentração prazosina para o outro para obter um 5 x 10 -9 M ou uma concentração de 5 nM no banho.
      NOTA: Embora a adição de veículo parece desnecessária neste exemplo, é imperativo fazê-lo quando se utiliza outros veículos que têm um potencial para ser vasoactivo (por exemplo, DMSO, etanol, acetato). Adicione o veículo correspondente, mesmo que pouca evidência existe para que seja vasoativas.
    2. Deixar veículo / prazosina nos banhos e não lavar o tecido durante 1 hora.
      1. Embora os tecidos são equilibrante, preparar várias concentrações de agonista (PE). Incluem uma vasta gama de concentrações, a partir das concentrações que não induz qualquer resposta (por exemplo, </ Em> 10 -9 M PE) para concentrações que ultrapassam a resposta máxima (por exemplo, 10 -4 M PE). Desde curvas concentração-resposta são logarítmicas na natureza, fazer seis soluções separadas banco de PE (10 -6 -10 -1 M) através de diluições em série a partir da solução estoque 10 -1 M. Certifique-se que o volume necessário para cada concentração é ligeiramente maior do que o triplo do volume total necessário para todos os banhos (ie> 300 ul).
    3. Continuar a adição de agonista, como descrito na Tabela 1.
      NOTA: Esta experiência vai gerar uma curva de resposta concentração cumulativa ao PE; cada iteração leva em conta a quantidade de substância já adicionado ao banho. Adições ocorrer até que já não aumentar a contração, ou de toda a curva atingiu patamar.
      1. Adicionar a cada concentração de droga individualmente até que o limite do tecido é alcançada.
      2. Se não houver mudança, adicionar o próximo concentração nosérie; ver Tabela 2.
        NOTA: O calendário destas adições depende do agonista utilizado. Por exemplo, norepinefrina e contração fenilefrina se desenvolve rapidamente, e deve platô em poucos minutos. Em contrapartida, a endotelina-1 contração desenvolve lentamente e pode não planalto para perto de 45 min. Outra experimentação pode ser feito sobre o tecido, após a construção de uma curva, tal como este, desde que (1) a substância lavagens para fora; e (2) que possa ser demonstrado que o tecido volta ao comportamento normal contrátil e não é afetado pelos estímulos anteriores.

    Análise 8. Dados

    1. Certifique-se de salvar os dados imediatamente antes e depois de uma intervenção (por exemplo, acordar ou curva cheia).
    2. Encontrar e definir a linha de base do tecido para cada canal de câmara / input banho de tecidos, o que ajudará na análise de dados.
    3. Uma vez que a linha de base é definida, encontrar a resposta máxima para cada concentração, e registrar o change a partir da linha de base. Sequencialmente percorrer cada uma das concentrações e registrar a mudança de linha de base.
    4. Gráfico os dados resultantes. Fazei isto em qualquer programa gráfico.
      NOTA: Graph Pad Prism é concebido para farmacologista, e este é ideal para o tipo de experiência aqui apresentada.

Representative Results

Em termos de agonismo, a eficácia relativa (E max) e a potência (EC50) de um agonista de um dado tecido pode ser calculado e comparado com as respostas de outros agonistas no mesmo tecido 1. Na nossa experiência, a aorta torácica do rato foram incubados com veículo ou antagonista do receptor adrenérgico prazosina α 1 (5 nM) durante uma hora antes da adição do agonista adrenérgico α 1 fenilefrina ao banho de tecidos e geração de contracção (Figura 1).

A figura 2 apresenta modificado resultados da Figura 1. As respostas verdes têm marcado a contração máxima atingida pelo PE marcado como max, a contração máxima ½ marcado como tal e, em seguida, associado à concentração PE que causou essa resposta. A identificação destes valores é a determinação da concentração eficaz de um agonista que consegue uma resposta max metade (50%) ou CE 50.

Na geração e interpretação destes resultados, é importante o uso de ambas as concentrações baixas e elevadas de agonista para criar a curva de concentração-resposta. Sem pontos suficientes para mostrar uma linha de base estável e máxima planalto, EC 50 e E MAX só pode ser estimado. Isto foi feito graficamente neste exemplo. O software de computador que usa funções logísticas para as curvas sigmoidais pode ser usado para ajuste de curva e cálculo dos valores de EC50.

Figura 1
Figura 1:. Esquemático representando tecido de banho dos desenhos um anel de tecido colocado na parede dupla, com camisa de água de tecido de bath. Tampão de entrada e saída são regulados por uma torneira de passagem de 3 vias de vidro integradas na base da câmara. O2 / CO2 é borbulhado através de um arejador que está selado com uma junta de vedação para evitar fugas de gás ou PSS. Recirculação de entrada é inferior à saída de recirculação para manter adequada e evitar a formação de bolsas de ar que causariam temperatura desregulação.

Figura 2
Figura 2:. Rat Aorta Torácica + Endothelium A figura acima mostra quatro experimentos distintos (diferentes animais e realizados por diferentes pesquisadores em diferentes set ups como representados por cores diferentes) para testar a capacidade de prazosin para deslocar uma contração induzida-PE. Prazosin (5 milhas náuticas) claramente deslocado para a direita da curva de contração induzida pelo PE em paralelo.


Figura 3: Rato Aorta Torácica + endotélio estimativa gráfica de valores de EC 50 para o PE na ausência (veículo) e presença (prazosina) de antagonista.. Linha Verde (grupo C) só é marcado.

Sal MW (g / mol) 5 Litros MM FINAL
(g)
NaCl 58,45 37.99 130
KCl 74,56 1.75 4.7
KH2PO4 136,1 0,8 1.18
MgSO4• 7h20 246,5 1,45 1.17
NaHCO3 84,21 6.25 14.9
Dextrose 180,16 5 5.5
EDTA 380 0,05 0,03

Tabela 1: Normal Physiological Solução Salina (PSS) da receita Conteúdo do PSS tamponada com bicarbonato usado neste experimento.. Incluem-se os pesos moleculares de todos os sais e a quantidade adicionada a 5 L de dH2O para obter a concentração desejada.

Concentração no banho A adição de agonista feito para banho
1 x 10 -9 M 50 ml de 1 x 10 -6 M
3 x 10 -9 M 100 ml de 1 x 10-6 M
1 x 10 -8 M 35 ml de 1 x 10 -5 M
3 x 10 -8 M 100 ml de 1 x 10 -5
1 x 10 -7 M 35 ml de 1 x 10 ~ 4 M
3 x 10 -7 M 100 ml de 1 x 10 ~ 4 M
1 x 10 -6 M 35 ml de 1 x 10 -3 M
3 x 10 -6 M 100 ml de 1 x 10 -3 M
1 x 10 -5 M 35 ml de 1 x 10 -2 M
3 x 10 -5 M 100 ml de 1 x 10 -2 M
1 x 10 -4 M 35 ml de 1 x 10 M -1

Tabela 2:. Tissue banho Aditivo Agonista Concentrações A quantidade de agonista a ser adicionado a cada banho de próPerly construir curvas de concentração-resposta cumulativas. A concentração do banho desejado é conseguido através da adição de quantidades sequenciais de concentrações crescentes de agonista. Cada adição leva em conta a concentração de agonista já presente no banho. Isto é feito para minimizar o aumento de volume no banho de tecido que resultam da utilização de volumes crescentes de uma única concentração de agonista.

Discussion

Medição da força isométrica como ferramenta de pesquisa é mais de 150 anos, mas continua a ser a técnica de protótipo para caracterização receptor em tecidos contráteis 2. O poder desta técnica é, na sua simplicidade e versatilidade: por gravação respostas induzidas por concentrações crescentes de agonista na presença ou ausência de um antagonista, uma miríade de informação pode ser derivada sobre as características farmacológicas de cada fármaco e o receptor ao qual se liga-se 3-5. As experiências deste tipo também reunir informação sobre o competitivo contra a natureza não competitiva dos antagonistas utilizados, bem como a heterogeneidade dos receptores e efeitos de drogas não-específicos 6-8. Assim, com permutações simples para este banho de tecido isolado experimento, um perfil farmacológico relativamente completa dos receptores que medeiam a contracção muscular induzida pelo agonista pode ser gerado.

Em termos de agonismo, the eficácia relativa (E max) e a potência (EC50) de um agonista de um dado tecido pode ser calculado e comparado com as respostas de outros agonistas no mesmo tecido 1. Na nossa experiência, a aorta torácica do rato foram incubados com veículo ou o α 1 adrenérgico prazosina antagonista do receptor (5 nM), durante uma hora antes da adição do agonista adrenérgico α 1 fenilefrina ao banho de tecidos e geração de contracção. A Figura 2 apresenta os resultados modificado da Figura 1. As respostas verdes foram marcados com a contracção máxima conseguida pela PE marcado como máximo, a contracção máxima ½ marcada como tal e, em seguida, associadas com a concentração do PE que causou que a resposta. A identificação destes valores é a determinação da concentração eficaz de um agonista que consegue uma resposta max metade (50%) ou o valor de EC 50.

Infelizmente, o uso do parâmetro dependente do agonistas sozinha para determinar as características de ligação ao receptor pode ser complicado 9. Idealmente, experiências adicionais utilizando antagonistas do receptor de permitir o cálculo dos dois parâmetros importantes que são a chave para definir a interacção entre um fármaco e um receptor: a 10 -log da dissociação antagonista constante (pK B) e 10 a -log molar do antagonista concentração necessária para induzir um duplo desvio para a direita na curva de concentração-resposta (pA 2) 10. Ambos K B e pA 2 ganho a sua utilidade a partir do fato de que eles são valores independentes de agonistas, e permanecer constante, mesmo entre diferentes tecidos 11. A partir dos dados na Figura 2, pK B pode ser calculado usando a equação seguinte, com base em valores de EC50 calculados em outros lugares:

CE 50, na ausência de prazosina = 2 x 10 ~ 8 M
CE 50 no présença de prazosina = 7 x 10 -6 M

Resolver para K B na equação seguinte:
log (dr-1) = log [B] - log K B
Onde:
[B] = concentração de antagonista, ou 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8.3
dr = relação dose de valor EC 50 na presença de antagonista / CE de 50 de ausência. Se houver um desvio para a direita, este valor irá ser maior do que um. Assim:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M ou 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Substituindo [B] e dr:
log (350-1) = -8 - log K B
2.54 = -8 - log KB
pK B = 10,54

Este valor para o prazosin é consistente com os valores obtidos com prazosin interage com um α 1 adrenérgico receptou 12,13, sugerindo que o receptor adrenérgico fenilefrina para mediar a contracção é o receptor adrenérgico α 1.

Vários passos são fundamentais para o sucesso desses experimentos. Os tecidos devem permanecer no PSS após a dissecação para evitar a perda de viabilidade do tecido. Qualquer preparação muscular isométrica tem uma relação comprimento-tensão ideal que gera força máxima contra tensão passiva 14,15. Para o experimento descrito neste protocolo, tensão passiva ótima foi previamente determinado pela soma brevemente incrementos de 0,5 g de tensão passiva ao tecido. O tecido deve começar sem tom e, em seguida, após 30 minutos de equilibração, o tecido foi desafiada com uma concentração máxima de KCl (80 mM), o que gerou tom activo. Em seguida, o tecido foi lavado e deixou-se voltar à linha de base tom. Depois de 15 min na linha de base, um outro 0,5 g de tensão passiva foi colocada e este processo foi repetido até que um patamar detensão ativa foi conseguido com tensão passiva adicional. Em experiências preliminares, 4 g no total de tensão passiva foi determinada para alcançar geração de tensão máxima activo em anéis de aorta e, assim, esta quantidade total de tensão é colocado sobre os anéis antes de equilibração. Em termos processuais, é melhor a zero aplicação tensão passiva antes, mas pode ser feito a qualquer momento antes do experimento. Excesso de alongamento dos tecidos, em qualquer ponto do experimento ou dissecção, vai impactar negativamente a viabilidade do tecido e os resultados experimentais. Isto é mais imperativo ao colocar no banho de tecidos, como este passo tem a maior probabilidade de estiramento excessivo. Lavagem adequada, em número e duração é necessária para efeitos reprodutíveis. Um segundo desafio muito cedo depois de um desafio inicial, ou antes de tecidos voltaram a tensão da linha de base, irá resultar em respostas aberrantes. Se estudar antagonistas / inibidores reversíveis, tecidos não deve ser lavado antes de ser agonista disso, como o inhibiconcentração tor vai ser diminuída.

Há vantagens notáveis ​​e desvantagens para os isolados ensaios de banho de tecido.

Desvantagens: Os tecidos podem experimentar diferentes graus de danos durante a remoção cirúrgica ou a colocação de anéis em ganchos. Uma vez que a célula endotelial é o revestimento interno do anel da aorta, é preciso ter cuidado com o posicionamento do anel de ganchos, de modo a não danificar a camada de células. Os tecidos também podem ter distintamente diferentes períodos de tempo em que eles são viáveis ​​no banho de tecido, e isto tem que ser determinado; nem todos os tecidos são o mesmo. Ao longo destas linhas, tecidos podem mudar em sua capacidade de resposta ao longo do dia de tal forma que os controles de tempo tornar-se um controle necessário para cada experimento. Um bom exemplo disto é a traqueia da cobaia que melhora máximo em contractilidade de 100% durante uma experiência típica 8 h. As drogas que são pouco solúveis em água pode precipitar no PSS. Finalmente, um acumuladond adições não-cumulativas de uma droga que é um agonista pode resultar em resultados diferentes se ocorrer dessensibilização do receptor para o agonista; angiotensina II é uma dessas drogas que mostra taquifilaxia rápidas.

Vantagens: Uma das principais vantagens de experimentos banho de tecidos é que é em tempo real; pode-se ver a experiência que se desenrola e pode rapidamente tirar conclusões e planejar os próximos passos, bem como solucionar problemas durante um experimento. Um experimento leva um dia para fazer. Vários tecidos podem geralmente ser preparados a partir de um animal tal que o animal possa servir como o seu próprio controlo, e que aumenta a resistência a um experimento. Pode-se também isolar o tecido a partir de outros factores, a fim de testar uma resposta relativamente puro do tecido à droga. Em experiências in vitro, tais como o sistema de banho de tecido também permitem o uso de uma pequena quantidade de fármaco em comparação com uma experiência in vivo.

O delineamento experimental básico aqui descrito pode serextensivamente modificado para permitir o registo dos parâmetros adicionais ou a introdução de outros estímulos externos. Por exemplo, além de permitir que os eléctrodos para a estimulação do campo eléctrico de nervos inervação 16,17. Com a adição de sondas térmicas ou de pH, os efeitos da temperatura e do pH sobre as respostas contrácteis também pode ser medido 18,19. Da mesma forma, o oxigênio pode ser substituída total ou parcialmente com N 2 para avaliar os efeitos induzidos pela hipóxia. Além disso, os mesmos princípios básicos de medição contractilidade isométrica utilizados neste vídeo pode ser utilizada para desenvolver sistemas que permitem a medição simultânea de desenvolvimento e alterações da tensão isométrica em 20 cálcio intracelular. A transdução do sinal é também prontamente estudados, uma vez que existem sistemas que podem congelar rapidamente uma amostra de tecido durante uma resposta, de modo que a actividade de um sistema de via de transdução de sinal pode ser verificada bioquimicamente.

A variação de equipment que pode ser usado para fazer isso é enorme. Este sistema todo, qualquer mão construídos ou automatizado, pode ser comprado a partir de várias empresas diferentes. Os banhos de tecido e titulares de tecido utilizados neste protocolo foram (banhos de tecido) e mão construído (titulares)-blown mão por um in-house oficinas mecânicas da Universidade Estadual de Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LabChart Software ADInstruments 7.2
PowerLab (4 channel)  ADInstruments ML760
QuadBridge (4 channel) ADInstruments ML112 ML112
Grass Adapter Cable ADInstruments MLAC11 MLAC11
Grass Force-displacement Transducer Grass Instrument Co FT03 FT03
Grass Transducer Cable Grass Instrument Co TAC-7 REV-1
BNC to BNC Cable ADInstruments MLAC01
IsoTemp 2100 Fisher Scientific IC-2100
Tissue Bath Multiple Sources 
Physiological Salt Solution PSS
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Ring Stand Humboldt MFG Co H-2122 7
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Tygon Tubing VWR Scientific 63010-100 R-3603
Hose Clamps Cole-Parmer Instrument Co 06832-08 SNP-8
50 ml Muscle Bath Eberhartglass Blowing Custom
250 ml Warming Chambers Eberhartglass Blowing Custom
Gas Dispersion Tube Ace Glass 7202-06 7202-02
Micrometer
Custom Stands
Three-prong Clamps VWR International Talon
S-connector VWR International Talon
Tissue Hooks Hand Made in House Custom
Tissue Dissection
Leica Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source Fisher Scientific 12562-36 12562-36
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Sylgard Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150 160-150
Splinter & Fixation Forceps George Tiemann & Co 160-55 160-55

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References

  1. Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
  2. Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
  3. Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
  4. Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
  5. Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
  6. Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
  7. Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
  8. Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
  9. Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).
  10. Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
  11. Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120, (4), 29-46 (1997).
  12. Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
  13. Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
  14. Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
  15. Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
  16. Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
  17. Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
  18. Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
  19. Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
  20. Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).

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