Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jespersen, B., Tykocki, N. R., Watts, S. W., Cobbett, P. J. Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (95), e52324, doi:10.3791/52324 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

farmakoloji disiplini, 150 yılı aşkın bir süredir izole organ banyosu sistemi kullandı. Bu sistemin çok yönlülüğü hipertansiyon, kalp yetmezliği, diyabet, gastrointestinal hastalık, mesane gibi hastalıklar ya da bozuklukları olan bireylerin milyonlarca tedavi etmiş tedavilerin temelini oluşturan bu bilgi ile, reseptörleri ve reseptör sinyal iletimini karakterize dünya çapında bilim adamları izin verdi disfonksiyon, astım ve yutma bozuklukları, sadece birkaç isim. Doku, bir doku olarak işlev sağlar gibi bu gün için, izole organ banyosu, ilaç geliştirme ve temel araştırma önemli bir yüzünü kalır. Bu vallahi derste, resmi protokol reseptör karakterizasyonu izin izometrik daralma ölçen bir izole organ banyosu deney, veri kullanan bir görsel ve sanal deney göstermek için paylaşılır.

Bu tekniğin en önemli avantajı, doku yaşayan olmasıdırvücuda alakalı bir fizyolojik sonuç (kasılma veya gevşeme) ile bir bütün dokusu gibi nd fonksiyonlar. Bu adımlar (ilaç-reseptör etkileşimi, sinyal iletimi, ikinci haberci nesil, düz kas uyarılabilirliğindeki değişim ve doku fonksiyonunda değişiklik) bir sentezidir. Diğer teknikler bu adımların her birinin çalışma (örneğin radyo-ilaç afinite, ikinci haberciler ölçümü için bağlayıcı) izin verirken, izole organ banyosu tekniği tüm bu adımların 1 entegrasyonu sağlar. Diğer bir avantajı doku işlevini koruyarak hücresel ortamda vs dokuda daha anlamlı olan önemli farmakolojik değişkenlerin hesaplanmasına imkan olduğunu; incelenen ilaçların bir bütün olarak vücutta nasıl çalışacağını yakın geliyor.

Protocol

NOT: Bu yazıda anlatılan tüm işlemler, Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen kurallara göre yapılır.

1. Sistem Hazırlama ve Kurulum

  1. 50 ml doku banyolarına kadar kullanan bir doku banyosu daralma deney için gerekli olan miktardır fizyolojik tuz çözeltisi (PSS), 5 L olun; PSS tarifi için bakınız Tablo 2. Gerekli doku yıkama sayısına göre çarpılarak sonra doku banyoları sayısı çarpı banyo hacmi çarpılarak ve toplam gerekli hacmi hesaplayın.
    1. PSS yapma bir rehber olarak Tablo 2 kullanın. Suyun yaklaşık 4 L tuzları çözülür. Not: HPLC - Tip I su önerilir
    2. Son çözelti, 1.6 mM kalsiyum, bu yüzden çözeltisine (dihidrat tuzu kullanılarak, eğer 147 g / L), 1 M CaCI2 çözeltisi 8 ml ilave edilir.
    3. 5 L. Quantum sufficit PSS çözümü
    4. Çevrimli ısıtılmış su banyosunda açarak 37 ° C doku banyo sistemi önceden ısıtın. Kritik Adım: Sistemin her bir bileşeni birbirlerine seri olarak bağlandığından emin olun, su-ceketli olduğunu. akış yönü çok önemlidir - en yüksek dikenli bağlantı en düşük dikenli bağlantısında ve dışarı her bileşenin içine su akışını sağlamak.
    5. Veri toplama sistemi açın. Deney öncesinde kuvvet dönüştürücüler en az 15 dakika Güç sıcaklığını dengelemek için.
      NOT: Çoğu kuvvet dönüştürücüler sıcaklık değişimlerine duyarlı ve enerji uygulandıktan sonra ilk termal sürüklenme sergileyen gerilme ölçerler kullanır.
    6. Lansman veri toplama yazılımı ve veri toplama sistemi ile bağlantıyı sağlamak. Veri kayıt etkinleştirme üretim talimatlarını takip edin.
    7. Kuvvet dönüştürücüler doku doku banyosu ve veri kayıt başlamadan önce yerleştirilmeden önce kalibre emin olun; foKalibrasyon için llow üretici talimatları.
    8. % 95 O 2 /% 5 CO 2 medikal dereceli gaz silindiri doku banyo sistemi bağlayın ve gaz kaçakları kontrol ve sistemi basınç.
    9. PSS ile doku banyo rezervuarları doldurun ve çözüm süresi optimum sıcaklığa gelmesini bekleyin. Başbakan sistemi ve sistem ve boru içinde herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak.
    10. PSS tampon oksijenatlar ve deney sırasında doku banyosunda tanıtılacak ilaçları dağıtmak için Brown hareketi sağlayan tutarlı çözüm havalandırma sağlamak için doku banyo havalandırıcılar kontrol edin. Emin olun havalandırma / kabarcıklar veri kayıtları bozacak doku hareketi, neden olmaz; Gerekirse gaz akışını azaltmak.
      NOT: Doku banyo ve veri toplama sistemi artık denemeyi başlatmak için hazırız.

    2. Doku Hazırlanması

    1. İdeal olarak, hayvan dokuları incelemek kullanımdan hemen önce ve i doğrudan yernGoogle'a PSS.
      NOT: Bazı dokular gecede 4 ° C'de PSS kaydedilebilir, ancak uygun kontroller uzun süreli depolamadan sonra doku işlevini doğrulamak için yapılmalıdır; Bölüm 6'ya bakınız.
    2. Bu egzersiz doku olarak aorta kullanın.
    3. Kurumsal kurallarına uygun olarak sıçan anestezisi ve aşağı sıçan dorsal yüzü koyun. Bir ayak-tutam ve bu ağrılı uyaranlara refleks yanıtın kaybı yoluyla anesthetization onaylayın.
      NOT: Bu protokol, bir intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilen pentobarbital 70 mg / kg kullanılır. Kemirgen anestezi için kurumsal düzenlemeler farklı olabilir.
    4. Göğüs kafesinin altındaki diyafram boyunca makasla bir kesi oluşturarak bir pnömotoraks oluşturun. Ardından, sternum göğüs kafesi altından kesi devam bisect.
    5. Parçalara ayır veya omurganın üstünde olan bu organları bir kenara koyun ve omurga boyunca doğrudan yatıyor aort bulun.
      NOT: Bu step aorta dışarı incelemek için açık bir çalışma alanı sağlar.
    6. Aorta tüm bağlantıları Sever; ve yemek borusu, akciğer, vb diyafram düzeyinde omurga dik aort kesti.
    7. Yavaşça forseps ile aort tutun ve omurga aorta incelemek için makas kullanın. Kalbe doğru omurga ve iş bitişik alt diyafram alanında diseksiyonu başlatın. Dokuya zarar verebilir aort dokusu, fazladan çekmeyin önlem veya römorkör almak emin olun.
    8. Hemen PSS içeren hazırlanmış diseksiyon çanak aort yerleştirin.
      NOT: halkalar halinde aort diseksiyonu iyi siyah silastik temeli olan bir diseksiyon çanak yapılır. Bu diseksiyon çanak sırasında stabilite sağlayan aorta kanül ve çanak vidalanmış kullanılabilir tellerin kullanımı için izin verir. Siyah arka plan diseksiyon yardımcı kontrast sağlar. Bakım endotelinde olarak kanüle telleri alınmalıdırial hücre tabakası damarın lümeninin karşı telin aşırı sürtünmesi ile temizlenebilir.
    9. Bir tel alın ve bir ucunda küçük bir 90 ° açı yapacak ve kılavuz tel çapa silastik temele açılı ucunu itin. Diseksiyon çanak bütün aort yerleştirin.
    10. Forseps ile kılavuz telin ucunu tutun ve yavaşça aort lümenine tel iplik.
    11. Forseps kullanın ve tel üzerine aorta kaydırın. Kılavuz telin serbest ucu görünür, eğri hafifçe tel ve doku stabilize etmek için çanak silastik temele serbest ucunu yerleştirin.
    12. Aorta beyaz ve biraz lifli görünene kadar küçük vannas makas ve forseps kullanarak, vb perivasküler adipoz doku ve diğer tüm yabancı doku, kan pıhtıları, kaldırın.
    13. Tel temizlenmiş aort çıkarın ve genişliği yaklaşık 3-5 mm halkalarda aorta kesmek için makas kullanın.
    14. Ti bir çiftinin bir üyesi üzerinde bir aort halkası yerleştirinkanca tutup hafifçe kanca üzerine halka slayt forseps kullanarak ssue kanca. İkinci kanca ile bu işlemi tekrarlayın. Arapsaçı yok kanca sağlamak için özen; Şekil 3'e bakınız.
    15. Her kanca takılı farklı bir ipek sütür olduğunu kontrol edin. Öte yandan bağladılar kuvvet dönüştürücü olacak bir 10-4 cm uzunluğunda bir parça dikiş iken bir kanca, bir cam veya paslanmaz çelik çubuk bağlantı için izin veren ipek küçük düğümlü döngü olduğunu kontrol edin; Şekil 3'e bakınız.
      Not: aort kanca tespit edildikten sonra, doku, doku banyosu içine monte edilmek üzere hazır olduğu; Şekil 3'e bakınız.
    16. Tekrar ikinci doku banyo odasında ikinci bir aort halka monte etmek, 2,14-2,15 adımları.

    Bath 3. Doku Sıralama

    1. Bu sistemde, doku banyoları kendilerini sabit olduğuna dikkat edin. Şu anda, sıcaklık gelmek için çözüm ısındı, gazlı PSS ile doku banyoları doldurun ve izinör.
    2. Ipek sütür ile, paslanmaz çelik çubuk üzerinde peg doku hazırlama kanca birini kravat. Doku banyosu odasına Bu amaca yerleştirin. Bir halka standı çubuğu bağlayın ve tampon dalmış doku tutmak için PSS ile dolu boyama çanak diğer ucunu yerleştirin; Şekil 3'e bakınız.
      1. Doku banyo odasında çubuk ve doku yerleştirin ve doku tamamen PSS batırılır ve çubuk güvenli olduğundan emin olun; Şekil 3'e bakınız.
      2. Kuvvet dönüştürücü diğer sütür kravat ve doku ve kuvvet dönüştürücü arasındaki dikiş gevşekliği terk emin olun.
        NOT: Bu gevşek mikrometre ayarlayarak tarafından silinecektir; Şekil 3'e bakınız.
    3. İkinci aort halka ve doku banyo odasının için bu adımları tekrarlayın.

    4. Pasif Gerginlik Ayarı

    NOT: Her doku düz kas hücrelerinin optima cevap hangi bir uzunluğa (Lo) sahiptirLly. Ön deneyler, her bir doku tipi için yapılması gereken bu uzunluk incelenecek elde uygun germe gerilimini belirlemek için. sıçan aort 4 g optimal pasif germe gerilimi vardır.

    1. 2 g gerilimi artırmak ve platoya ulaşması dokuya beklemek mikrometre / kremayer kullanın. Plato ulaşıldığında, tansiyonu başka 2 gr artırmak ve yayla dokusu bekleyin.
      Not 2 g başlangıç ​​gerilimi ayarlamak ve platoya ulaşıldıktan sonra aort halkalarında, Doku daha sonra ~ 1.6 g dinlenmek. 2 g ikinci bir uygulama ~ doku tekrar dinlenmek ve gerginlik azalacaktır hangi 3.6 g, doku getirecek. Bu durumda, toplam gerilim, 4 g sonra, program bir gerilim yaklaşık 3.2 g göstermelidir.
    2. İkinci aort halka ve doku banyo odasının için bu adımları tekrarlayın.

    5. Dengeleme ve İlaç Yapımı

    1. Için doku dengelenmesiDokuya pasif gerilim uygulandıktan sonra 60 dak.
    2. Denge aşamasında, dokuya her 15-20 dakikada yıkayın. Dokular banyo boşaltın ve ısıtılmış hazneden PSS ile PSS'in değiştirin.
      NOT: Bu süre boyunca, doku pasif bir gerilim kaybı ile gösterilmiş olduğu, gevşetir.
    3. Bu süre boyunca, yani ilaç içerisinde çok küçük hacimli, istenen konsantrasyon elde etmek için gerekli olan, bir banyo gerçek konsantrasyonda en az 1000 kat daha fazla konsantre olması için gereken deney için olan ilaçların hazırlanması.

    6. İlk Mücadelesi

    1. Dengeleme dönemi sonunda, dokuya son bir kez yıkayın verileri kaydetmek, ve tüm girdileri sıfır yeniden.
    2. Doku yanıt hangi (aktif kasılmalara neden olur bileşik) bir agonisti seçin.
      NOT: sıçan torasik aorta ise, arteriyel düz kas aktif nedeniyle innervasyonunun bir alfa adrenerjik reseptör agonist küçüleceğiniSempatik sinir sistemi tarafından dokusudur. Bir adrenerjik agonisti adrenerjik agonistler gevşemesine neden olduğu göz önüne alındığında bağırsak dokularında faydalı olmaz. Bu durumda böyle bir asetilkolin (kolinerjik reseptörü) gibi bir alıcı agonisti kullanılabilir. Fenilefrin ve asetilkolin bir alternatif örneğin ilk sorun, yüksek potasyum (K) olmayan bir reseptör agonisti kullanmaktır. Düz kasta, yüksek K dolaylı açık kalsiyum kanallarını çalışır ve böylece düz kas bütünlüğünün genel endeksi olarak görülüyor.
      1. Doku banyosuna 10 -5 M fenilefrin ekleyerek ilk meydan veya uyandırma meydan gerçekleştirin. 50 ml doku banyosuna bu yoğunluğa ulaşabilmek 10 -2 M fenilefrin çözeltisi 50 ul ekleyin.
        Not: PSS 50 ml 50 ul nihai konsantrasyon değerden 1,000x az olacak şekilde, bir 1 / 1,000 seyreltme ya da 10 -5, M. Doku banyosu c içinde hacim ve hacim tutarlı bakım Bilgihamber nihai ilaç konsantrasyonunun saptanması için çok önemlidir.
    3. Veri eğimi sıfır olduğunda, doku banyosuna 10 -5 M fenilefrin ekleyin ve tepe ve ardından yayla daralma izin. Sonrası deneysel analiz yardımcı olmak için her deney olayı kaydetmek için emin olun.
    4. Plato sonra, boşaltma ve yeni PSS ile doku banyo odasını dolumu ile iyice agonist yıkayın. Hem de bu olayları kaydetmek için emin olun.
      NOT: Dikkat etmeniz gereken bir kural banyosunda agonist konsantrasyonu her yıkama ile 10 kat azalır olmasıdır. Fazla 3-4 yıkar gerekebilir rağmen geri aşağı denge temel tonu (gerilim) için doku getirmek.
    5. Devam etmeden önce ~ 10 dakika için temel sesi doku dinlensin.

    7. Deney

    NOT: Prazosin, bir alfa adrenerjik reseptör antagonisti, konsantrasyon ve onaya kaydırmaya doku banyo odasına tanıtılacakonse eğrisi fenilefrin (PE) için; Bu bir ispat husumet olduğunu.

    1. Bir banyo için araç eklemek (H2O) 'in prazosin çözülmüştür. Başka, prazosin uygun konsantrasyonunu ekleyin. Bu durumda, bir 5 x 10 -9 M veya banyoda 5 nM bir konsantrasyon elde etmek için, diğer bir banyo aracın 25 ul ve prazosin 10 -5 M konsantrasyonda 25 ul ekle.
      NOT: Aracın eklenmesi bu örnekte gereksiz gibi görünse de, vazoaktif olmak için potansiyeli (örneğin, DMSO, etanol, asetat) sahip diğer araçlar kullanırken, bunu yapmak zorunludur. Bu vazoaktif olmak için çok az kanıt varsa bile gelen araç ekleyin.
    2. Hamam araç / prazosini bırakın ve 1 saat doku yıkama yok.
      1. Dokular dengeye iken, agonist (PE) çok sayıda konsantrasyonları hazırlamak. Örneğin, <yanıt ortaya çıkaran konsantrasyon (konsantrasyona, geniş bir yelpazede yer alır/ Maksimal yanıt (aşmak konsantrasyonlarda em> 10 -9 M PE), örneğin, 10 -4 M PE). Konsantrasyon-cevap eğrileri, 10 -1 M stok çözeltisinden PE altı ayrı stok çözeltileri (10 -6 -10 -1 M) seri seyreltileri yapmak doğada logaritmik olduğundan. Her bir konsantrasyon için gerekli hacmi tüm banyo (yani> 300 ul) için gerekli üç toplam hacim biraz daha büyük olduğundan emin olun.
    3. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, agonist ilave devam edin.
      Not: Bu deney PE kümülatif konsantrasyon yanıt eğrisi oluşturur; Her yineleme dikkate zaten banyoya ilave madde miktarını alır. Artık daralma artırmak kadar ilaveler meydana veya tüm eğri plato etti.
      1. Doku eşik ulaşılana kadar tek tek her ilaç konsantrasyonu ekleyin.
      2. Hiçbir değişiklik meydana gelirse, bir sonraki konsantrasyon eklemekserisi; Tablo 2'ye bakınız.
        NOT: Bu eklemeler zamanlaması kullanılan agonist bağlıdır. Örneğin, norepinefrin ve fenilefrin daralma hızla gelişir ve birkaç dakika içinde plato gerekir. Buna karşılık, endotelin-1 daralma yavaş gelişir ve yakınında 45 dakika boyunca plato olmayabilir. Diğer deneyler sürece, bu gibi bir eğrinin inşaatından sonra doku üzerinde yapılabilir gibi (1) madde yıkar dışarı; ve (2) doku, normal kasılma davranışı döner ve önceki uyarılara etkilenmez olmadığını ortaya konabilir.

    8. Veri Analizi

    1. Önce ve bir müdahaleden sonra hemen verileri kaydetmek emin olun (örneğin, uyandırma veya tam eğri).
    2. Bul ve veri analizine yardımcı olacak her doku banyo odası / giriş kanalı, doku taban ayarlamak.
    3. Taban ayarlandıktan sonra, her bir konsantrasyon için maksimum yanıtını bulmak ve chan kayıtbaşlangıca ge. Sırayla konsantrasyonlarının her gezinmek ve temel vardiya kaydedin.
    4. Elde edilen verilerin grafik. Herhangi bir grafik programında yapın.
      NOT: Graph Pad Prizma farmakolog için tasarlanmış, ve bu burada sunulan deney türü için idealdir.

Representative Results

Agonizmi açısından, belirli bir dokuda bir agonist nispi etkinliği (Emax) ve güçte (EC50) hesaplanır ve aynı dokuda 1 diğer agonistlerin yanıtlarıyla karşılaştırıldığında edilebilir. Bizim deneyde, sıçan aort araç ya da önce (Şekil 1) ya da doku banyosuna α 1 adrenerjik agonisti fenilefrin ilave edilmesi ve daralma üretilmesi için bir saat boyunca α 1 adrenerjik reseptör antagonisti, prazosin (5 nM) ya da birlikte inkübe edildi.

Şekil 2, Şekil 1 hediye sonuçları değiştirilmiş. Yeşil tepkiler PE tarafından elde edilen maksimum kasılma yanıtı olduğunu neden olduğu max, ½ maksimum kasılma gibi işaretlenir ve daha sonra PE konsantrasyonu ile ilişkili olarak işaretlenmiş işaretlediğiniz. Bu değerler belirlenmesi yarım maksimum (% 50) tepki ya da EC elde eden bir agonistinin etkili konsantrasyonu belirlenmesi olan 50 değerlerinin eğri uydurma ve hesaplama için kullanılabilir kullanan bu example.Computer yazılım donegraphically oldu.

Oluşturma ve bu sonuçlara, bu konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturmak üzere agonist hem düşük hem de yüksek konsantrasyonlarda kullanılması önemlidir. Yeterli puan istikrarlı bir temel ve maksimum plato göstermek için olmadan, AK 50 ve E MAX sadece tahmin edilebilir. Bu, bu örnekteki grafik yapıldı. Sigmoidal eğriler için lojistik işlevleri kullanır Bilgisayar yazılımı EC 50 değerleri eğri uydurma ve hesaplama için kullanılabilir.

Şekil 1,
Şekil 1:. Doku Banyosu şematik Karikatür çift duvara yerleştirilen bir doku halka temsil, su ceketli doku bainci. Tampon giriş ve çıkış odasının tabanına entegre bir 3-yollu vana cam tarafından düzenlenir. O2 / CO2 PSS ya da gaz sızmasını önlemek için bir conta ile sızdırmaz bir havalandırıcı yoluyla köpürtülür. Devridaim girişi uygun devridaim korumak ve sıcaklık düzensizliğinin neden olur hava cepleri oluşumunu önlemek için çıkış altındadır.

Şekil 2,
Şekil 2:. Sıçan Göğüs Aort + Endotel Yukarıdaki dört ayrı deneyler (farklı hayvan ve farklı renklerle temsil edilen farklı set up farklı araştırmacılar tarafından yapılan) PE kaynaklı daralma kaydırmaya prazosin yeteneğini test etmek göstermektedir. Prazosin (5 nM) açık bir şekilde paralel bir şekilde PE kaynaklı kasılma eğrisi sağa doğru kaymıştır.


Şekil 3: Sıçan Toraks Aort + Endotel Grafik yokluğu (araç) PE EC 50 değerlerinin tahmini ve antagonist varlığı (prazosin).. Yeşil hat (C grubu) sadece işaretlenmiş.

Tuz MW (g / mol) 5 Litre SON mM
(Gram)
NaCl 58,45 37.99 130
KCI 74,56 1.75 4.7
KH2PO4 136.1 0,8 1.18
MgSO4• 7H20 246,5 1.45 1.17
NaHCO3 84,21 6.25 14.9
Üzüm şekeri 180,16 5 5.5
EDTA 380 0.05 0.03

Tablo 1: normal fizyolojik tuzlu çözelti (PSS) Tarif Bu deneyde kullanılan bikarbonat tamponlu PSS içeriği.. Bütün tuzlar molekül ağırlıkları ve istenen konsantrasyon elde etmek için dH 2 O 5 L 'sine ilave miktarda bulunuyor.

Banyosunda konsantre Agonist eklenmesi banyosuna yapılan
1 x 10 -9 M 50 ml 1 x 10 -6 M
3 x 10 -9 M 100 mi, 1 x 10-6 M
1 x 10 -8 M 35 mi, 1 x 10 5 M
3 x 10 8 M 100 mi, 1 x 10 -5
1 x 10 7 M 35 mi, 1 x 10 4 M
3 x 10 7 M 100 mi, 1 x 10 4 M
1 x 10 -6 M 35 mi, 1 x 10 3 M
3 x 10 -6 M 100 mi, 1 x 10 3 M
1 x 10 5 M 35 mi, 1 x 10 -2 M
3 x 10 5 M 100 ml 1 x 10 -2 M
1 x 10 4 M 35 mi, 1 x 10 -1 M

Tablo 2:., Doku banyosu katkı agonist konsantrasyonları agonistinin miktarı, ön maddeye, her banyo için eklenecekPerly kümülatif konsantrasyon-tepki eğrilerini oluşturmak. istenen banyo konsantrasyonu agonistinin artan konsantrasyonlarının ardışık miktarlarda ilave edilmesi sureti ile elde edilir. Her bir ek dikkate banyosu içinde zaten mevcut olan agonist konsantrasyon alır. Bu agonistin tek bir konsantrasyonda artan miktarlarda kullanmaktan sonuçlanacak olan, organ banyosunda hacmindeki artışı en aza indirmek için yapılır.

Discussion

Bir araştırma aracı olarak izometrik kuvvet ölçümü 150 yaşında, ama kasılma dokularda 2 reseptör karakterizasyonu için prototip tekniği olmaya devam ediyor. Bu tekniğin güç basitliği ve çok yönlülük olup: bir antagonistin varlığında veya yokluğunda, bir agonist arasında artan konsantrasyonları ile tetiklenen tepkileri kaydederek bir bilgi sayısız her ilacın farmakolojik özellikleri ve reseptör ile ilgili elde edilebildiği o 3-5 bağlar. Bu tür deneyler ayrıca, kullanılan antagonistler rekabetçi olmayan doğaya karşı rekabet ilgili bilgilerin yanı sıra reseptör heterojenliği ve spesifik olmayan ilaç etkileri 6-8 toplamak. Bu nedenle, bu izole edilmiş bir organ banyosu deney basit permütasyon ile, agonist kaynaklı kas büzülmesine neden reseptörlerinin nispeten tam farmakolojik profili elde edilebilir.

Agonizmi açısından, inciBelirli bir doku, bir agonist e nispi etkinlik (Emax) ve güçte (EC50), aynı doku 1 diğer agonistlerin yanıtlarına göre hesaplanır ve edilebilir. Bizim deneyde, sıçan aort araç ya da önceden daralma doku banyosuna α 1 adrenerjik agonisti fenilefrin ilave edilmesi ve üretilmesi için bir saat α 1 adrenerjik reseptör antagonisti, prazosin (5 nM) ya da birlikte inkübe edildi. Modifiye sonuçları 2 sunar Şekil Yeşil tepkiler max olarak işaretlenmiş PE tarafından elde edilen maksimum kasılma ile işaretlenmiş Şekil 1., ½ maksimum kasılma gibi işaretlenir ve daha sonra cevap olduğunu neden olduğu PE konsantrasyonu ile ilişkili. Bu değerler belirlenmesi yarım maksimum (% 50) tepki ya da EC50 değeri elde eden bir agonistinin etkili konsantrasyonu tespitidir.

Ne yazık ki, agonist bağımlı parametre kullanılarakreseptör bağlanma özellikleri 9 karmaşık olabilir belirlemek için tek başına s. Sabit antagonisti ayrışma (pKa B) log 10 mol antagonist -log 10: İdeal olarak, reseptör antagonistleri kullanarak ek deneyler, bir ilacın ve bir reseptörü arasındaki etkileşimin tanımlanması için önemli olan iki önemli parametrelerin hesaplanmasına imkan gerekli konsantrasyonu, konsantrasyon-yanıt eğrisinde iki kat sağa doğru bir kaymaya (pA2) 10 çıkarmak için. K B ve pA 2 kazanç onlar agonist-bağımsız değerlerdir ve hatta farklı dokular 11 arasında sabit kalması aslında onların kullanışlılığı Hem. Başka hesaplanmaktadır 50 değerleri Şekil 2 'de verilerden pKa B, aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir ve EC'ye göre:

= 2 x 10 8 M prazosin yokluğunda EC50
Öncesi AK 50prazosin sence = 7 x 10 -6 M

Aşağıdaki denklemde K B çözün:
log (dr-1) = [B] log - K B log
Nerede:
[B] antagonisti konsantrasyonunu = veya 5 x 10 -9 M log (5 x 10 -9 M) = -8.3
dr = yokluğunda antagonist / EC 50 varlığında AT 50 değer doz oranı. Sağa doğru bir kayma ise, bu değer, birden daha fazla olacaktır. Böylece:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M veya 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
[B] ve dr için yerine:
K B log - = -8 (350-1) log
2.54 = -8 - KB log
pKa B = 10.54

Prazosinin bir α 1 adrenerjik recept ile etkileşime girdiğinde prazosin Bu değer, elde değerlerle tutarlıfenilefrinle daralma aracılık adrenerjik reseptör α 1 adrenerjik reseptör olduğunu düşündüren ya da 12,13,.

Birkaç adım bu deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. Dokular, doku yaşabilirliği kaybını önlemek için ayrıldıktan sonra, PSS kalmalıdır. Herhangi bir izometrik kas hazırlık pasif gerginlik 14,15 karşı maksimum güç üretir optimal uzunluk-gerilim ilişkisi vardır. Bu protokolde tarif edilen deneme için, en iyi pasif gerilim önceden dokuya pasif gerilim 0.5 g kısa bir süre ilave artışlarla saptanmıştır. Doku tonu olmadan başlamalı ve dengeleme için 30 dakika sonra, doku aktif sesi üretilir KCI (80 mM) bir maksimum konsantrasyonu ile meydan. Daha sonra, doku yıkandı ve bazal tonu geri bırakıldı. Başlangıçta 15 dakika sonra pasif geriliminin bir diğer 0.5 gr yerleştirilmiş ve bu işlem, bir plato kadar tekrarlanırAktif gerginlik ek pasif gerilim ile elde edilmiştir. Hazırlık deneylerinde, pasif gerginlik 4 g aort halkalarında maksimal etkin gerilim yaratma amaçlı belirlendi ve böylece gerilim bu toplam miktarı önce dengeleme için çalma üzerine yerleştirilir. Prosedürel, önceden pasif germe uygulaması sıfıra en iyi, ama deney öncesinde herhangi bir zamanda yapılabilir. Deney ya da diseksiyon herhangi bir noktada, dokuları germe Aşırı olumsuz doku canlılığını ve deneysel sonuçlar etkileyecektir. Bu adım, aşırı streç en yüksek olasılığı olduğu gibi, banyoda dokuları yerleştirirken Bu en zorunludur. Sayısı ve süresi yeterli yıkama, yeniden üretilebilir etkileri için gereklidir. İkinci zorluk çok yakında dokular başlangıç ​​gerilim döndü ilk mücadeleden sonra, ya da önce, anormal tepkiler neden olacaktır. Döner antagonistleri / inhibitörleri araştırıldığında ise, dokular inhibi olarak, ilave Agonisti önce yıkanmamalıdırtor konsantrasyonu azalacaktır.

Izole organ banyosu deneyleri için önemli avantaj ve dezavantajları vardır.

Dezavantajları: Dokular kanca halkaları cerrahi olarak çıkarılması veya yerleştirilmesi sırasında hasar farklı derecelerde karşılaşabilirsiniz. Endotel hücre aort halkasının iç astar olduğu bu hücre tabakasına zarar vermemek için, bakım kanca halka yerleşiminde alınmalıdır. Dokular ayrıca, doku banyosu içindeki uygun olduğu zaman belirgin bir biçimde farklı uzunluklara sahip olabilir, ve bu tespit eder; tüm dokular aynıdır. Bu doğrultuda, dokular zaman kontrolleri, her deney için gerekli kontrol olmak gibi o gün boyunca yanıt değişebilir. Bu iyi bir örnek tipik bir 8 saat deney sırasında% 100 kontraktilite maksimum geliştirir kobay trakea olduğunu. Suda zayıf ölçüde çözünür olan ilaçlar PSS çökelebilir. Son olarak, toplu birnd agonist reseptör duyarsızlaştırma oluşursa bir agonist, farklı sonuçlara neden olabilir olan bir ilacın kümülatif olmayan ilaveler; anjiotensin II hızlı Taşiflaksi gösterir böyle bir ilaçtır.

Avantajları: Doku banyo deneylerinin temel avantajlarından biri gerçek zamanlı olmasıdır; o yaşanıyor ve hızla sonuç yapmak ve bir deney sırasında sonraki adımlar, yanı sıra gidermenize planı gibi bir deney görebilirsiniz. Bir deney yapmak için bir gün sürer. Multipl dokular tipik haliyle, bir hayvan, kendi kontrolü olarak görev yapabilir, öyle ki, bir hayvandan elde edilebilir ve bu, bir deney gücü ekler. Ilacın doku nispeten saf karşılığının test edilmesi için, böylece bir diğer faktörlere doku izole edilebilir. Bu tür bir doku banyosu sistemi in vitro deneyler, aynı zamanda bir in vivo deney göre ilacın küçük bir miktarının kullanılmasını sağlar.

Burada tarif edilen temel deneysel tasarım olabiliryaygın olarak ilave parametrelerin kaydedilmesi ya da diğer dış uyaranların giriş sağlamak için değiştirilebilir. Örneğin, elektrot eklenmesi innerve sinir 16,17 elektrik alan uyarımı için izin verir. Termal veya pH sondaları eklenmesiyle, kasılmaları üzerindeki sıcaklık ve pH etkileri de 18,19 ölçülebilir. Benzer bir şekilde, oksijen, kısmen veya hipoksi nedenli etkilerini değerlendirmek için N2 ile tam olarak sübstitüe edilmiş olabilir. Bundan başka, bu video kullanılan izometrik kontraktilite ölçüm aynı temel prensiplerin hücre içi kalsiyum 20 izometrik gerilim gelişim ve değişikliklerin eşlik eden ölçümüne olanak sistemleri geliştirmek için de kullanılabilir. Sistemleri, bu hızla yanıt sırasında bir doku örneği dondurarak bulunduğu için sinyal transdüksiyonu, hali hazırda, incelenen, bir sinyal iletim yolu sisteminin aktivitesi biyokimyasal kontrol edilebilir, öyle ki.

eşdeğeri varyasyonBunu yapmak için de kullanılabilir ipment çok büyüktür. Bütün bu sistem, inşa veya otomatik iki el, birden fazla farklı şirketlerden satın alınabilir. Bu protokolde kullanılan doku banyoları ve doku sahipleri in-house Michigan State Üniversitesi Makine mağazaları tarafından el üfleme (doku banyoları) ve el inşa (sahipleri) idi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LabChart Software ADInstruments 7.2
PowerLab (4 channel)  ADInstruments ML760
QuadBridge (4 channel) ADInstruments ML112 ML112
Grass Adapter Cable ADInstruments MLAC11 MLAC11
Grass Force-displacement Transducer Grass Instrument Co FT03 FT03
Grass Transducer Cable Grass Instrument Co TAC-7 REV-1
BNC to BNC Cable ADInstruments MLAC01
IsoTemp 2100 Fisher Scientific IC-2100
Tissue Bath Multiple Sources 
Physiological Salt Solution PSS
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Ring Stand Humboldt MFG Co H-2122 7
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Tygon Tubing VWR Scientific 63010-100 R-3603
Hose Clamps Cole-Parmer Instrument Co 06832-08 SNP-8
50 ml Muscle Bath Eberhartglass Blowing Custom
250 ml Warming Chambers Eberhartglass Blowing Custom
Gas Dispersion Tube Ace Glass 7202-06 7202-02
Micrometer
Custom Stands
Three-prong Clamps VWR International Talon
S-connector VWR International Talon
Tissue Hooks Hand Made in House Custom
Tissue Dissection
Leica Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source Fisher Scientific 12562-36 12562-36
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Sylgard Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150 160-150
Splinter & Fixation Forceps George Tiemann & Co 160-55 160-55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
  2. Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
  3. Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
  4. Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
  5. Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
  6. Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
  7. Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
  8. Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
  9. Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).
  10. Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
  11. Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120, (4), 29-46 (1997).
  12. Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
  13. Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
  14. Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
  15. Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
  16. Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
  17. Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
  18. Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
  19. Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
  20. Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics