Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jespersen, B., Tykocki, N. R., Watts, S. W., Cobbett, P. J. Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (95), e52324, doi:10.3791/52324 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

De discipline van de farmacologie heeft het geïsoleerde weefsel bad systeem dat wordt gebruikt voor meer dan 150 jaar. De veelzijdigheid van het systeem toegestaan ​​wetenschappers over de hele wereld receptoren en receptor signaaltransductie karakteriseren, met deze kennis die de basis van therapieën die behandeld miljoenen individuen met ziektes of aandoeningen zoals hoge bloeddruk, hartfalen, diabetes, gastro-intestinale ziekte, blaas disfunctie, astma en slikproblemen, om maar een paar. Tot op de dag, de geïsoleerde weefsel bad blijft een belangrijk facet van de ontwikkeling van geneesmiddelen en fundamenteel onderzoek, omdat het laat het weefsel om te functioneren als een tissue. In deze Jupiter les, wordt een formele protocol gedeeld met een visuele en virtuele experiment gebruik te maken van de gegevens uit een geïsoleerde weefsel bad experiment dat isometrische contractie meet, die receptor karakterisering toelaat te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het weefsel levend hetnd functioneert als geheel weefsel, met een fysiologisch resultaat (contractie of relaxatie) die waaraan het lichaam is. Het is een synthese van stappen (geneesmiddel-receptor interactie, signaaltransductie, tweede boodschapper generatie verandering in gladde spier prikkelbaarheid en veranderingen in weefsel functie). Terwijl andere technieken laten bestuderen elke van deze stappen (bijvoorbeeld radioactieve ligand voor drug affiniteit meting van tweede boodschappers), de geïsoleerde weefselbad techniek maakt integratie van al deze stappen 1. Een ander voordeel is dat met behoud weefsel functie kan berekenen belangrijke farmacologische variabelen die meer betekenis in een weefsel versus een cellulaire omgeving; het dichter bij hoe de onderzochte geneesmiddelen in het lichaam zou werken als een geheel.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures beschreven in dit document worden uitgevoerd op basis van door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Michigan State University richtlijnen.

1. Systeem Voorbereiding en Setup

  1. Voeg 5 L van een fysiologische zoutoplossing (PSS), dat is de hoeveelheid die nodig is voor een weefselbad samentrekking experiment up gebruikt om 50 ml weefselbaden; zie tabel 2 voor PSS recept. Bereken de totale vereiste volume van het aantal weefselbaden keer te vermenigvuldigen badvolume en vervolgens vermenigvuldigen met het aantal gewenste weefsel wasbeurten.
    1. Gebruik tabel 2 als een gids voor het maken van PSS. Los het zout ongeveer 4 liter water. OPMERKING: HPLC - Type I water wordt aanbevolen
    2. Voeg 8 ml 1 M CaCl2-oplossing (147 g / l bij gebruik van het dihydraat zout) aan de oplossing, zodat het einde oplossing 1,6 mM calcium.
    3. Quantum sufficit PSS oplossing 5 L.
    4. Verwarm het weefselbad systeem tot 37 ° C door te draaien aan het recirculerende verwarmde waterbad. Kritische stap: Elke component van het systeem watermantel, opdat zij die serieel met elkaar. De stromingsrichting is kritisch - waarborgen dat water stroomt in elke component aan scherpe weerhaken verbinding en op het hoogste weerhaken verbinding.
    5. Schakel data-acquisitie systeem. Macht op de krachtopnemers ten minste 15 minuten voor het experiment om de temperatuur in evenwicht.
      OPMERKING: De meeste krachtopnemers in dienst rekstroken die gevoelig zijn voor schommelingen in temperatuur zijn en vertonen thermische drift aanvankelijk na de voeding wordt ingeschakeld.
    6. Start data acquisitie software en zorgen kader gegevensverzamelsysteem. Volg de fabricage instructies voor het inschakelen van gegevensregistratie.
    7. Zorg ervoor dat de krachtopnemers worden gekalibreerd voordat het weefsel wordt geplaatst in het weefsel bad en voordat de gegevens opname is gestart; follow instructies van de fabrikant voor kalibratie.
    8. Sluit het weefsel bad systeem om een 95% O 2/5% CO 2 medische kwaliteit gasfles en gaslekken en vervolgens het systeem onder druk.
    9. Vul het weefsel bad reservoirs met PSS en laat de oplossing tijd om de optimale temperatuur te bereiken. Prime het systeem en verwijder eventuele luchtbellen in het systeem en slangen.
    10. Controleer weefsel bad beluchters om consistente oplossing beluchting, waarbij de PSS buffer van zuurstof en biedt Brownse beweging om geneesmiddelen die in het weefsel bad zal worden ingevoerd tijdens het experiment te verspreiden waarborgen. Zorg ervoor dat de beluchting / bellen veroorzaakt geen weefsel beweging, die data opnames zal verstoren; verlagen gasstroom nodig.
      OPMERKING: Het weefsel bad en data-acquisitie systeem zijn nu klaar om het experiment te starten.

    2. Tissue Voorbereiding

    1. Idealiter ontleden weefsel van het dier onmiddellijk vóór gebruik en is rechtstreeks plaats into PSS.
      OPMERKING: Sommige weefsels kunnen worden opgeslagen in de PSS overnacht bij 4 ° C, maar passende controles moeten worden uitgevoerd om weefsel functie na langdurige opslag te valideren; zie hoofdstuk 6.
    2. Gebruik de thoracale aorta als het weefsel in deze oefening.
    3. Verdoven van de rat in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en plaats de rat dorsale zijde naar beneden. Bevestig verdoving via een teen-snuifje en het verlies van de reflex reactie op deze pijnlijke stimulus.
      Opmerking: In dit protocol wordt 70 mg / kg pentobarbital geleverd via een intraperitoneale injectie. Institutionele richtlijnen voor knaagdieren anesthesie kunnen verschillen.
    4. Een pneumothorax Door een incisie met een schaar langs de membraan aan de onderkant van de ribbenkast. Vervolgens blijven de incisie van de onderkant van de ribbenkast naar het borstbeen en halveren.
    5. Ontleden weg of plaats opzij die organen die op de top van de wervelkolom en zoek de aorta, die direct langs de wervelkolom ligt.
      OPMERKING: Deze sTEP zorgt voor een duidelijke werkruimte te ontleden uit de aorta.
    6. Sever alle aansluitingen aan de aorta; van de slokdarm, long, etc. en snijd de aorta loodrecht op de ruggengraat ter hoogte van het membraan.
    7. Zachtjes houd de aorta met een pincet en gebruik een schaar om de aorta ontleden van de wervelkolom. Start de dissectie in het onderste membraan gebied grenzend aan de wervelkolom en werken in de richting van het hart. Zorg ervoor dat u extra voorzorgsmaatregelen om niet trekken of sleepboot te nemen over de aorta weefsel, dat het weefsel kunnen beschadigen.
    8. Plaats onmiddellijk de aorta in de voorbereide dissectie schotel met PSS.
      OPMERKING: Dissectie van de aorta in ringen gebeurt best in een dissectie gerecht dat een zwarte silastische stichting heeft. Dit maakt het gebruik van draden die kunnen gebruikt worden om de aorta canule en worden bevestigd aan de schotel, die stabiliteit terwijl de dissectie schotel. De zwarte achtergrond geeft contrast dat dissectie helpt. Zorg moeten worden genomen bij het gebruik van cannulating draden als de endothelial cellaag kunnen worden verwijderd met overmaat wrijven van de draad tegen het lumen van het vat.
    9. Neem een ​​draad en een kleine hoek van 90 ° aan de ene kant en duw het schuine uiteinde in de silastische stichting om de voerdraad te verankeren. Plaats het gehele aorta in de dissectie schotel.
    10. Houd het uiteinde van de geleidedraad met een pincet en dan zachtjes draad de draad in het lumen van de aorta.
    11. Gebruik een tang en schuif de aorta op de draad. Bij het vrije uiteinde van de geleidingsdraad is zichtbaar, curve de draad voorzichtig en plaats het vrije uiteinde in de silastic basis van de schotel naar het weefsel te stabiliseren.
    12. Met behulp van kleine Vannas schaar en pincet, verwijder de perivasculair vetweefsel en alle andere vreemde weefsel, bloedstolsels, enz. Tot de thoracale aorta lijkt wit en enigszins vezelig.
    13. Verwijder de gereinigde aorta van draad en met een schaar om de aorta ringen die ongeveer 3-5 mm breed gesneden.
    14. Een aorta-ring op één van een paar tissue haken door het vasthouden van de haak en met behulp van een tang om schuif de ring op de haak. Herhaal dit proces met de tweede haak. Let erop de haken niet verward; zie figuur 3.
    15. Controleer dat elke haak heeft een andere zijden hechtdraad bevestigd. Controleer dat één haak een kleine geknoopte lus van zijde die zorgt voor bevestiging aan een glas of roestvrij stalen staaf, terwijl de andere is een 04/10 cm lang stuk hechtdraad die hand gebonden aan de krachtopnemer zijn; zie figuur 3.
      Opmerking: Als de aorta is bevestigd aan de haken, het weefsel gereed in het weefselbad te monteren; zie figuur 3.
    16. Herhaal de stappen 2,14-2,15, om een ​​tweede aorta ring monteren in de tweede weefsel bad kamer.

    3. Tissue Plaatsing in Bath

    1. Merk op dat in dit systeem de weefselbaden zelf stationair. Op dit moment, vult het weefsel baden met warm, cellenbeton PSS en laat de oplossing te komen om temperature.
    2. Met de zijden hechtdraad, das een van de haken op het weefsel voorbereiding op de pen op het roestvast stalen staaf. Plaats dit uiteinde in het weefsel bad kamer. Sluit de stang om een ​​ring stand en plaats het andere uiteinde in de kleuring schotel gevuld met PSS om weefsel ondergedompeld in buffer te houden; zie figuur 3.
      1. Plaats de staaf en weefsel in het weefsel bad kamer en zorg ervoor dat het weefsel wordt volledig ondergedompeld in PSS en de stang is veilig; zie figuur 3.
      2. Bind de andere hechtdraad aan de krachtopnemer en zorg ervoor om speling in de hechting tussen het weefsel en de krachtopnemer.
        LET OP: Deze speling wordt verwijderd door het aanpassen van de micrometer; zie figuur 3.
    3. Herhaal deze stappen voor de tweede aorta ring en weefsel bad kamer.

    4. Instellen Passief Tension

    OPMERKING: Elk weefsel heeft een lengte (Lo) waarop gladde spiercellen reageren optimally. Voorlopige experimenten de optimale strekspanning die bereikt deze lengte voor elk weefseltype verplicht zodat onderzocht bepalen. De rat thoracale aorta heeft een optimale passieve strekspanning van 4 g.

    1. Gebruik de micrometer / tandheugel om de spanning te verhogen tot 2 g en wacht tot het weefsel naar een plateau te bereiken. Zodra plateau is bereikt, verhogen de spanning nog 2 g en wacht tot het weefsel naar een plateau.
      Opmerking: In de aorta ringen na de aanvankelijke spanning van 2 g werd ingesteld en plateau bereikt, het weefsel moet vervolgens ontspannen tot ~ 1,6 g. Een tweede toepassing van 2 g weefsel zou brengen ~ 3,6 g, waarvan het weefsel weer ontspannen en spanning afnemen. Dus na 4 g totale spanning te hebben toegevoegd, de software moet ongeveer 3,2 g van spanning geven.
    2. Herhaal deze stappen voor de tweede aorta ring en weefsel bad kamer.

    5. Equilibratie and Drug Maken

    1. Equilibreer het weefsel voor60 min na het aanbrengen passieve spanning op het weefsel.
    2. Tijdens de evenwichtsfase, was het weefsel elke 15-20 min. Giet de weefsels bad en vervang de PSS met PSS uit een verwarmd reservoir.
      OPMERKING: Gedurende deze tijd, wordt het weefsel ontspannen, hetgeen wordt aangegeven door het verlies van passieve spanning.
    3. Gedurende deze tijd bereiden geneesmiddelen voor de proef, die moeten ten minste 1000 maal meer geconcentreerd dan de werkelijke concentratie in het bad te zijn, zodat slechts een kleine hoeveelheid van het geneesmiddel voorraad nodig is om de gewenste concentratie te bereiken.

    6. Eerste Challenge

    1. Aan het einde van de evenwichtsperiode, was het weefsel een laatste keer, opslaan en opnieuw nul alle ingangen.
    2. Pick een agonist (verbinding die actieve contractie veroorzaakt) waarop het weefsel reageert.
      Opmerking: In de ratten thoracale aorta, de arteriële gladde spier actief samentrekken om een ​​alfa-adrenerge receptor agonist door de innervatie van deweefsel door het sympathische zenuwstelsel. Een adrenerge agonist zou niet nuttig zijn in darmweefsel te zijn gezien het feit dat adrenerge agonisten veroorzaken ontspanning. In dit geval wordt een receptor agonist zoals acetylcholine (cholinerge receptor) worden gebruikt. Een alternatief voor Fenylefrine en acetylcholine is een niet-receptor-agonist zoals hoge kalium (K) als de eerste uitdaging. In de gladde spieren, hoge K werkt om indirect geopend calciumkanalen en dus wordt gezien als een algemene index van de gladde spieren integriteit.
      1. Voer de eerste uitdaging of de wake-up challenge door het toevoegen van 10 -5 M fenylefrine aan het weefsel bad. Om deze concentratie in 50 ml weefselbad bereiken, voeg 50 ul van een 10 -2 M fenylefrine oplossing.
        OPMERKING: 50 pi in 50 ml PSS is een 1/1000 verdunning, zodat de uiteindelijke concentratie 1000x dan beelden, of 10 -5 M. Kennis van volume en consistente handhaving van het volume binnen het weefselbad chamber is van cruciaal belang voor het bepalen van de uiteindelijke concentratie van het geneesmiddel.
    3. Voeg 10 -5 M fenylefrine aan het weefselbad en laat de contractie piek en plateau, wanneer de helling van nul wordt. Zorg ervoor dat elke experimentele evenement aan post-experimentele analyse te helpen vast te leggen.
    4. Na het plateau, was de agonist grondig door het legen en opnieuw vullen van de weefsel bad kamer met nieuwe PSS. Zorg ervoor dat deze gebeurtenissen vast te leggen ook.
      OPMERKING: Een vuistregel is dat de concentratie van agonist in het bad wordt verminderd 10 maal met elke wasbeurt. Hoewel, kan meer dan 3-4 wassingen nodig zijn om het weefsel terug naar het evenwicht basislijn signaal (spanning) brengen.
    5. Laten we voor ~ 10 min voordat u verder gaat de rest weefsel bij baseline toon.

    7. Experiment

    OPMERKING: Prazosin, een alfa adrenergische receptor antagonist, worden ingevoerd om het weefselbad kamer naar de concentratie resp verschuivenonse bocht naar fenylefrine (PE); dit is een aantoonbaar antagonisme.

    1. Om één bad, voeg het voertuig (H 2 O) waarin prazosine werd ontbonden. Naar de andere, voeg de juiste concentratie van prazosine. In dit geval, voeg 25 ul voertuig een bad en 25 ui 10 -5 M concentratie van prazosine voor de andere een 5 x 10 -9 M of 5 nM concentratie in het bad bereiken.
      OPMERKING: Terwijl de toevoeging van het voertuig lijkt overbodig in dit voorbeeld, is het noodzakelijk om dit te doen wanneer andere voertuigen die potentieel vasoactieve zijn (bijvoorbeeld DMSO, ethanol, acetaat) hebben. Voeg de bijbehorende voertuig, zelfs als weinig bewijs bestaat voor het aan vasoactieve zijn.
    2. Verlaat het voertuig / prazosine in de baden en hoeft het weefsel niet wassen gedurende 1 uur.
      1. Terwijl weefsels equilibreren, bereiden meerdere concentraties van agonist (PE). Omvatten een breed bereik van concentraties van concentraties waarbij nog geen respons (bv </ Em> 10 -9 M PE) aan concentraties die de maximale respons (overtreffen bijvoorbeeld 10 -4 M PE). Aangezien de concentratie-respons curves zijn logaritmisch van aard, maken zes afzonderlijke voorraad oplossingen van PE (10 -6 -10 -1 M) via de seriële verdunningen van de 10 -1 M stockoplossing. Zorg ervoor dat het benodigde volume voor elke concentratie is iets groter dan driemaal het totale benodigde volume voor alle baden (dwz> 300 ul).
    3. Ga verder toevoegen van agonist, zoals beschreven in tabel 1.
      LET OP: Dit experiment zal een cumulatieve concentratie respons curve naar PE genereren; elke iteratie houdt rekening met de hoeveelheid stof reeds toegevoegd aan het bad. Toevoegingen gebeuren totdat ze niet meer te verhogen contractie, of de hele curve heeft plateaued.
      1. Voeg elke geneesmiddelconcentratie afzonderlijk totdat het weefsel is bereikt.
      2. Als er geen verandering optreedt, voeg de volgende concentratie in hetserie; zie tabel 2.
        OPMERKING: De timing van deze toevoegingen is afhankelijk van de agonist. Bijvoorbeeld, noradrenaline en fenylefrine samentrekking ontwikkelt zich snel, en moet plateau binnen enkele minuten. Daarentegen endotheline-1 contractie ontwikkelt zich langzaam en kunnen niet plateau voor bijna 45 min. Andere experimenten kan op het weefsel na de bouw van een kromme zoals deze, mits (1) de stof uitwasbaar; en (2) kan worden aangetoond dat het weefsel weer normaal contractiele gedrag en wordt niet beïnvloed door de vorige stimulatie.

    8. Data Analyse

    1. Zorg ervoor om gegevens op te slaan onmiddellijk voorafgaand aan en na een interventie (bijv wakker of volledige curve).
    2. Vinden en stel het weefsel basislijn voor elk weefsel bad kamer / input kanaal, dat zal helpen bij data-analyse.
    3. Zodra de basislijn is ingesteld, vindt de maximale respons voor elke concentratie, en noteer de change van de uitgangswaarde. Achtereenvolgens door elk van de concentraties en noteer de basislijn.
    4. Grafiek van de resulterende gegevens. Doe dit in een grafische programma.
      OPMERKING: Graph Pad Prism is ontworpen voor farmacologen en is ideaal voor type experiment hier gepresenteerd.

Representative Results

Qua agonisme, kunnen de relatieve werkzaamheid (Emax) en sterkte (EC50) van een agonist in een bepaald weefsel wordt berekend en vergeleken met reacties van andere agonisten in hetzelfde weefsel 1. In het experiment werd de rat thoracale aorta geïncubeerd met ofwel drager of α 1 adrenergische receptor antagonist prazosine (5 nM) gedurende één uur voorafgaand aan het toevoegen van de α 1-adrenerge agonist fenylefrine aan het weefselbad en genereren contractie (figuur 1).

Figuur 2 presenteert gewijzigd resultaten van figuur 1. De groene reacties zijn gemarkeerd de maximale krimp gerealiseerd door PE gemarkeerd als maximum, de ½ maximale contractie als zodanig gemarkeerd en vervolgens gekoppeld aan de PE-concentratie die ervoor zorgde dat de respons. Het identificeren van deze waarden is het identificeren van de effectieve concentratie van een agonist die een half maximaal (50%) respons of EC behaalt EC50 waarden.

In genereren en interpreteren van deze resultaten is het belangrijk om zowel lage en hoge concentraties gebruik van agonist tot de concentratie-respons curve. Zonder voldoende punten om een stabiele basislijn en maximale plateau vertonen, kunnen EC50 en Emax alleen worden geschat. Dit werd grafisch gedaan in dit voorbeeld. Software die logistieke functies gebruikt voor sigmoïdale curves kunnen worden gebruikt voor curve fitting en berekening van EC50 waarden.

Figuur 1
Figuur 1:. Tissue Bad Schematische Cartoon vertegenwoordigt een ring van weefsel geplaatst in de dubbele wand, watermantel weefsel bath. Buffer in- en uitstroom worden gereguleerd door een 3-way glas kraan geïntegreerd in de basis van de kamer. O 2 / CO 2 wordt in geborreld door een beluchter die wordt afgesloten met een pakking om lekkage van PSS of gas te voorkomen. Recirculatie ingang beneden de uitgang juiste recirculatie handhaven en de vorming van luchtzakken die temperatuur ontregeling zou leiden, te voorkomen.

Figuur 2
Figuur 2:. Rat thoraxaorta + Endotheel Bovenstaande figuur toont vier afzonderlijke experimenten (verschillende dieren en uitgevoerd door verschillende onderzoekers op verschillende opstellingen zoals voorgesteld door verschillende kleuren) het vermogen van prazosine om een PE-geïnduceerde contractie verschuiven testen. Prazosine (5 nM) duidelijk verschoven-PE-geïnduceerde contractie bocht naar rechts in een parallelle wijze.


Figuur 3: Rat thoraxaorta + Endotheel Grafische schatting van EC50 waarden voor PE zonder (voertuig) en aanwezigheid (prazosine) antagonist.. Groene lijn (groep C) alleen is gemarkeerd.

Zout MW (g / mol) 5 liter FINAL mM
(Gram)
NaCl 58.45 37.99 130
KCl 74,56 1.75 4.7
KH2PO4 136,1 0.8 1.18
MgSO4• 7H20 246,5 1.45 1.17
NaHCO3 84.21 6.25 14.9
Dextrose 180,16 5 5.5
EDTA 380 0.05 0.03

Tabel 1: normale fysiologische zoutoplossing (PSS) Recept inhoud van het bicarbonaat gebufferde PSS gebruikt in dit experiment.. Inbegrepen zijn de molecuulgewichten van alle zouten en toegevoegd aan 5 L dH 2 O tot de gewenste concentratie te bereiken bedrag.

Concentratie in bad Toevoeging van agonist aan bath
1 x 10 -9 M 50 ml 1 x 10 -6 M
3 x 10 -9 M 100 ml 1 x 10-6 M
1 x 10 -8 M 35 ml 1 x 10 -5 M
3 x 10 -8 M 100 ml 1 x 10 -5
1 x 10 -7 M 35 ml 1 x 10 -4 M
3 x 10 -7 M 100 ml 1 x 10 -4 M
1 x 10 -6 M 35 ml 1 x 10 -3 M
3 x 10 -6 M 100 ml 1 x 10 -3 M
1 x 10 -5 M 35 ml 1 x 10 -2 M
3 x 10 -5 M 100 ml 1 x 10 -2 M
1 x 10 -4 M 35 ml 1 x 10 -1 M

Tabel 2:. Tissue badadditief Agonist Concentraties De hoeveelheid agonist te zijn om elk bad toegevoegd proPerly construeren cumulatieve concentratie-respons curves. De gewenste badconcentratie wordt bereikt door toevoeging van opeenvolgende hoeveelheden van toenemende concentraties van agonist. Elke toevoeging houdt rekening met de concentratie van agonist reeds in het bad. Dit wordt gedaan om de volumetoename van het weefselbad die zouden voortvloeien uit de steeds grotere volumes van een enkele concentratie van agonist minimaliseren.

Discussion

Meting van de isometrische kracht als een onderzoeksinstrument is meer dan 150 jaar oud, maar het blijft de prototypische techniek voor receptor karakterisering in contractiele weefsels 2 zijn. De kracht van deze techniek is zijn eenvoud en veelzijdigheid van opname respons uitgelokt door toenemende concentraties van een agonist in de aanwezigheid of afwezigheid van een antagonist kan een waaier aan informatie worden afgeleid omtrent de farmacologische eigenschappen van elk geneesmiddel en de receptor waaraan het bindt 3-5. Experimenten van deze informatie over de competitieve versus niet-concurrerende aard van de gebruikte antagonisten, evenals heterogeniteit receptor en niet-specifieke effecten van geneesmiddelen 08/06 Garner ook. Aldus, met eenvoudige permutaties deze geïsoleerde weefselbad experiment, een relatief volledige farmacologische profiel van de receptoren die agonist geïnduceerde spiercontractie bemiddelen kan worden gegenereerd.

In termen van agonisme, the relatieve werkzaamheid (Emax) en sterkte (EC50) van een agonist in een bepaald weefsel kan worden berekend en vergeleken met reacties van andere agonisten in hetzelfde weefsel 1. In het experiment werd de rat thoracale aorta geïncubeerd met ofwel drager of α 1 adrenergische receptor antagonist prazosine (5 nM) gedurende één uur voorafgaand aan het toevoegen van de α 1-adrenerge agonist fenylefrine aan het weefselbad en genereren contractie. Figuur 2 stelt gemodificeerde resultaten van Figuur 1. De groene reacties gemarkeerd met de maximale contractie bereikt PE gemarkeerd als maximum, de halve maximale contractie gemerkt en vervolgens verbonden aan de PE-concentratie die veroorzaakte dat reactie. Het identificeren van deze waarden is het identificeren van de effectieve concentratie van een agonist die een half maximaal (50%) respons of EC 50 waarde bereikt.

Helaas, met agonist-afhankelijke parameters alleen bepalen receptor bindingseigenschappen kan ingewikkeld 9. Idealiter aanvullende experimenten met receptorantagonisten kan de berekening van twee belangrijke parameters die bepalend zijn voor het definiëren van de wisselwerking tussen een geneesmiddel en een receptor zijn: -log 10 van de antagonist dissociatieconstante (pK B) en de -log 10 van de molaire antagonist concentratie noodzakelijk tweevoudige verschuiving naar rechts in de concentratie-respons curve (pA 2) 10 wekken. Zowel K B en pA2 krijgen hun bruikbaarheid het feit dat zij agonist-onafhankelijke waarden, en constant blijft zelfs tussen verschillende weefsels 11. Uit de gegevens in figuur 2, kan pK B wordt berekend met de volgende vergelijking en op basis van EC50 waarden elders berekend:

EC50 bij afwezigheid van prazosine = 2 x 10 -8 M
EC50 in de presence van prazosine = 7 x 10 -6 M

Los K B in de volgende vergelijking:
inloggen (dr-1) = log [B] - log K B
Waar:
[B] = antagonist concentratie, of 5 x 10 -9 M. inloggen (5 x 10 -9 M) = -8,3
dr = dosisverhouding van EC 50 -waarde in aanwezigheid van antagonist / EG 50 in afwezigheid. Als er een verschuiving naar rechts, zal deze waarde groter dan één zijn. Dus:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M of 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Vervanging van [B] en dr:
inloggen (350-1) = -8 - log K B
2,54 = -8 - log KB
pK B = 10.54

Deze waarde voor prazosine is consistent met de waarden verkregen bij prazosine interageert met een α 1 adrenerge receptof 12,13, wat suggereert dat de adrenerge receptor die contractie fenylefrine de α 1-adrenerge receptor.

Verschillende stappen zijn cruciaal voor het succes van deze experimenten. Weefsels moet in PSS blijven na dissectie om het verlies van levensvatbaarheid van het weefsel te voorkomen. Elke isometrische spier voorbereiding heeft een optimale lengte-spanning relatie die maximale kracht genereert tegen passief spanning 14,15. Voor de in dit protocol beschreven experiment werd een optimale passieve spanning eerder bepaald door het kort toe te voegen stappen van 0,5 g passieve spanning aan het weefsel. Het weefsel moet beginnen zonder toon en vervolgens na 30 minuten equilibratie, het weefsel werd uitgedaagd met een maximale concentratie van KCl (80 mM), die actief toon gegenereerd. Vervolgens werd het weefsel gewassen en gewacht totdat uitgangswaarde toon. Na 15 min bij aanvang werd nog 0,5 g passieve spanning gebracht en dit proces herhaald totdat een plateau vanactieve spanning werd bereikt met extra passieve spanning. In voorlopige experimenten, 4 g totaal passieve spanning was vastbesloten om maximale actieve spanning generatie te bereiken in de aorta ringen, en dus dit totale bedrag van de spanning op de ringen is geplaatst voorafgaand aan het in evenwicht brengen. Procedureel, is het best om vooraf passieve spanning toepassing nul, maar kan worden gedaan op elk moment vóór het experiment. Over-stretching weefsels, op elk punt in het experiment of dissectie, een negatieve invloed weefsel levensvatbaarheid en experimentele resultaten. Dit is vooral noodzakelijk bij het plaatsen van weefsels in het bad, aangezien deze stap de hoogste waarschijnlijkheid van overmatige rek. Adequate wassen, het aantal en de duur vereist om reproduceerbare effecten. Een tweede uitdaging te snel na een eerste uitdaging, of voordat weefsels zijn teruggekeerd naar de uitgangswaarde spanning, zal resulteren in afwijkende reacties. Als bestuderen reversibele antagonisten / remmers, weefsels moeten niet vóór gewassen toevoeging agonist, als inhibitor concentratie wordt verlaagd.

Er zijn opmerkelijke voordelen en nadelen aan het geïsoleerde weefselbad assays.

Nadelen: Weefsels kunnen verschillende graden van schade ondervinden tijdens chirurgische verwijdering of plaatsing van ringen op haken. Aangezien de endotheelcel is de binnenvoering van de aorta ring, moet erop worden gelet op de positie van de ring aan haken om niet deze cellaag beschadigd. Weefsels kan ook duidelijk verschillende lengtes van de tijd waarin ze levensvatbaar zijn in het weefsel bad, en dit moet worden vastgesteld; niet alle weefsels hetzelfde. Langs deze lijnen, kunnen weefsels veranderen hun respons gedurende de dag zodat de bedieningselementen geworden nodige controle voor elk experiment. Een goed voorbeeld hiervan is de caviatrachea dat verbetert in contractiliteit maximaal 100% gedurende een typische 8 uur experiment. Geneesmiddelen die slecht oplosbaar zijn in water mogen neerslaan in de PSS. Tot slot, een cumulatievend niet-cumulatieve toevoegingen van een medicijn dat een agonist kan leiden tot verschillende resultaten als receptor desensitisatie de agonist plaatsvindt; Angiotensine II is een dergelijk geneesmiddel waarvan snel tachyfylaxie blijkt.

Voordelen: Een van de belangrijkste voordelen van weefselbad experimenten is dat het real time; men kan het experiment te zien zoals het zich ontvouwt en kan snel conclusies trekken en plan volgende stappen, evenals het oplossen van problemen tijdens een experiment. Een experiment duurt een dag te doen. Meerdere weefsels kunnen kenmerkend worden bereid uit een dier, dat een dier kan fungeren als zijn eigen controle en die leidt kracht om een ​​experiment. Men kan ook het weefsel te isoleren van andere factoren zodat een relatief zuivere reactie van het weefsel om de drug te testen. In vitro experimenten, zoals het weefselbad systeem gebruik van een kleine hoeveelheid geneesmiddel en een in vivo proef stelt.

De basis proefopzet hierin beschreven kan wordeningrijpend gewijzigd om te zorgen voor de opname van extra parameters of de introductie van andere externe prikkels. Bijvoorbeeld, toevoeging van elektroden mogelijk maken elektrisch veld stimulatie van zenuwen innerveren 16,17. Met de toevoeging van thermische of pH-sondes, kunnen de effecten van temperatuur en pH op de contractiele responsen worden gemeten 18,19. Op dezelfde manier kan zuurstof geheel of gedeeltelijk met N2 tot hypoxie geïnduceerde effecten te evalueren worden vervangen. Bovendien kan dezelfde basisprincipes van isometrische contractie metingen in deze video worden gebruikt voor systemen die gelijktijdige meting van isometrische spanning ontwikkeling en veranderingen in intracellulaire calcium 20 laten ontwikkelen. Signaaltransductie ook gemakkelijk bestudeerd, omdat systemen bestaan ​​die een weefselmonster snel tijdens een reactie te bevriezen, zodat de activiteit van een signaaltransductieroute biochemisch systeem kan worden gecontroleerd.

De variatie van apipment die kan worden gebruikt om dit te doen is enorm. Dit hele systeem, hetzij met de hand of geautomatiseerd gebouwd kunnen worden aangekocht van meerdere verschillende bedrijven. Het weefsel baden en houders weefsel gebruikt in dit protocol werden met de hand geblazen (weefsel baden) en met de hand vervaardigd (houders) door een in-house Michigan State University machine winkels.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LabChart Software ADInstruments 7.2
PowerLab (4 channel)  ADInstruments ML760
QuadBridge (4 channel) ADInstruments ML112 ML112
Grass Adapter Cable ADInstruments MLAC11 MLAC11
Grass Force-displacement Transducer Grass Instrument Co FT03 FT03
Grass Transducer Cable Grass Instrument Co TAC-7 REV-1
BNC to BNC Cable ADInstruments MLAC01
IsoTemp 2100 Fisher Scientific IC-2100
Tissue Bath Multiple Sources 
Physiological Salt Solution PSS
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Ring Stand Humboldt MFG Co H-2122 7
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Tygon Tubing VWR Scientific 63010-100 R-3603
Hose Clamps Cole-Parmer Instrument Co 06832-08 SNP-8
50 ml Muscle Bath Eberhartglass Blowing Custom
250 ml Warming Chambers Eberhartglass Blowing Custom
Gas Dispersion Tube Ace Glass 7202-06 7202-02
Micrometer
Custom Stands
Three-prong Clamps VWR International Talon
S-connector VWR International Talon
Tissue Hooks Hand Made in House Custom
Tissue Dissection
Leica Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source Fisher Scientific 12562-36 12562-36
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Sylgard Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150 160-150
Splinter & Fixation Forceps George Tiemann & Co 160-55 160-55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
  2. Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
  3. Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
  4. Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
  5. Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
  6. Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
  7. Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
  8. Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
  9. Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).
  10. Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
  11. Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120, (4), 29-46 (1997).
  12. Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
  13. Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
  14. Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
  15. Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
  16. Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
  17. Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
  18. Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
  19. Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
  20. Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics