Misura di Smooth funzione muscolare nei isolato carta igienica-applicazioni Farmacologia Research

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Jespersen, B., Tykocki, N. R., Watts, S. W., Cobbett, P. J. Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (95), e52324, doi:10.3791/52324 (2015).

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Abstract

Introduction

La disciplina di farmacologia ha utilizzato il sistema isolato bagno tessuto per oltre 150 anni. La versatilità di questo sistema ha permesso agli scienziati di tutto il mondo per caratterizzare recettori e del segnale del recettore trasduzione, con questa conoscenza che costituisce la base di terapie che hanno curato milioni di persone con malattie o disturbi come l'ipertensione, insufficienza cardiaca, diabete, malattie gastrointestinali, della vescica disfunzione, asma e disturbi della deglutizione, per citarne solo alcuni. A tutt'oggi, la vasca tessuto isolato rimane un aspetto importante di sviluppo di farmaci e la ricerca di base, in quanto consente il tessuto di funzionare come un tessuto. In questa lezione Giove, un protocollo formale è condivisa a dimostrare un esperimento visivo e virtuale utilizzando i dati di un esperimento isolato carta igienica che misura contrazione isometrica, che permette la caratterizzazione del recettore.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto vive unnd funzioni nel suo complesso tessuto, con esito fisiologica (contrazione o rilassamento) che è rilevante per il corpo. Si tratta di una sintesi di passi (interazione farmaco-recettore, trasduzione del segnale, di seconda generazione messenger, il cambiamento in eccitabilità del muscolo liscio, e modificare in funzione del tessuto). Mentre altre tecniche permettono lo studio di ciascuno di questi passaggi (es radiolegante vincolante per affinità farmaco, la misurazione di secondi messaggeri), isolato tecnica vasca tessuto consente l'integrazione di tutti questi passaggi 1. Un altro vantaggio è che il mantenimento funzione del tessuto consente il calcolo di importanti variabili farmacologici che sono più significativi in un tessuto vs un ambiente cellulare; si avvicina a come i farmaci esaminati funzionerebbero nel corpo nel suo complesso.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure descritte in questo documento vengono eseguite secondo le linee guida stabilite dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) della Michigan State University.

Preparazione sistema 1. e configurazione

  1. Effettuare 5 L di una soluzione salina fisiologica (PSS), che è la quantità necessaria per un esperimento di contrazione vasca tessuto che utilizza fino a 50 ml bagni tessuto; vedi Tabella 2 per PSS ricetta. Calcolare totale volume richiesto moltiplicando numero di bagni tessuto volte il volume bagno e poi moltiplicato per il numero di lavaggi tissutali necessarie.
    1. Utilizzare Tabella 2 come guida per rendere PSS. Sciogliere i sali in circa 4 L di acqua. Si raccomanda acqua Tipo I - HPLC: NOTE
    2. Aggiungere 8 ml di 1 M CaCl 2 soluzione (147 g / L se si utilizza il sale diidrato) alla soluzione, quindi la soluzione finale è Calcium mM 1.6.
    3. Soluzione PSS Quantum sufficit a 5 L.
    4. Preriscaldare il sistema bagno tessuto a 37 ° C, attivando il ricircolo bagno di acqua riscaldata. Fase critica: Ogni componente del sistema è camicia d'acqua, assicurarsi che siano collegati in serie tra loro. La direzione del flusso è critica - assicurare che i flussi d'acqua verso ogni componente del collegamento spinato più basso e al più alto collegamento spinato.
    5. Accendere sistema di acquisizione dati. Accendere i trasduttori di forza almeno 15 minuti prima dell'esperimento equilibrare la temperatura.
      NOTA: La maggior parte dei trasduttori di forza impiegano estensimetri che sono sensibili alle variazioni di temperatura e presentano deriva termica inizialmente dopo l'accensione.
    6. Lancio software di acquisizione dati e di garantire il collegamento con il sistema di acquisizione dati. Si prega di seguire le istruzioni del produttore per l'abilitazione registrazione dei dati.
    7. Assicurarsi che i trasduttori di forza sono calibrati prima tessuto viene posto nel bagno tessuti e prima della registrazione dei dati è iniziata; foistruzioni del produttore per la calibrazione llow.
    8. Collegare il sistema bagno tessuto una O 95% 2/5% di CO 2 bombole di gas per uso medico e controllare eventuali perdite di gas e quindi pressurizzare il sistema.
    9. Riempire i serbatoi bagno tessuto con PSS e lasciare il tempo di soluzione di raggiungere la temperatura ottimale. Prime il sistema e rimuovere eventuali bolle d'aria all'interno del sistema e il tubo.
    10. Controllare aeratori bagno tessuto per garantire l'aerazione soluzione coerente, che ossigena il buffer PSS e fornisce moto browniano per distribuire farmaci che saranno introdotte nel bagno del tessuto durante l'esperimento. Assicurati di aerazione / bolle non provoca il movimento dei tessuti, che interromperà le registrazioni di dati; diminuire il flusso di gas come necessario.
      NOTA: Il bagno dei tessuti e il sistema di acquisizione dati sono ora pronti ad avviare l'esperimento.

    2. Preparazione del tessuto

    1. Idealmente, sezionare tessuti dal animali immediatamente prima dell'uso e collocare direttamente into PSS.
      NOTA: Alcuni tessuti possono essere salvati in PSS notte a 4 ° C, ma controlli appropriati deve essere fatto per convalidare la funzione del tessuto dopo una conservazione prolungata; vedere la sezione 6.
    2. Utilizzare l'aorta toracica come il tessuto in questo esercizio.
    3. Anestetizzare il topo in conformità alle linee guida istituzionali e posizionare il lato dorsale topo giù. Confermare anestesia tramite una punta pizzico e la perdita di risposta riflessa a questo stimolo doloroso.
      NOTA: Questo protocollo usa 70 mg / kg di pentobarbital distribuito mediante un'iniezione intraperitoneale. Linee guida istituzionali per l'anestesia roditore possono differire.
    4. Creare un pneumotorace creando un'incisione con forbici lungo la membrana sul fondo della gabbia toracica. Poi, continuare l'incisione dal fondo della gabbia toracica allo sterno e bisecare.
    5. Sezionare o collocare parte quegli organi che sono sulla parte superiore della colonna vertebrale e individuare l'aorta, che si trova direttamente lungo la colonna vertebrale.
      NOTA: Questo step fornisce uno spazio di lavoro chiaro per sezionare l'aorta.
    6. Sever tutti i collegamenti con l'aorta; dall'esofago, polmone, ecc e tagliare l'aorta perpendicolare alla colonna vertebrale a livello del diaframma.
    7. Premere delicatamente l'aorta con una pinza e usare le forbici per sezionare l'aorta dalla spina dorsale. Avviare la dissezione nella zona della membrana inferiore adiacente alla colonna vertebrale e di lavoro verso il cuore. Assicurati di prendere precauzioni in più per non tirare o tirare sul tessuto aortico, che può danneggiare il tessuto.
    8. Posizionare immediatamente l'aorta nel piatto dissezione preparato contenente PSS.
      NOTA: dissezione dell'aorta ad anelli è meglio farlo in un piatto dissezione che ha un silastic nero fondazione. Questo permette l'utilizzo di cavi che possono essere utilizzati per cannulare aorta ed essere fissato al piatto, garantendo stabilità mentre nel piatto dissezione. Lo sfondo nero prevede contrasto che aiuta la dissezione. Si deve prestare attenzione in uso di fili cannulating come endothelstrato di cellule ial può essere rimosso con eccesso sfregamento del filo contro il lume del vaso.
    9. Dai filo e fare un piccolo angolo di 90 ° ad una estremità e spingere l'estremità angolata nella fondazione silastic per ancorare il filo guida. Inserire l'intera aorta nel piatto dissezione.
    10. Tenere l'estremità del filo guida con una pinza, e poi infilare delicatamente il filo nel lume dell'aorta.
    11. Utilizzare pinze e far scorrere il aorta sul filo. Quando l'estremità libera del filo guida è visibile, curva il filo delicatamente e collocare l'estremità libera nelle fondamenta silastic del piatto per stabilizzare il tessuto.
    12. Utilizzando Vännäs piccole forbici e pinze, rimuovere il tessuto adiposo perivascolare e tutti gli altri tessuti estranei, coaguli di sangue, ecc fino a visualizzare l'aorta toracica bianco e un po 'fibrosa.
    13. Rimuovere l'aorta pulita dal filo e usare le forbici per tagliare l'aorta in anelli che sono di circa 3-5 mm in larghezza.
    14. Inserire un anello aortico su uno di una coppia di tiganci SSUE tenendo premuto il gancio e con pinze a scivolare delicatamente l'anello sul gancio. Ripetere questa operazione con il secondo gancio. Prestare attenzione al fine di garantire i ganci non groviglio; vedi figura 3.
    15. Verificare che ogni gancio ha una sutura di seta diverso allegato. Verificare che un gancio ha un piccolo anello annodato seta che consente per il fissaggio a un bicchiere o in acciaio inossidabile, mentre l'altro è un 10-4 cm lungo pezzo di sutura che sarà legato a mano al trasduttore di forza; vedi figura 3.
      NOTA: Dopo l'aorta è fissato ai ganci, il tessuto è pronto per essere montato nel bagno tessuti; vedi figura 3.
    16. Ripetere i passaggi 2,14-2,15, per montare un secondo anello aortico nella seconda camera bagno tessuto.

    3. Tissue Placement a Bath

    1. Si noti che in questo sistema, i bagni tessuti stessi sono fermi. In questo momento, riempire le vasche di tessuto con riscaldato, PSS aerato e consentire la soluzione di venire a temperature.
    2. Con la sutura di seta, cravatta uno dei ganci sulla preparazione del tessuto al piolo della barra di acciaio inossidabile. Posizionare questo fine nella camera bagno tessuti. Collegare l'asta di un supporto ad anello e posizionare l'altra estremità nel piatto colorazione pieno di PSS per mantenere il tessuto immersi in tampone; vedi figura 3.
      1. Posizionare l'asta e il tessuto nella camera bagno tessuto e assicurarsi che il tessuto è completamente immerso nel PSS e l'asta è sicuro; vedi figura 3.
      2. Legare l'altra sutura al trasduttore di forza e assicurarsi di lasciare lasco nel sutura tra il tessuto e il trasduttore di forza.
        NOTA: Questo gioco sarà rimosso regolando il micrometro; vedi figura 3.
    3. Ripetere questi passaggi per il secondo anello e il bagno il tessuto della camera aortica.

    4. Impostare tensione passiva

    NOTA: Ogni tessuto ha una lunghezza (Lo) in cui le cellule muscolari lisce rispondono optimally. Esperimenti preliminari per determinare la tensione di stretching ottimale che realizza questa lunghezza deve essere eseguito per ciascun tipo di tessuto individuo da esaminare. Il ratto aorta toracica ha un ottimale tensionamento stiramento passivo di 4 g.

    1. Utilizzare il micrometro / cremagliera per aumentare la tensione di 2 g ed attendere il tessuto per raggiungere plateau. Una volta raggiunto plateau, aumentare la tensione altri 2 g e attendere per il tessuto di plateau.
      NOTA: negli anelli aortici, dopo la tensione iniziale di 2 g è tramontato e plateau raggiunto, il tessuto deve poi rilassarsi a ~ 1,6 g. Una seconda applicazione di 2 g porterebbe il tessuto ~ 3,6 g, da cui il tessuto sarà nuovamente valigie e tensione diminuirà. Quindi, dopo aver aggiunto 4 g di tensione totale, il software dovrebbe indicare circa 3,2 g di tensione.
    2. Ripetere questi passaggi per il secondo anello e il bagno il tessuto della camera aortica.

    5. Fare Equilibrazione e droga

    1. Equilibrare il tessuto per60 min dopo l'applicazione di tensione passiva al tessuto.
    2. Durante la fase di equilibrio, lavare il tessuto ogni 15-20 min. Svuotare la vasca tessuti e sostituire il PSS con PSS da un serbatoio riscaldato.
      NOTA: Durante questo tempo, il tessuto si rilasserà, che è indicata dalla perdita di tensione passiva.
    3. Durante questo tempo, preparare farmaci per l'esperimento, che devono essere almeno 1000 volte più concentrato rispetto alla concentrazione effettiva nel bagno, così è necessario solo un piccolo volume dello stock farmaco per ottenere la concentrazione desiderata.

    6. Sfida iniziale

    1. Alla fine del periodo di equilibrazione, lavare il tessuto un'ultima volta, salvare i dati, e riazzerare tutti gli ingressi.
    2. Scegliere un agonista (composto che causerà contrazione attiva) a cui il tessuto risponde.
      NOTA: Nel ratto aorta toracica, il muscolo liscio arteriosa attivamente contratto per un agonista del recettore adrenergico alfa a causa della innervazione delil tessuto del sistema nervoso simpatico. Un agonisti adrenergici non sarebbe utile nei tessuti intestinali dato che agonisti adrenergici causano rilassamento. In questo caso potrebbe essere utilizzato un agonista del recettore come acetilcolina (recettore colinergico). Un'alternativa sia fenilefrina e acetilcolina è quello di utilizzare un agonista non recettoriale quali alta potassio (K) come prima sfida. In muscolatura liscia, alta K opera per indirettamente i canali del calcio aperta e quindi è visto come un indice generale di integrità della muscolatura liscia.
      1. Eseguire la prima sfida o la sfida di sveglia con l'aggiunta di 10 -5 M fenilefrina al bagno tessuti. Per raggiungere questa concentrazione in 50 ml vasca tessuto, aggiungere 50 ml di una soluzione di fenilefrina 10 -2 M.
        NOTA: 50 ml in 50 ml di PSS è una diluizione 1/1000, per cui la concentrazione finale è 1,000x inferiore a magazzino, o 10 -5 M. La conoscenza di volume e manutenzione costante del volume all'interno del bagno tessuto cHamber è fondamentale per determinare la concentrazione finale di droga.
    3. Aggiungere 10 -5 M fenilefrina al bagno tessuti e consentire la contrazione di picco e poi plateau, quando la pendenza dei dati diventa zero. Assicurati di registrare ogni evento sperimentale per facilitare l'analisi post-sperimentale.
    4. Dopo plateau, lavare l'agonista accuratamente svuotando e riempimento della camera di bagno con tessuto nuovo PSS. Assicuratevi di registrare questi eventi pure.
      NOTA: Una regola generale è che la concentrazione di agonista nel bagno è ridotto 10 volte con ogni lavaggio. Sebbene, più di 3-4 lavaggi possono essere necessari per portare il tessuto indietro al suo tono basale equilibrio (tensione).
    5. Lasciare riposare in tessuto tono basale per ~ 10 minuti prima di procedere.

    7. Experiment

    NOTA: Prazosin, un antagonista del recettore adrenergico alfa, sarà introdotto nella camera bagno tessuti a spostare il resp concentrazioneCurva Onse di fenilefrina (PE); questo è un antagonismo dimostrabile.

    1. Per un bagno, aggiungere il veicolo (H 2 O) in cui è stato sciolto prazosin. Per un altro, aggiungere la giusta concentrazione di prazosina. In questo caso, aggiungere 25 ml di veicolo ad un bagno e 25 pl di 10 -5 M concentrazione del prazosin all'altro per ottenere un 5 x 10 -9 M o una concentrazione 5 nM nel bagno.
      NOTA: L'aggiunta di veicolo sembra necessario in questo esempio, è imperativo farlo utilizzando altri veicoli che hanno un potenziale di essere vasoattivo (ad esempio, DMSO, etanolo, acetato). Aggiungere il rispettivo veicolo anche se poche prove esiste per essere vasoattivo.
    2. Lascia veicolo / prazosina nei bagni e non lavare il tessuto per 1 ora.
      1. Mentre i tessuti sono equilibrante, preparare più concentrazioni di agonisti (PE). Comprendono una vasta gamma di concentrazioni, dalle concentrazioni che provochino alcuna risposta (ad esempio, </ Em> 10 -9 M PE) a concentrazioni che superano la risposta massima (ad esempio, 10 -4 M PE). Dal curve concentrazione-risposta sono logaritmica in natura, fare sei soluzioni separate stock di PE (10 -6 -10 -1 m) attraverso diluizioni seriali dalla soluzione madre 10 -1 M. Assicurarsi che il volume necessario per ogni concentrazione è leggermente maggiore del triplo rispetto al volume totale necessario per tutti i bagni (cioè> 300 ml).
    3. Procedere aggiungendo agonisti, come descritto nella Tabella 1.
      NOTA: Questo esperimento genererà una curva di concentrazione-risposta cumulativa a PE; ogni iterazione tiene conto della quantità di sostanza già aggiunto al bagno. Aggiunte verificano fino a quando aumentano più la contrazione, o l'intera curva è stabilizzato.
      1. Aggiungere ogni concentrazione di farmaco singolarmente fino al raggiungimento della soglia di tessuti.
      2. Se non si verifica alcun cambiamento, aggiungere il successivo concentrazioneSerie; vedi Tabella 2.
        NOTA: La tempistica di queste aggiunte dipende l'agonista utilizzato. Ad esempio, noradrenalina e fenilefrina contrazione sviluppa rapidamente, e dovrebbero plateau in pochi minuti. Al contrario, endotelina-1 contrazione si sviluppa lentamente e può non plateau per quasi 45 minuti. Altro sperimentazione può essere effettuata sul tessuto dopo la costruzione di una curva come questo, purché (1) la sostanza lava fuori; e (2) si può dimostrare che il tessuto ritorna normale comportamento contrattile e non è influenzato dalle stimolazioni precedenti.

    Analisi 8. Dati

    1. Assicurarsi di salvare i dati immediatamente prima e dopo un intervento (ad esempio, sveglia o completo della curva).
    2. Trovare e impostare la linea di base del tessuto per ogni bagno tessuto canale di camera / ingresso, che sarà di aiuto in analisi dei dati.
    3. Una volta che la linea di base è impostato, trovare la risposta massima per ogni concentrazione, e registrare il change al basale. Sequenziale muoversi attraverso ciascuna delle concentrazioni e registrare lo spostamento della linea di base.
    4. Rappresentare graficamente i dati risultanti. Fate questo in qualsiasi programma di grafica.
      NOTA: Graph Pad Prism è progettato per farmacologi, e questo è ideale per il tipo di esperimento qui presentata.

Representative Results

In termini di agonismo, l'efficacia relativa (E MAX) e la potenza (EC 50) di un agonista in un dato tessuto possono essere calcolate e confrontate alle risposte di altri agonisti della stessa tessuti 1. Nel nostro esperimento, il ratto dell'aorta toracica è stata incubata con entrambi veicolo o α 1 antagonista del recettore adrenergico prazosin (5 nM) per un'ora prima di aggiungere l'α 1 adrenergico fenilefrina al bagno tessuti e generando contrazione (Figura 1).

Figura 2 presenta modificate risultati di Figura 1. Le risposte verdi hanno segnato la contrazione massima raggiunta dal PE contrassegnato come max, la contrazione massima ½ contrassegnati come tali e poi associato alla concentrazione di PE che ha causato tale risposta. Identificare questi valori è identificare la concentrazione effettiva di un agonista che realizza un mezzo max (50%) di risposta o CE 50.

In generare e interpretare questi risultati, è importante utilizzare entrambe le concentrazioni basse e alte di agonista per creare la curva concentrazione-risposta. Senza abbastanza punti per mostrare una linea di base stabile e massima plateau, EC 50 e E MAX possono solo essere stimati. Ciò è stato fatto graficamente in questo esempio. Software che utilizza funzioni logistiche per le curve sigmoidali può essere utilizzato per il montaggio della curva e il calcolo dei valori di EC 50.

Figura 1
Figura 1:. Carta igienica Schema Cartoon rappresentano un anello di tessuto posto nella doppia parete, camicia d'acqua ba tessutoth. Buffer afflusso e deflusso sono regolati da un rubinetto di vetro 3 vie integrato nella base della camera. O 2 / CO 2 viene fatto gorgogliare attraverso un aeratore che viene sigillato con una guarnizione per impedire perdite di PSS o gas. Ingresso ricircolo è inferiore alla uscita per mantenere adeguato ricircolo e prevenire la formazione di sacche d'aria che potrebbero causare disregolazione temperatura.

Figura 2
Figura 2:. Rat toracica Aorta + endotelio La figura in alto raffigura quattro esperimenti separati (diversi animali e fatto da diversi ricercatori su diversi set up, come rappresentato da colori diversi) per testare la capacità di prazosina di spostare una contrazione PE-indotta. Prazosin (5 NM) chiaramente spostato PE-indotta curva contrazione verso destra in modo parallelo.


Figura 3: Rat toracica Aorta + endotelio stima grafica dei valori di EC 50 per PE in assenza (veicolo) e presenza (prazosina) antagonista.. Linea verde (gruppo C) solo è segnato.

Sale MW (g / moli) 5 Litri FINALE mM
(grammi)
NaCl 58.45 37.99 130
KCl 74.56 1.75 4.7
KH2PO4 136,1 0.8 1.18
MgSO4• 7h20 246.5 1.45 1.17
NaHCO3 84.21 6.25 14.9
Destrosio 180,16 5 5.5
EDTA 380 0.05 0.03

Tabella 1: Normal fisiologica soluzione salina (PSS) Ricetta Contenuti del PSS tamponato con bicarbonato utilizzato in questo esperimento.. Sono inclusi i pesi molecolari di tutti i sali e la quantità aggiunta di 5 L di dH 2 O per ottenere la concentrazione desiderata.

Concentrazione in bagno L'aggiunta di agonisti fatto il bagno
1 x 10 -9 M 50 ml 1 x 10 -6 M
3 x 10 -9 M 100 ml 1 x 10-6 M
1 x 10 -8 M 35 ml 1 x 10 -5 M
3 x 10 -8 M 100 ml 1 x 10 -5
1 x 10 -7 M 35 ml 1 x 10 -4 M
3 x 10 -7 M 100 ml 1 x 10 -4 M
1 x 10 -6 M 35 ml 1 x 10 -3 M
3 x 10 -6 M 100 ml 1 x 10 -3 M
1 x 10 -5 M 35 ml 1 x 10 -2 M
3 x 10 -5 M 100 ml 1 x 10 -2 M
1 x 10 -4 M 35 ml 1 x 10 -1 M

Tabella 2:. Tissue Bath Additive Agonist Concentrazioni La quantità di agonisti da aggiungere a ogni bagno a proPerly costruire curve concentrazione-risposta cumulative. La concentrazione vasca desiderato si ottiene con l'aggiunta di quantità sequenziali di concentrazioni crescenti di agonista. Ogni aggiunta tiene conto della concentrazione di agonista già presente nel bagno. Questo viene fatto per ridurre al minimo l'aumento di volume nel bagno tessuto che risulterebbe da utilizzando volumi crescenti di una singola concentrazione di agonista.

Discussion

Misurazione della forza isometrica come strumento di ricerca è di oltre 150 anni, ma continua ad essere la tecnica prototipo per la caratterizzazione dei recettori nei tessuti contrattili 2. La potenza di questa tecnica è nella sua semplicità e versatilità: registrando risposte indotte da concentrazioni crescenti di un agonista in presenza o assenza di un antagonista, una miriade di informazioni può essere ricavato sulle caratteristiche farmacologiche di ciascun farmaco e il recettore a cui si lega 3-5. Esperimenti di questo tipo Garner anche informazioni sulla concorrenza contro natura non competitiva degli antagonisti utilizzati, nonché eterogeneità recettore e effetti non specifici farmacologiche 6-8. Così, con permutazioni semplici a questa isolata esperimento vasca tessuto, un profilo farmacologico relativamente completo dei recettori che mediano agonista indotta contrazione muscolare può essere generato.

In termini di agonismo, the efficacia relativa (E MAX) e la potenza (EC 50) di un agonista in un dato tessuto possono essere calcolati e rispetto alle reazioni di altri agonisti della stessa tessuti 1. Nel nostro esperimento, il ratto dell'aorta toracica è stata incubata con entrambi veicolo o α 1 antagonista del recettore adrenergico prazosin (5 nM) per una ora prima di aggiungere l'α 1 adrenergico fenilefrina al bagno tessuti e generando contrazione. Figura 2 presenta modificato risultati di figura 1. Le risposte verdi sono stati contrassegnati con la contrazione massima raggiunta dal PE contrassegnati come max, la ½ massima contrazione contrassegnati come tali e poi associato alla concentrazione di PE che ha causato tale risposta. Identificare questi valori è identificare la concentrazione effettiva di un agonista che realizza un mezzo max (50%) di risposta o valore EC 50.

Purtroppo, con il parametro agonista-dipendentes da solo per determinare le caratteristiche dei recettori di legame può essere complicato 9. Idealmente, ulteriori esperimenti utilizzando antagonisti dei recettori permettono il calcolo dei due parametri importanti che sono fondamentali per definire l'interazione tra un farmaco e un recettore: la -log 10 della dissociazione antagonista costante (pK B) e la -log 10 dell'antagonista molare concentrazione necessaria per suscitare duplice spostamento verso destra della curva concentrazione-risposta (pA 2) 10. Sia K B e pA 2 guadagno loro utilità dal fatto che esse sono valori agonisti indipendenti, e rimangono costanti anche tra differenti tessuti 11. Dai dati della figura 2, pK B può essere calcolata utilizzando la seguente equazione e basato su valori di EC 50 calcolati altrove:

CE 50 in assenza di prazosin = 2 x 10 -8 M
CE 50 nella presence di prazosina = 7 x 10 -6 M

Risolvere per K B nella seguente equazione:
log (dr-1) = log [B] - log K B
Dove:
[B] = concentrazione antagonista, o 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8.3
dr = rapporto dose di valore EC 50 in presenza di antagonisti / CE 50 in assenza. Se vi è uno spostamento verso destra, questo valore sarà maggiore di uno. Pertanto:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M o 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Sostituendo per [B] e dr:
log (350-1) = -8 - log K B
2.54 = -8 - log KB
pK B = 10.54

Questo valore per prazosina è coerente con i valori ottenuti quando prazosina interagisce con un α 1 adrenergici recepto 12,13, suggerendo che il recettore adrenergico mediare contrazione fenilefrina è il recettore adrenergico α 1.

Diversi passi sono fondamentali per il successo di questi esperimenti. I tessuti devono rimanere in PSS dopo la dissezione per prevenire la perdita di vitalità del tessuto. Qualsiasi preparazione muscolare isometrica ha un ottimo rapporto lunghezza-tensione che genera forza massima contro tensione passiva 14,15. Per l'esperimento descritto in questo protocollo, tensione passiva ottimale è stato precedentemente determinato da incrementi brevemente aggiunta di 0,5 g di tensione passiva al tessuto. Il tessuto deve iniziare senza tono e poi, dopo 30 minuti di equilibrio, il tessuto è stato sfidato con una concentrazione massima di KCl (80 mm), che ha generato tono attivo. Quindi, il tessuto è stato lavato e lasciata tornare a tono basale. Dopo 15 min al basale, un'altra 0,5 g di tensione passiva è stata posta e questo processo ripetuto finché un plateau ditensione attiva è stato raggiunto con tensione passiva supplementare. In esperimenti preliminari, 4 g totale di tensione passiva è stato determinato per raggiungere la massima generazione tensione attiva in anelli aortici, e quindi tale quantità totale di tensione è posto sugli anelli prima equilibrazione. Procedurale, è meglio azzerare prima applicazione tensione passiva, ma può essere fatto in qualsiasi momento prima dell'esperimento. Over-stiramento dei tessuti, in qualsiasi punto l'esperimento o dissezione, avrà un impatto negativo vitalità del tessuto e dei risultati sperimentali. Questo è più indispensabile quando si posiziona tessuti nel bagno, in quanto questa operazione ha la più alta probabilità di eccessivo stiramento. Lavaggio adeguato, in numero e durata è richiesto per gli effetti riproducibili. Una seconda sfida troppo presto dopo una sfida iniziale, o prima di tessuti sono tornati alla tensione di riferimento, si tradurrà in risposte aberranti. Se lo studio reversibili antagonisti / inibitori, i tessuti non devono essere lavati prima di agonista Inoltre, come l'inibizioneconcentrazione tor sarà diminuito.

Ci sono notevoli vantaggi e svantaggi per gli isolati da bagno tessuto saggi.

Svantaggi: I tessuti possono sperimentare diversi gradi di danni durante la rimozione chirurgica o il posizionamento di anelli a ganci. Poiché la cellula endoteliale è il rivestimento interno dell'anello aortico, è necessario prestare attenzione al posizionamento dell'anello a ganci in modo da non danneggiare questo strato di cellule. I tessuti possono anche avere distintamente differenti lunghezze di tempo in cui sono vitali nel bagno tessuti, e questo deve essere determinata; Non tutti i tessuti sono uguali. Lungo queste linee, i tessuti possono cambiare nella loro capacità di risposta per tutto il giorno in modo che i controlli orari diventano un controllo necessario per ogni esperimento. Un buon esempio di questo è la trachea cavia che migliora in contrattilità massimo del 100% durante un tipico esperimento 8 ore. I farmaci che sono poco solubili in acqua possono precipitare nel PSS. Infine, un cumulativoND additivi non cumulativi di un farmaco che è un agonista potrebbe tradursi in risultati diversi se si verifica recettore desensibilizzazione per l'agonista; angiotensina II è uno di questi farmaci che mostra tachifilassi rapidi.

Vantaggi: Uno dei vantaggi principali di tessuto esperimenti bagno è che è in tempo reale; si può vedere l'esperimento come si svolge e può rapidamente trarre conclusioni e pianificare i prossimi passi, così come risoluzione dei problemi durante un esperimento. Un esperimento prende un giorno di fare. Tessuti multipli possono tipicamente essere preparati da un animale in modo che un animale può servire come proprio controllo, e che aggiunge forza per un esperimento. Uno può anche isolare il tessuto da altri fattori, per testare una risposta relativamente pura del tessuto al farmaco. In esperimenti in vitro come il sistema vasca tessuto permettono anche l'uso di una piccola quantità di farmaco rispetto ad un esperimento in vivo.

Il disegno sperimentale di base qui descritto può essereampiamente modificato per consentire la registrazione dei parametri aggiuntivi o l'introduzione di altri stimoli esterni. Ad esempio, l'aggiunta di elettrodi consente campo stimolazione elettrica di nervi che innervano 16,17. Con l'aggiunta di sonde termiche o di pH, gli effetti della temperatura e del pH sulle risposte contrattili possono essere misurati 18,19. Analogamente, l'ossigeno può essere sostituito parzialmente o completamente con N 2 per valutare ipossia effetti indotti. Inoltre, gli stessi principi di base della misurazione contrattilità isometrica utilizzati in questo video possono essere utilizzati per sviluppare sistemi che permettono la misurazione concomitante di sviluppo tensione isometrica e cambiamenti di calcio intracellulare 20. La trasduzione del segnale è anche facilmente studiato, poiché esistono sistemi che possono rapidamente congelare un campione di tessuto durante una risposta, in modo tale che l'attività di un sistema via di trasduzione del segnale può essere verificata biochimicamente.

La variazione di equipment che può essere usato per fare questo è enorme. L'intero sistema, sia a mano costruito o automatico, può essere acquistato da più aziende diverse. I bagni di tessuto e titolari dei tessuti utilizzati in questo protocollo sono stati (bagni tissutali) e costruito a mano (titolari) soffiato a mano da parte di un in-house officine Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LabChart Software ADInstruments 7.2
PowerLab (4 channel)  ADInstruments ML760
QuadBridge (4 channel) ADInstruments ML112 ML112
Grass Adapter Cable ADInstruments MLAC11 MLAC11
Grass Force-displacement Transducer Grass Instrument Co FT03 FT03
Grass Transducer Cable Grass Instrument Co TAC-7 REV-1
BNC to BNC Cable ADInstruments MLAC01
IsoTemp 2100 Fisher Scientific IC-2100
Tissue Bath Multiple Sources 
Physiological Salt Solution PSS
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Ring Stand Humboldt MFG Co H-2122 7
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Tygon Tubing VWR Scientific 63010-100 R-3603
Hose Clamps Cole-Parmer Instrument Co 06832-08 SNP-8
50 ml Muscle Bath Eberhartglass Blowing Custom
250 ml Warming Chambers Eberhartglass Blowing Custom
Gas Dispersion Tube Ace Glass 7202-06 7202-02
Micrometer
Custom Stands
Three-prong Clamps VWR International Talon
S-connector VWR International Talon
Tissue Hooks Hand Made in House Custom
Tissue Dissection
Leica Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source Fisher Scientific 12562-36 12562-36
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Sylgard Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150 160-150
Splinter & Fixation Forceps George Tiemann & Co 160-55 160-55

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References

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